CN108949850A - 一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法 - Google Patents

一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法，该方法可以高收率地在线分离鼠李糖脂，获得高纯鼠李糖脂产品，同时解决在发酵过程中的起泡问题。该方法包括以下步骤：1.使用工程菌发酵生产鼠李糖脂时，在发酵过程的中后期向发酵液中一次性加入阴离子交换树脂，继续完成发酵；2.分离树脂和发酵液，树脂用洗脱剂反洗，获得鼠李糖脂水溶液；3.调节鼠李糖脂水溶液pH值，用超滤膜过滤浓缩，冷冻干燥浓缩液，得到鼠李糖脂纯品。

Description

一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法。
技术背景
鼠李糖脂，是一种生物表面活性剂，主要由铜绿假单胞菌在一定的环境下代谢生成，其具有良好的表面活性及界面活性，可以广泛地应用于石化、环境、医药、食品以及农业等领域。鼠李糖脂具有良好的化学和生物特性，随着目前国家在环境保护及修复方面越来越重视，同时由于鼠李糖脂在环境修复方面突出的表现，其需求量与日俱增。
但鼠李糖脂产率低，发酵培养基成分复杂，副产物多，直接导致其提取工艺复杂，成本较高，阻碍了产品的工业化发展。传统的鼠李糖脂提纯方法主要采用离心、酸沉、萃取工艺，提取过程复杂，如果采用有机溶剂萃取不仅影响产品品质、消耗大量有机溶剂而且生产过程存在安全隐患。专利CN103833800A报道使用有机溶剂萃取水相中鼠李糖脂进而进行分离的方法，使用的溶剂可以是乙酸乙酯、丁醇或二乙醚，最终产品纯度仅为75％，并且需要处理大量的废有机溶剂。
鼠李糖脂的生产过程中存在的另一大问题是发泡问题。鼠李糖脂本身是一种表面活性剂，发酵液中成分复杂，随着鼠李糖脂含量的不断累积，发酵罐中的起泡现象会越来越严重，不利于发酵过程的持续进行。普通的物理消泡方法是将泡沫引入溢流罐，待完全消泡后再打回发酵罐，但是增加回路极容易引起染菌；如果加入化学消泡剂，可以明显消泡，但最终产品中残留了消泡剂，影响产品使用效果，降低了产品品质。专利CN103966282B中介绍了一种物理消泡法，将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1-2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1-0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐，该方法虽然可以实现消泡，但增加了一整套消泡体系，包括消泡罐、消泡回路及消泡装置，需要进行压力控制，增加了染菌的可能性与操作的复杂性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种收率高、纯度高，同时减少起泡现象的鼠李糖脂分离纯化方法。
为达到上述目地，本发明采用如下技术方案：
一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法，包含以下步骤：
(1)使用工程菌发酵生产鼠李糖脂时，在发酵过程中向发酵液中一次性加入阴离子交换树脂，继续完成发酵；
(2)分离树脂和发酵液，用洗脱剂反洗树脂，得到鼠李糖脂水溶液；
(3)调节鼠李糖脂水溶液pH值，过滤浓缩，干燥浓缩液，得到鼠李糖脂纯品。
步骤(1)在发酵中后期加入阴离子交换树脂，优选在开始发酵72-96小时后加入；树脂加入后继续发酵96-120小时至发酵终点，上述发酵周期合计为168-216小时。
步骤(1)中阴离子交换树脂为碱性阴离子树脂，优选苯乙烯系弱碱性阴离子树脂；阴离子交换树脂加入体积为发酵液体积的1-10％，优选3-8％。
步骤(1)中树脂加入后控制发酵液的pH值为6.8-7.0。
步骤(2)中树脂与发酵液的分离方式采用沉降或过滤方式；分离后的树脂用2-5倍体积超纯水洗涤1-2次，然后装入树脂交换柱，其树脂装填的长径比为19:1-100:1，优选30:1-50:1。
步骤(2)中树脂洗脱剂为氢氧化钾和/或氢氧化钠的水溶液，浓度为0.1-4wt％，优选0.5-1wt％；洗脱剂用量为待洗脱树脂体积的10-200倍，优选20-50倍，洗脱方式为动态洗脱，洗脱剂体积流速为每分钟0.2-5倍于树脂体积，优选0.5-2倍于树脂体积。
步骤(3)调节鼠李糖脂水溶液pH为7-8。
步骤(3)中使用超滤工艺对鼠李糖脂水溶液进行过滤浓缩，采用截留分子量3k-5k的超滤膜；待超滤截留体积为鼠李糖脂水溶液原体积的1/10-1/5时停止过滤，保留浓缩液。
步骤(3)中使用冷冻干燥方法干燥浓缩液。
采用该方法分离鼠李糖脂，产品回收率大于90％，所获鼠李糖脂为含量大于98％的粉末状高纯品，发酵过程中无明显起泡现象。
本发明的有益效果：
(1)本方法的鼠李糖脂回收率大于90％，所获鼠李糖脂为含量大于98％的粉末状高纯品；
(2)采用在线分离的方法，通过离子交换树脂将产生的鼠李糖脂即时吸附到树脂表面，从根本上解决了发酵过程中的起泡问题，有利于发酵过程的持续进行，与其他物理消泡或化学消泡法相比，该方法操作简单、不引入其他杂质，大大降低了破泡的成本；
(3)与传统使用有机溶剂萃取等方法相比，通过离子交换树脂分离纯化鼠李糖脂的分离过程工艺简单、无复杂设备、不使用有毒有害溶剂、三废量少、绿色环保。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。
发酵罐：容积3L，上海保兴生物设备工程有限公司；树脂：717强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D382弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D301型弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，蓝星集团。
鼠李糖脂含量检测方法为硫酸-蒽酮法，具体操作方法如下：
1)配制蒽酮溶液：取0.2g蒽酮溶于100ml体积分数为80％硫酸中，避光待用，现用现配，不可存放。
2)取0.5mL待测样品于10-15ml具塞刻度试管中，将其置于冰水浴充分冷却，保持冰水浴加入2mL蒽酮溶液，快速混匀(尽量减少反应)，然后沸水浴10min，取出放入冰水浴中冷却至室温，620nm测吸光度。
3)鼠李糖标准曲线：
