CN101877961B - 神经调节蛋白用于器官保护的方法和组合物 - Google Patents

神经调节蛋白用于器官保护的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于移植器官比如心脏，保存、灌注或再灌注的组合物和方法。该组合物包含一种保存液和有效量的神经调节蛋白。该方法包括用有效量的神经调节蛋白接触该器官。

Description

神经调节蛋白用于器官保护的方法和组合物
本申请要求了美国临时申请No.60/993,566的优先权，优先权日为2007年9月12日，该优先申请的内容全部结合至本申请中。
1.技术领域
本发明涉及用于保存、灌注或再灌注移植用器官比如心脏的方法和组合物。
2.背景技术
器官移植往往由于缺血-再灌注损伤而失败。离体心脏缺氧超过4个小时逐渐失去活力并导致移植体不能存活。其它器官比如肾、肝、胰腺和肺同样由于移植前的离体会导致细胞和组织的损伤。在生理条件下，血液循环给器官带来氧气和营养，同时带走器官代谢产生的有害物质，而离体条件下的去循环状态引起的缺氧则是出现器官损伤的原因。如果器官从其供体上切除后马上移植到受体，其成功率将会大大提高。
最近的一些科学进展增加了器官移植和器官手术比如冠状动脉旁路手术的成功率。首先是对于器官保护和器官灌注液的研究进展。其次是器官灌注方法的改进。
心脏停搏后的冷冻保存可以提供短时间的心肌保护。由于器官保护液的组分、保存温度以及灌注方法的不同导致冷冻保存的程序不同。目前已经开发了多种不同的用于心脏手术中心脏停搏和心肌保护的溶液，比如Krebs-Henseleit溶液，UW溶液，St.Thomas II溶液，Collins溶液以及Stanford溶液(参见美国专利No.4798824和4938961；Southard和Belzer，Ann.Rev.Med.46：235-247(1995)；以及Donelly和Djuric，Am.J.Hosp.Pham.48：2444-2460(1991))。尽管如此，仍然存在着由于器官从供体切除后到移植至受体后血供恢复期间器官的恶化而导致移植失败的可能。
目前发现神经调节蛋白(neuregulin，NRG)可以引起心肌细胞的生长和/或分化。NRG是一类结构上相似的生长和分化因子，包括NRG1，NRG2，NRG3和NRG4以及它们的异构体。目前已经发现的NRG1的异构体已经超过15种，并且根据其表皮生长因子(EGF)样结构域的序列差异可以分为α和β两型。
NRG的受体为表皮生长因子受体(EGFR)家族，包含EGFR，ErbB2，ErbB3和ErbB4，它们在多种细胞学功能中发挥了重要的作用，包括细胞生长、分化以及存活。EGFR受体家族为一类络氨酸蛋白激酶受体，包含细胞外配体结合区域，跨膜区域和细胞内络氨酸激酶区域。当NRG结合到ErbB3或ErbB4胞外段结构域后，导致其构象改变并引起ErbB3、ErbB4与ErbB2的异二聚体形成或ErbB4本身同二聚体形成，并最终导致了受体细胞内C末端结构域的磷酸化。细胞内磷酸化的结构域结合了更多的信号传导蛋白，激活下游的AKT或ERK信号通路，由此激活了一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增殖，细胞分化，细胞凋亡，细胞迁移或黏附。在心脏组织中表达的ErbB家族受体主要为ErbB2和ErbB4。
已有的证据显示，NRG1的EGF样结构域，其长度约为50-64个氨基酸，足够行使结合并激活其受体的功能。早先的研究发现NRG-1β可以以较高的亲和力结合直接结合ErbB3和ErbB4。孤儿受体ErbB2与ErbB3或ErbB4形成的异二聚体的亲和力要高于ErbB3或ErbB4同二聚体。在有关神经发育的研究中发现，交感神经系统的形成需要NRG-1β和ErbB2、ErbB3信号系统的参与。定向阻断NRG-1β、ErbB2或ErbB4后由于心脏发育障碍导致胚胎死亡。最近的一些研究亦强调了NRG-1β、ErbB2和ErbB4在心脏发育以及维持心脏功能中的作用。NRG-1β已被证明可以增强成年心肌细胞的肌小节的结构。在三种不同的心衰动物模型中发现短期摄入NRG-1βEGF样结构域的重组蛋白可以显著提高心脏功能或防止其进一步恶化。更为重要的是，NRG-1β可以显著延长心衰动物的生存时间。
然而目前仍然需要一种组合物，其可以延长待移植器官的保存时间，并防止其受到缺血后的再灌注损伤，从而使得移植后的器官在血供恢复后能够恢复正常功能。本发明即提供了用于器官保护、灌注或再灌注的方法及包含NRG的组合物。
3.发明概述
本发明提供了一种用于器官比如心脏，保存、灌注和/或再灌注的组合物，其包含一种保存液和NRG。该组合物可以防止在该器官脱离循环状态或缺血状态(血供减少)时其组织和细胞受到伤害。已有的证据显示NRG可以在器官缺血/再灌注时起到保护作用。
本发明提供的组合物可以根据本技术领域内的专业人士的判断来使用。比如该组合物可以泵入待移植器官的血管中，起到保护该器官组织和细胞的作用。或者，该组合物也可以用于浸泡待移植的器官。优选的，待移植的器官首先用该组合物灌注，并随后用该组合物浸泡。更进一步，本发明提供的组合物可以用于器官缺血后恢复血供时的再灌注液。
本发明还提供了使用该组合物的方法。包括灌注待移植器官、保护缺血器官、减少器官缺血后的失功能、以及保护器官在脱离循环状态时不受损害的方法。
本发明还提供了治疗慢性心力衰竭的方法，包括使需要治疗的患者摄入有效量的NRG，持续6小时。
4.附图说明
图1显示心肌细胞舒张至最大长度一半时所需要的时间。对照组和心梗组分别代表来自假手术大鼠和心梗大鼠的心肌细胞。心梗组的第二个柱是代表加入了NRG，时间单位为毫秒(ms)。对照组、心梗组和心梗组伴随NRG处理这三组中检测的细胞数目分别为68，97和100个，来自不同的大鼠。
图2显示心脏组织保存在不同条件下6小时后AKT的磷酸化水平。1-3道为保存在Celsior溶液中的情况，4-6道为保存在含有NRG的Celsior溶液中的情况，7-9道为心脏组织预先用wortmannin处理后保存在含有NRG的Celsior溶液中的情况。WM和P-AKT分别代表wortmannnin和磷酸化的AKT。
图3显示慢性心衰患者在24小时内持续摄入NRG后的平均心输出量。
图4显示慢性心衰患者在24小时内持续摄入NRG后平均体循环血管阻力。5.发明内容5.1释义
除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。
除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。
“约”一词意为一个固定值或范围的上下20％以内，优先的在10％以内，更为优选的在5％(或1％或更小)以内。
此处所用“摄入”或“给药”一词意为通过注射或其它物理的方法将一种物质从体外传递到体内的行为，比如通过粘膜，皮内，静脉内或肌肉内途径或其它此处描述或其它已知的给药途径。当治疗一种疾病或其症状时，给药往往是在疾病或其症状发生之后。当预防一种疾病或其症状时，给药则往往是在疾病或其症状发生之前。
