CN101852781A - 环孢菌素a的hplc分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种环孢菌素A单位的HPLC分析检测方法。本发明提出了一种环孢菌素A的高效液相检测方法，所述高效液相检测方法采用如下色谱条件：色谱柱：十八烷基键合硅胶的C8柱或C18柱；检测波长：190～380nm，优选190-230nm；流动相：磷酸二氢钠-乙腈缓冲液或磷酸二氢钠-甲醇缓冲液。本发明的HPLC分析方法，可以进行多个环孢菌素A样品的分析，之间的相互干扰大大减少，极大的提高了环孢菌素A样品分析的准确性和快速性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种环孢菌素A单位的HPLC分析检测方法。
背景技术
环孢菌素最早于1970年由瑞士Sandoz公司的科学家在光泽柱孢菌和多孔木霉发酵液中研究发现，1983年被美国FDA批准应用于临床肾移植，由于其良好的免疫抑制活性，作为第三代免疫抑制剂，取得了巨大的成功。其后，环孢菌素其他组分也受到科研工作者的重视，陆续发现了26个以上的天然环孢菌素组分(CsA、B……Z)。对于成分复杂的环孢菌素发酵液来说，建立一种方便、快捷、可靠的目标产物检测方法显得十分必要，特别是环孢菌素的同系物C、B、D结构与A十分相似，分离难度很大。
《河北医药》2006年10月第28卷第10期，《高效液相色谱法检测人全血环孢素A浓度》公开了一种检测全血环孢素A的方法，采用的色谱条件是：色谱柱：ZORBAX SB-C18(5)，4.6×150mm，紫外检测波长208nm，柱温70℃，流速1.4ml/min，流动相为乙腈∶甲醇∶水∶异丙醇：58∶18∶23∶1(V/V)。
《沈阳医学院学报》2006年6月第8卷第2期，《反相高效液相色谱法测定人环孢素A血药浓度》公开了一种测定人血液中环孢素A的方法，采用的色谱条件是：Sphefisorb.C8型色谱柱，检测波长为214nm，甲醇-水(75∶25，V/V)为流动相，柱温60℃。
总体而言，在现有技术中，环孢菌素A与同系物之间虽能较好分离，但分析方法时间较长，不但浪费时间和大量的溶剂，而且还会缩短色谱柱的使用寿命。特别是分析多个样品时，相互之间还会出现明显的干扰，影响分析的准确性。
发明内容
本发明的目的旨在提高样品中环孢菌素A单位分析的准确性和快速性，提供一种环孢菌素A方便、快捷、可靠的HPLC分析方法。
为了实现本发明的目的，通过大量试验研究，发明人提出了一种环孢菌素A的高效液相检测方法，所述高效液相检测方法采用如下色谱条件：
色谱柱：十八烷基键合硅胶的C8柱或C18柱；
检测波长：190～380nm，优选190-230nm；
流动相：磷酸二氢钠-乙腈缓冲液或磷酸二氢钠-甲醇缓冲液。
上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中检测器可以采用紫外检测器或二极管阵列检测器。
上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中所述流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝20％-40％∶60％-80％，或磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝20％-40％∶60％-0％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01～0.50mol/L，磷酸调pH值为2.0～3.0。优选地，流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝30％∶70％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01mol/L，磷酸调pH值为2.7。
上述环孢菌素A的高效液相检测方法，其中流动相的流速为0.5ml/min～1.5ml/min，柱温为25～35℃。优选地，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
上述环孢菌素A的高效液相检测方法，所述的环孢菌素A样品是指经过前处理的环孢菌素A发酵液样品，或者环孢菌素A发酵液提取过程中间样品，或者其它环孢菌素A样品。
应用本发明的检测方法，环孢菌素A和环孢菌素的同系物C、B、D完全分离，且主峰明显，分析时间缩短，选择性，分辨率、灵敏度高，重现性好，准确可靠。
附图说明
图1实施例1所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.177处为环孢菌素C，5.855处为环孢菌素B，9.034为环孢菌素D，7.782为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。
图2实施例2所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.181处为环孢菌素C，5.853处为环孢菌素B，9.036为环孢菌素D，7.771为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。
图3实施例3所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.186处为环孢菌素C，5.862处为环孢菌素B，9.039为环孢菌素D，7.785为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。
图4实施例4所述检测方法的色谱图，其中图谱中出峰时间5.065处为环孢菌素C，6.326处为环孢菌素B，9.073为环孢菌素D，7.687为环孢菌素A，可以看出在该条件下环孢菌素A可以和三个杂质很好的分离。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。
实施例1
取10.104g环孢菌素A发酵液，完全转移至一250mL三角瓶中，然后用量筒量取80mL甲醇进行浸泡，再加入1mL 2N NaOH溶液，封口，将三角瓶置于摇床上，于室温、转速250rpm下进行振摇提取1小时，用50mL离心管取40mL浸提液于4000rpm离心10分钟，得到经过前处理的环孢菌素A发酵上清液。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A发酵液。将上清液直接进样分析即可。色谱柱为Alltima HP C18反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长214nm，流动相：乙腈-0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.7)＝70∶30，流速1.0mL/min，柱温30℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保发酵液含量的检测。见图1
