CN101837027A

CN101837027A - 一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN101837027A
Application number: CN200910119853A
Authority: CN
Inventors: 林嘉镇
Original assignee: HUA CHANG BIOPHARM CO Ltd
Current assignee: HUA CHANG BIOPHARM CO Ltd
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2010-09-22

Abstract

本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，主要是以中药材中所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得作为抑制癌细胞株的中药制剂，并且关于其制备方法中的发酵以及萃取，提供较佳的方法。

Description

一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法

技术领域

本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，尤其指利用四种中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得的中药物。

背景技术

樟芝(Antrodia camphorate)，为属于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类。为珍贵的药材或食材。迩来被重视用于养生保健。因为樟芝往往依附在牛樟树Cinnamomum kanehirai Hay，所以又称牛樟芝或牛樟菇。至于樟芝对于肝病的疗效，根据资料所称，土著人饮酒导致肝病，都是饮用樟芝所制作的汤汁，得到很好疗效。因此在口耳相传之下，受到极大的重视。此外也受到生化、中西医药界及政府、学界相关机构的重视与证实，例如(但不限于)：论文类：

1、牛樟芝不同极性区分保肝机能性之研究——中山医学大学营养研究所92硕士论文。

2、牛樟芝辅助肝癌化学治疗与改善抗药性表现的药理活性暨分子机制探讨——南台科技大学生科技所94硕士论文。

3、牛樟芝辅助肝癌化学治疗与改善抗药性表现的药理活性暨分子机制探讨——南台科技大学生科技所94硕士论文。

4、牛樟芝萃取物抑制微小胶质细胞发炎机制的探讨——台北医学大学医学研究所94硕士论文。

5、不同樟芝菌种发酵液在肝癌细胞的毒杀性比较——国立台湾海洋大学食品科学所94硕士论文。

6、以细胞培养模式评估固态培养牛樟芝菌取物的之抗肝癌生物活性及其机制——国立台湾海洋大学食品科学所94硕士论文。

7、樟芝的保肝功效与保肝有效成分纯化的研究——国立成功大学药理学研究所94硕士论文。

8、中草药对肝炎的研究探讨——实践大学食品营养所93硕士论文。台湾大学食科所92硕士论文。

期刊类：

1、生物科技——顾肝保肝牛樟芝，中华文化双周报，陈相训，94.04

2、正确认识生技食品牛樟芝，中华文化双周报，陈俊志，94.02

3、灵芝与樟芝之研发与市场现况，农业世界，王伯彻，民94.01页20-32

Taiwanofungus，A Polypore New Genus，中华真菌学会会刊，吴声华等，93.12

4、樟芝活性成分的研究及应用，食品工业，王薇猗，93.12

5、樟芝的牛樟树宿主专一性，食品工业，林永浩，93.05

6、灵芝和牛樟，明道文艺，徐基东，92.12

前案类：

申请案号：093113387：一种可抑制B型肝炎抗原之化合物及其医药或食品组合物

申请案号：092106890：一种可提高人体运动能力与抗疲劳的人工栽培樟芝萃取制造方法与其新用途

由上述等深入的研究以及临床实验，皆可证实樟芝良好的功效。

虽然樟芝受到重视，但是因为樟树在家俱、雕刻业以及樟脑油业大量需求下遭大量砍伐，以至实际上「樟芝子实体」的产量相当有限，所以目前实际上使用的比较多的「樟芝菌丝体」的的产物。

「樟芝子实体」与「樟芝菌丝体」的区别，根据日本东京农大生化应用资深研究员蓝苍洲指出，所谓「樟芝子实体」指的是已出菇的樟芝，具备完整的「生理结构及活性」，是最接近野生樟芝的；而「菌丝体」指的未出菇的樟芝，属于不成熟且不完整的生理结构，与野生的成分相差非常大，原本樟芝的主要价值在「樟芝子实体」。

由于前述野生樟芝数量极少，近年来更因为盗垦而濒临绝种，所以生物界积极投入人工樟芝子实体的培育技术，经历十多年的研究。例如目前市面上所呈现的牛樟芝胶囊，等即是由菌丝体作成，然而利用不同的液态或固态(如葡萄糖-液态五谷豆皮、洋菜等)培养的菌丝商品，因为培养基不同，因此菌丝体功效并不相同，而有良窳之分。

【发明内容】

本发明目的在于解决上述不足，提供一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，其能很好地培养樟芝菌丝体的培养基。

为达成上述目的，本发明采用如下技术方案：

抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于：以包括当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。

四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤包括：

A、取当归∶川芎∶熟地黄∶白芍为1～5∶1～5∶1～5∶1～5种类以及重量比例；

B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；

C、取药渣并为脱水，成为固形物；

D、混入碳酸钙，该碳酸钙∶固形物重量为1～5％∶100％；混入米糠，该米糠∶固形物重量为1～30％∶100％混入蛋白胴(peptone)，该蛋白胴(peptone)∶固形物重量为1～5％∶100％

