CN101842751A - 用全息视频显微术来跟踪和表征颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产生诸如分散在透明介质中的一个或多个颗粒等样品的图像的同轴全息术。用来自光散射理论的结果来分析这些图像提供具有纳米尺寸分辨率的颗粒尺寸、在千分之一以内的其折射率、及具有纳米分辨率的其三维空间位置。此程序快速并直接地表征样品及其介质的机械、光学和化学性质。

Description

用全息视频显微术来跟踪和表征颗粒

本工作由国家科学基金拨款号DMR-0606415支持。

对相关专利申请的交叉引用

本申请根据35USC 119(e)要求于2007年10月30日提交的美国申请61/001,023和于2008年6月19日提交的美国申请61/073,959的权益，这两个申请整体地通过引用结合到本文中。

技术领域

本系统和方法旨在通过对经由全息视频显微术记录的全息图的定量分析来测量胶体颗粒在胶态分散体内的三维位置，此外还表征每个颗粒的形状、尺寸、以及光学性质。从此分析获得的信息可以用来表征胶体颗粒本身。此信息还可以用来测量和检验颗粒分散在其中的介质的性质。在所有此类应用中，定量全息视频显微术与先前已描述和实施的方法和分析系统相比提供显著的优点。

背景技术

颗粒成像测速技术被广泛地应用于测量分散在透明介质中的胶体颗粒的轨迹。颗粒成像测速技术的传统实施方式包括使用标准光显徽术来形成颗粒的图像并随后通过计算机图像分析方法来分析那些图像。此类测量和分析通常提供关于单独的颗粒在显微镜的焦平面中的位置的信息，而不是提供关于颗粒相对于焦平面的轴向位移的信息。在提取轴向跟踪信息的情况下，结果通常具有本质上比平面内位置更差的空间分辨率。此外，轴向位置的测量对于每个颗粒需要单独的标定测量。此类传统的颗粒成像方法通常很少提供关于颗粒的尺寸、形状、或组成的信息。因为移动至过于远离焦平面的颗粒的图像变得过于模糊且扩散而无法进行分析，因此可以应用传统颗粒成像方法的轴向位移的范围受到显微镜的焦深的限制。

基于图像的颗粒跟踪的应用包括测量流动流体中的流线，评估胶态分散体对于聚合和絮凝的热力学稳定性，测量胶体颗粒之间的相互作用，测量胶体颗粒与表面的相互作用，评估颗粒对外部场和力的响应，表征颗粒的粘滞曳力特性，并使用颗粒的运动作为包埋介质的粘弹性和流变性质的探测指标。后一类测量一般称为颗粒跟踪微流变学(microrheology)，其中，使用胶体颗粒作为介质的流变性质的显微镜探测指标。所有此类应用均得益于颗粒跟踪技术，所述颗粒跟踪技术提供较好的空间分辨率、三维跟踪、和较宽的轴向范围。诸如微流变学的某些这种应用还需要关于探测颗粒的特性的信息，诸如其半径。通常，在单独的测量中获得该颗粒表征数据。

在微流变学的特定情况下，有其它方法可用于获得关于介质的粘弹性性质的等价信息。其中有扩散波光谱、动态光散射和干涉仪颗粒跟踪。所有此类方法相比基于颗粒成像的方法提供更优越的带宽。然而，前两种方法不提供在某些应用中需要的空间分辨测量。干涉仪颗粒跟踪提供优良的带宽和优良的跟踪分辨率。然而，其只能应用于样本中的一点或两点，因此不能用于对流变性质的多点检验。这些方法中没有一种适合于分析非均相样本的性质。

单独的胶体颗粒通常由其形状、其尺寸、其总体成分、及其表面性质来表征。用这些量的分布以及通过颗粒的总浓度来表征胶态分散体。可以通过对干燥且另外制备的样本的电子显微镜检查来评估尺寸和形状。然而，制备可能改变颗粒的性质，因此，此类测量的结果可能无法准确地现场反应颗粒的特性。通常将光散射法用于胶体颗粒尺寸的现场分析。然而，此类测量提供分散体中的颗粒的样本平均视图，且通常需要以用于颗粒的尺寸分布、形状、和折射率的近似或现象学模型进行详细解释。一般使用的商用颗粒分选(sizing)仪器基于这些方法并受到其限制。此外，这些方法不能用来表征在颗粒跟踪测量中使用的特定颗粒。诸如库尔特计数器的其它颗粒分选仪器同样依赖于间接方法来测量颗粒尺寸且不能现场应用。还已知多种用于测量胶体颗粒的折射率的方法。传统光散射法通常提供用于折射率的样本平均值并需要关于颗粒的尺寸和形状的信息。特别有效的方法包括使流体的折射率与颗粒的折射率匹配并随后测量流体的折射率。该方法需要与胶体相容的折射率匹配流体且在可以评估的折射率的范围方面受到很大限制。

发明内容

对通过全息视频显微术获得的图像的定量分析提供同时跟踪并表征大量胶体颗粒所需的信息，并单独地提供关于每个颗粒的信息。为了跟踪颗粒，这种方法在轴向位置的超大范围内提供三维的纳米级位置测量。该高分辨率宽范围三维跟踪数据对于微流变学的应用是理想的，且类似地可以有利地在当前应用传统颗粒跟踪的任何应用中使用。全息颗粒跟踪用于尺寸从几纳米到至少几微米的颗粒。其提供用来获取全息图的视频照相机的全时间分辨率。为了进行颗粒表征，全息分析提供具有纳米分辨率的半径和具有不劣于千分之一的相对误差的复折射率。其覆盖从高折射率介质中的低折射率气泡到其折射率过高而不能用其它方式来评估的颗粒的整个范围的折射率。这些规格超过单独地专用于颗粒表征许多方法的规格。高分辨率颗粒跟踪与现场颗粒表征的精确性的组合使得不能以其它方式执行的测量成为可能。

本文描述本发明的各种方面；并在下文(包括下文描述的附图)中更详细地描述这些及其它改进。

附图说明

图1A示出全息视频显微镜的示意性表示；图1B示出图1A中描绘的像平面中的所得到的光散射；图1C示出所得到的测量的全息图且图1D示出使用本发明的方法的拟合全息图；

图2A示出分析样品以提供特性信息的优选实施例的示意性流程图；图2B示出处理样品数据的计算机软件驱动方法的细节；

图3A示出在牛顿流体中自由地扩散的聚苯乙烯珠的轨迹的三维图；且图3B示出作为时间函数的每个x、y、z坐标的均方位移；

图4A示出从图3A和3B的数据提取的粘弹性模量G′(ω)和G″(ω)的度量；图4B示出相关动态粘度η(ω)；图4C示出水中的250k Da聚环氧乙烷(“PEO”)的17wt.％样本的粘弹性模量，插图示出探测颗粒的轨迹的均方位移；且图4D示出动态粘度；

图5A示出重组S型多糖生物膜的粘弹性模量G′(ω)和G″(ω)，其具有均方位移的插图；图5B示出S型生物膜的动态粘度；图5C示出用于同一浓度下的N型多糖的与图5A相同的变量；且图5D示出用于N型多糖的相同浓度的与图5B相同的变量；

