CN101984997B - 一种含有四物汤提取物的抗肿瘤作用组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用，该组合物由环磷酰胺和四物汤提取物组成，其中四物汤提取物可为四物汤的水提取物、醇提取物或水提醇沉物等。本发明提供的具有抗肿瘤作用的组合物，在大量实验研究基础上，筛选出古方四物汤可明显降低抗肿瘤药物环磷酰胺的心脏毒性，四物汤与环磷酰胺科学配比组合后，环磷酰胺在发挥其强抗肿瘤活性的同时，心脏毒性等副作用明显降低，两者组合后，具有比单用环磷酰胺更高的药物安全性，是一种很有应用前景的化学药物和中药复方的组合物，对临床用药具有重要的指导作用。

Description

一种含有四物汤提取物的抗肿瘤作用组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物，具体设计一种具有抗肿瘤作用的组合物及其该组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 

背景技术

环磷酰胺为氮芥与磷酰胺基结合而成的化合物，是临床常用的烷化剂类免疫抑制剂和抗肿瘤剂，可用于类风湿关节炎、儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。环磷酰胺在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺，而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。临床常用于恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等，有一定疗效。 

但是环磷酰胺在大剂量下可出现心脏毒性，引起心肌病和心包炎，甚至致死性充血性心衰。虽然环磷酰胺诱发心脏毒性的机制尚不清楚，研究发现，环磷酰胺及其代谢产物可直接损伤血管内皮，引起毛细血管微血栓的形成和内皮通透性升高，使含有高浓度药物的血液外渗，使心肌细胞损伤；同时血浆蛋白和红细胞漏至心肌间质，引起纤维蛋白沉积和局灶性出血；而大量含丰富蛋白质液体渗入心包腔造成心包积液，导致难治性充血性心衰。同时，环磷酰胺有抗利尿作用，可致一过性水潴留，可促进心肺衰竭的发生。代谢产物丙烯醛在体内和体外均可与细胞色素P450起反应，并使之变性，造成心脏毒性。有报道认为，大剂量环磷酰胺治疗后引起心脏损害，约20％出现心电图改变，40％出现心肌酶谱升高。另外，联合化疗既往有充血性心力衰竭等心脏病病史、电解质失衡(如低钾血症和低镁血症)和基础射血分数小于50％，以及蒽环类抗肿瘤药联用都可增加环磷酰胺产生心脏毒性。 

现有的心肌保护药如ATP、辅酶Q、半胱氨酸、抗氧化剂VE和VC等可在一定程度上预防环磷酰胺产生心脏毒性。但这些常规药物减毒效果不佳，临床迫切需要具有安全有效的减低环磷酰胺心脏毒性的药物。 

四物汤(《仙授理伤续断秘方》)由地黄、当归、川芎和白芍四味药组成，为中医补血和血名方，主治头晕目眩，面色无华，形瘦乏力，妇人月经不调、量少或经闭不行，脐腹作痛， 舌淡，脉细弦或细涩之营血虚滞证。以往的研究报道了四物汤能够改善环磷酰胺诱导的贫血，未见有四物汤在用于减低环磷酰胺心脏毒性的报道。 

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中环磷酰胺存在致命性心脏毒性问题的不足，提供一种抗肿瘤活性强，且较低心脏毒性的环磷酰胺和四物汤的组合物。 

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为： 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺0.01～1份，四物汤提取物0.1～100份。 

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：环磷酰胺0.1～1份，四物汤提取物1～100份。 

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，是由下列重量份数的原料制成：环磷酰胺0.2～0.8份，四物汤提取物10～80份。 

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，是由下列重量份数的原料制成：环磷酰胺0.7～1份，四物汤提取物10～40份。 

本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其中四物汤提取物和环磷酰胺组合后能发挥降低环磷酰胺心脏毒性的用途。或四物汤提取物可作为降低环磷酰胺心脏毒性的新用途。 

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其中所述的四物汤提取物为四物汤的水提取物、醇提取物或水提醇沉物。其中水提醇沉物可以是四物汤水提后，用浓度为30～95％乙醇沉淀后得到的精制物；作为其它优选方案，本发明所述的四物汤提取物也可以为水提醇沉后，上大孔吸附树脂柱，用水、低浓度到高浓度的乙醇依次洗脱，取浓度为30至85％浓度乙醇的洗脱物，得到去除杂质的四物汤精制提取物。 

本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。作为优选方案，本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物在制备治疗骨髓瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌或肺癌药物中的应用。 

本发明提供的具有抗肿瘤作用的组合物，可以将环磷酰胺和四物汤的组合物和药学上可接受的载体，如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂等制备成注射液、粉针剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂等剂型的药物。 

本发明提供的具有抗肿瘤活性的组合物制成片剂时，把组合物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。本发明提供的组合物制成胶囊剂时把组合物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的组合物制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。如把本发明提供的组合物制成注射液时，取组合物加入增溶剂，搅拌均匀，80℃加热 30分钟，过滤，调节PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。 

