CN101862314A - 醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用。本发明所述醌类化合物的结构通式如式(I)所示，其中，R为H或OH。本发明针对当前结核病发病率高、结核杆菌多重耐药菌株的出现，使结核病发病率和死亡率呈上升趋势的现状，根据醌类化合物具有抗结核菌和耐药性结核菌活性的特点，将醌类化合物用于制备抗结核菌药物。本发明醌类化合物来源于海洋微生物，提取简便，成本低廉，用于制备抗结核菌药物，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物应用领域，具体涉及醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用。
背景技术
自从20世纪60是年代从海洋真菌中发现头孢菌素以来，海洋微生物的代谢产物日益成为了药物的丰富来源。根据John教授在1010年《Natural Product Reports》的报道，2008年发现海洋天然产物新化合物首次超过1000种，海洋微生物是主要来源之一(约占23％)。
由于海洋微生物的特殊环境，能代谢结构新颖的化合物，并且具有良好的药理活性，已经发现大量的抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂等活性化合物。此外，海洋微生物易于采集和培养，人工发酵产生的代谢产物比高等生物所含的物质更易提纯，成本更低，符合可持续发展的资源开发原则，所以从中筛选到的活性化合物更利于工业化生产。因此海洋微生物被认为是寻找药理活性物质的新源泉。
近年来全球结核病的发病呈增高趋势，据世界卫生组织(WHO)估计，目前全球受结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中5～10％的感染者成为结核病患者。我国每年出现活动性肺结核病人130万例，其中传染性肺结核约60万例，是全球结核病高负担国家之一。
自抗结核药物相继问世，使结核病的治疗起到划时代的变化。然而由于结核病患者的治疗管理尚不十分规范，不规则化疗，滥用抗结核药物，使结核病耐药情况日益严重，且耐药性的变化更趋向于多种药物同时耐药，这给结核病的防治工作造成极大困难。因此寻找新的抗结核药物，尤其是抗多药耐药性的抗结核药物对保护人民身体健康，具有重要意义。
来源于南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下简称真菌1403)醌类化合物1403B和1403C，其结构式如式(I)
其中：
(1)R＝H时，化合物为1403B。
(2)R＝OH，化合物为1403C。
夏雪奎，中山大学博士学位论文(2007年)和佘志刚，陈省平，林永成等专利，醌类化合物Bostrycin及其制备方法与抗肿瘤应用，申请号：200810028628.3，公开号CN101544556，已经给出了1403B和1403C的提取方法，结构分析方法及其抗肿瘤应用。目前尚未见1403B和1403C具有抗结核活性的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有醌类化合物研究中未发现其具有抗结核活性的报道的现状，提供了醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
本发明醌类化合物可从南海红树林真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养液中提取分离得到。所述醌类化合物的结构通式如式(I)所示，其中，当R为H时，醌类化合物为1403B；当R为OH时，醌类化合物为1403C：
上述醌类化合物制备方法的具体步骤如下：
(1)真菌Halorosellinia sp.1403(CCTCC NO：M 201018)的种子培养：
培养基按重量比为：葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，琼脂1～1.5，氯化钠3～5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培养5-7天；
(2)真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养：
发酵培养基按重量比为：葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化钠3～5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25～35℃静置1～2个月；
(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体得到培养液；
(4)真菌的培养液加热浓缩(温度不超过50℃)至原液体积的1/20～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；
(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集30～80％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，45％乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403B，65％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403C。
发明人先用卡介苗做应试菌株，采用纸片扩散法对1403B和1403C的抗结核菌活性进行初步试验，根据初步试验的结果，本发明再用固体培养基稀释法测定了该化合物对卡介苗、结核分枝杆菌标准株H37Rv株和耐多药结核分枝杆菌(MDR MTB)三种结核菌的最小抑菌浓度，实验结果证实1403B和1403C具有很强的抗结核菌和抗耐药性结核菌活性，可作为治疗结核菌感染疾病的先导化合物，也可用于制备治疗结核病药物。
当R为H时，对卡介苗的最小抑菌浓度为20μg/mL；当R为OH时，对卡介苗的最小抑菌浓度为39μg/mL。
当R为H时，对结核分枝杆菌标准株H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的最小抑菌浓度为小于7.5μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌标准株H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的最小抑菌浓度为小于7.5μg/mL。
当R为H时，对耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis(MDR MTB))的最小抑菌浓度为小于5μg/mL；当R为OH时，对耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis(MDR MTB))的最小抑菌浓度为小于5μg/mL。
当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株(INH，异烟肼Isoniazid)的最小抑菌浓度为小于15μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株(INH，异烟肼Isoniazid)的最小抑菌浓度为小于30μg/mL。
当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株(耐SM(硫酸链霉素Streptomycin Sulfate)和EMB(乙胺丁醇Ethambutol))的最小抑菌浓度为小于5μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株(耐SM(硫酸链霉素Streptomycin Sulfate)和EMB(乙胺丁醇Ethambutol))的最小抑菌浓度为小于10μg/mL。
当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)的最小抑菌浓度为小于10μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)的最小抑菌浓度为小于15μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种可用于抗结核病治疗的醌类化合物1403B和1403C，从而扩大了抗结核菌药物的种类；
(2)针对目前结核病发病率高、结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现，使结核病发病率和死亡率呈上升趋势的现状，本发明发现1403B和1403C具有抗结核菌和耐药性结核菌活性的特点，可用于抗结核药物的制备，具有非常广阔的应用前景；
(3)1403B和1403C来源于海洋红树林内生真菌，从真菌中提取化合物的方法简单，而优化培养方法将使大量发酵生产本化合物的成本低廉。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 1403B和1403C的制备
本发明的醌类化合物1403B和1403C，可从海洋真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养液中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下：
(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；
(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；
(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体得到培养液；
(4)真菌的培养液加热浓缩(温度不超过50℃)至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；
(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集20％-100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，50％乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403B，70％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403C。
1403C 的试验数据：
红色颗粒状晶体，mp 232℃.FABMS：337(M+1)，m/z：55.EA(w/％，)：C56.56，H 4.617。计算直(C16H16O8)：C 57.14，H 4.76，IRv/cm-1(KBr)：3514，3479，3374，3029，2987，2938，2896，1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200，1208，1138，1082，997，948，864，821，632，554，491.1HNMR(500Mz，CDCl3，TMS.)：13.35(s，OH-9)，12.62(s，OH-10)，6.46(s，H-3)，4.77(t，4.5，4.5Hz，H-7，OH)，3.92(s，CH3-16)，3.54(t，4.5，4.5Hz，H-5)，2.74(d，18Hz，H-8a)，2.67(d，18Hz，H-8b)，1.24(s，CH3-15).13CNMR(CDCl3)：183.3(C-4)，176.5(C-1)，160.9(C-10)，160.9(C-2)，160.2(C-9)，139.5(C-11)，136.8(C-12)，109.8(C-14)，109.6(C-3)，107.3(C-13)，76.3(C-7)，69.2(C-6)，68.2(C-5)，56.8(C-16)，34.8(C-8)，25.5(C-15).
