CN115266996A - 一种环孢素a制剂中有关物质的分析方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全新的环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其色谱条件如下：检测波长：210‑230nm柱温：50‑60℃流速：0.8‑1.5ml/min流动相A：乙腈(0.085％磷酸)；流动相B：异丙醇(0.085％磷酸)；流动相C：水(0.1％磷酸)本发明的分析检测方法，能很好的同时解决辅料干扰和众多有关物质的分离度问题，也为本类制剂的有关物质的质量标准制定提供了一种有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学以及医药领域，特别涉及一种环孢素A制剂中有关物质分析方法及其应用。
背景技术
环孢素A(cyclosprine,CyA)是由11个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物。环孢素A为白色或类白色粉末，无臭无味。在甲醇、乙醇或乙腈中极易溶解，在醋酸乙酯中易溶，在丙酮或乙醚中溶解，在水中几乎不溶。临床是一般采用聚氧乙烯蓖麻油、蓖麻油或吐温等非离子表面活性剂进行增溶。环孢素A中目前已经知道的杂质有6种，分别是环孢素B、环孢素C、环孢素D、环孢素H，异环孢素A、异环孢素H。
干眼病(dry eye disease，DED)又名角结膜干燥症(KCS)，是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。它是目前最为常见的眼表疾病，主要治疗方法是使用人工泪液。
环孢素A是一种免疫抑制剂，它可抑制干眼症相关的眼睛炎症，进而促进患者的眼泪分泌。但也有研究表明，环孢素可以通过神经激动作用而促进眼泪的分泌。此外，环孢素还可以抑制结膜杯状细胞的凋亡。因此，环孢素治疗干眼症的作用机制可能包括了免疫抑制作用、促进眼泪分泌以及抑制结膜杯状细胞的凋亡。
目前上市的环孢素A制剂主要是注射液、乳剂、胶囊等，美国FDA于2002年12月批准ALLERGAN公司的环孢素眼用乳剂(规格为0.05％；商品名：
)上市，是由环孢素加适宜的增溶剂、凝胶基质、保湿剂、pH调节剂和注射用水制成的凝胶剂，每天给药一次，单眼每次30mg，用于治疗中度至重度泪液缺乏型干眼病。
目前已经在中国药典公开了环孢素A原料的检测方法，其具体为：
色谱柱：C18色谱柱(150×4.6mm，5um)；
流动相：乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸(430:520:50:1)；
流速：1.0ml/min；
柱温：70℃；
波长：220nm；
进样量：80ul。
上述检测方法的问题是，同时检测多个杂质的专属性不好，杂质于主峰的分离度欠佳，个别杂质峰出峰过早，空白辅料干扰出峰早的杂质检测。且混标检测后，前面的两个杂质分离度很差(远小于1.5)，而且主峰后的杂质根本无法实现基线分离，无法同时对多个已知杂质进行检测。因此需建立一个新的有关物质检测方法，从而能够检测和分离以上6个已知杂质(环孢素B、环孢素C、环孢素D、环孢素H，异环孢素A、异环孢素H)及其他未知杂质。
环孢素眼用凝胶属于化学药品2.2类改良型新药。根据化学药品2.2类新药的申报要求以及《化学药物制剂研究基本技术指导原则》等文件要求，对制剂的有关物质控制十分严格，但目前国内外专利和药典法案等，胶囊、注射液等都有没有对有关物质提出有效检测手段，并对检测限度也没有一定要求，因此给临床应用带来较大的风险，进而也会降低产品的品质。
当前也有不少文献或专利对环孢素A中有关物质的分析方法进行了一定的探索，刘浩等人[1]选则了多达14个品牌18种C18普通柱，在检验环孢素A和降解产物环孢素H，异环孢素A、异环孢素H时有一定的分离效果，系统适用性和耐用性均比较好，但是未考察其他几种杂质和辅料的干扰(刘浩、仇士林，HPLC法测定环抱素胶囊中环孢素及降解产物的含量，中国抗生素杂志(Chinese Journal of Antibiotics,2002,27,227-231)。庞文哲等[2]对环孢素A注射液的含量和有关物质进行检验，选用的色谱条件为Merck
C18，流动相为四氢呋喃-0.05mol/L磷酸溶液(45:55，V/V)，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温为75℃，进样量为10μl，其系统适用性、专属性、稳定性和重复性均达到了目标，但未涉及聚氧乙烯蓖麻油等辅料的干扰问题(庞文哲，宋更申，王茉莉，HPLC法同时测定环孢素注射液的含量和有关物质，中国药房(China Pharmacy,2015,26,399-401)。如何解决检测中有关物质的有效分离和辅料干扰成为当前急需解决的重大问题。
本发明根据环孢素A的产品特性，结合多肽柱在进行氨基酸和多肽分离中的优势(Keys for Enabling Optimum Peptide Characterizations:A Peptide Mapping“Howto”Guide,Agilent Technologies,Inc.Printed in the USA April 25,2014,5991-2348EN)，引入各品牌系列多肽柱进行分析检测，找到了一种能将有关物质有效分离及并能排除辅料干扰的分析检测方法。
发明内容
本发明提供了一种环孢素A制剂中有关物质的分析方法，所述分析方法为高压液相色谱法，其条件为：
所述高压液相色谱法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
所述高压液相色谱法的流动相包括流动相A、流动相B、流动相C；