图6A示出商业乳品样本的脂肪球半径相对于折射率的关系，每个数据点表示单个脂肪滴的结果(根据拟合参数的归一化方差指数计算误差棒)；图6B示出计数分布相对于直径的关系；且图6C示出计数分布相对于折射率的关系；

图7A示出对于水中的B分散型浸油的在具有和没有表面活性剂的情况下的折射率相对于液滴半径的关系；图7B示出计数分布相对于直径的关系，且图7C示出计数分布相对于折射率的关系；

图8A(1)示出在z_p＝22.7μm下来自水中的1.43μm直径的聚苯乙烯球的归一化全息图B(ρ)；图8A(2)是使用等式(18)的数值拟合；图8A(3)示出对于所述球的方位角平均径向分布B(ρ)；图8B(1)示出在z_p＝7.0μm下分散在浸油(n_m＝1.515)中的1.45μm直径TiO₂球的全息图数据；图8B(2)示出如在图8A(3)的方法中的数值拟合；图8B(3)示出相应的方位角平均径向分布B(ρ)；图8C(1)示出在z_p＝38.8μm下的水中的4.5μm SiO₂球的全息图数据；图8C(2)示出如在图8A(3)的方法中的数值拟合；且图8C(3)示出相应方位角平均径向分布B(ρ)；

图9A(1)示出轨迹开头部分处的胶体硅石球的数字全息图像；图9A(2)示出该轨迹的末尾处的胶体硅石球；图9B(1)示出在轨迹的开头部分处使用等式(18)的相应数值拟合；且图9B(2)示出在该轨迹的末尾处的相应拟合；

图10示出胶体硅石球的三维轨迹，该三维轨迹显示已标记的其起始点(圆圈)和终点(正方形)；

图11示出与热沉淀相关的热波动函数z(t)(插图是与位置无关的折射率的拟合)；以及

图12示出作为τ(sec.)的函数的均方位置波动，其具有爱因斯坦-斯莫卢霍夫斯基x、y、z的定标并具有轨迹投影的x、y平面的插图。

具体实施方式

在图1A中示意性地描绘的该全息显微镜10基于商用倒置光学显微镜(Zeiss Axiovert TV 100S)。用在λ＝632.8nm的真空波长下工作的准直10mW氦氖激光器20(例如，Uniphase)来取代传统白炽照明器。样品散射平面波照明光的一小部分，所述样品诸如为设置在位置r_p处的载物台或保持器38上的介质35内的单独颗粒12或不同相30。散射的光50随后传播到显微镜10的焦平面60，在那里，光50与激光束光40的未散射部分干涉。所得到的干涉图案被显微镜的物镜70(诸如S PlanApo，100x，NA 1.4，油浸)且在用数字视频记录器18(例如PanasonicDVR-H110，未示出)记录为未压缩数字视频之前被视频目镜80(0.63x)投射到CCD照相机15(诸如NEC TI-324AII)上，由执行嵌入模块120中的各种计算机软件的计算机100来处理累积数据。在本发明的优选形式中，模块120上的计算机软件包括用于对样品的数据特性进行操作的一组指令。样品12、30的数据特性涉及由从样品12、30散射的激光50与激光40的未散射部分的相互作用得到的干涉图案。该组指令还包括散射函数，该散射函数在执行时提供描述样品12、30的性质的收敛解，从而使得能够表征样品12、30的机械性质、光学性质、和化学性质中的至少一个。

由记录器18提供的视频流中的每个全息图像是显微镜的视场中的散射体的三维分布的时间分辨快照。在附加实施例中，多个时间快照使得能够跟踪颗粒轨迹并获得特性性质。然后我们使用小颗粒12进行的光散射的洛伦兹-米氏理论(或作为程序嵌入软件模块120中的其它适当光散射方法)的结果来测量每个颗粒12或不同相30的特性。在图1A的系统中，可以将从记录器18输出并经计算机100处理的样品数据输出到控制系统150，控制系统150用于为样品12、30生成质量控制或生产控制信号100。

在最优选实施例中，显微镜10依照图2A和2B所示的流程图操作。全息图像的获取从选择用来照射样品12、30的激光器20开始。可以针对特定应用选择的激光器20的特性包括光40的波长、光40的不同波长的数目、相干长度、每个波长下的光40的强度、以及激光器20是连续的还是脉动的。如果激光器20是脉动的，则可以针对不同的应用使脉冲的形状和定时优化。通常考虑预期的应用和显微镜10中的其它硬件和软件组件来进行这些选择。例如，激光器20的脉动形式对于快速移动对象的时间分辨成像而言可能是优选的。然后，可以使脉冲与用来记录图像的视频记录器18或其它照相机的快门同步。可以类似地选择波长以利用样品12、30的光学性质。可以选择激光器20的多个波长以通过对在不同的波长下记录的全息图的分析来获取光谱信息。可以用能够记录彩色信息的照相机(诸如视频记录器18)来同时记录不同波长下的全息图。可以通过各自被选择用于特定波长的多个照相机来记录它们。或者，可以通过一个或多个照相机来顺序地记录它们。

对于同轴全息术，最优选的是样品12、30足够透明以便充足的一部分照明激光20在不失真的情况下通过，从而形成干涉图案。因此，必须将样品12、30设置在透明形式的样本保持器38中；且被刚性地设置在激光束20中的样本保持器38被布置为使得所得到的干涉图案对于显微镜10而言是可见的。如果满足这些条件，则被样品12、30散射的光40将提供光50，光50将与激光束20的未散射部分干涉而形成干涉图案或全息图。显微镜10的作用是将全息图放大并将放大的全系统投射到照相机18上。因此优选地将显微镜的物镜70和目镜80选择为在所选的波长下使光40的聚集、放大和投射优化。

可能与单独的数字化系统耦合在一起的视频记录器或照相机18记录全息图，将其数字化，并将数字化图像传输到数字图像存储系统(例如，在图1A中被示为25)。照相机的像素计数、空间分辨率和帧速率确定可以用全息显微术方法执行的测量的空间范围、空间分辨率和时间带宽。另外，其动态范围确定获取有用的图像所需的激光20的强度和可从每个图像获取的信息量。其记录彩色信息的能力决定照相机18能够在多个波长下获取全息图时起到什么作用。可以记录由照相机18获取的图像以供稍后分析所用，或者直接将其传输到图像分析例程以进行实时分析。

可以以图2B所示的方式将图像准备好用于分析和随后使用。由照相机18获取的图像和可能的存储在数字图像存储系统25中的数据由像素阵列组成，每个像素将本地强度值记录为数字。在用光散射理论分析这些数字之前，最优选地将其适当地归一化。如本文所述，归一化可以包括将该图像除以先前记录的背景图像。这具有消除由于虚假干涉条纹而引起的图像的强度变化的益处。可选地，其可以包括将整个图像除以归一化常数，或者通过背景照明图案的数字模型对图像进行归一化。

一旦将图像归一化，则可以基于所选的适当光散射理论对预测结果的拟合来对其进行分析。光散射理论包括多个不同的数学表示法，包括洛伦兹-米氏理论、T矩阵理论、及预测由被照射对象散射的电波和磁波的其它方法。可以使用任何此类表示法来分析归一化图像。在样品12、30是球的特定情况下，洛伦兹-米氏理论是特别合适的。对于较复杂的结构，T矩阵理论可能是优选的。