1403B的试验数据：红色粒状晶体，mp 222-225℃。FABMS m/z 321[M+1]+。1HNMR(DMSO-d6，500MHz)δH 13.20(1H，s)，12.67(1H，s)，6.43(1H，s)，4.71(1H，dd，2.5，5.0)，4.38(1H，d，2.5)，3.92(3H，s)，3.62(1H，m)，1.19(3H，s)；13CNMR(DMSO-d6，125MHz)δC 184.3(C)，183.0(C)，175.9(C)，161.7(C)，160.3(C)，138.8(C)，136.4(C)，109.4(CH)，109.0(C)，106.8(C)，70.1(CH)，68.8(C)，56.8(CH3)，35.5(CH2)，29.9(CH2)，25.2(CH3)。
实施例2 固体培养基稀释法测定1403B和1403C抗卡介苗(BCG)绝对浓度
从斜面上刮取卡介苗培养物，加入到3ml Middlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的卡介苗(BCG)菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟、冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C，浓度分别为60μg/mL，40μg/mL，30μg/mL，20μg/mL，15μg/mL，10μg/mL，7.5μg/mL，5μg/mL等的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的卡介苗(BCG)菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
本实施例中所用Middlebrook 7H9肉汤培养基和Middlebrook 7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。
实施例3 固体培养基稀释法测定1403B和1403C抗结核分枝杆菌标准株H37Rv株绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌标准株H37Rv株培养物，加入到3mlMiddlebrook 7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的H37Rv株菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基中(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟，并冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C分别为60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL等浓度的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的H37Rv株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
实施例4 固体培养基稀释法测定 绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISRE MTB株(耐异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇结核分枝杆菌临床分离株)培养物，加入到3ml Middlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基中(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟，并冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C，浓度分别为60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL等的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISRE MTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
实施例5 固体培养基稀释法测定1403B和1403C抗结核分枝杆菌临床分离株(INH，异烟肼Isoniazid)绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离株(INH，异烟肼Isoniazid)培养物，加入到3ml Middlebrook 7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基中(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟，并冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C，浓度分别为60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL等的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的结核分枝杆菌临床分离株(INH，异烟肼Isoniazid)菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
实施例6 固体培养基稀释法测定1403B和1403C结核分枝杆菌临床分离株(耐SM(硫酸链霉素Streptomycin Sulfate)和EMB(乙胺丁醇Ethambutol))绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离株(耐SM和EMB)培养物，加入到3ml Middlebrook 7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基中(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟，并冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C，浓度分别为60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL等的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的结核分枝杆菌临床分离株(耐SM和EMB)菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
实施例7 固体培养基稀释法测定1403B和1403C结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)绝对浓度
从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)培养物，加入到3mlMiddlebrook 7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarland No.1)比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
将1403B和1403C分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5％的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的1403B和1403C按所需剂量加入到4ml Middlebrook 7H11琼脂培养基中(该培养基已经121℃高压蒸汽灭菌15分钟，并冷却至50～55℃)，混匀，制成含1403B和1403C，浓度分别为60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL等的斜面培养基。
将浓度为1mg/ml的结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含1403B和1403C系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37℃培养4～8周，观察实验结果，结果如表1所示。
表1 固体培养基稀释法测定1403B和1403C抗结核菌绝对浓度结果
Claims (8)
1.醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述醌类化合物的应用，其特征在于所述醌类化合物的结构通式如式(I)所示，其中，R为H或OH：
3.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对卡介苗的最小抑菌浓度为20μg/mL；当R为OH时，对卡介苗的最小抑菌浓度为39μg/mL。
4.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最小抑菌浓度为小于7.5μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最小抑菌浓度为小于7.5μg/mL。
5.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对耐多药结核分枝杆菌的最小抑菌浓度为小于5μg/mL；当R为OH时，对耐多药结核分枝杆菌的最小抑菌浓度为小于5μg/mL。
6.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度为小于15μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度为小于30μg/mL。
7.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株和EMB的最小抑菌浓度为小于5μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株和EMB的最小抑菌浓度为小于10μg/mL。
8.根据权利要求2所述醌类化合物的应用，其特征在于当R为H时，对结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)的最小抑菌浓度为小于10μg/mL；当R为OH时，对结核分枝杆菌临床分离株(敏感株)的最小抑菌浓度为小于15μg/mL。
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