CN103435457A

CN103435457A - 一种从发酵液中分离纯化1403b的方法

Info

Publication number: CN103435457A
Application number: CN2013103300268A
Authority: CN
Inventors: 那可; 赵文杰; 赵波; 刘永双; 魏晓东; 马川川; 张守雨
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: CN103435457B

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离纯化1403B的方法。所述方法包括步骤：（1）将1403B的发酵液和有机溶剂或其水溶液混合、抽提，得到抽提液；（2）使抽提液经大孔吸附树脂吸附，用有机溶剂或其水溶液解吸，得到解吸液；（3）使解吸液经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂或其水溶液洗脱，得到1403B馏分。

Description

一种从发酵液中分离纯化1403B的方法

技术领域

本发明涉及发酵液的分离纯化，尤其涉及一种从发酵液中分离纯化1403B的方法。

背景技术

1403B是从海洋红树林内生真菌Halorosenia sp.1403（CCTCC NO.201018）的发酵液中分离得到的蒽醌类天然产物。经活性测试发现其具有较好的抗结核菌活性（佘志刚，林永成等.醌类化合物在制备抗结核菌药物中的应用.ZL201010204766.3），该化合物能用于开发抗结核药物，应用前景广阔。

目前已报道的分离纯化方法主要为萃取--硅胶、聚酰胺层析--重结晶的方法，如专利ZL201010204766.3报道：将发酵液固液分离后除去菌体，上清液加热浓缩至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯反复萃取、浓缩，浓缩物在硅胶柱中进行层析分离，用石油醚/乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，收集30%--80%乙酸乙酯/石油醚部分，浓缩后再经聚酰胺柱层析，45%乙酸乙酯/石油醚洗脱，重结晶纯化，得到红色颗粒状1403B晶体。

文献报道的分离纯化方法存在一些缺点：操作较为繁琐；有机溶剂用量大、挥发性强、毒性较大、对环境有污染且安全性差；所用层析介质易污染、重复使用次数少等。上述缺点不利于1403B的规模化制备。

因此，本领域迫切需要提供一种从红树林内生真菌Halorosenia sp.1403（CCTCC NO.201018）的发酵液中分离纯化天然产物1403B的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种从发酵液中分离纯化1403B的方法。

本发明提供了一种从发酵液中分离纯化1403B的方法，所述方法包括步骤：

（1）将1403B的发酵液和有机溶剂或其水溶液混合、抽提，得到抽提液；

（2）使抽提液经大孔吸附树脂吸附，用有机溶剂或其水溶液解吸，得到解吸液；和

（3）使解吸液经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂或其水溶液洗脱，得到1403B馏分。

在另一优选例中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物填料；

较佳地，所述非极性大孔吸附树脂骨架选自苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸脂；更佳地为苯乙烯-二乙烯苯；

较佳地所述的非极性聚合物填料的骨架选自苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸脂；更佳地为苯乙烯-二乙烯苯。

在另一优选例中，所述大孔聚合物填料粒径为4-100μm；更优选4-30μm。

在另一优选例中，步骤（2）中所述有机溶剂或其水溶液的pH为10.0-13.0；更优选pH12.5-13.0。

在另一优选例中，步骤（3）中使pH为2.0-5.0的解吸液经大孔聚合物填料吸附；更优选pH2.0-4.0。

在另一优选例中，所述有机溶剂选自醇类、酮类或腈类；更优选醇类；最优选C1-C4醇。

在另一优选例中，步骤（1）中将1403B的发酵液和有机溶剂或其水溶液混合后，所述有机溶剂在混合物中的体积比为20%-90%（更优选30%-90%），并且混合液的pH为1.0-4.0（更优选pH1.0-2.5）。

在另一优选例中，步骤（1）中在室温-80℃进行抽提；更优选70-80℃。

在另一优选例中，步骤（2）中用于解吸的有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积比为30%-75%；更优选30%-55%。

在另一优选例中，步骤（3）中用于洗脱的有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积比为30%-75%。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：将1403B馏分浓缩、析晶，得到1403B晶体。

据此，本发明提供了一种从红树林内生真菌Halorosenia sp.1403（CCTCCNO.201018）的发酵液中分离纯化天然产物1403B的方法。

附图说明

图1显示了实施例1分离纯化得到的1403B的质谱测定结果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现将1403B发酵液经过有机溶剂抽提、大孔吸附树脂的富集、大孔聚合物填料层析和结晶，可以得到高纯度的1403B。