在此所用“生长因子神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”的意思是指与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。包括但不受限于所有NRG的亚型，EGF样结构域，包含EGF样结构域的多肽，NRG突变体或衍生物，以及其它可以激活上述受体的NRG样分子。在优选的实施方案中，NRG可以识别并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。NRG包括NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4蛋白，多肽，片段以及可以模拟NRG激活功能的复合物。本发明所用NRG可以激活上述受体并调控它们的生物学活性，比如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞的分化、成活以及DNA合成。在这里，NRG也包括保留NRG保守氨基酸序列，且其生物学活性不变的突变体。适当的氨基酸替换不影响其生物学功能，这在本领域的技术人员中是被广泛认可的。一般情况下，对多肽的非功能区域的单个氨基酸的改变对其功能无影响(参见Watson等.Molecular Biology ofthe Gene，4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。
NRG蛋白包括NRG的一个蛋白或者多肽。NRG核酸包括编码NRG的核酸或寡核苷酸片段。
此处所用“EGF样结构域”或“epidermal growth factor-like domain”或“EGF-likedomain”是指由NRG基因编码的与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，并激活上述受体，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽。关于“EGF样结构域”参见WO 00/64400，Holmes等，Science，256：1205-1210(1992)；美国专利No.5,530,109及5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，13：1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387：509-512(1997)；Carraway等，Nature，387：512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.，122：675-680(1997)以及WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样结构域能够结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1的第177-226或177-237或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-2的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-3的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-4的受体结合序列。在某些实施方案中，EGF样结构域包含了美国专利No.5,834,229中所述的氨基酸序列：AlaGlu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。
此处所用“射血分数”是指每搏输出量占左心室舒张末期最大容积的百分比，可以用以下公式计算：(左心室舒张末期容积-左心室收缩末期容积)/左心室舒张末期容积。
此处所用“心力衰竭”是指心功能异常，表现为心脏不能以组织代谢所需的速度供血。心力衰竭包括范围广泛的疾病状态如充血性心力衰竭、心肌梗死、快速心律不齐、家族性肥大性心肌病、缺血性心脏病、自发扩张型心肌病、心肌炎。许多因素可导致心力衰竭，包括但不受限于缺血性、先天性、风湿性以及自发性。慢性心肌肥大是充血性心力衰竭和心脏停跳前的明显的疾病状态。
除非明确指明，此处所用“蛋白”是与“多肽”或“肽”同义。
此处“主体”和“病人”可以互换使用。一个主体优选的是哺乳动物，比如非灵长类动物(牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(猴、人)，更为优选的是人。
此处所用“活性单位”或“U”是指能够诱导50％最大活性反应的剂量。换句话说，为了测定一个活性成分的活性单位，必须测量其EC50。比如某一批次的产品的EC50是0.067μg/ml，那么其活性单位即为0.067μg/ml。那么，1μg该产品即包含14.93个活性单位(1/0.067)。EC50的测定方法可以使用本发明中所使用的方法测定，亦可以通过其它本技术领域中所知的方法测定。这种活性单位测定的方法对于基因工程产物和临床药物的质量控制非常重要，它使得同一药物的不同批次以及不同的药物之间可以通过统一的标准来定量。
在某些实施方案中，NRG的活性通过一种名为激酶受体活化酶联免疫吸附实验，在实施例6以及WO03/099300以及Sadick等，1996，Analytical Biochemistry，235：207-214中有关于该方法的详细描述。简单地说，该方法通过检测NRG诱导的乳腺癌细胞MCF-7的ErbB2受体的活化和磷酸化测定NRG的活性。膜蛋白用Triton X-100游离后通过包被了特异性抗ErbB2抗体(比如H4，与ErbB3和ErbB4无交叉反应)的ELISA板捕获。ErbB2受体的磷酸化水平则通过抗磷酸化抗体的ELISA试验测定。5.2用于移植心脏保护、灌注或再灌注的组合物及其方法
本发明提供了一种用于器官，比如心脏保护、灌注和/或再灌注的组合物，其包含一种保存液和有效量的NRG。已有的证据发现NRG可以防止器官比如心脏在脱离循环血供或血供不足时受到氧化物损伤、缺血再灌注损伤。
任何本技术领域内所知的NRG均可以用于本发明的组合物。该组合物包含有足以防止器官不受组织缺氧、缺血或再灌注损伤的有效量的NRG。在一些实施方案中，NRG的量是足以激活AKT信号通路的量。在一些实施方案中，NRG的浓度为大于约0.01nM，约0.1nM，约1nM，约10nM，约100nM，约1000nM，约10μM，约100μM，约1000μM。在一些实施方案中，NRG的浓度为约14nM。在一些实施方案中，NRG的浓度约为0.01-1000nM，约0.1-100nM，约0.1-50nM，约0.5-25nM，或约10-20nM。在一些实施方案中，NRG的浓度为约14nM。