称取0.1g鼠李糖定容到250mL容量瓶，配置成400mg/L鼠李糖母液，然后按比例稀释得到不同浓度的标样，见下表：
母液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
纯水(mL) 0.5 1.8 1.6 1.4 1.2 1
终浓度(mg/L) 0 40 80 120 160 200
利用蒽酮法测定吸光值，绘制标准曲线。
y＝ax+b
其中y为鼠李糖含量，x为吸光度，最终鼠李糖脂的计算公式为：
鼠李糖脂含量＝反应液中鼠李糖的含量×稀释倍数×3.4。
鼠李糖脂发酵液通过以下工艺制备得到：
摇瓶和发酵罐的发酵培养基配方为：大豆油30g/L、甘油15g/L、硝酸钠5g/L、酵母粉10g/L，KH2PO4 0.5g/L、MgSO4 0.5g/L、ZnSO4·7H2O 0.29g/L、CaCl2·6H2O 0.28g/L、CuSO4·5H2O 0.25g/L、MnSO4·H2O 0.17g/L。按上述配方配制1.5L发酵培养基，121℃灭菌20mins，冷却备用。
平板培养基为LB固体培养基，配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。按上述配方配制25mL平板培养基，121℃灭菌20mins，然后降温至50℃，在超净工作台中倒平板，冷却至室温待用。
工程菌为Pseudomonas sp VTS-1，菌种保藏号：CGMCC2200，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，通过购买获得，将保存在-80℃的菌种Pseudomonas spVTS-1在室温下解冻，取5μL接种在平板培养基上，30℃培养24小时，取100mL已灭菌的摇瓶培养基，从生长24小时平板上转接菌种到摇瓶，200rpm，30℃摇床培养18小时得到种子液。然后按照2％接种量接种到装有1.5L培养基的3L发酵罐中，保持30℃，120vvm通气量，维持pH 7.0发酵。
实施例1
在前述发酵条件下发酵72小时得到发酵中期的发酵液1.5L。向发酵液中加入已经活化好的717强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂75mL，保持pH 7.0不变，继续发酵96小时后结束。
含有树脂的发酵液通过过滤分离，树脂先用375mL去离子水洗涤一次，然后全部装入直径为1cm离子交换柱(树脂对应的长径比为95.5:1)，用3L浓度为1％的NaOH水溶液进行洗脱，流速为75mL/min，收集全部洗脱液，得到2.95L鼠李糖脂水溶液，经过检测，鼠李糖脂含量为11.1g/L。过滤分离树脂后的发酵液未检测到鼠李糖脂。
将鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节pH为7.5，然后用孔径3k的聚醚砜膜进行过滤，过滤压力为1.5公斤(表压)，浓缩至300mL时停止超滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末31g，经过检测鼠李糖脂含量为98.5％。
计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5L，鼠李糖脂含量为22g/L，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为92.5％。
实施例2
维持前述条件下发酵96小时得到发酵中期的发酵液1.5L。向发酵液中加入已经活化好的D382弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂150mL，维持pH6.8继续发酵96小时后结束。
含有树脂的发酵液过滤分离，树脂用750ml去离子水洗涤一次，然后全部装入直径为1.6cm离子交换柱(树脂对应的长径比为46.7:1)，用1.5L浓度为4％KOH水溶液进行洗脱，洗脱流速为30mL/min。收集全部洗脱液，得到1.45L鼠李糖脂水溶液，经过检测，鼠李糖脂含量为22g/L，过滤分离树脂后的发酵液未检测出鼠李糖脂。
将鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节pH为8，然后用孔径5k的聚醚砜卷式超滤膜进行过滤，过滤方式为错流过滤，浓缩液为300mL时停止超滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末30g，经检测鼠李糖脂含量为99.5％。
计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5L，鼠李糖脂含量为22g/L，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为90.5％。
实施例3
在前述条件下发酵96小时，得到发酵中期发酵液1.5L，向发酵液中加入已经活化好的D301型弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂15mL，维持pH为7继续发酵120小时直到发酵结束。
含有树脂的发酵液沉降分离，树脂用30mL去离子水洗涤两次，然后全部装入直径1cm离子交换柱(树脂对应的长径比为19.1:1)，用3L 0.1％KOH和0.1％NaOH混合溶液洗脱，洗脱流速为75mL/min，收集全部洗脱液，得到2.98L溶液，经检测，鼠李糖脂含量为11g/L，过滤分离树脂后的发酵液未检测出鼠李糖脂。
鼠李糖脂水溶液先加盐酸调节pH为7，然后用孔径3k的聚醚砜卷式超滤膜进行过滤，过滤方式为错流过滤，浓缩液为300mL时停止过滤，保留浓缩液，冷冻干燥得到淡黄色冻干粉末31g，鼠李糖脂含量为99.0％。
计算回收率：若不经离子交换树脂分离，维持原发酵条件至发酵结束，发酵液体积为1.5L，鼠李糖脂含量为22g/L，鼠李糖脂理论产量为33g，对应回收率为93.0％。
对比例1
在前述发酵条件下发酵196小时，发酵罐外接10L压力可调的溢流罐，发酵后期泡沫引入溢流罐，通过改变溢流罐内的压力使泡沫消除，将消泡后的发酵液再重新打回发酵罐，如此重复直到发酵结束，检测发酵液鼠李糖脂含量为22g/L。
发酵液离心除菌，保留上清液，然后加入80％硫酸，调节pH为2.5，有固体沉淀析出，用等体积乙酸乙酯分两次对析出固体进行萃取，分离有机相，合并两次萃取液，在60℃下抽真空蒸干溶剂，得到褐色粘稠状液体35g，纯度55％，鼠李糖脂收率为58.3％。