一旦已经选择用于散射光场的适当表示法，则可以通过控制可调参数来将归一化图像对该理论进行拟合。在样品12、30的均质各向同性球对象的特定情况下，可调参数包括球的三维位置、其半径、及其复折射率。在更复杂对象的情况下，可能需要附加拟合参数。通常，必要的拟合包括对可调参数的高度非线性优化。在我们将此方法付诸实施时，我们采用Levenberg-Marquardt非线性最小二乘优化算法。对于某些应用，其它算法可能是优选的。可以使用计算机100的CPU逐个像素地执行拟合。可选地，可以通过使用图形处理单元(GPU)或另一此类并行处理系统(在图1A中也称为“计算机100”)来加速计算。

可以在每个记录的全息图像中对样品12、30执行拟合。可选地，可以出于其它考虑在每个图像中选择某些特定的样品12、30。一旦已经分析了图像，则可以以隔离方式或与来自其它图像的数据相结合地分析对象数据。该对象数据可以是供其使用的所期望的最终产品(product)。对于检验样品12、30的三维结构或评估样品12、30的样本的光学特性的情况而言可能如此。

可以将样品12、30中的单独一个的全息图像的序列组合以导出该样品的三维轨迹的时间分辨测量结果。该轨迹本身可以用作用于进一步分析的输入。例如，可以使用轨迹数据的统计分析来导出流动流体的速度场的测量结果。通常，该测量称为颗粒成像测速。因此，可以将基于全息颗粒跟踪的变化称为全息颗粒成像测速。可选地，可以分析轨迹数据以获得关于介质35的粘弹性质的信息，其中多个样品颗粒18散布在介质35内，这可以称为全息微流变学(下面将在A部分中对此进行更详细的描述)。

如下文更详细地描述的那样，可以随着时间的推移监视样品的尺寸和折射率数据及单独颗粒的尺寸和折射率。在稳定系统中，这些值应保持恒定。这些值中的变化提供关于系统内的变化条件的信息。该信息可能在诸如全息微流变学的应用中有用。可选地，可以从多个全息图像获得颗粒18或相30的统计集合(ensemble)的尺寸和折射率。可以分析该集合以估计主体样品12、30内的尺寸和折射率的统计分布。该信息在对过程和产品进行质量和一致性监视时是有用的。在非球形样品12、30的情况下，还可以获得诸如形状和取向的附加信息，并执行统计分析。

在某些情况下，可以通过在多个波长下测量样品12、30的折射率来评估其化学组成。在诸如被涂覆球的异质样品的情况下，组成分析可以检测样品12、30的表面上的涂层的存在或组成。组成分析对于过程控制和产品质量保证是有用的，例如作为检测乳状液或基于颗粒的产物中的掺杂物的手段。分子尺度涂层的检测对于无标签分子结合检验是有用的。几何和组成数据的其它应用也应是显而易见的，包括同样利用跟踪数据的应用。

A.介质的微流变学

在各种实施例中，应用这种方法来分析许多不同类型的颗粒和相12、30。在一个优选实施例中，我们已通过直接地或通过介质对嵌入的探测颗粒的影响来分析其热驱动波动而执行介质的粘弹性性质的全息微流变分析。在一个实施例中，该方法能够监视探测颗粒的均方位置波动<Δr²(t)>，并使用广义Stokes-Einstein关系式来提取介质的频率相关储能模量G′(ω)。这通过Kramer-Kronig关系式与频率相关损耗模量G″(ω)相关，其完成微观机械性描述。

我们的示例性探测颗粒是标称半径a＝0.75μm(Duke Scientific，Catalog#5153A，Lot#26621)的填充稳定(charge-stabilized)聚苯乙烯球，其通过漩涡而随机地分散到样本介质中。该样本介质随后被填充到通过将1号盖玻片结合到显微镜用载玻片的表面形成的透明容器中。允许密封的样本介质在T＝23±1℃下在显微镜载物台上达到热和机械平衡。

在数字视频记录器(Panasonic DMR-E100H)上以每秒30帧的速度记录全息图像作为未压缩数字视频流。随后分析每个图像以测量探测颗粒相对于显微镜的焦平面中心的三维位置。

更具体而言，准直激光用平面波入射电场E₀(r_p)＝u₀(r_p)exp(-ikz_p)在位置r_p处照射探测颗粒，其中，k＝2πn_m/λ是折射率为n_m的介质中的光的波数。被颗粒散射的场E_s(r)＝u₀(r_p)f_m(r-r_p)传播至z＝0处的焦平面，在那里，其与入射射束干涉。用传统洛伦兹-米氏散射函数f_m(r-r_p)来描述散射光的分布，所述洛伦兹-米氏散射函数取决于颗粒的位置r_p、其半径a、及其折射率n_p。

实际上，入射照明随着位置而变，因此我们通过测量入射照明I₀(r)＝|u₀(r)|²来将所测量的干涉图案I(r)归一化而获得

其中α≈1，考虑了I₀(r_p)中的变化。可以用颗粒的位置、半径、和折射率作为自由参数将等式(1)拟合到诸如图1B所示的实例的归一化图像。尽管同一仪器上的传统明场(bright-field)颗粒跟踪提供10nm的平面内分辨率和100nm轴向分辨率，全息颗粒跟踪以至少一个更好的数量级执行。此外，与传统颗粒跟踪不同，全息跟踪不需要用于轴向测量的单独准直。

我们可以通过跟踪在诸如水的牛顿流体中自由扩散的探测颗粒来评估颗粒位置上的测量误差。如何颗粒距离边界面足够远，则其沿着三个笛卡尔方向中的每一个的均方位移应根据Stokes-Einstein关系式演化。

$\&lang;{\mathrm{\&Delta;r}}_j^2\left(t\right)\&rang;\&equiv;\&lang;{|r_j(t+\mathrm{\&tau;})-r_j\left(\mathrm{\&tau;}\right)|}^2\&rang;=2D_{0}t,---\left(2\right)$

其中，D₀＝k_BT/(6πηa)是在绝对温度T下粘度为η的流体中的球的扩散系数。等式(2)中的尖括号表示起始时间内的集合平均。使该平均值局限于相隔间隔t的起始时间保证对<Δr_j ²(t)>的贡献在统计上是独立的。然而，当分析单个离散采样的轨迹时，此选择在较长的延迟时间t的情况下提供异常大的统计误差。在所有起始时间上求平均值改善对<Δr_j ²(t)>的估计且如果轨迹可作为马尔可夫过程处理，则证明其是正确的。对于我们考虑的热驱动轨迹而言情况如此，且该穷尽采样使我们能够根据在几千个时间步长内测量的单个轨迹来估计均方位移。必须针对间隔t内的相关测量之间的协方差对<Δr_j ²(t)>中的统计误差进行修正。

r_j(t)的测量也受到随机误差影响，其平均值ε_j确定跟踪分辨率。这些误差使颗粒的视在均方偏移增加2ε_j ²，而与t无关。由于照相机的快门周期期间的运动模糊而引起的互补误差τ_s减小视在均方位移。结果由下式给出，

