CN101862316A - 香草酸在预防及治疗辐射损伤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及香草酸在预防及治疗辐射损伤中的新用途。实验证明：香草酸在小于100μg/ml浓度范围内对V79细胞无毒性；在0.2-5μg/ml对⁶⁰C_oγ射线导致V79细胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用；预防性给予100、200mg/kg可剂量依赖的提高⁶⁰C_oγ射线6Gy照射BALB/c小鼠的活存率，说明香草酸可用于预防及治疗辐射损伤。

Description

香草酸在预防及治疗辐射损伤中的用途

技术领域

本发明涉及香草酸在预防及治疗辐射损伤中的用途。

背景技术

高能量辐射能引起细胞损伤和死亡的特点被广泛用于癌症治疗中。而值得重视的是辐射不仅杀伤肿瘤细胞也对正常的细胞造成了损伤，另外一些特殊人群比如辐射仪器操作人员，宇航员，核基地工作人员等都需要避免辐射损伤，意外核事故中受辐射损伤者更需要有效救治，所以多年来各国科学家一直致力于抗辐射药物的研究。对辐射防护剂的研究开始于20世纪早期，主要包括巯基类、维生素类、氨基酸类和抗氧化类等。但由于高效、低毒可供临床应用的辐射防护剂较难发现，人们将注意力转移到了天然药物上，因其易获得，副作用小倍受关注，成为有潜力可挖掘的资源，如单味药人参、刺五加、灵芝和中药复方四物汤、八珍补血汤都有一定的抗辐射效果，因此可以合理的推测中草药中含有的某些化合物能够保护机体免于辐射诱导的机体损伤。

电离辐射使组织和细胞中产生大量活性氧(ROS)，通过直接和间接作用损伤生物大分子(如DNA，蛋白质，脂类等)，引起细胞死亡和机体功能丧失，而酚酸类具有抗氧化作用，可以通过清除自由基发挥辐射防护作用。Abdelhak Mansouri等报道苯甲酸类衍生物比桂皮酸类衍生物具有更强的过氧化氢清除能力，其中以香草酸最有效，IC50是0.59μM。ChannaKeshava等报道香草醛作为食品香料添加剂，具有抗氧化、抗诱变和抑制化学致癌作用，可以降低辐射诱导的V79细胞中微核率和染色体畸变的产生。而香草酸作为香草醛的衍生物，具有抗细菌、抗真菌等作用。。张俏忻等讨论了香草酸能够表现出一定的保护DNA抗氧化活性。本实验室在前期对蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏不同部位抗辐射活性筛选的基础上，得到卷柏水部位通过促进照射后小鼠造血系统恢复，提高免疫力和抗氧化能力而表现出一定的抗辐射作用，提示卷柏中某些天然化合物能够保护机体免于辐射损伤。对卷柏进行化学成分分析及结构鉴定，得到卷柏中含有大量的酚酸类、木脂素类、黄酮类等化合物，而卷柏水部位中以酚酸类化合物居多，现有技术对其中含量丰富、结构简单的香草酸的应用进行了广泛的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供香草酸在预防及治疗辐射损伤的药物中的新用途。

本实验室通过细胞、动物水平对香草酸的抗辐射活性进行反复筛选，实验结果表明香草酸可以抑制⁶⁰C₀γ射线照射导致的V79细胞活力丧失，并能提高⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠的活存率，从而完成了本发明。

本发明中所述“香草酸”可以是植物中提取的单体化合物，也可以是化学合成的香草酸，还可以是含香草酸的提取物。

香草酸可与药学上可接受的载体按本领域已知方法制备成各种药物组合物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等各种固体、液体制剂或贴剂等；或和其他中药单体组合制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于预防及治疗辐射损伤。

本发明具有以下优点：

1、发现了香草酸的新的医疗用途。

2、香草酸作为常用中药卷柏的已知提取物，天然存在于许多植物或有机物质中，来源广，原料易得，用药剂量小，安全性大，药用前景广阔。

3、香草酸可以提高⁶⁰C₀γ射线6Gy全身照射BALB/c小鼠的活存率，这特点有助于将其开发成辐射防护药物，用于预防和治疗辐射损伤，改善患者生存质量。

附图说明

图1香草酸的不同浓度对V79细胞毒性试验

图2V79细胞的辐射剂量毒性试验

图3香草酸对4Gy⁶⁰C₀γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用(24h检测)

图4香草酸对4Gy⁶⁰C₀γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用(48h检测)

图5香草酸预防给药对⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响。

具体实施方式

通过以下实施例来阐述本发明所述药物香草酸体外及体内抗辐射作用进行评价，但并不限于以下途径。这些生物实验中主要包括：1.化合物香草酸细胞毒性检测；2.化合物香草酸对⁶⁰C₀γ射线导致的V79细胞活力丧失的影响；3.化合物香草酸对⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响。

[实施例一]香草酸细胞毒性检测

材料与方法

1.V79细胞培养

V79细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃，5％CO²培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将V79细胞接种96孔板，5×10³细胞/孔，37℃，5％CO²孵育12小时，细胞汇合后进行给药实验，共同孵育24h后，待细胞长至70～80％⁶⁰C₀γ射线照射处理。