E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物∶樟芝菌丝体菌液为1～50∶1；

F、发酵：

其发酵条件为温度：15-50℃湿度：30-95％培养天娄：7-50天；取得樟芝四物药材。

本发明的有益之处在于提供一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，这种抑制癌细胞株的中药制剂，是以当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四种中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。主要是以中药材为木质化的药材，加入具有强烈纤维素分解酵素，而作为固体发酵用菌种，可有效将残留于中药药渣的一些成份，再予以分解及合成可能有功效性的特殊成份出来，本方案特别是以上述中药材中所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。

本发明主要是由具有强烈纤维素分解酵素及木质素分解酵素的高等真菌，特别是菇类，作为固体发酵用菌种，可有效将残留于中药药渣的一些成份，再予以分解及合成可能有功效性的特殊成份出来，透过功能性评估试验，可以有突破性的发现。

领取四物药材(当归∶川芎∶熟地黄∶白芍＝1～5∶1～5∶1～5∶1～5)用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用。领取药渣，脱水(形成固形物)，混合(加入碳酸钙、米糠、蛋白胴(peptone))，充填，取混合后四物药材(或药渣)，经灭菌后，取四物药材，加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为1-50∶1，发酵后收成，其发酵条件为温度：15-50℃湿度30-95％培养天数：7-50天。

本发明的樟芝四物药材，可以利用以下几种萃取液来达到萃取的目的，例如第一种萃取液为水∶酒精＝100％∶0％、第二种萃取液为水∶酒精＝50±3％∶50±3％、第三种萃取液为水∶酒精＝5±3％∶95±3％，而经过实验证实，以第三种萃取液为较佳。

本发明实验过程，可以容许第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g。

该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至发酵物∶第一种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第二种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第三种萃取液1～30g∶1ml。

附图说明

以下结合附图对本发明详细说明：

图1是本发明动物小鼠体内试验示意图一；

图2是本发明动物小鼠体内试验示意图一；

图3是灌食本发明萃取物的老鼠状态图；

图4是尚未灌食本发明萃取物的老鼠状态图；

图5是显示肝癌增生细胞的KI-67抗体染色图；

图6是喂食樟芝四物(J20)萃取物后，KI-67抗体与肝癌增生细胞产生的红点减少示意图；

图7是本发明四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明详述：

本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂，是以包括当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四种中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。而该四物、其功效以及其主治，包括：

当归：

功效：补血活血，滋养强壮，调经止痛，润燥滑肠。

主治：风湿痹痛，经闭腹痛，崩漏眩晕，肠燥便难，痈疽疮疡，跌打损伤。

川芎：

功效：头痛眩晕，胸胁胀痛，筋挛寒痹，腰脚软弱，腹内冷痛，泻痢，痈疽，月经不调。

主治：行气开郁，驱风止痛，理气活血，排脓长肉，燥湿，上行头面，外达肌肤，为治痛常用药。

白芍：

功效：泻肝火，和血脉，敛阴平肝，缓中止痛。

主治：血虚头晕，崩漏虚汗，胸腹疼痛，月经不调，四肢挛急，泻痢。

熟地黄：

功效：补精益髓，滋阴强壮，养肝明目。

主治：月经不调，胎产崩漏，遗精消渴，潮热盗汗，耳聋目昏。

由于该四物具有高度营养，因此做为培养基极为恰当，该四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤，请参阅第图7所示，包括：

A、取当归∶川芎∶熟地黄∶白芍＝1～5∶1～5∶1～5∶1～5种类以及重量比例。

B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；萃取温度可以选择为50-150℃，2-5小时。

C、取药渣并为脱水，成为固形物；滤液可以供其它药品使用。该固形物仍然可以保持部分水分于占固型量1-30％。该水分由于微量，仍然界定于该固形物的范围。

D、混入碳酸钙，该碳酸钙∶固形物重量＝1～5％∶100％混入米糠，该米糠∶固形物重量＝1～30％∶100％混入蛋白胴(peptone)，该蛋白胴(peptone)∶固形物重量＝1～5％∶100％

E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例中间制备物∶樟芝菌丝体菌液＝1～50∶1；可以利用机器充填至发酵瓶。灭菌条件可以设为121℃，1-5小时。

F、发酵：

其发酵条件为温度：15-50℃湿度：30-95％培养天数：7-50天；取得樟芝四物药材。该培养较佳是在无尘室里(Hepa)中进行。即可得到发酵后的樟芝四种药材(后简称为「樟芝四物」)。

本发明的樟芝四种药材，可以利用以下几种萃取液来达到萃取目的，例如第一种萃取液为水∶酒精＝100％∶0％、第二种萃取液为水∶酒精＝50±3％∶50±3％、第三种萃取液为水∶酒精＝5±3％∶95±3％，而经过实验证实，以第三种萃取液为较佳。至于本发明实验过程，可以容许第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g。该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第一种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第二种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第三种萃取液1～30g∶1ml。水及水酒：以70-100℃萃取1-3小时，95％酒精：则以浸渍或超音波震荡方式萃取，浸渍方式为24-48小时，超音波的话为1-3小时。