$\&lang;{\mathrm{\&Delta;r}}_j^2\left(t\right)\&rang;=2D_{0}t+2({\mathrm{\&epsiv;}}_j^2-\frac{1}{3}{D}_0{\mathrm{\&tau;}}_s)---\left(3\right)$

其考虑了两种效果，并使我们能够测量ε_j。

<Δr_j ²(t)>的傅立叶变换通过现象广义Stokes-Einstein关系式与复频率相关粘弹性模量相关。

$G^{*}\left(\mathrm{\&omega;}\right)=-i\frac{k_{B}T}{\mathrm{\&pi;\&alpha;\&omega;}\&lang;{\mathrm{\&Delta;}\hat{r}}_j^2\left(\mathrm{\&omega;}\right)\&rang;}---\left(4\right)$

$\&ap;i^{\mathrm{\&alpha;j}\left(\mathrm{\&omega;}\right)}\frac{k_{B}T}{\mathrm{\&pi;\&alpha;}\&lang;{\mathrm{\&Delta;r}}_j^2(1/\mathrm{\&omega;})\&rang;\mathrm{\&Gamma;}(1+{\mathrm{\&alpha;}}_j\left(\mathrm{\&omega;}\right))}---\left(5\right)$

其中，Γ(x)是伽玛函数，且

${\mathrm{\&alpha;}}_j\left(\mathrm{\&omega;}\right)=\frac{d\ln \&lang;{\mathrm{\&Delta;r}}_j^2\left(t\right)\&rang;}{d\ln t}|t=\frac{1}{\mathrm{\&omega;}}---\left(6\right)$

由此，我们获得

G′(ω)度量介质对剪切力的弹性响应，且G″(ω)度量其粘度。它们是生物膜对潜在治疗剂的自然探测量(probe)。类似地，动态粘度

$\mathrm{\&eta;}\left(\mathrm{\&omega;}\right)=\frac{1}{\mathrm{\&omega;}}\sqrt{G^{\&prime;2}\left(\mathrm{\&omega;}\right)+G^{\&prime;\&prime;2}\left(\mathrm{\&omega;}\right),}---\left(8\right)$

提供生物膜与其周围环境交换物质的能力的总体印象。

为了确定我们的全息微流变学系统的准确度，我们首先分析在牛顿流体中扩散的探测颗粒的运动。针对悬浮在水中的25％(w/w)甘油的密度匹配溶液中的标称半径为a＝0.75μm的单个聚苯乙烯球而获得图3A中绘制的五分钟轨迹，所述溶液的粘度预期为1.7mPa s。用光学镊子将颗粒设置在50μm厚的样本容积的中平面处以使到玻璃壁的液力耦合最小化并随后将其释放以获取数据。

将图像拟合到洛伦兹-米氏散射公式提供ε_x＝ε_y＝4nm和ε_x＝20nm的估计的单图像精度。每个坐标的均方位移在图3B中连同对等式(3)的拟合一起绘出。全部三个迹线与D₀＝0.1695±0.0001μm²/s一致。当与颗粒的测量半径a＝0.775±0.014μm的轨迹平均值组合时，这暗示η＝1.67±0.01mPa s的总粘度。给定t_s＝1ms的快门周期，外推偏移提供ε_x＝ε_y＝8±4nm和ε_z＝35±8nm。这些值与所估计的单帧分辨率一致并暗示位置测量的准确度与其精度相当。

高分辨率轴向跟踪数据的可用性是微流变学的全息颗粒跟踪的主要益处之一。在这种情况下，三个数据组之间的一致性确认测量相对于与表面的液力耦合的自由性。更概括地说，此类比较对于测量样本的各向同性和均质性是有用的。

由于来自三个坐标的结果是一致的，所以我们用等式(4)、(6)和(8)来分析三维均方位移以获得在图4A中绘出的损耗模量G″(ω)和在图4B中绘出的动态粘度η(ω)。如预期的那样，甘油-水溶液充当牛顿流体，其储能模量G′(ω)过小而不能在所探测的频率范围内分辨。因此，其粘度η(ω)＝1.680±0.001mPa s与频率无关且与从主体测量获得的值一致。

已确定了三维颗粒法的准确度和我们的仪器的机械稳定性，通过将其应用于标准非牛顿样本、高分子量PEO的水溶液而显示出其颗粒跟踪微流变学的效力。图4C示出从分散在去离子水中的200kDa PEO的17wt％溶液中的单个球获得的G′(ω)和G″(ω)。关于牛顿流体，在全部三个坐标中获得一致的结果，因此，组合结果在图4C和4D中给出。

在图4C中绘出的粘弹性模量在相当条件下在数量上与针对类似样本报告的结果一致。在整个频率范围内，损耗模量G″(ω)超过储能模量G′(ω)，这将此样本识别为流体而不是凝胶。在图4D中绘出的相关动态粘度随着频率的增加的单调递减，这是剪切稀释流体的标志。

图5中的数据示出对于生物膜多糖的相当结果。先前使用其它方法进行的生物膜结构的研究已在亚毫米尺度下显示出看起来不服从系统物理分析的非均质程度。事实上，即使是对于名义上类似的样本，对模型生物膜的宏观流变性质的测量已提供相差大于三个数量级的粘弹性模量。这些差已归因于负荷、应变速率、总应变和样本制备。

微流变学通过探测处于平衡状态的未加载样本的局部尺度性质来解决这些问题中的许多个。虽然已将颗粒跟踪微流变学应用于大范围的工业和生物学相关材料，但其对生物膜的应用显然是新的。可以在没有游走细菌的复杂化的情况下制备模型生物膜，且其因此有利于这种分析。

对从在存在10％蔗糖的情况下在载玻片上生长的变异链球菌UA159(ATCC 700610)的5天的生物膜提取的变异链球菌多糖样本执行示例性研究。在室温下用MiIIiQ水提取水溶性(S)多糖。然后在1N NaOH中提取不可溶(N)多糖部分。将两个提取物中和至pH 7.0±0.5并在-18℃下用冷乙醇(75％v/v)沉淀至少24小时。所得到的多糖样本具有约10kDa的平均分子量，聚合分散性为至少50％，并包含微量的蛋白质。在沉淀之后，用75％(v/v)乙醇冲洗样本几次，吸干并以20％(v/v)溶解于水(S)或1N NaOH(N)中以形成在微流变测量中使用的凝胶。聚苯乙烯探测颗粒这时随机地分散在多糖中，并选择密封样本室的中平面附近的颗粒进行测量。

在图5A和5B中绘出的S部分的结果与在图4C和4D中的PEO溶液的那些结果类似。生物膜的水溶性多糖形成大致上比水粘十倍的剪切稀释流体。

相反，图5C中的数据显示N型部分形成具有10Pa的典型储能模量的弹性凝胶。这比在其它传统现有技术中对于变异链球菌多糖的主体样本报告的平均值小几百倍。然而，当将显著的测量误差考虑在内时，其与在最低加载下报告的值一致。低加载情况下的准确测量结果是微流变学的强度之一，因此图5C和5D中的结果很可能反应活体内的生物膜的性质。即使在低加载的情况下，如图5D中的其动态粘度所指示的，N型凝胶也是强剪切稀释的。这对于牙齿生物膜而言是期望的特性，因为其有利于通过刷牙来去除。