2.香草酸对V79细胞增殖的影响

V79细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基中，于37℃，5％CO²培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将V79细胞接种96孔板，5×10³细胞/孔，37℃，5％CO²孵育12小时，细胞汇合后，将化合物香草酸以终浓度15.625μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml分别给药，每浓度3孔，同时设无药物细胞对照和空白对照，37℃，5％CO²培养，48小时观察结果。每孔加入CCK-8工作液10μl，避光，37℃，5％CO²培养2小时，在酶标仪(BIO-RADModel 680)上测定450nm处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。

3.香草酸作用结果的处理与统计

香草酸对V79细胞增殖的影响以不同组别吸光度值OD450表示：＝A450_试验-A450_空白

计算抑制率公式：＝(A450_对照-A450_给药)/(A450_对照-A450_空白)

IC50计算公式：lgIC50＝X_m-I(P-(3-P_m-P_n)/4)

结果用Origin Pro 7.5进行统计分析，与无药物细胞对照组相比：#，P＜0.05；##，P＜0.01。

结果

化合物香草酸以2倍稀释为浓度梯度的7个浓度处理V79细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有明显的变化。实验独立重复三次，CCK-8检测结果见图1；溶剂DMSO、香草酸IC50分别是2.44％、205.12μg/ml；DMSO含量在2％，香草酸浓度在100μg/ml以下时对细胞均没有毒性。

[实施例二]香草酸对⁶⁰C₀γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用

材料与方法

1.V79细胞培养

方法见实施例一

2.香草酸对⁶⁰C₀γ射线导致的V79细胞活力丧失影响的检测

V79细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培养基中，于37℃，5％CO²培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将V79细胞接种96孔板，5×10³细胞/孔，37℃，5％CO²孵育12小时，细胞汇合后，将化合物香草酸以终浓度0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml分别给药，共同孵育24小时后⁶⁰C₀γ射线4Gy照射，剂量率为2.3～2.5Gy/min，同时设无药物细胞对照和空白对照，继续在37℃，5％CO²培养箱中培养，分别在24小时、48小时两个时间点观察结果。每孔加入CCK-8工作液10μl，避光，37℃，5％CO2培养2小时，在酶标仪上(BIO-RAD Model 680)测定450nm处吸光值A。同时在倒置显微镜下每日观察细胞形态。

3.香草酸作用结果的处理与统计

香草酸对⁶⁰C₀γ射线导致V79细胞活力丧失的影响以不同组别吸光度值OD450表示：＝A450_试验-A450_空白

结果用Origin Pro 7.5进行统计分析，与无药物细胞对照组相比：#，P＜0.05；##，P＜0.01；与4Gy组相比：*，P＜0.05；**，P＜0.01。

结果

实验独立重复三次，CCK-8检测结果24h见图2；48h见图3。香草酸在0.2～5μg/ml对⁶⁰C₀γ射线导致V79细胞活力丧失呈剂量依赖的抑制作用。

[实施例三]香草酸对⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响

材料与方法

1.BALB/c小鼠饲养

选用18～22g雄性BALB/c小鼠50只，由军事医学科学院动物实验中心提供(动物合格证号SCXK-(军)2007-004)。小鼠饲养环境温度21℃±2℃，相对湿度50％±10％，12小时灯光12小时黑暗。

2.香草酸对⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响

药物制备：精密称取E523粉末1.5mg，加生理盐水3ml，配置成0.5mg/ml溶液；香草酸粉末60mg、120mg，分别加生理盐水6ml，配置成10mg/ml、20mg/ml的溶液，超声2小时助溶，形成混悬液备用。

动物分组及处理：BALB/c雄性小鼠50只，按体重随机分为模型组(6Gy)、阳性对照组(E523 5mg/kg)，香草酸低剂量组(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)，每组10只，每天定时灌胃蒸馏水或不同浓度药物。除E523组照射⁶⁰C₀γ射线6Gy前24h灌胃一次外，其它各组小鼠均于照射前24h和1h分别灌胃两次，之后每天定时观察、称重、记录各组动物死亡数。

30天活存状况观察：⁶⁰C₀γ射线6Gy照射后BALB/c小鼠体重减轻，皮毛干枯，精神萎靡，行动迟缓，团缩拱背，视力障碍。与模型组相比，各给药组小鼠的上述体征均有所改善。

3.香草酸作用结果的处理与统计

香草酸预防给药对⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影响。结果用OriginPro 7.5进行统计分析。

结果

香草酸预防给药对6Gy照射的BALB/c小鼠30天活存率影响的结果见表1。香草酸预防性给药能够剂量依赖的提高⁶⁰C₀γ射线6Gy一次全身照射BALB/c小鼠的活存率见图4。

表1香草酸预防性给药对⁶⁰C₀γ射线6Gy照射的BALB/c小鼠活存率的影响

与模型组比较：*，P＜0.05；**，P＜0.01。

Claims (3)

1.一种抗辐射作用的药物组合物，含药用载体，特征为：其活性成分为香草酸。

2.根据权力要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物可被配制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等固体制剂；注射剂、口服液等液体制剂或贴剂。

3.香草酸在制备预防及治疗辐射损伤的药物中的应用。

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