实施例2
取12.025g环孢菌素A发酵液，完全转移至一250mL三角瓶中，然后用量筒量取90mL甲醇进行浸泡，再加入1mL 2N NaOH溶液，封口，将三角瓶置于摇床上，于室温、转速250rpm下进行振摇提取1.5小时，用50mL离心管取40mL浸提液于4000rpm离心10分钟，得到经过前处理的环孢菌素A发酵上清液。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A发酵液。将上清液直接进样分析即可。色谱柱为Alltima HP C18反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长190nm，流动相：乙腈-0.10mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.0)＝80∶20，流速0.8mL/min，柱温25℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保发酵液含量的检测。
实施例3
取11.324g环孢菌素A发酵液，完全转移至一250mL三角瓶中，然后用量筒量取90mL甲醇进行浸泡，再加入1mL 2N NaOH溶液，封口，将三角瓶置于摇床上，于室温、转速250rpm下进行振摇提取1.5小时，用50mL离心管取40mL浸提液于4000rpm离心10分钟，得到经过前处理的环孢菌素A发酵上清液。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A发酵液。将上清液直接进样分析即可。色谱柱为Alltima HP C8反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长380nm，流动相：乙腈-0.20mol/L磷酸盐缓冲液(pH3.0)＝60∶40，流速1.2mL/min，柱温35℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保发酵液含量的检测。
实施例4
用分析天平称量提取终端产品(未精制，含量约95％)12mg，置于10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度1mg/mL的环孢菌素溶液。然后取对照品用流动相分别配成浓度0.1mg/mL和0.5mg/mL的溶液，利用外标法作标线。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A粗品溶液。色谱柱为Alltima HP C18反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长230nm，流动相：乙腈-0.30mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.5)＝＝50∶50，流速1.0mL/min，柱温30℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保提取过程中间样品的检测。
实施例5
用分析天平称量提取终端产品(未精制，含量约95％)12mg，置于10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度1mg/mL的环孢菌素溶液。然后取对照品用流动相分别配成浓度0.1mg/mL和0.5mg/mL的溶液，利用外标法作标线。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A粗品溶液。色谱柱为Alltima HP C18反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长214nm，流动相：乙腈-0.40mol/L磷酸盐缓冲液＝50∶50，流速1.0mL/min，柱温30℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保提取过程中间样品的检测。
实施例6
用分析天平称量提取终端产品(未精制，含量约95％)12mg，置于10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度1mg/mL的环孢菌素溶液。然后取对照品用流动相分别配成浓度0.1mg/mL和0.5mg/mL的溶液，利用外标法作标线。
用反相HPLC方法分析经过处理的环孢菌素A粗品溶液。色谱柱为Alltima HP C8反相柱(5um，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长190nm，流动相：乙腈-0.50mol/L磷酸盐缓冲液(pH2.7)＝70∶30，流速1.0mL/min，柱温30℃。利用该方法，12分钟样品即可分析完毕，主成分峰明显，柱压无明显变化，能较好的确保提取过程中间样品的检测。
Claims (7)
1.一种环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶的C8柱或C18柱；
检测波长：190～380nm；
流动相：磷酸二氢钠-乙腈缓冲液或磷酸二氢钠-甲醇缓冲液。
2.如权利要求1所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，采用紫外检测器或二极管阵列检测器。
3.如权利要求2所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，检测波长为190-230nm。
4.如权利要求1所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝20％-40％∶60％-80％，或磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝20％-40％∶60％-0％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01～0.50mol/L，磷酸调pH值为2.0～3.0。
5.如权利要求4所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，流动相为磷酸二氢钠水溶液∶乙腈＝30％∶70％，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为0.01mol/L，磷酸调pH值为2.7。
6.如权利要求1-5任一所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，流速为0.5ml/min～1.5ml/min，柱温为25～35℃。
7.如权利要求6所述的环孢菌素A的高效液相检测方法，其特征在于，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
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