有益效果：本发明提供的环磷酰胺和四物汤提取物的组合物和现有技术相比具有以下优点： 

本发明立足祖国医药学方剂配伍理论，在大量实验研究基础上，筛选出古方四物汤可明显降低抗肿瘤药物环磷酰胺的心脏毒性，四物汤与环磷酰胺科学配比组合后，环磷酰胺在发挥其强抗肿瘤活性的同时，心脏毒性等副作用明显降低，两者组合后，具有比单用环磷酰胺更高的药物安全性，是一种很有应用前景的化学药物和中药复方的组合物，对临床用药具有重要的指导作用。

附图说明 

图1为四物汤对环磷酰胺中毒大鼠心肌CK水平的影响柱形图。 

图2为四物汤对环磷酰胺中毒大鼠心肌MDA水平的影响柱形图。 

图3为四物汤与环磷酰胺联合使用后对环磷酰胺心脏毒性的评分图。 

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。 

实施例1 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺0.01份，四物汤水提取物10份。四物汤水提取物的制备方法为：取地黄、当归、川芎和白芍四味药组成的四物汤加8倍量的水煎煮提取2次，合并提取液，减压浓缩，干燥，得四物汤水提取物。 

实施例2 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺0.1份，四物汤醇提取物60份。四物汤醇提取物的制备方法为：取地黄、当归、川芎和白芍四味药组成的四物汤加8倍量的95％乙醇回流提取2次，合并提取液，减压浓缩，干燥，得四物汤醇提取物。 

实施例3 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺1份，四物汤水提醇沉提取物100份。四物汤水提醇沉提取物的制备方法为：取地黄、当归、川芎和白芍四味药组成的四物汤加8倍量的水煎煮提取3次，合并提取液，减压浓缩，然后加入95％乙醇，使水提液中乙醇的浓度为50～85％，3000转/分钟，离心，取上清液，浓缩，干燥，得四物汤水提醇沉提取物。 

实施例4 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺0.2份，四物汤提取物10份。四物汤提取物制备方法为：取地黄、当归、川芎和白芍四味药组成的四物汤加8倍量的水煎煮提取3次，合并提取液，减压浓缩，然后加入95％乙醇，使水提液中乙醇的浓度为50～85％，3000转/分钟，离心，取上清液，浓缩，干燥，得四物汤水提醇沉提取物上大孔吸附树脂柱，用水和20％至90％浓度的乙醇依次洗脱，收集浓度为30至85％浓度乙醇的洗脱物，得到去除杂质的四物汤精制提取物。 

实施例5 

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成： 

环磷酰胺1份，四物汤水提醇沉提取物30份。四物汤水提醇沉提取物的制备方法为：取地黄、当归、川芎和白芍四味药组成的四物汤加8倍量的水煎煮提取3次，合并提取液，减压浓缩，然后加入95％乙醇，使水提液中乙醇的浓度为60～80％，3000转/分钟，离心，取上清液，浓缩，干燥，得四物汤水提醇沉提取物。 

实施例6环磷酰胺和四物汤组合后降低环磷酰胺诱导大鼠心电的毒性变化 

1、实验方法：将大鼠分为4组，包括正常组、环磷酰胺中毒模型组、四物汤水提物(SWT)低剂量组(0.9g/kg)、四物汤水提物(SWT)高剂量组(1.8g/kg)。模型组：大鼠灌胃生理盐水1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。SWT-低：大鼠灌胃四物汤低剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺(恒瑞医药)1ml/100g。SWT-高：大鼠灌胃四物汤高剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。以上步骤持续五天。第五天大鼠连接心电图机，二导联测定心电图变化。 

2、实验结果：如下表1所示，环磷酰胺注射5天后，模型组大鼠的心电图出现明显异常。其中心律失常的发生率高达75％(6/8)。而给予低剂量和高剂量四物汤与环磷酰胺联合治疗后，其总心律失常的发生率分别降低至44.4％和25.0％。说明本发明在把四物汤和环磷酰胺组合后可以有效降低环磷酰胺导致的心律失常不良反应。 

如下表2所示，环磷酰胺注射5天后，模型组大鼠的心电图出现明显异常。其中P-R间隔显著延长，而给予低剂量和高剂量四物汤与环磷酰胺联合治疗后则显著恢复。进一步表明本发明在把四物汤和环磷酰胺有机结合后能明显降低环磷酰胺导致的心律失常等不良反应。 

表1四物汤对环磷酰胺诱导心律失常的发生率的影响(n＝8～9) 

表2四物汤对环磷酰胺诱导心电变化的影响( 

n＝8～9) 