这些观察结果暗示两个部分在确定活体内的生物膜机械性质和生物学性质时的互补作用。N型材料显然更适合于扮演机械脚手架的角色，在其内部，生物膜的菌落形成其生态系统。因此，可以将使N型凝胶分裂的能力视为治疗剂的有前途的特性。此类药剂对N型提取物的影响的微流变试验应提供简单且具有成本效益的筛选技术。此外，全息微流变学同时跟踪多个探测颗粒的能力产生根据浓度单独地和以组合方式筛选多重治疗剂的机会。

B.表征乳脂肪球

在另一实施例中，我们已使用本发明的方法来分析来自一系列商售乳产品的乳脂肪滴，所述乳产品包括多个级别的均质巴氏杀菌牛奶、绵羊奶和山羊奶。在每种情况下，在样本密封在显微镜用载玻片与盖玻片之间并设置在显微镜的载物台上之前按1000∶1用去离子水对其进行稀释。给定成像系统的101nm/像素的标定放大倍率，典型的640×480像素图像I(r)捕获大约10个可分辨小球。

未处理的全息图受到由于斑点、显微镜的光学装置中的干涉作用以及灰尘和其它缺陷的散射而引起的大的强度变化的影响。我们通过用在在视场中没有样本的情况下获得的背景全息图I₀(r)对I(r)进行归一化来对其进行修正。如在前面的部分中所述，然后可以将归一化全息图向洛伦兹-米氏理论的预测进行拟合，

其中，k＝2πn_m/λ是复折射率n_m的介质中的光的波数，并且其中，f_s(r-r_p)是描述偏振光

如何被位于r_p处的球散射的洛伦兹-米氏函数。实际上，照明射束并不是完美均匀的，可以使用因数α≈1来考虑诸如位置相关变化的I₀(r_p)的变化。假设散射体是被沿着

方向线性偏振的光照射的均匀且均质的电介质球，

$f_s\left(r\right)=\underset{n=1}{\overset{\&infin;}{\mathrm{\&Sigma;}}}{f}_n({\mathrm{ia}}_n{N}_{e1n}^{\left(3\right)}\left(r\right)-b_n{M}_{o1n}^{\left(3\right)}\left(r\right)),---\left(10\right)$

其中f_n＝iⁿ(2n+1)/[n(n+1)]，并且其中，M_o1n ⁽³⁾(r)和N_e1n ⁽³⁾(r)是众所周知的矢量球谐波。

$M_{o1n}^{\left(3\right)}\left(r\right)=\frac{\cos \mathrm{\&phi;}}{\sin \mathrm{\&theta;}}P\frac{1}{n}\left(\cos \mathrm{\&theta;}\right)j_n\left(\mathrm{kr}\right)\widehat{\mathrm{\&theta;}}$

$-\sin \mathrm{\&phi;}\frac{{\mathrm{dP}}_n^1\left(\cos \mathrm{\&theta;}\right)}{\mathrm{d\&theta;}}{j}_n\left(\mathrm{kr}\right)\widehat{\mathrm{\&phi;}}---\left(11\right)$

$N_{e1n}^{\left(3\right)}\left(r\right)=n(n+1)\cos \mathrm{\&phi;}{P}_n^1\left(\cos \mathrm{\&theta;}\right)\frac{j_n\left(\mathrm{kr}\right)}{\mathrm{kr}}\hat{r}$

$+\cos \mathrm{\&phi;}\frac{{\mathrm{dP}}_n^1\left(\cos \mathrm{\&theta;}\right)}{\mathrm{d\&theta;}}\frac{1}{\mathrm{kr}}\frac{d}{\mathrm{dr}}\left[{\mathrm{rj}}_n\left(\mathrm{kr}\right)\right]\widehat{\mathrm{\&theta;}}$

$-\frac{\sin \mathrm{\&phi;}}{\sin \mathrm{\&theta;}}{P}_n^1\left(\cos \mathrm{\&theta;}\right)\frac{1}{\mathrm{kr}}\frac{d}{\mathrm{dr}}\left[{\mathrm{rj}}_n\left(\mathrm{kr}\right)\right]\widehat{\mathrm{\&phi;}}.---\left(12\right)$

这里，P_n ¹(cosθ)是第一类关联的勒让德多项式，且j_n(kr)是n阶的第一类球贝塞尔函数。由众所周知的传统关系式来给出等式(10)中的膨胀系数。

$a_n=\frac{m^2{j}_n\left(\mathrm{mka}\right){\left[{\mathrm{kaj}}_n\left(\mathrm{ka}\right)\right]}^{\&prime;}-j_n\left(\mathrm{ka}\right){\left[{\mathrm{mkaj}}_n\left(\mathrm{mka}\right)\right]}^{\&prime;}}{m^2{j}_n\left(\mathrm{mka}\right){\left[{\mathrm{kah}}_n^{\left(1\right)}\left(\mathrm{ka}\right)\right]}^{\&prime;}-h_n^{\left(1\right)}\left(\mathrm{ka}\right){\left[{\mathrm{mkaj}}_n\left(\mathrm{mka}\right)\right]}^{\&prime;}}---\left(13\right)$

以及

$b_n=\frac{j_n\left(\mathrm{mka}\right){\left[{\mathrm{kaj}}_n\left(\mathrm{ka}\right)\right]}^{\&prime;}-j_n\left(\mathrm{ka}\right){\left[{\mathrm{mkaj}}_n\left(\mathrm{mka}\right)\right]}^{\&prime;}}{j_n\left(\mathrm{mka}\right){\left[{\mathrm{kah}}_n^{\left(1\right)}\left(\mathrm{ka}\right)\right]}^{\&prime;}-h_n^{\left(1\right)}\left(\mathrm{ka}\right){\left[{\mathrm{mkaj}}_n\left(\mathrm{mka}\right)\right]}^{\&prime;}}---\left(14\right)$

其中，m＝n_p/n_m是颗粒相对于介质的折射率，j_n(x)是n阶的第一类球贝塞尔函数，h_n ⁽¹⁾(x)是n阶的第一类球汉克尔函数函数，并且其中，“’”表示相对于自变量的导数。等式(2)中的和在许多项之后收敛，n_c＝ka+4.05(ka)^1/3+2，其取决于颗粒的尺寸。此计算中的唯一挑战是准确且高效地计算贝塞尔函数及其比率。最优选地，使用准确、计算密集型的连续分数展开(continued fraction)算法，其为来自Lentz的计算系数a_n和b_n的传统方法。另外，可以将由于Wiscombe而更高效的递归算法用于球贝塞尔函数。此权衡保证我们可以将我们的装置用于直径在从10nm至大于10μm的范围内且折射率超过n_p＝2.6的球来获得准确的结果。

为了表征球，我们使用Levenberg-Marquardt最小二乘法将其归一化全息图拟合到用于r_p、n_p、a、和α的等式(9)至(14)。虽然有相当多的自由参数，但这些拟合快速并稳定地收敛，且通常提供具有纳米尺度分辨率的颗粒位置和尺寸，且其折射率在千分之一以内。