其中，所述流动相A为磷酸-乙腈溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.1％；例如，在一些具体实施方式中，磷酸浓度还可以是0.06％、0.07％、0.08％、0.09％；在一个具体实施方式中，磷酸浓度为0.085％。
所述流动相B为磷酸-异丙醇溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.1％；例如，在一些具体实施方式中，磷酸浓度还可以是0.06％、0.07％、0.08％、0.09％；在一个具体实施方式中，磷酸浓度为0.085％。
所述流动相C为磷酸水溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.2％；例如，在一些具体实施方式中，磷酸浓度还可以是0.06％、0.07％、0.08％、0.09％；在一个具体实施方式中，磷酸浓度为0.1％。
进一步的，所述高压液相色谱法的检测波长为210-230nm；例如，在一些具体实施方式中，所述检测波长还可以是211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、在一个具体实施方式中，检测波长为220nm。
进一步的，所述高压液相色谱法的柱温为40～70℃；例如，在一些具体实施方式中，所述柱温还可以是41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃；在一个具体实施方式中，柱温为50℃；在一个具体实施方式中，柱温为60℃。
进一步的，所述高压液相色谱法的流速为0.8～1.5ml/min；在一个具体实施方式中，流速为1.0～1.5ml/min。
优选的，所述高压液相色谱法的色谱柱为Waters色谱柱、Agilent色谱柱、Thermo色谱柱、Phenomenex色谱柱、Shimatsu色谱柱或YMC色谱柱中的一种或几种。在一些具体实施方式中，所述色谱柱为Agilent或Phenomenex色谱柱；在一个具体实施方式中，所述色谱柱为Agilent多肽色谱柱，优选的，所述色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱。
进一步的，所述高压液相色谱法采用梯度洗脱检测，其梯度洗脱条件为：
0-20min：流动相由50％的流动相A和50％的流动相C组成，流速为1.00ml/min；
20min之后至100min：流动相由35％的流动相A、20％的流动相B和45％的流动相C组成，流速为1.50ml/min；
100min之后：流动相由50％的流动相A和50％的流动相C组成，流速为1.00ml/min。
进一步的，所述环孢素A为原料药、制剂的有效成分或API。
在一些具体实施方式中，所述有关物质包括还药物辅料，进一步的，所述药物辅料为聚氧乙烯(35)蓖麻油、蓖麻油或吐温；在一个具体实施方式中，所述药物辅料为聚氧乙烯(35)蓖麻油；
在一些具体实施方式中，所述有关物质包括环孢素A的6个已知杂质中的一种或几种，所述的环孢素A的六个已知杂质是环孢素B、环孢素C、环孢素D、环孢素H，异环孢素A、异环孢素H。
本发明还提供了一种如上所述的分析方法在制备环孢素A制剂中的应用。进一步的，所述环孢素A制剂为药物上可接受纯度的制剂；在一个具体实施方式中，所述环孢素A制剂为环孢素A眼用凝胶。
本发明所述方法以氨基酸/多肽型的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×150mm，5μm)，流动相A：乙腈(0.085％磷酸)；流动相B：异丙醇(0.085％磷酸)；流动相C：水(0.1％磷酸)；检测波长为220nm，柱温为60℃，流速为1.0-1.5ml/min，可以有效检测和分离环孢素A的6个已知杂质(环孢素B、C、D、H，异环孢素A、异环孢素H)，并能有效的防止辅料聚氧乙烯蓖麻油的干扰，并由此可以建立环孢素眼用凝胶有关物质检验的质量标准。
附图说明
图1是Agilent色谱柱添加聚氧乙烯(35)蓖麻油后能有效分离的谱图(加了杂质的标样)；
图2是Phenomenex色谱柱添加聚氧乙烯(35)蓖麻油，不能有效分离的谱图；
图3是Waters色谱柱添加聚氧乙烯(35)蓖麻油，有关物质不能有效分离的谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种环孢素制剂中有关物质的分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施案例进行描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
以下实施例中的环孢素眼用凝胶来自兆科(广州)眼科药物有限公司，型号为ZK20211001，水为超纯水，其他试剂如未特殊声明均为市面上可得的分析纯试剂。
以下实施例中的所述混合对照品溶液是指含有各种对照品的混合溶液，其中环孢素A眼凝胶参考专利CN103735495B中实施例3记载的方法制得。
以下实施例中的空白辅料不含药物的有效成分，其剂型、大小、颜色、重量、气味及口味等外观与试验药物一致，不能为受试对象所识别。主要辅料是聚氧乙烯(35)蓖麻油(生产厂家：BASF，型号：Kolliphor ELP，批号：85210956P0)。
溶液的制备：
(1)空白辅料溶液：取处方中的辅料总计约2g称定，置10ml量瓶中，加稀释剂适量；超声溶解，放至室温，再加入0.1ml 10％CaCl2，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，以每分钟10000转离心10分钟，取上清液进样。