而本发明是一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其步骤包括：A、取当归∶川芎∶熟地黄∶白芍＝1～5∶1～5∶1～5∶1～5种类以及重量比例；B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；C、取药渣并为脱水，成为固形物；D、混入碳酸钙，该碳酸钙∶固形物重量＝1～5％∶100％；混入米糠，该米糠∶固形物重量＝1～30％∶100％∶混入蛋白胴(peptone)，该蛋白胴(peptone)∶固形物重量＝1～5％∶100％；E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物∶樟芝菌丝体菌液＝1～50∶1；F、发酵：其发酵条件为温度：15-50℃湿度：30-95％培养天数：7-50天；取得樟芝四物药材。

而本发明是一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵的樟芝四物药材萃取方法，其特征在于，该以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其萃取液系选自第一种萃取液为水∶酒精＝100％∶0％，第二种萃取液为水∶酒精＝50±3％∶50±3％第三种萃取液为水∶酒精＝5±3％∶95±3％的一萃取液萃取。该第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g；第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度＝1～30ml∶1g。该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第一种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第二种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第三种萃取液1～30g∶1ml。

值得一提的是，真空减压浓缩的原理主要系利用标准状况下，若大气压力降低时，沸点也会呈现以倍数的比例降低，使溶剂在较低的温度(低于溶剂沸点)甚至是常温时，即沸腾蒸发成气体，且在另一端冷凝成液态溶剂，而溶质由于沸点远大于溶剂，因而留在热端，当溶剂量减少但溶质量不变时，则浓度就提高(浓缩)了，旨在移除溶液中多余的溶剂，或是溶质在高温时容易分解，则采用此法，相当于减压蒸馏的原理。

实验结果：

体外试验(细胞试验)结果参见下表：

分别取三种萃取液(a：水萃、b：95％酒精、c：水酒(50％))进行抑制血小板凝集及癌细胞毒杀能力试验(三种癌细胞，肝癌、肺癌及乳癌)，其结果得知四物药材培养樟芝以95％酒精萃取后，其抑制癌细胞能力的效果最佳。

体内试验(动物小鼠试验)参见图1，樟芝四物(J20)萃取液能有效抑制癌细胞生长，使得患有肝癌细胞的小鼠存活率提高。

樟芝四物(J20)萃取液对肝癌细胞株有抑制作用，可抑制癌细胞的体积增大，图2为喂食第17天后，对照组(PBS)与实验组(J20)的肝癌细胞体积的大小。图中横线为代表平均值。该对照组(PBS)为磷酸缓卫溶液(phosphate-buffered Saline)，功用为类似生理食盐水，以便作为常态的比较组。

请参阅图3所示，显示利用本发明实施于老鼠，而灌食樟芝四物药材萃取物的老鼠(第十七天)，肝癌细胞已明显缩小。

请参阅图4所示，未灌食樟芝药材萃取物的老鼠(第十七天)，肝癌细胞体积未见缩小。

请参阅图5所示，显示肝癌增生细胞的KI-67抗体染色，未喂食前，图中的红点为肝癌增生细胞与KI-67抗体染色的后所产生。

请参阅图6所示，喂食樟芝四物(J20)萃取物后，可以发现KI-67抗体与肝癌增生细胞产生的红点已明显减少，代表细胞未有肝癌的增生细胞大量产生。另外也证明此萃取液对正常细胞并也毒杀作用。

Claims

1.抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于：以包括当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。

2.如权利要求1所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于该四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤包括：

B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；

C、取药渣并为脱水，成为固形物；

E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物：樟芝菌丝体菌液为1～50∶1；

F、发酵：

3.如权利要求1所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于该樟芝四物药材的萃取系选自：

第一种萃取液为水∶酒精为100％∶0％；

或第二种萃取液为水∶酒精为50±3％∶50±3％；

或第三种萃取液为水∶酒精为5±3％∶95±3％；

之一的萃取液萃取。

4.如权利要求3所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于：

第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g；

或第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g；

或第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g。

5.如权利要求4所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于：

该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第一种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第二种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至发酵物∶第三种萃取液1～30g∶1ml。

6.抑制癌细胞株的中药制剂的方法，其为一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其步骤包括：

B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；

C、取药渣并为脱水，成为固形物；

D、混入碳酸钙，该碳酸钙∶固形物重量为1～5％∶100％；混入米糠，该米糠∶固形物重量为1～30％∶100％∶混入蛋白胴(peptone)，该蛋白胴(peptone)∶固形物重量为1～5％∶100％；

F、发酵：

其发酵条件为温度：15-50℃湿度：30-95％，培养天数：7-50天；取得樟芝四物药材。

7.如权利要求6所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于该樟芝四物药材的萃取系选自：

第一种萃取液为水∶酒精为100％∶0％；

或第二种萃取液为水∶酒精为50±3％∶50±3％；

或第三种萃取液为水∶酒精为5±3％∶95±3％之一的萃取液萃取。

8.如权利要求7所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于该

第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g；

第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g；

第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1～30ml∶1g。

9.如权利要求8所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于：该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第一种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第二种萃取液与樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第二种萃取液1～30g∶1ml；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材∶第三种萃取液1～30g∶1ml。