我们将此技术应用于从本地超市获得的经商业处理的乳品的5份样本。其包括具有在无脂至全乳范围内的指定脂肪含量的巴氏杀菌均质牛奶以及山羊奶。针对每个样本分析上至100个随机选择的脂肪滴以获得对每个样本中的脂肪滴的尺寸和折射率分布的估计。该结果在图6A～6C和表1中总结。

样本	半径[μm]	折射率
			Elmherst全脂	0.693±0.174	1.468±0.035
Elmherst 2％	0.643±0.183	1.460±0.029
			Elmherst 1％	0.590±0.131	1.465±0.034
Elmherst无脂	0.562±0.140	1.460±0.031
			Meyenberg山羊 新鲜	0.576±0.137	1.425±0.038
Meyenberg山羊 1Mo.	0.441±0.088	1.451±0.036
			B型浸油		1.521±0.017

表1：商售乳品样本的小球半径和折射率

脂肪球的半径随着脂肪含量的增加而增加，半径的分散也是如此。来自牛奶的单独小球的平均折射率n＝1.464与通过光散射获得的单液滴折射率的样本平均值一致。其基本上超过针对主体样本的总折射率获得的1.3444至1.3525的范围。该值由水的光学性质控制，水在室温下的折射率为n_m＝1.333。相反，全息测量提供单独液滴的值，并因此提供比这些先前报告的方法中的任何一个更详细地脂肪性质的视图。事实上，可以基于此将山羊奶与牛奶区别开，山羊奶具有可分辨的较低平均折射率。

有趣的是，此关系随着乳品的老化而变。表1显示山羊奶液滴的平均折射率在一个月的时间内增大，上升至1.45。此结果表明全息表征不仅可用于区别乳品类型，而且可用于评估样本的龄期(其与化学变化相关)。

访问颗粒可分辨数据还显示脂肪球的尺寸和具有其估计的折射率的分散体之间的感兴趣的相关性。较大颗粒的视在折射率在该测量技术的分辨率内是相互一致的。较小的液滴显示出基本上较大的折射率范围。

这不是对该测量技术的固有限制，如图7A～7C中的数据所表明的那样。圆形数据点是针对由于剧烈剪切而作为球形液滴分散在水中的Cargille B型显微镜浸油的液滴而获得的。在25±C的温度下，对于红光而言，此油具有1.515的标称主体折射率。此值与在此研究中考虑的液滴半径的整个范围内、从0.25μm到2.5μm范围内获得的单液滴结果一致。液滴之间的变化可以归因于通过等式(9)进行的对照明强度变化的不完美修正。

当用表面活性剂使油滴稳定时，获得更使人想起乳脂肪滴的结果的结果。图7A中的方形点是针对添加了0.1％(v/v)Tergitol NP9、非离子表面活性剂的B型油而获得的，所述非离子表面活性剂的主体折射率是1.491。此表面活性剂的添加减小了较大颗粒的单液滴折射率。其还应增大针对较小颗粒测量的折射率的范围。

此观察结果使我们断定全息颗粒表征对于表面性质、且特别是对于表面活性剂的表面覆盖度敏感。在乳液滴的情况下，其暗示全息显微术对乳脂肪球膜(MFGM)敏感。此敏感性是显著的，因为仅仅在10至20nm厚度下，MEGM比光的波长薄得多并构成液滴体积的非常小的一部分。

针对较小液滴获得的结果的可变性很可能反应基于等式10至14的推导的假设不成立。洛伦兹-米氏散射理论的这种形式适合于具有突变界面的均质各向同性球。使用此结果来解释被涂覆球的全息图可能导致所提取的参数的不一致性。这种影响对于其表面面积与体积的比率较高的较小球而言更加明显。应用考虑了核-壳结构的更完善形式的散射函数将以较大的附加计算复杂性为代价减小此可变性。

较小的乳脂肪滴还系统地显示比较大液滴更大的折射率。这可以反应MFGM和甘油三酸酯核的脂肪酸组成的尺寸相关变化。因此，甚至全息表征的最简单实施方式也对评估乳脂肪滴组成也可能是有用的。

可以通过同时在多个波长下执行对单液滴的全息表征来获得更多信息。所得到的光谱信息可用于进一步量化单个小球的组成。然而，即使以其最简单的形式，通过全息显微术进行的脂肪球表征也提供对乳脂肪组成的逐颗粒分析(以别的方式无法获得)。其几乎不需要专用设备，因此可以容易地适合于过程控制和质量保证应用。

全息表征对乳品的特定应用表明可以基于全息分析来确定乳品样本的类型(母牛、山羊等)和质量(无脂、全脂、新鲜、过时等)。此观察结果暗示全息表征对乳品场工业中的质量保证和过程控制的特定应用。更概括地说，基于本文的公开，全息表征针对诸如油漆、其它食物、以及化妆品的其它基于乳状液的系统的更广泛使用很明显可适用。

还应注意的是全息表征对乳状液滴的表面性质以及其主体性质敏感。表面表征可以包括识别表面涂层的存在、表面覆盖度的测量、以及表面涂层性质的表征。对更完善形式理论的拟合可以提供关于表面涂层的厚度和组成的定量信息。这对于乳品表征是有用的，且其还将在颗粒的表面可能不同于其主体的其它情况(如上所述)下有用。

C.表征胶体颗粒

在另一实施例中，分析并表征分散在水中的聚苯乙烯硫酸盐球。如前文所述，数字化全息图提供颗粒的三维位置r_p、其半径a、及其折射率n_p。我们假设入射场

在

方向均匀地偏振，并在将被视为沿着

方向传播的平面波的颗粒的尺寸内足够缓慢地变化。因此，其在颗粒的平面z＝z_p中的位置ρ＝(x，y)处的振幅u₀(ρ)与其在焦平面z＝0中的振幅相同。该波沿着

方向传播，波数为k＝2πn_m/λ，其中，λ是光在真空中的波长且n_m是介质的折射率。对于25℃下的纯水，在λ＝0.632下，n_m＝1.3326。

r_p处的颗粒将入射场的一部分散射到高度结构化的出射波E_s(r)＝αexp(-ikz_p)u_o(r_p)f_s(r-r_p)中，其中，a＝1考虑了照明的变化，并且其中，f_s(r)是洛伦兹-米氏函数，其取决于a、n_p、n_m和λ。该散射场一般覆盖由|u₀(ρ)|²的长波长变化所支配干涉图案

I(ρ)＝|E_s(r)+E₀(r)|²|_s＝0，          (15)

的焦平面处的足够大的区域。已表征了所得到的失真，但在I(ρ)的先前分析中未进行修正。幸运的是，|u₀(ρ)|²可以在空视场中测量，并且可以将同轴全息图归一化以便在平面z＝0上获得无失真图像，

$B\left(\mathrm{\&rho;}\right)\&equiv;\frac{I\left(\mathrm{\&rho;}\right)}{{\left|u_0\left(\mathrm{\&rho;}\right)\right|}^2}---\left(16\right)$

如果我们进一步假设准直入射射束的相位在视场内缓慢地变化，则该归一化图像与通过下式在平面z＝0中计算的米氏散射图案f_s(r)相关，

可以通过将颗粒的三维位置、其半径及其折射率作为自由参数来将等式(18)拟合到所测量的全息图。先前的研究针对这些量中的某些而并非全部五个将非归一化全息图拟合到现象学模型或米氏散射理论。由于可调参数的误差在很大程度上是相关的，所以不同时使其全部优化提供不准确的结果。作为替代拟合到整个洛伦兹-米氏理论提供具有更高精度的更多信息。