本发明所提供的组合物中的保存液可以是任何已知的用于器官灌注、保存或再灌注的保存液。举例来说包括但不限于Celsior溶液，Krebs-Henseleit溶液，生理盐溶液，University of Wisconsin溶液，St.Thomas II溶液，Collins溶液以及Stanford溶液等。
优选的，本发明所提供的组合物应维持在生理性的PH值如约7.0-7.5，更为优选的，约7.2-7.4。
本发明所提供的组合物也可以含有一种或多种已知的用于防止器官组织在移植过程中或由手术或外伤导致的缺血而受到损伤的物质。这样的物质包括但不限于公开号为20070148628和20060166182的美国专利申请中记载的蛋白激酶C抑制剂，布比卡因，左旋布比卡因，依替卡因，罗哌卡因，或丁卡因。
本发明提供了使用所提供组合物的方法。这些方法包括保存待移植的器官，防止缺血器官受到损害，减少缺血器官的失功能以及防止器官在脱离循环时受到损害。
本发明所提供的组合物可以被用于器官移植特别是心脏移植的各个阶段，包括但不限于1)从供体上分离器官；2)保存器官；3)受体再植器官。
本发明提供了用有效量的NRG接触器官从而保存移植用的器官比如心脏的方法。该器官可以在从供体身上切除前接触NRG，也可以在切除过程中或切除后接触NRG。
本发明所提供的组合物可以用本技术领域内已知的方法制备。比如，1)在蒸馏水中溶解稀释NRG和其它成分；2)用比如NaOH等物质调整PH值至所需数值，比如7.2-7.4；3)除菌，比如用0.2μM的滤膜过滤。除菌后的溶液将作无菌保藏。5.2.1NRG
任何NRG(比如NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4以及它们的亚型)蛋白、多肽或片段均可以用于本发明。
NRG是指与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。包括但不受限于所有NRG的亚型，EGF样结构域，包含EGF样结构域的多肽，NRG突变体或衍生物，以及其它可以激活上述受体的NRG样分子。在优选的实施方案中，NRG可以识别并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。本发明所用NRG可以激活上述受体并调控它们的生物学活性，比如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞的分化、成活以及DNA合成。测量受体结合活性的方法是本技术领域内熟知的。比如，可以使用转染了ErbB2和ErbB4受体的细胞，这些表达受体的细胞与过量的放射性标记的NRG孵育后，去除未结合的标记的NRG，再加入未标记的NRG与标记的NRG竞争结合受体。EC50用本技术领域中已知的方法测定。EC50即竞争50％放射性标记的配体所需配体的浓度。EC50的值越高，代表受体亲和力越低。
本发明所用的NRG包括任何NRG以及它们的亚型，包括但不限于所有NRG-1的亚型，NRG-2的亚型，NRG-3的亚型和NRG-4的亚型。NRG-1在美国专利No.5530109，5716930，7037888；Lemke，Mol.Cell.Neurosci.1996，7：247-262；Peles和Yarden，1993，BioEssays15：815-824；Peles等，1992，Science 256：1205-1210；Falls等，1993，Cell 72：801-815；Marchionni等，1993，Nature 362：312-318等文献中有记载。NRG-2在Chang等，1997，Nature 387：509-512；Carraway等，1997，Nature 387：512-516；Higashiyama等，1997，J Biochem，122：675-680；Busfield等，1997，Mol Cell Biol 17：4007-4014以及PCT专利申请WO97/09425等文献中有记载。NRG-3在Hijazi等，1998，Int J Oncol 13：1061-1067中有记载。NRG-4在Harari等，1999，Oncogene18：2681-2689中有记载。上述文献的内容均以参考文献的形式结合到此处。
本发明所用NRG还包括NRG突变体或衍生物，与野生型NRG相比其具有一个或多个氨基酸的替换、删除或插入。优选的，氨基酸替换、删除或插入的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施方案中，该NRG衍生物在氨基末端或羧基末端含有一个或多个氨基酸替换、删除或插入。在另一个实施方案中，该NRG衍生物在全长范围内的任意位置含有一个或多个氨基酸替换、删除或插入。
在一些实施方案中，氨基酸的替换可以是保守性或非保守性氨基酸的替换。保守性氨基酸替换是根据氨基酸残基的极性、电荷、可溶性、亲水性、疏水性和/或双亲性的性质为根据。比如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、络氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；正电性(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电性(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守性的氨基酸替换则是指上述不同类别的氨基酸替换。
在一些实施方案中，NRG衍生物含有的保守性氨基酸替换不实质性地影响其生物学功能。本技术领域内的技术人员熟知如何适当地进行保守性氨基酸替换并一般不会造成生物学功能的改变。同时，在多肽的非关键区域的单个氨基酸的替换一般也不实质性地影响生物学功能。(参见Watson等，Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub..co.，p224)。
在一些实施方案中，NRG突变体或衍生物包含非经典氨基酸或氨基酸的化学类似物的替换。非经典氨基酸包括但不受限于氨基酸右旋异构体，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，γ-2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟(基)脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，碘丙氨酸，t-丁基甘氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟代氨基酸，设计氨基酸比如β-甲基氨基酸以及其它氨基酸类似物。