如本文所用，“1403B”是指分子式为C₁₆H₁₆O₇的物质，其结构式为：

如本文所用，“1403B发酵液”是指能够产生1403B的菌体的发酵液，所述能够产生1403B的菌体可以是本领域通常使用的，例如但不限于，由红树林内生真菌Halorosellinia sp.1403经培养后获得，该发酵液的制备方法已公开在专利201010179396.2、200910199117.6、201010204766.3以及文献“中国南海红树内生真菌No.1403次级代谢物的研究”、“七种南海海洋真菌和放线菌代谢产物的研究”中。Halorosellinia sp.1403的菌种在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）有保藏，保藏号：M201018。

如本文所用，“室温”是指15-30℃，优选20-25℃。

具体地，本发明提供的从发酵液中分离纯化1403B的方法包括步骤：

第一步，将1403B的发酵液同极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合溶液混合，调节pH至酸性，抽提，固液分离得到含有1403B的澄清抽提液；

第二步，将第一步所得的抽提液用大孔吸附树脂吸附，用极性有机溶剂的碱性溶液或极性有机溶剂溶液与水的碱性混合溶液解吸，收集解吸液；

第三步，调节解吸液的pH至酸性，用小粒径的大孔聚合物填料进行层析，用极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合溶液进行洗脱，收集1403B馏分。

上述的方法中，以所述的极性有机溶剂和水的混合溶液的总体积计，其中的极性有机溶剂的体积百分比在0%-100%（不包括端点值）范围内；所述的极性有机溶剂包括醇类、酮类、腈类等。较佳地为醇类，优选低级醇。所述的低级醇是指C1-C4醇，可以为甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇。

上述第一步中，将1403B的发酵液同极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合溶液混合时，以得到的混合物的总体积计，其中的极性有机溶剂的体积百分比为20%-90%，优选30%-90%，最优选30%。

上述第一步中，调节pH至pH为1.0－4.0，优选pH为1.0-2.5，最优选pH为2.5。

在本发明的一个优选实施例中，上述第一步中，调节pH至酸性后，搅拌混合抽提，使1403B全部释放并溶解于液相中，可以采取升温的方法促进该过程，如室温至80℃，较佳地为25℃－80℃，更佳地为70-80℃，最佳地为70℃。

上述第一步中所述的固液分离可以采用本领域常规的方法，例如但不限于，离心、抽滤、微滤。

上述第二步中涉及的大孔吸附树脂，为非极性大孔吸附树脂，其树脂骨架优选苯乙烯－二乙烯苯或甲基丙烯酸脂，最优选苯乙烯－二乙烯苯。在本发明的具体实施方式中，所述的大孔吸附树脂可以为Amberlite XAD1600N、NM100、DIAION HP20、DIAION SP207、Amberchrome CG161c、Amberlite XAD7HP等。

上述第二步中，所述的用于解吸的极性有机溶剂的碱性溶液或极性有机溶剂溶液与水的碱性混合溶液的pH为10.0－13.0，优选pH为12.5-13.0，最优选pH为12.5；以所述的用于解吸的溶液的总体积计，其中含有的极性有机溶剂体积百分比为30％－75％，优选为30%-55%，最优选为55％。

上述第三步中，调节解吸液的pH至2.0－5.0，优选pH2.0-4.0，最优选pH4.0。

上述第三步中，所述的小粒径的大孔聚合物填料，为非极性大孔聚合物填料，其骨架优选苯乙烯－二乙烯苯或甲基丙烯酸脂，更优选苯乙烯－二乙烯苯；所述的小粒径聚合物填料的粒径范围为4μm－100μm，优选4μm-30μm，更优选30μm粒径的聚合物填料。在本发明的具体实施方式中，所述小粒径的大孔聚合物层析填料可以为MCIGEL CHP20ss、MCIGEL CHP20P、MCIGELCHP10M、MCIGEL CHP20Y、Uni PS30－300、Uni PS40－300、Uni PS10－100、Amberchrome CG161m、Amberchrome CG161s、MCIGEL CHP2MGY等。

上述第三步中，以用于洗脱的溶液的总体积计，其中的极性有机溶剂的体积百分比为30％－75％，优选55％。

上述方法中还可以包括第四步，将收集的1403B馏分浓缩析晶，得到红色1403B晶体。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的分离纯化方法操作步骤少。

2、本发明提供的分离纯化方法有机溶剂用量小、挥发性弱、毒性较低，对环境的污染小，操作安全性较高。

3、本发明提供的分离纯化方法中涉及的分离介质化学稳定性高，耐污染，重复使用次数多。

4、本发明提供的分离纯化方法更有利于工业化放大以及规模化的制备。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