通过使用照相机的测量信噪比来估计单像素误差的Levenberg-Marquardt非线性最小二乘极小化算法来执行对数字化和归一化全息图像的数值拟合。我们报告的所有拟合的χ²偏离具有一致的量级，因此，所计算的拟合参数中的不确定性准确地反应其精度。

由于激光器的波长和介质的折射率两者都是已知的，所以唯一的仪器标定是总放大倍率。这与其它三维颗粒跟踪技术形成对比，其它技术需要对于每种类型的颗粒进行独立标定(特别是为了深入地跟踪颗粒)。

图8A(1)中的图像(及图8A(2)和8A(3)的随附数据)示出用于分散在焦平面之上的高度z_p＝22.7μm处的水中的聚苯乙烯硫酸盐球的归一化全息图B(ρ)。此球是从具有2a＝1.48±0.03μm的标称直径的商业样本(Bangs Labs，Lot PS04N/6064)获得的。针对0.25毫秒的曝光时间来设置照相机的电子快门以使由于布朗运动而引起的模糊最小化。在将原始8位数字化图像归一化之后，每个像素大致包含5个有效信息位。对B(ρ)的数值拟合不仅如实地再现干涉条纹的位置，而且还如实地再现其幅值。可以根据方向角平均值来判断拟合的质量；实线曲线是B(ρ)的中心附近的角平均值，虚线曲线指示平均值的标准偏差，且离散点是通过拟合获得的。

对于半径a＝0.73±0.01μm的拟合值(参见图8A(2))落在样本的特定范围内，其反应用Beckman Z2库尔特计数器获得的0.69±0.07μm的下界和用分析离心分离获得的0.76±0.08μm的上界。引用与测量颗粒尺寸之间的一致性暗示本测量的准确度相当于其精度。在这种情况下，精度和准确度两者均超过先前通过对I(ρ)的分析获得的结果。折射率的轨迹平均值n_p＝1.55±0.03也与从对主体分散体的光散射测量推断的聚苯乙烯胶体的性质一致。

已通过分析光学捕获中的胶体颗粒的动态特性而实现测量单个颗粒的折射率时的相当精度。然而，这种方法只能应用于具有相对小的折射率的颗粒，因为具有大于n_p≈1.3n_m的相对折射率的颗粒难以捕获。相反，全息表征只需要单个全息快照而不是扩展时间序列，不需要光学捕获，因此不需要捕获的单独标定，并且在颗粒尺寸和折射率的更宽范围内有效。

图8B(1)至8B(3)中的附加数据是针对焦平面之上的z_p＝7μm处的1.45μm直径TiO₂球而获得的。此样本是由四乙氧基钛合成且经过加热处理以增加其密度。除非介质与盖玻片是折射率匹配的，否则此类高折射率颗粒的强前向散射产生成像伪象。将颗粒分散在浸油(n_m＝1.515)中消除这些伪象，但引入我们使用的透镜的球面像差，这必须进行修正以获得可靠的结果。1.45±0.03nm的拟合直径和2.01±0.05的折射率分别与通过电子显微术和主体光散射获得的结果一致。此结果是值得注意的，因为没有其它单个颗粒表征方法用于此类高折射率。

图8C(1)至8C(3)中的数据示出针对在焦平面之上的z_p＝38.8μm处分散在水中的标称5μm硅石球(Bangs Labs，Lot SS05N/4364)的结果。拟合折射率n_p＝1.434±0.001适合于多孔硅石且直径a＝4.15±0.01μm与用Beckman Z2库尔特计数器针对此样本获得的4.82±0.59μm值相符。我们已成功地将全息表征应用于直径小到100nm并大到10μm的胶体球。与基于模型的分析方法不同，拟合到精确的洛伦兹-米氏散射理论在宽得多的颗粒尺寸范围内是稳定且可靠的，条件是注意在计算f_s(r)时保持数值稳定性。

相同的拟合以平面内1nm和沿光轴10nm的精度分辨颗粒的位置。可以用传统照明来获得相当的纳米尺度跟踪分辨率，但其不需要针对每个颗粒的详细标定。全息成像的另一益处是与传统显微术相比非常大的焦深。我们的系统提供在大于100μm的范围内的有用数据，其与使用传统照明的±3μm可用焦深形成对比。

全息视频显微术适用于三维颗粒跟踪，如图9A(1)至9B(2)中的数据针对分散在水中的胶体硅石球(Bangs Labs，Lot SS04N/5252)所证明的那样。用光学镊子将此颗粒在焦平面之上提高30μm，并随后将其释放且允许其沉淀。图9A(1)和9B(1)中的图像示出其轨迹的开头部分附近和末尾附近的颗粒。对等式18的拟合在图9A(2)和9B(2)中示出。

在图10中绘出颗粒在其下降的15秒期间以1/30秒为间隔的测量轨迹。图11中的其垂直位置z(t)显示关于均匀沉淀速度的波动，v＝1.021±0.005μm/s。这通过ρ_p＝ρ_m+9nv/(2a²g)来提供对颗粒密度的估计，其中，ρ_m＝0.997g/cm³是水的密度，且η＝0.0105P是其在T＝21℃下的粘度，并且其中，g＝9.8m/s²是由于重力而引起的加速度。在a＝0.729±0.012μm处，颗粒半径的拟合值随着颗粒的沉淀而保持恒定。此值与用BeckmanZ2库尔特计数器测量的制造商指定的0.76±0.04μm的半径一致。因此，我们获得ρ_p＝1.92±0.02g/cm³，其比该样本的制造商额定值小几个百分数。然而，折射率的拟合值n_p＝1.430±0.007也比额定值低1.5％，暗示颗粒的密度确实比指定的低。

颗粒位置的分量的均方位移

提供附加的一致性检查。如图12中的数据所示，单独笛卡尔分量的轨迹中的波动相互一致，且三个全部显示出线性Einstein-Smoluchowsky定标

扩散系数D＝0.33±0.03μm²/s。这与预期的Stokes-Einstein值D₀＝k_BT/(6πηa)＝0.30±0.03μm²/s一致，其中，k_B是玻尔兹曼常数。从对Δr_j ²(t)的线性拟合获得的偏移在整个轨迹中也是一致的，不劣于针对平面内位置的1nm和针对轴向位置的10nm精度。因此，对颗粒性质的光学表征与所测量的颗粒动态特性一致。

通过视频全息显微术使其成为可能的对探测颗粒的三维轨迹的精确测量本质上适合于在颗粒成像微流变学中的应用。特别地，将此技术应用于生物膜对于候选医疗或治疗剂的高吞吐量组合筛选很有前途。全息微流变学不评估其生物学或生物化学影响，而是提供对这些药剂对生物膜物理性质的影响的直接了解。在牙齿生物膜的情况下，模型多糖凝胶的可用性将大大地简化用于治疗剂的标准试验的开展。由于微流变测量仅需要微米尺度的样本，所以在厘米尺度的体系中独立试验的非常大的阵列应是可能的，每个试验只需要几分钟的全息记录。