本发明中所用的NRG也包括NRG的同源类似物，即与NRG或其中能结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3受体的结构域具有氨基酸序列同源性和/或结构相似性的多肽。典型的蛋白质同源类似物与该蛋白的氨基酸序列具有至少50％相同性，优选的，至少75％相同性，更为优选的，至少80％，85％，86％，87％，88％或89％，甚至更为优选的至少90％，91％，92％，93％或94％，最优选的，95％，96％，97％，98％或99％相同性。
上文中所述的序列同源性是指相比较的氨基酸序列的氨基酸残基相同(同一位置的氨基酸残基相同)或相似(同一位置的氨基酸残基保守性替换)的比例，为了达到最大程度的同源性，可以在必要的时候插入间隔。在一些实施方案中，NRG的同源类似物是以其与野生型NRG的氨基酸序列相同或相似的比例为特征的。序列同源性，包括序列相同和相似的比例，可以通过本技术领域内熟知的序列对比技术进行测定，最常用的是计算机运算方法，使用计算机软件中默认的参数进行演算。
无穷多的例子运用了计算机运算法则或包含有计算机运算法则的软件包来计算序列的同源性，包括下述例子。BLAST程序家族是一个典型的用于序列比较的数学运算法则(比如Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改良)，Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410(描述NBLAST和XBLAST)，Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(描述Gapped BLAST和PSIBLAST))。另外一个常用的是Myers和Miller所发明的结合于ALIGN程序(2.0版本)的运算法则，同时也可以作为GCG序列对比软件包的一部分。还有一个常用的是FASTA程序(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：2444-2448，1988)，可以作为Wisconsin序列分析软件的一部分。其它还包括Smith和Waterman发明的BESTFIT，运用“局部同源性”的运算法则来寻找两个对比序列中最相似的区域，在两个对比序列的氨基酸长度不同时，该运算法则尤其适用；和GAP，运用Neddleman和Wunsch所发明的运算法则来寻找“最大相似度”，该运算法则在对比序列的氨基酸长度相差无几，且希望进行全长对比的情况下尤其适用。
同源类似物可以是来自其它物种的直系同源物，包括来自动物、植物、酵母、细菌等等的直系同源物，也可以来自比如野生型蛋白的突变。举例来说，同源类似物可以通过定点突变来诱导结合蛋白质相互作用试验来验证。其它的方法比如蛋白亲和层析，亲和印迹，体外结合试验等等，是本领域技术人员熟练掌握的。
为了比较两个不同的核苷酸或多肽序列，本发明所采用的描述方式是待测序列对比于参照序列的相似百分比。当待测序列的氨基酸长度小于参照序列的90％时，采用Myers和Miller的运算法则(Bull.Math.Biol，51：5-37(1989))，具体来说是运用ALIGN程序，采用系统设定参数。
当待测序列的氨基酸长度大于或等于参照序列的90％时，采用Karlin和Altschul的结合于多种BLAST程序的运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-77(1993))。具体来说，同源百分比可以通过“BLAST 2Sequences”工具来计算(参照Tatusova和Madden，FEMSMicrobiol.Lett.，174(2)：247-250(1999))。当比较两个成对的DNA序列的同源性时，可以使用BLASTN 2.1.2程序并且使用系统设定参数(Match：1；Mismatch：-2；Open gap：5penalties；extension gap：2penalties；gap x_dropoff：50；expect：10；and word size：11，with filter)。当比较两个成对的蛋白质序列的同源性时，可以使用BLASTP 2.1.2程序并且使用系统设定参数((Matrix：BLOSUM62；gap open：11；gap extension：1；x_dropoff：15；expect：10.0；andwordsize：3，with filter)。
本发明中所用NRG还包括NRG的EGF样结构域、包含NRG EGF样结构域NRG样基因产物的多肽，其能够结合并激活ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合受体，模拟NRG的功能。EGF样结构域是指与ErbB2，ErbB3，ErbB4或它们的组合物结合，并激活上述受体，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽。关于“EGF样结构域”参见WO 00/64400，Holmes等，Science，256：1205-1210(1992)；美国专利No.5,530,109及5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，13：1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387：509-512(1997)；Carraway等，Nature，387：512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.，122：675-680(1997)以及WO 97/09425。
在一些实施方案中，所用NRG包含NRG-1的EGF样结构域。在一些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1的受体结合区域的氨基酸序列。在一些实施方案中，EGF样结构域包含了NRG-1第177-226、177-237或177-240位氨基酸。
在优选的实施方案中，本发明所用是NRG包含下述氨基酸序列：SerHis LeuVal LysCys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu SerAsn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln(SEQ ID NO：1)，其代表了人NRG-1的第177-237位氨基酸。相应的编码该段多肽的核苷酸序列为：agccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggcgagcttctacaaggcggaggagctgtaccag(SEQ ID NO：2)。
在一些实施方案中，所用NRG包含NRG-2编码的EGF样结构域。在一些实施方案中，所用NRG包含NRG-3编码的EGF样结构域。在一些实施方案中，所用NRG包含NRG-4编码的EGF样结构域。在一些实施方案中，所用NRG包含美国专利No.5,834,229中所述的氨基酸序列：Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys AspLeu Ser Asn Pro。5.3治疗慢性心力衰竭的方法