在本实施方式中，发酵液的获得按如下方式进行。

菌种：Halorosellinia sp.1403，CCTCC NO：M201018。

斜面培养基：葡萄糖5-15g；酵母粉0.5-1.5g；蛋白胨1-3g；氯化钠30-50g；水1000mL；琼脂15－20g。

种子培养基：葡萄糖5-15g；酵母粉0.5-1.5g；蛋白胨1-3g；氯化钠30-50g水1000mL。

发酵培养基：葡萄糖5-15g；酵母粉0.5-4g；蛋白胨0.5-4g；氯化钠30-50；水1000mL。

培养方法：

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经高温灭菌的种子培养基，培养后接入同样经过高温灭菌的发酵培养基，培养温度25-30℃，培养时间72-144小时。

本发明中1403B的浓度以及纯度测定采用HPLC法，色谱条件如下：

色谱柱：反相C₁₈色谱柱，260mm×4.6mm

流速：1mL/min

进样量：15　L

柱温：26℃

检测波长：280nm

A溶液：1%乙酸：水溶液（V：V）

B溶液：甲醇

洗脱方法：

洗脱时间(min)	A溶液百分比(％)
		0	70
10	50
		20	20
25	20

实施例1

发酵结束后收集发酵液共12L，1403B浓度为50mg/L，加入乙醇使混合液中乙醇体积百分含量达到30％。用盐酸调节混合液pH至2.5，70℃下恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液。抽提液经过100mL Amberchrome CG161c的树脂床，然后用pH12.5的55％乙醇水溶液（NaOH调）解吸。收集解吸液，用盐酸调节pH至4.0后，溶液经过400ml Uni PS30－300柱床，而后用55％的乙醇水溶液洗脱，收集1403B的馏分，合并后真空浓缩，静置析晶，过滤、洗涤、真空干燥，得到红色的1403B晶体180mg（其MS图谱如图1所示），重量纯度为99.7％。

实施例2

发酵结束后收集发酵液共13L，1403B浓度为48mg/L，加入甲醇使混合液中甲醇体积百分含量达到30％。用硫酸调节混合液pH至2.5，70℃下恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液。抽提液经过100mL Amberchrome CG161c的树脂床，然后用pH12.5的55％甲醇水溶液（KOH调）解吸。收集解吸液，用硫酸调节pH至4.0后，溶液经过400ml Uni PS30－300柱床，而后用55％的甲醇水溶液洗脱，收集1403B的馏分，合并后真空浓缩，静置析晶，过滤、洗涤、真空干燥，得到红色的1403B晶体165mg，重量纯度为96.3％。

实施例3

发酵结束后收集发酵液共10L，1403B浓度为58mg/L，加入异丙醇使混合液中异丙醇体积百分含量达到30％。用磷酸调节混合液pH至2.5，70℃下恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液。抽提液经过100mL AmberchromeCG161c的树脂床，然后用pH12.5的55％异丙醇水溶液（Na₃PO₄调）解吸。收集解吸液，用磷酸调节pH至4.0后，溶液经过400ml Uni PS30－300柱床，而后用55％的异丙醇水溶液洗脱，收集1403B的馏分，合并后真空浓缩，静置析晶，过滤、洗涤、真空干燥，得到红色的1403B晶体170mg，重量纯度为95.2％。

实施例4

发酵结束后收集发酵液共12L，1403B浓度为52mg/L，加入丙酮使混合液中丙酮体积百分含量达到30％。用盐酸调节混合液pH至2.5，70℃下恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液。抽提液经过100mL Amberchrome CG161c的树脂床，然后用pH12.5的55％丙酮水溶液（氨水调）解吸。收集解吸液，盐酸调节pH至4.0后，溶液经过400ml Uni PS30－300柱床，而后用55％的丙酮水溶液洗脱，收集1403B的馏分，合并后真空浓缩，静置析晶，过滤、洗涤、真空干燥，得到红色的1403B晶体139mg，重量纯度为94.7％。

实施例5

发酵结束后收集发酵液共11L，1403B浓度为55mg/L，加入乙腈使混合液中乙腈体积百分含量达到30％。用硫酸调节混合液pH至2.5，70℃下恒温搅拌0.5小时，抽滤后得到澄清的抽提液。抽提液经过100mL Amberchrome CG161c的树脂床，然后用pH12.5的55％乙腈水溶液（氨水调）解吸。收集解吸液，用硫酸调节pH至4.0后，溶液经过400ml Uni PS30－300柱床，而后用55％的乙腈水溶液洗脱，收集1403B的馏分，合并后真空浓缩，静置析晶，过滤、洗涤、真空干燥，得到红色的1403B晶体173mg，重量纯度为98.2％。