^#p＜0.05，^##p＜0.01与正常组比较；^*p＜0.05，^**p＜0.01与模型组比较。 

实施例7四物汤降低环磷酰胺诱导大鼠心肌磷酸激酶CK的改变 

1、实验方法：将大鼠分为4组，包括正常组、环磷酰胺中毒模型组、四物汤醇提物(SWT)低剂量组(0.9g/kg)、四物汤醇提物(SWT)高剂量组(1.8g/kg)。模型组：大鼠灌胃生理盐水1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。SWT-低剂量组：大鼠灌胃四物汤低剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g。SW-高剂量组：大鼠灌胃四物汤高剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。以上步骤持续五天。第五天取大鼠心脏，制备心肌匀浆，3000转离心15分钟，取上清液测定心肌损伤磷酸激酶(CK)的水平 

2、实验结果： 

磷酸激酶CK为心肌损伤的特征性酶，如图1所示，环磷酰胺中毒大鼠心肌CK水平显著升高，给予高低浓度的四物汤治疗后，环磷酰胺中毒大鼠的CK水平显著降低，并且呈现较好的量效关系。 

丙二醛MDA为心肌细胞膜受到环磷酰胺代谢物氧化损伤后的标志物。如图2所示，环磷酰胺中毒大鼠心肌MDA水平显著升高，给予高低浓度的四物汤治疗后，丙二醛MDA水平显著降低。并且呈现较好的量效关系。 

以上实验结果通过观测单用环磷酰胺和环磷酰胺与四物汤联合治疗后心肌磷酸激酶CK和丙二醛MDA的含量对比，结果表明四物汤与环磷酰胺联合治疗后，能够显著降低肌磷酸激酶CK和丙二醛MDA两种生化指标的含量，说明本发明在把四物汤与环磷酰胺有机结合 后具有明显抑制环磷酰胺导致的心肌损伤的不良反应，临床上用药更安全。 

实施例8四物汤减低环磷酰胺诱导大鼠心肌病理改变实验 

1、实验方法：将大鼠分为4组，包括正常组、环磷酰胺中毒模型组、四物汤水提物(SWT)低剂量组(0.9g/kg)、四物汤水提物(SWT)高剂量组(1.8g/kg)。模型组：大鼠灌胃生理盐水1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。SWT-低：大鼠灌胃四物汤低剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。SWT-高：大鼠灌胃四物汤高剂量1ml/100g，半小时后腹腔注射环磷酰胺1ml/100g(50mg/kg)。以上步骤持续五天。第五天取大鼠心脏，浸泡于福尔马林溶液，石蜡包埋，病理切片，HE染色后观察病理改变。 

2、实验结果：由病理染色图表明，单用环磷酰胺模型组的中毒心脏存在广泛的心肌内出血，心肌细胞核多形核或者固缩，表现为明显的心肌病理损伤。而在联合使用高低浓度的四物汤治疗心肌组织纤维表现为显著的毒性恢复。如图3所示，四物汤与环磷酰胺联合使用后能显著降低环磷酰胺心脏毒性的评分。 

通过以上病理组织切片观测表明，本发明在把四物汤和环磷酰胺有机组合后，能够明显改善环磷酰胺所致的心肌病理改变，也进一步表明本发明提供的四物汤和环磷酰胺组合物不仅能发挥环磷酰胺抗肿瘤作用，同时能够明显降低其心脏毒性。 

实施例9四物汤与环磷酰胺组合物抗肿瘤的细胞实验 

1、实验方法：使用MTT法对环磷酰胺及四物汤水提醇沉物与环磷酰胺组合物进行体外抗癌细胞HepG2实验。将相应的细胞用胰酶进行消化、计数、制成浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液。将96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔5×10³个细胞)，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需的不同剃度浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，再将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时。然后每孔加入20μL MTT(5mg/ml)，继续培养4小时，终止培养，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀。在λ＝490nm处用酶标仪检测每孔的吸光度即OD值，计算各药物的抑制率。 

2、实验结果：Hep G2细胞具有与人类相似的代谢能力，如下表3所示HepG2能够将无活性的环磷酰胺转化为具有抗肿瘤活性的代谢物，并对癌细胞HepG2产生抑制作用。在同样环磷酰胺的剂量下组合不同浓度的四物汤，发现组合物同样具有良好的抗肿瘤活性，因此环磷酰胺和四物汤组合后仍能发挥环磷酰胺的抗肿瘤作用。 

表3四物汤与环磷酰胺组合物对癌细胞HepG2的抑制作用( 

n＝4) 

通过以上研究表明环磷酰胺与四物汤科学组合后，在发挥良好抗肿瘤作用的同时，能明显降低其心脏毒性，临床用药更安全，对指导临床用药具有重要的意义。因此本发明提供的组合物，其抗肿瘤作用强，心脏毒性更低，有望开发成为新一代抗肿瘤的药物制剂。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (1)

1.四物汤提取物在制备降低环磷酰胺心脏毒性药物中的应用，所述的四物汤提取物为地黄、当归、川芎和白芍四味药的水提取物、醇提取物或水提醇沉物。

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