本发明也提供了为有需要的主体治疗慢性心力衰竭的方法，包括使该主体摄入有效量的NRG。在一些实施方案中，NRG以0.2μg/ml/kg/hour的量给药6小时。NRG的给药量可以根据疾病的本质、严重程度，以及给药途径的不同有所变化。同样，给药的频率和剂量也可以根据个体病人的特殊因素(比如治疗性或预防性药物的摄入)，疾病的严重程度，给药的途径，以及体重、反应和既往病史等因素而变化。有效的剂量可以根据体外试验或动物模型的剂量-反应曲线推测。值得效仿的NRG的剂量包括每公斤体重毫克级或微克级的NRG(比如，约1微克每公斤体重到约500微克每公斤体重，约100微克每公斤体重到约5毫克每公斤体重，约1微克每公斤体重到50微克每公斤体重)。在本发明中所用的NRG的持续给药方式，一个病人的给药剂量一般是0.001mg/kg到15mg/kg(活性多肽的量/体重)。优选的，给药的剂量介于0.001mg/kg到15mg/kg，0.005mg/kg到10mg/kg，0.01mg/kg到5mg/kg，0.001mg/kg到4mg/kg，0.005mg/kg到3mg/kg，0.01mg/kg到2mg/kg，0.001mg/kg到1mg/kg，0.005mg/kg到0.5mg/kg，0.010mg/kg到0.2mg/kg，0.005mg/kg到0.050mg/kg。
值得效仿的NRG的剂量还包括给予每公斤体重多少活性单位的NRG(比如，约1U每公斤体重到约5000U每公斤体重，约10U每公斤体重到约1000U每公斤体重，或约100U每公斤体重到约500U每公斤体重)。在本发明中所用的NRG的持续给药方式，一个病人的给药剂量一般是10U/kg到1000U/kg(活性多肽的量/体重)。优选的，给药剂量介于1U/kg到10000U/kg，1U/kg到5000U/kg，10U/kg到5000U/kg，10U/kg到1000U/kg，50U/kg到2000U/kg，50U/kg到1000U/kg，50U/kg到500U/kg，100U/kg到1000U/kg，100U/kg到500U/kg，100U/kg到200U/kg。
一般而言，根据本发明中所描述的情况，推荐的NRG每天的用量介于约0.001毫克至约1000毫克之间。特别地，每天的总量应介于0.001毫克到15毫克之间，0.005毫克到10毫克之间，0.01毫克到5毫克之间，0.001毫克到4毫克之间，0.005毫克到3毫克之间，0.01毫克到2毫克之间，0.001毫克到1毫克之间，0.005毫克到0.5毫克之间，0.010毫克到0.2毫克之间。在治疗时，可以从一个较低的剂量开始，比如约0.1微克到约1微克，然后根据需要升高至约20微克到约1000微克每天，可以根据病人的反应情况单次给药或分次给药。如同本技术领域中普通技术人员所知的一样，在某些情况下需要使用的NRG的剂量可能在本发明所公开的剂量范围之外。另外，临床医生应当知道如何根据病人的反应来干预、调整或终止治疗。在一些实施方案中，NRG的给药量为约1U每天到约10000U每天。在一些实施方案中，NRG的给药量为约1U每天到约5000U每天。在一些实施方案中，NRG的给药量为约10U每天到约2000U每天。在一些实施方案中，NRG的给药量为约10U每天到约1000U每天。在一些实施方案中，NRG的给药量为约100U每天到约200U每天。
NRG也可以按照疗程给药。疗程中每天的给药量参见以上描述。疗程可以持续2天，5天，7天，10天，2周，3周，4周，5周或6周。
在一些实施方案中，疗程中的每一天都给药。在一些实施方案中，在一个疗程中连续给药3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。
在一些实施方案中，在疗程的第一天开始给药，并且在整个疗程中有一天或多天没有给药。在一些实施方案的疗程中，在连续给药3天、5天、7天或10天后有一段时间的停药期。5.3.1联合治疗
在一个实施方案中，本发明可以用于预防心力衰竭和心肌病的发生，目标人群为使用可以导致心脏肥大或心衰的药物的病人，比如使用醋酸氟氢可的松或何塞亭的病人。NRG可以在使用这些药物之前、同时或在使用这些药物后给药。
在本发明的另一个实施方案中，NRG可以与有效量的其它能够抑制心脏肥大的化合物联合使用，该化合物抑制心脏肥大的机制不同于NRG。在另一个实施方案中，NRG可以与这种心脏肥大抑制剂和/或其它物质联合使用，在治疗充血性心力衰竭时联合使用的药物包括但不限于心肌营养抑制剂比如心肌营养素拮抗剂，血管紧张素转换酶抑制剂比如卡托普利
Figure GPA00001045766400101
人生长激素，胰岛素样生长因子，在治疗其它类型的心衰或心脏疾病时可以联合使用的药物包括但不限于其它抑制肥大的药物，心肌营养因子，抗心率失常药物或正性肌力药物。
在另一个实施方案中，NRG与现行的心衰治疗方案联合使用，包括但不限于ACEI和其它扩血管药物，利尿剂，洋地黄类药物，β阻滞剂，血液化稠剂，血管紧张素受体阻断剂，钙通道阻断剂或钾剂。
ACEI，防止血管紧张素I向血管紧张素II转化，是一种血管扩张剂，使得血管扩张，血压降低并减小心脏的工作负担。适用于本发明的血管扩张剂包括但不限于以下药物：喹那普利
Figure GPA00001045766400102
雷米普利
Figure GPA00001045766400103
卡托普利
Figure GPA00001045766400104
贝那普利
Figure GPA00001045766400105
福辛普利
Figure GPA00001045766400106
赖诺普利(
Figure GPA00001045766400107
或
Figure GPA00001045766400108
)，依那普利
Figure GPA00001045766400109
莫西普利
Figure GPA000010457664001010
群多普利和培哚普利。本发明中可用的其它血管扩张剂包括但不限于硝酸异山梨酯
Figure GPA000010457664001011
奈西利肽
Figure GPA000010457664001012
肼屈嗪
Figure GPA000010457664001013
硝酸酯类和米诺地尔。
利尿剂导致从肾脏排除水和钠，较小心脏工作负担。包括但不限于下列药物：氢氯噻嗪
Figure GPA00001045766400111
氯噻嗪
Figure GPA00001045766400112
呋塞米
Figure GPA00001045766400113
布美他尼
Figure GPA00001045766400114
螺内酯氨苯蝶啶
Figure GPA00001045766400116
美托拉宗
Figure GPA00001045766400117
托塞米，吲哒帕胺，泊利噻嗪，阿米洛利和联合药物