Claims (10)

1.一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法，包含以下步骤：
(1)使用工程菌发酵生产鼠李糖脂时，在发酵过程中向发酵液中一次性加入阴离子交换树脂，继续完成发酵；
(2)分离树脂和发酵液，用洗脱剂反洗树脂，得到鼠李糖脂水溶液；
(3)调节鼠李糖脂水溶液pH值，过滤浓缩，干燥浓缩液，得到鼠李糖脂纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)在发酵中后期加入阴离子交换树脂，优选在开始发酵72-96小时后加入，树脂加入后继续发酵96-120小时至发酵终点，上述发酵周期合计为168-216小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中阴离子交换树脂为碱性阴离子树脂，优选苯乙烯系弱碱性阴离子树脂；阴离子交换树脂加入体积为发酵液体积的1-10％，优选3-8％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中树脂加入后控制发酵液的pH值为6.8-7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中树脂与发酵液的分离方式采用沉降或过滤方式；分离后的树脂用2-5倍体积超纯水洗涤1-2次，然后装入树脂交换柱，其树脂装填的长径比为19:1-100:1，优选30:1-50:1。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中树脂洗脱剂为氢氧化钾和/或氢氧化钠的水溶液，浓度为0.1-4wt％，优选0.5-1wt％；洗脱剂用量为待洗脱树脂体积的10-200倍，优选20-50倍，洗脱方式为动态洗脱，洗脱剂体积流速为每分钟0.2-5倍于树脂体积，优选0.5-2倍于树脂体积。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)调节鼠李糖脂水溶液pH为7-8。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)使用超滤工艺对鼠李糖脂水溶液进行过滤浓缩，采用截留分子量3k-5k的超滤膜；待超滤截留体积为鼠李糖脂水溶液原体积的1/10-1/5时停止过滤，保留浓缩液。
9.根据权利要求1、7-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中使用冷冻干燥方法干燥浓缩液。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，该方法产品回收率大于90％，所获鼠李糖脂为含量大于98％的粉末状高纯品，发酵过程中无明显起泡现象。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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