实施例6

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇使混合液中乙醇体积百分含量达到20％。得到红色1403B晶体152mg，重量纯度为98.4%

实施例7

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇使混合液中乙醇体积百分含量达到90％。得到红色1403B晶体45mg，重量纯度为99.3%。

实施例8

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇后，用盐酸调节混合液pH至1。得到红色1403B晶体172mg，重量纯度99.4%。

实施例9

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇后，用盐酸调节混合液pH至4。得到红色1403B晶体144mg，重量纯度98.9%。

实施例10

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇并调节pH后，在室温下搅拌0.5小时。得到红色1403B晶体123mg，重量纯度99.1%。

实施例11

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，向发酵液中加入乙醇并调节pH后，在80℃下搅拌0.5小时。得到红色1403B晶体183mg，重量纯度98.5%。

实施例12

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经过200mL Amberlite XAD1600N的树脂床。得到红色1403B晶体146mg，重量纯度97.5%。

实施例13

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经过150mL DIAION SP207的树脂床。得到红色1403B晶体162mg，重量纯度98.2%。

实施例14

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经过100mL NM100的树脂床。得到红色1403B晶体175mg，重量纯度99.2%。

实施例15

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经过200mL Amberlite XAD7HP的树脂床。得到红色1403B晶体85mg，重量纯度98.6%。

实施例16

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经大孔吸附树脂吸附后，用pH10.0的乙醇溶液解吸。得到红色1403B晶体90mg，重量纯度97.4%。

实施例17

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经大孔吸附树脂吸附后，用pH13.0的乙醇溶液解吸。得到红色1403B晶体157mg，重量纯度98.8%。

实施例18

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经大孔吸附树脂吸附后，解吸剂乙醇体积百分含量为30%。得到红色1403B晶体172mg，重量纯度98.7%。

实施例19

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，抽提液经大孔吸附树脂吸附后，解吸剂乙醇体积百分含量为75%。得到红色1403B晶体152mg，重量纯度96.0%。

实施例20

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，用盐酸调节解吸液的pH至2.0。得到红色1403B晶体178mg，重量纯度99.4%。

实施例21

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，用盐酸调节解吸液的pH至5.0。得到红色1403B晶体156mg，重量纯度97.6%。

实施例22

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析所用聚合物填料为MCIGELCHP2MGY。得到红色1403B晶体89mg，重量纯度95.5%。

实施例23

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析所用聚合物填料为Amberchrom CG161m，其粒径为75μm。得到红色1403B晶体133mg，重量纯度95.5%。

实施例24

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析所用聚合物填料为MCIGELCHP20Y，其粒径为30μm。得到红色1403B晶体180mg，重量纯度99.4%。

实施例25

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析所用聚合物填料为MCIGELCHP10M，其粒径为4μm。得到红色1403B晶体177mg，重量纯度99.6%。

实施例26

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析所用聚合物填料为MCIGELCHP20ss，其粒径为100μm。得到红色1403B晶体166mg，重量纯度96.5%。

实施例27

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析洗脱剂中乙醇体积百分比为30％。得到红色1403B晶体153mg，重量纯度97.7%。

实施例28

其他操作如实施例1，仅不同之处在于，层析洗脱剂中乙醇体积百分比为75％。得到红色1403B晶体130mg，重量纯度95.2%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种从发酵液中分离纯化1403B的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（2）使抽提液经大孔吸附树脂吸附，用有机溶剂或其水溶液解吸，得到解吸液；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物填料。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非极性大孔吸附树脂骨架选自苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸脂；优选苯乙烯-二乙烯苯；所述的非极性聚合物填料的骨架选自苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸脂；优选苯乙烯-二乙烯苯。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料粒径为4-100μm；优选4-30μm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述有机溶剂或其水溶液的pH为10.0-13.0；优选pH12.5-13.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中使pH为2.0-5.0的解吸液经大孔聚合物填料吸附；优选pH2.0-4.0。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自醇类、酮类或腈类；优选醇类；更优选C1-C4醇。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将1403B的发酵液和有机溶剂或其水溶液混合后，所述有机溶剂在混合物中的体积比为20%-90%（优选30%-90%），并且混合液的pH为1.0-4.0（优选pH1.0-2.5）。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中在室温-80℃进行抽提；优选70-80℃。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中用于解吸的有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积比为30%-75%；优选30%-55%。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中用于洗脱的有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积比为30%-75%。

12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：将1403B馏分浓缩、析晶，得到1403B晶体。