Figure GPA00001045766400118
洋地黄类药物增强心脏收缩力，包括但不限于，地高辛
Figure GPA00001045766400119
和洋地黄毒苷。
β阻滞剂减少心脏搏动增快的倾向，包括但不限于下列药物；卡维地洛美托洛尔(
Figure GPA000010457664001111
或
Figure GPA000010457664001112
)，阿替洛尔，比索洛尔，拉贝洛尔，普萘洛尔，索他洛尔，吲哚洛尔，喷布洛尔，醋丁洛尔，噻吗洛尔，纳多洛尔和倍他洛尔。
本发明可用的血液化稠剂包括但不限于华法林
Figure GPA000010457664001113
和肝素。
本发明的实施方案也可以使用血管紧张素II受体阻断剂，其不像ACEI那样降低血管紧张素II的水平，而是防止血管紧张素II作用于心脏和血管。可以用于本发明的血管紧张素II受体阻断剂包括但不限于洛沙坦
Figure GPA000010457664001114
缬沙坦
Figure GPA000010457664001115
厄贝沙坦
Figure GPA000010457664001116
坎地沙坦，依普沙坦，替米沙坦和奥美沙坦。
钙通道阻断剂一般用来治疗高血压，后者往往与心衰联系起来。适用于本发明的钙通道阻断剂包括但不限于阿洛地平
Figure GPA000010457664001117
在本发明的其它实施方案中，NRG也可以与治疗心脏疾病比如高血压的药物联合使用。比如，NRG可以与内皮素受体拮抗剂，比如针对内皮素受体的抗体，多肽或其它小分子拮抗剂；3-肾上腺素受体拮抗剂比如卡维地洛；x-肾上腺素受体拮抗剂；抗氧化剂；多功能化合物；卡维地洛样化合物；生长因子等。
NRG激动剂单独或与其它抑制心脏肥大物质的激动剂或已知的诱导肥大通路的拮抗剂联合，可以用于治疗哺乳动物心力衰竭，也可以用于预防或减轻心衰症状。
将符合纯度求的治疗心脏疾病的激动剂与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合后制成可储存形式的药物制剂，比如冻干剂或水针剂。(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在其使用剂量或浓度时对受者没有毒性，并且包含缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化物质包括抗坏血酸；低分子多肽(小于10个氨基酸残基)；蛋白比如血清白蛋白，凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸比如甘氨酸、谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖或其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或白糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子例如钠；非离子性的表面活性剂例如吐温、普朗尼克或聚乙二醇。拮抗剂同样可以与非蛋白聚体相连接，比如聚乙二醇、聚丙二醇或聚烃基乙二醇，可以参考美国专利No.4640835，4496689，4301144，4670417，4791192或4179337。在制剂中载体所用的量可以是(重量)1％到99％，优选的是80％到99％，最佳的是90％到99％。
用于体内使用的激动剂需要灭菌。可以通过本技术领域中已知的方法进行灭菌，比如在冻干前或重悬后用除菌滤膜进行过滤。激动剂一般以冻干形式或溶液形式进行保存。
治疗性的激动剂组合物一般被放置于有无菌入口的容器中，比如有一个可被皮下注射针穿刺的瓶塞的静脉溶液包或小瓶。激动剂的给药可以用以下方式进行长期给药：静脉注射或输液，腹腔给药，颅内给药，肌肉给药，眼内给药，动脉内给药或病灶局部给药，口服给药或使用上面所述的缓释系统给药。
如同上面所述，合适的缓释制剂包括半透性的内含蛋白质的疏水聚合物基质，该基质可以是薄片或微囊等形状。缓释基质的例子包括聚脂纤维、水凝胶(比如Langer等在JBiomed Mater Res 1981，15：167-277和Langer在Chem Tech 1982，12：98-105中描述的聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯，或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3773919和欧洲专利58481)、左旋谷氨酸和γ-乙基-左旋谷氨酸盐的共聚物(Langer等，Biopolymers 1983，22：547-556)、不可降解性乙烯醋酸乙烯酯(Langer等J Biomed Mater Res 1981，15：167-277)、可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物比如Lupron DepotTM(包含乳酸-乙醇酸共聚物和利普安的注射性微球)以及聚羟基丁酸酯(欧洲专利133988)。
激动剂还可以通过比如凝结技术或界面聚合技术(比如羟甲基纤维素或凝胶微囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微囊)包裹在微囊中，通过胶体给药系统(比如脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米微囊)或大乳剂给药。这些技术也在上面所述的Remington’sPharmaceutical Sciences中有记载。
一些聚体比如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸聚体可以缓释100天以上，而水凝胶则只能缓释较短时间。当被包裹的物质在体内保留较长时间，它们可能由于体内环境(潮湿、37℃)变性或聚集，并导致生物学功能的丧失以及产生免疫学原性。为了克服这些不足，应当设计合理的策略增加稳定性，比如使用适当的添加剂以及开发特殊的聚合物基质组合物等。
缓释激动剂组合物还包括脂质体包裹激动剂。脂质体包裹激动剂的制备方法为本技术领域中已知，比如德国专利3218121；Epstein等，PNAS 1985，82：3688-3692；Hwang等，PNAS 1980，77：4030-4034；欧洲专利52322、36676、88046、143949、142641；日本专利申请83-118008；美国专利4485045、4544545以及欧洲专利102324。一个缓释剂型的特殊的例子是欧洲专利647449。
在本发明的另一个实施方案中，NRG和其他治疗充血性心力衰竭的药物联合使用，包括ACEI，CT-1抑制剂，人生长因子，IGF-I。临床医生可以酌情考虑这些药物的有效使用量。为了达到最佳的治疗充血性心衰的效果，同时考虑利尿剂或洋地黄类药物的使用，以及高血压和肾脏功能受损等情况，本技术领域内的技术人员知道如何对剂量进行控制和调节。剂量的决定还取决于药物的类型和病人的情况，一般情况下，这些药物的使用剂量和它们在不和激动剂联合使用时的剂量一致，但是在某些情况下需要减少剂量，比如出现副作用的情况，考虑病人的类型和情况，药物和激动剂的类型，以及所有药物的总剂量足够有效治疗疾病的情况。