很容易针对其折射率具有大虚部的颗粒和介质扩展我们已描述的技术。针对核壳颗粒和诸如圆柱形纳米线的具有更复杂形状的颗粒的扩展类似地应是可行的。

我们已证明可以使用来自同轴全息显微镜的单个快照来以纳米尺度分辨率测量胶体球的位置和尺寸，并以通常超过1％的精度来测量其折射率。

因此，此类图像的视频流组成用于软物质和生物系统的强大的六维显微术。对于三维微流变学、对于测量胶体相互作用和作为用于生物物理学的力探测，全息颗粒跟踪是理想的。我们已描述的方法可以应用于同时跟踪视场中的大量颗粒以进行高度并行的测量。在诸如光子设备的全息组件等应用中，对大颗粒集合的实时单颗粒表征和跟踪将是无法估价的。应用于诸如生物细胞和胶体异质结构等更高度结构化的样本时，可以将其用作血细胞分析和组合合成的基础。

另外，可以应用多波长全息表征的构思来获得光谱信息，诸如折射率对波长的依赖性。这可以用于量化乳品和相关系统中的营养浓度。其可以用于将掺杂物与纯产品区别开。多波长表征还提供无标定测量的机会。该构思在于所测量的颗粒尺寸应与激光波长无关。如果用来照射样本的激光器的波长是已知的，则可以从颗粒的视在半径在所有波长下应相同的条件获得整个长度尺度的标定。

虽然已示出并描述了优选实施例，但应理解的是在本发明的较广泛方面在不脱离本发明的情况下本领域的技术人员可以对其进行修改和变更。本发明的各种特征在所附权利要求中定义。

Claims (35)

1.一种用于光学地表征样品的方法，包括：

提供全息显微镜；

向所述全息显微镜提供准直激光束；

从样品散射准直激光束以产生散射部分；

由所述准直激光束的未散射部分和所述散射部分产生干涉图案；

记录该干涉图案以供后续分析；以及

测量样品的空间位置、机械性质、光学性质和化学性质中的至少一个。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括能够包含颗粒的介质和被放置在介质中的颗粒中的至少一个。

3.如权利要求1所述的方法，其中，记录干涉图案的步骤包括获得关于样品的尺寸和关于样品的复折射率中的至少一个的信息。

4.如权利要求1所述的方法，还包括应用散射函数来分析所记录的干涉图案的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述散射函数包括洛伦兹-米氏函数。

6.如权利要求2所述的方法，其中，所述样品选自球形样品、均质样品、非均质样品、乳品滴、胶体颗粒、固体颗粒、乳状液滴、核壳颗粒、薄膜和凝胶的组。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述全息显微镜包括焦平面且测量步骤包括识别样品相对于该焦平面的轴向位移，其中，所述样品包括放置在介质内的颗粒。

8.如权利要求7所述的方法，其中，识别轴向位移的步骤不要求至少一个标定，或者不受所述全息显微镜的焦深的限制。

9.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤包括在一次快照中识别样品中的颗粒的位置并表征该颗粒的性质，从而生成颗粒数据。

10.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤包括在多次快照中识别样品中的颗粒的轨迹并表征沿着该轨迹的性质，从而生成颗粒数据。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述颗粒数据包括颗粒与表面之间的相互作用、至少两个颗粒之间的相互作用、样品的流体的速度场和此样品的介质的粘弹性性质中的至少一个。

12.如权利要求10所述的方法，其中，所述颗粒数据包括颗粒与表面之间的相互作用、至少两个颗粒之间的相互作用、样品的流体的速度场和此样品的介质的粘弹性性质中的至少一个。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括保持颗粒的胶状悬浮的介质且测量步骤包括分析介质以及悬浮体的颗粒之间的相互作用中的至少一个。

14.如权利要求1所述的方法，其中，测量机械性质的步骤包括测量颗粒形状。

15.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤包括以下中的至少一个：测量样品的流动流体中的流线、评估样品的胶态分散体对于聚合和絮凝的热力学稳定性、测量样品的胶体颗粒之间的相互作用、测量胶体颗粒与样品表面的相互作用、评估颗粒对样品的外部场和力的反应、表征样品的颗粒粘滞曳力特性、以及使用颗粒的运动作为包括样品的介质的粘弹性和流变性质的探测指标。

16.如权利要求2所述的方法，其中，测量步骤包括同时测量样品的尺寸和样品的空间位置。

17.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤还包括执行流变性质的多点试验。

18.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤包括对样品的性质的现场测量。

19.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括多个颗粒且测量步骤包括对每个颗粒单独地执行测量。

20.如权利要求1所述的方法，其中，由视频照相机全时地获取干涉图案。

21.如权利要求1所述的方法，其中，测量步骤包括分析探测颗粒的性质。

22.如权利要求21所述的方法，其中，分析探测颗粒的性质的步骤包括评估样品性质的热驱动波动，从而确定包括样品的介质的粘弹性性质。

23.如权利要求21所述的方法，其中，测量步骤包括确定均方波动Δr²(t)，从而使得能够表征包含探测颗粒的介质。

24.如权利要求23所述的方法，其中，介质的表征步骤包括确定介质的流变性质。

25.如权利要求1所述的方法，其中，测量光学性质的步骤包括确定颗粒的折射率和半径中的至少一个，所述颗粒包括样品并作为温度、化学组成和化学浓度中的至少一个的函数而被测量，从而使得能够表征样品的稳定性、样品的化学变化和样品的可选材料族的不同化学态中的至少一个。

26.如权利要求1所述的方法，其中，所述准直激光束包括使用多个不同的光波长来获得关于样品的光谱信息。

27.如权利要求1所述的方法，其中，将所述干涉图案归一化并将归一化干涉图案对光散射的特定预测方法进行选择性拟合，从而提供关于样品的特性信息。

28.如权利要求1所述的方法，其中，测量空间位置的范围包括动态跟踪介质中的颗粒，从而使得能够表征颗粒的性质。

29.如权利要求28所述的方法，其中，颗粒的性质包括液力半径、半径和折射率。

30.一种全息显微镜，包括：

激光束源，其用于提供相干激光束；

载物台，其设置在所述激光束源的下游，用于接收激光束；

物镜，其设置在所述载物台的下游；

视频目镜和成像系统，其设置在所述物镜的下游以收集样品数据。

31.如权利要求26所述的全息显微镜，还包括用于执行嵌入计算机软件模块中的计算机软件的计算机。

32.如权利要求31所述的全息显微镜，其中，所述计算机软件执行分析干涉图案从而使得能够表征样品的方法。

33.如权利要求32所述的全息显微镜，其中，所述方法包括洛伦兹-米氏函数。

34.如权利要求30所述的全息显微镜，还包括响应于样品数据控制样品的质量的控制系统。

35.一种用于处理信息以表征样品的计算机可读介质，包括：

计算机软件模块，其包括计算机软件，所述计算机软件具有用于对样品的数据特性进行操作的一组指令；

与干涉图案有关的样品的数据特性，所述干涉图案由从样品散射的激光束与激光束的未散射部分的相互作用引起；并且

该组指令还包括散射函数，该散射函数在执行时提供表示样品的性质的收敛解，从而使得能够表征样品的机械性质、光学性质、和化学性质中的至少一个。

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