(2)供试品溶液：取环孢素眼凝胶约2g称定，置10ml量瓶中，加稀释剂适量；超声溶解，放至室温，再加入0.1ml 10％CaCl2，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，以每分钟10000转离心10分钟，取上清液进样。
(3)混合对照品溶液：精密称取环孢素A、环孢素B、C、D、H、异环孢素A、异环孢素H对照品适量，分别置于7个合适的量瓶中，加入四氢呋喃适量，超声溶解，用四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，制成0.1mg/ml的各成分溶液，分别作为各成分对照品溶液。
色谱条件：
【仪器】Agilent Infinity II
【检测器】Agilent DAD
色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，4.6×150mm，5μm；检测波长：220nm；柱温：50℃；流速：0.8-1.5ml/min；流动相A：乙腈(0.085％磷酸)；流动相B：异丙醇(0.085％磷酸)；流动相C：超纯水(0.1％磷酸)；将供试品溶液与混合对照品溶液混合进样，进样体积100ul，流动相的体系为梯度检测，具体如表1：
表1实施例1的洗脱梯度
检测结果：如图1所示，从中可以看出，该方法(使用安捷伦高效液相二元泵)能将有关物质有效分离，而且添加了聚氧乙烯(35)蓖麻油后，不会对有关物质产生干扰。
实施例2
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 250mm×4.6mm×5μm；流动相A：乙腈(0.085％磷酸)；流动相B：异丙醇(0.085％磷酸)；流动相C：超纯水(0.1％磷酸)；柱温60℃；将空白辅料溶液与混合对照品溶液混合进样，进样体积100ul，流速1.0ml/min；波长220nm。调节梯度(如表2)进行考察，运行时间为120min。目前能检测到正常分离的7个峰，但在同等条件下检测空白辅料溶液时，发现对环孢素有关物质影响较大，不能有效分离。
表2实施例2的洗脱梯度
结果如图2所示，从中可以看出，该方法能将有关物质有效分离，而且添加聚氧乙烯(35)蓖麻油后，会对有关物质的分离造成一定的干扰。
实施例3：
色谱柱：Waters Nova-Pak C18 3.9mm×300mm×4μm(YKY-202112-132)。
流动相：四氢呋喃、水和磷酸正丙胺的混合液，其比例为四氢呋喃:水:磷酸正丙胺＝400:590:10；等度洗脱；柱温50℃；将空白辅料溶液与混合对照品溶液混合进样，进样体积100ul，流速1.0ml/min；运行时间60min。
结果如图3所示，从中可以看出，空白辅料溶液前漂移，后续安慰剂辅料峰往左移动，会对环孢素A及环孢素C存在干扰。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述分析方法为高压液相色谱法，其条件为：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相包括流动相A、流动相B、流动相C；所述流动相A为磷酸-乙腈溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.1％；所述流动相B为磷酸-异丙醇溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.1％；所述流动相C为磷酸水溶液，其中磷酸的浓度为0.05％～0.2％。
2.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述高压液相色谱法的检测波长为210-230nm。
3.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的析方法，其特征在于，所述高压液相色谱法的柱温为50～60℃。
4.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述高压液相色谱法的流速为0.8～1.5ml/min。
5.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述高压液相色谱法的色谱柱为Waters色谱柱、Agilent色谱柱、Thermo色谱柱、Phenomenex色谱柱、Shimatsu色谱柱或YMC色谱柱中的一种或几种。
6.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述高压液相色谱法采用梯度检测，其洗脱条件为：
0-20min：流动相由50％的流动相A和50％的流动相C组成，流速为1.00ml/min；
20min之后至100min：流动相由35％的流动相A、20％的流动相B和45％的流动相C组成，流速为1.50ml/min；
100min之后：流动相由50％的流动相A和50％的流动相C组成，流速为1.00ml/min。
7.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述有关物质包括聚氧乙烯(35)蓖麻油。
8.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述有关物质包括环孢素B、环孢素C、环孢素D、环孢素H，异环孢素A、异环孢素H的一种或几种。
9.如权利要求1所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法，其特征在于，所述制剂为凝胶制剂。
10.一种权利要求1-9任一项所述环孢素A制剂中有关物质的分析方法在制备药物上可接受纯度的环孢素A制剂中的应用。
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