本技术领域的技术人员可以理解，在不背离本发明宗旨和范围的情况下可以对本发明的具体的实施方案进行一些变化和修改。因而本发明所列举的实施方案，应当被理解为是出于更好地阐明本发明的目的，而非为了限制本发明。5.4试剂盒
本发明还提供了用于移植器官比如心脏保存、灌注或再灌注的试剂盒。该试剂盒包含置于一个或多个容器内的本发明的组合物，还有可能包含其它用于心脏移植的物质。该试剂盒还可以包含针对临床医师或病人的使用该组合物的说明书。6.实施例通过下列实施例进一步阐述本发明。这些实施例是出于让本技术领域内的普通技术人员充分理解如何制造和使用本发明的目的，而非为了限制本发明的范围。我们已经努力确保数据的准确性，但试验的误差仍有可能存在。6.1试验方法6.1.1冠状动脉左前降支结扎和心脏超声
将体重在200±20克范围内的Wistar雄大鼠(来自中国科学院上海动物中心)按照100mg/kg(药物/体重)的比例腹腔注射克他命麻醉剂麻醉。将大鼠颈部和肩部之间的区域褪毛并消毒，小心的在颈前中部的皮肤上切开一个切口，暴露气管。在气管第3到5软骨间用一个18G针头插入导管，拔出针头后，插入一个塑料套管并推入气管1-2cm，并与呼吸机连接固定(SAR-830/P型-吸入流量1ml/100g/次，呼吸频率，60次/分钟)。在胸部左前侧切开另一个口子，钝性分离皮肤以暴露第4、5肋，用肘形蚊式止血钳切断第4肋。上述呼吸机与套管相连并开启，暴露心脏，观察心脏和肺脏状态。撕开心包，辨别左心房和肺动脉圆锥。在它们之间用6/0缝合线结扎冠状动脉左前降支，缝合胸腔，阻塞呼吸机以充盈肺脏。在胸腔气体被慢慢挤出后缝合胸部肌肉和皮肤。在自主呼吸恢复后去除呼吸机。
在结扎手术后14天时用心脏超声(Philips Sonos 7500S4probe)检查大鼠心脏功能，选用射血分数在30％至50％之间的大鼠并将其分组(15只/组)。6.1.2用NRG治疗结扎大鼠
在结扎手术后第15天对大鼠进行称重，计算NRG的用量。对照组大鼠静脉注射0.4ml/100g(体积/体重)载体溶液，每天注射1次，连续5天，间隔2天后继续注射5天。
使用具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的NRG：Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys GluLys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr LeuCys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys AlaGlu Glu Leu Tyr Gln。
如下所述，NRG组在分组后第5天植入渗透泵(ALZET渗透泵2ML1)。每个泵含有2ml NRG溶液(62.5μg NRG)，其中包含933.1活性单位的NRG(每个大鼠约250克体重)，输液速度约18.7活性单位每公斤体重每小时。
7天之后，再用心脏超声的方法检测所有大鼠的心脏功能。之后1天，通过血液动力学参数和解剖情况再次确认大鼠的心脏功能。
植入渗透泵
以下操作在无菌条件下完成。将1mL灭菌蒸馏水和1mL0.9％的灭菌生理盐水连续注射到一小瓶NRG中(993.1单位，62.5微克)，用注射器吸取纽兰格林溶液，给注射器换一个钝的针头，将注射器中的气泡小心挤出。将泵竖直放置，再将针头径直插入到泵的顶部的小开口中，轻轻推动活塞将纽兰格林溶液加入到泵中，直到有液体从泵中过量流出。随后拿去针头，并将泵擦拭干净。将流速调制器的白色帽子取下，露出一段短的不锈的铁管，将铁管插入到一个5厘米长的PE60管子的一端，注射器针头插入到另一端，推动活塞将纽兰格林液体加入到流速控制器中直到它满了为止。接下来将流速控制器的长管插入到插入到泵中，直到它白色的边缘结合到泵上。将针从流速控制器上取出，将泵放入灭菌的0.9％的生理盐水中37℃过夜。
用克他命麻醉大鼠(如上所述)。将颈部和肩部之间的皮肤褪毛并消毒，用一块消毒的湿布覆盖在大鼠身上。小心的在肩胛骨间的皮肤上切开一个切口，定位并分离颈外静脉。结扎颈外静脉的远心端，用眼科剪在颈外静脉表皮上扎一个洞，并用微镊子扩大，通过这个洞，将连接着透析泵的PE60管向血管中插入2cm。血管的近心端被附着在PE60管子上以固定，再将血管远端和与其靠近的PE60管绑紧以进一步固定管子。用止血钳，在切口和肩胛骨之间钝性分出一条管道，最终通过扩展皮肤在大鼠背上肩胛骨之间区域做成一个口袋。将流速调制器和渗透泵通过之前的管道塞入到口袋中，从而远离切口，最后将切口缝合。大鼠苏醒过来后放回动物房中饲养如初。6.1.3分离大鼠心肌细胞并检测其收缩速度
大鼠用克他命麻醉。快速切除心脏，冲洗后在降主动脉中插入导管。以60厘米水柱的灌注压力连续倒灌心脏。最初用不含钙离子的修饰的Krebs溶液灌注心脏，其组份为：110mM NaCl，2.6mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，2.1mM NaHCO3，11mM葡萄糖和4mM Hepes。该溶液持续冲入氧气，不作再循环。约3分钟之后用含有3.3％胶原酶(Boehringer Mannheim)和胰酶(Sigma)的修饰的Krebs溶液灌注，直到心脏变白变软。将心脏从导管上取下，剪去心房和血管，将心室剪成小片。将心室组织置于新鲜的含有胶原酶的Krebs溶液中慢慢搅动，分散心肌细胞，用一个200μm的尼龙网过滤得到分散的心肌细胞，并用含有25μM钙的修饰的Krebs溶液重悬心肌细胞。在10分钟内逐渐加入原浓度为100mM钙离子溶液最终使得钙离子浓度达到100μM，使得心肌细胞对钙耐受。30分钟后，去除上清，并加入30-50ml Tyrode溶液(137mM NaCl，3.7mM KCl，0.5mM MgCl，11mM葡萄糖，4mM Hepes和1.2mM CaCl2，PH7.4)。细胞在37℃下保存60分钟后可以开始用于试验，并且在分离后的5小时内使用。
含有心肌细胞的Tyrode溶液被等份放置于配有加热平台的灌注小室中，将小室加热到37℃，待心肌细胞贴壁后用37℃的Tyrode溶液灌注。心肌细胞用铂电极以0.5Hz的频率刺激。选用具有明显纹状结构、在起搏前处于静态的心肌细胞用于收缩试验。在测量细胞的基础收缩性时，用一个可变帧率(60-240Hz)的CCD相机，40倍物镜，成像以240Hz频率显示于计算机屏幕(抓帧、同步、获取和分析软件来自IonOptix公司)。以边缘检测技术连续记录心肌细胞的收缩以及收缩舒张速度。6.2实施例2：NRG的心脏舒张效应
正常大鼠分成3组(15只每组)。其中一组为假手术组，作为对照组。其余大鼠以上述冠状动脉结扎的方法制成心梗大鼠模型(MI大鼠)。心梗大鼠也分成两组，15只每组。其中一组用渗透泵给予NRG治疗，另一组给予载体溶液治疗。治疗结束后，取大鼠心脏并分离心肌细胞，测定心肌细胞收缩指数。如图1所示，同载体溶液治疗组相比，NRG治疗组的心肌细胞舒张速度更快。显示NRG有利于心脏的舒张。6.3实施例3：NRG用于移植心脏保存的效应
从正常大鼠分离心脏，分成3组(7个心脏每组)。心脏用Krebs溶液灌注时用心脏超声检测心脏功能。将第1组心脏保存于2℃的Celsior溶液中6小时，第2组保存于2℃的含有14nM NRG的Celsior溶液中6小时，第3组心脏事先用0.1μM Wortmannin处理15分钟，之后再保存于2℃的含有14nM NRG的Celsior溶液中6小时。保存结束后用Krebs溶液灌注并用心脏超声检测心脏功能。其中一些心脏匀浆后用Western Blot检测AKT磷酸化。
表1中记录了心脏功能的检测结果。表1.保存6小时后心脏功能
  组别  主动脉血流(恢复百分比，％)  冠状动脉血流(恢复百分比，％)  心输出量(恢复百分比，％)  心率(恢复百分比，％)
  Celsior   1.2±0.4   1.7±1.1   1.4±0.6   32.2±8.6
  Celsior+NRG   15±7.2   39±11.5   21.2±7.9   75.7±11.7
  Celsior+NRG(Wortmannin预处理)   1.28±0.7   0.79±0.7   1.17±0.7   42.9±7.1
注：表中数据是以保存后的心功能指标同分离心脏后立即检测的心功能指标相比，恢复的百分比表示的。
从表1中可以看出，保存在含有NRG的Celsior溶液中的心脏同保存在不含NRG的Celsior溶液中的心脏相比，前者的心输出量比后者高15.14倍，冠状动脉血流量高22.94倍。显示NRG对移植心脏具有较好的保存作用。因此NRG可以添加至Celsior溶液中保存移植用心脏，有利于心脏功能的保存。
从表1中还可以看出，用Wortmannin预处理完全阻断了NRG的效应。从图2中也可以看到Wortmannin预处理抑制了心脏组织AKT磷酸化。提示Wortmannin通过抑制AKT信号通路阻断NRG对心脏的效应，并且NRG是通过AKT信号通路发挥其对心脏的保护作用。6.4实施例4：用NRG治疗慢性心力衰竭
6例稳定性慢性心衰患者，以0.2μg/kg/hour(剂量/体重/小时)的速度持续静脉给药6小时。通过右心导管和原位气囊漂浮心脏导管检测24小时血流动力学。结果见图3和图4。
从图3中可以看出，病人的平均心输出量从基线时3.7±1.0L/min升高到治疗2小时后的4.8±0.8L/min，升高了29.7％。而从图4中可以看出，系统血管阻力从基线时的1679.3±336.3dynessec-cm-5降低到1199.5±127.6dynessec-cm-5。从上述结果可以看到NRG治疗可以即刻提高慢性心衰患者的心输出量和系统血管阻力。[0102]上述列举的实施例不会限制本发明的保护范围。在没有背离本发明的宗旨和范围的情况下，本技术领域内的技术人员可以对本发明进行调整和改变。因此，本发明的保护范围应当根据权利要求来定义，而不是通过具体的实施例来限定。
序列表
<110>上海泽生科技开发有限公司
<120>神经调节蛋白用于器官保护的方法和组合物
<150>US60/993566
<151>2007-09-12
<160>2
<170>Patentin Version 3.3
<210>1
<211>61
<212>PRT
<213>人类(homo sapiens)
<400>1
Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser
16              20                  25                  30
Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys
31              35                  40                  45
Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr
46              50                  55                  60
Gln
<210>2
<211>183
<212>DNA
<213>人类(homo sapiens)
<400>2
agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc   60
ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt  120
actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac  180
cag                                                                183

Claims (10)

1.一种用于移植心脏器官灌注、保存或再灌注的组合物，包含一种保存溶液和有效量的NRG。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述保存溶液选自Celsior溶液，Krebs-Henseleit溶液，生理盐溶液，University ofWisconsin溶液，St.Thomas II溶液，Collins溶液以及Stanford溶液。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述保存液是Celsior溶液。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述保存液是Krebs-Henseleit溶液。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述NRG包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述NRG的浓度为10-20nM。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述NRG的浓度约为14nM。
8.一种保护移植心脏器官的方法，其特征在于用有效量的NRG接触该器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述NRG包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述NRG的量足以激活AKT信号通路。
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