CN101835897B - 通过靶向细胞致死肿胀毒素对弯曲杆菌属细菌进行的检测 - Google Patents

通过靶向细胞致死肿胀毒素对弯曲杆菌属细菌进行的检测 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素(CDT)和编码它的多核苷酸，以及使用cdt基因检测豚肠弯曲杆菌的新方法。本发明人关注于弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素(CDT)，并对分离自泰国的一位肠炎患者的类弯曲杆菌属的cdt基因进行检测。本发明人发现了一种菌株，其cdtB基因在空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌中为通用引物所扩增，但是不为可特异性检测三种细菌cdtA、cdtB和cdtC基因的多重PCR所扩增。通过16S rRNA基因分析鉴定该菌株为豚肠弯曲杆菌。此外，通过cdtB基因上游和下游的基因组步移鉴定了该cdt基因完整的核苷酸序列。

Description

通过靶向细胞致死肿胀毒素对弯曲杆菌属细菌进行的检测
技术领域
本发明涉及通过靶向弯曲杆菌属(Campylobacter)细菌的细胞致死肿胀毒素用于检测试样中是否存在弯曲杆菌属细菌的方法。 
本发明还涉及豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)的细胞致死肿胀毒素及编码其的多核苷酸，以及通过靶向豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素用于检测试样中是否存在豚肠弯曲杆菌的方法。 
背景技术
迄今已鉴定了17种弯曲杆菌属菌种。通常采用培养试验来鉴定弯曲杆菌属细菌种类。然而，由于某些菌种仅根据其生化性质难以进行鉴定，因此该试验需要复杂且大量的工作。并且，该细菌是微需氧的，并且，取决于菌种，某些细菌需要在不同的温度下进行培养。此外，包括分离和鉴定在内的针对弯曲杆菌属细菌的培养试验通常费时(7～10天)。 
由于弯曲杆菌感染率和患者数量都存在增加的趋势(“各种病原体食物中毒暴发(Food poisoning outbreak for each causativeagent)”，日本厚生劳动省)，因此期待开发用于鉴定不同种类弯曲杆菌属细菌更简单快速的方法。 
根据生化性质难以快速鉴定弯曲杆菌属细菌种类，并且由于某些弯曲杆菌接近的相似性，因此根据它们的生化性质常常无法对其进行区分。例如，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni，以下简称“C.jejuni”)和大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli，以下简称“C.coli”)就存在这样的问题，因为它们是根据马尿酸酶活性的存在来进行区分的，在酶活力低时，空肠弯曲杆菌被错误地鉴定为大肠弯曲杆菌。为此，在实际试验中业已使用PCR的方法来检测马尿酸酶基因的存在。近年来，常使用16S rRNA基因分析法在基因水平上进行细菌种类鉴定。然而，空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌彼此之间高度同源，因此通过16S rRNA基因分析经常无法相互区分。 
迄今，空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌分别占由腹泻患者分离的弯曲杆菌属细菌的约94％和4％。也就是说，这两种细菌占弯曲杆菌属细菌的大多数。因而，在大多数情况下，临床实践中对于弯曲杆菌属细菌的检测仅涵盖被指定为食物中毒细菌的空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。此外，主要针对空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌开发了常用于该检测的选择培养基，以及培养通常在42℃下进行。另一方面，因为较少对其他细菌种类进行分离，因此这种细菌分离方法并不适用于除空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌以外的其他菌种。特别是，由于属于弯曲杆菌属的菌种之间存在着抗生素敏感性或最佳培养温度的差异，因此依赖所使用的选择培养基或培养条件，有时无法分离得到除空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌以外的菌种。也就是说，很难说该检测覆盖了温度敏感特性不同的胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus，以下缩写为“C.fetus”)，或其他弯曲杆菌属细菌。 
与此同时，除空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌以外的菌种同样分布于宠物、家畜和野生动物等的胃肠道内，因此感染人类的概率被认为与空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌一样高。2005年在大阪大规模暴发了由胚胎弯曲杆菌引起的食物中毒。感染胚胎弯曲杆 菌不仅导致诸如腹泻的胃肠炎，还引发其他严重的症状，例如人类的败血症和脑膜炎。此外，感染胚胎弯曲杆菌可能导致动物(如牛)的不育、流产等。除了空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌外，红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari，以下缩写为“C.lari”)、乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis，以下缩写为“C.upsaliensis”)和豚肠弯曲杆菌(Campylobacterhyointestinalis，以下缩写为“C.hyointestinalis”)这三种细菌也是导致人类的肠炎、败血症等的动物传染病细菌。因此，对用于检测除空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌以外的弯曲杆菌属细菌的系统进行改进是很重要的。 
本发明人根据Cape Town实验方案在不使用抗生素的情况下培养、分离并鉴定了弯曲杆菌属细菌。结果显示约1.3％的由弯曲杆菌属细菌引起的腹泻患者被感染了豚肠弯曲杆菌(非专利文献1)。 
豚肠弯曲杆菌作为猪增生性肠炎的病原菌被分离。此外，已不时从人肠炎患者中分离到豚肠弯曲杆菌，暗示其与人体病理有关。尽管如此，尚未建立用于豚肠弯曲杆菌的快速诊断方法。 
因此，尽管认为除空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌之外的弯曲杆菌属细菌感染人的潜在概率很高，但是没有针对它们的合适的分离/培养检测方法。 
为解决上述问题，本发明人关注并进行了针对弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素(CDT)的学术研究(非专利文献2和3)，并且开发了一种利用细胞致死肿胀毒素基因(cdtA、cdtB和cdtC)检测弯曲杆菌属细菌的方法(专利文献1)。然而，该检测方法仅用于空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和/或胚胎弯曲杆菌，而对于包括豚肠弯曲杆菌在内的其他弯曲杆菌属细菌则尚未开发合适的检测方 法。 
与在此描述的本发明相关的现有技术文献如下所示。 
[专利文献1]WO 2005/054472 
[非专利文献1]Lastovica AJ.等，Campylobacter，第2版，89-120(2000) 
[非专利文献2]Asakura M.等，Microbial Pathogenesis 42(2007)174-183 
[非专利文献3]Yamasaki S.等，Toxin Reviews，25：61-88，2006 
发明内容
鉴于上述情况完成了本发明。本发明的一个目的是提供豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素(CDT)及编码其的多核苷酸。本发明的另一个目的是提供利用cdt基因检测豚肠弯曲杆菌的新方法。 
如上所述，尽管弯曲杆菌属细菌的致病因子还未完全阐明，但是对于除空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌以外的弯曲杆菌属菌种感染的快速诊断仍有需求。按照惯例，会使用基于其血清型的鉴定细菌种类的PCR引物、检测CDT产生的通用引物等(J.AppliedMicrobiol.，94：1003-1014(2003))。然而，这些方法需要富集培养步骤，致使无法实现弯曲杆菌属细菌的快速检测。 
豚肠弯曲杆菌作为猪增生性肠炎的病原菌被分离。此外，已不时从人肠炎患者中分离到豚肠弯曲杆菌，暗示其与人体病理有关。尽管已报道过可能的豚肠弯曲杆菌致病因子的类细胞毒素活性，但是细节仍未澄清。其间，Johnson和Lior发现了在大肠杆菌(E.coli)中的一种名为CDT的新毒素(Johnson WM，Lior H.1988.Microbial Pathogen 4，115-126.)，并报道了空肠弯曲杆菌也产生 CDT。随后，Pickett等确定了空肠弯曲杆菌cdt基因的完整的核苷酸序列(Pickett CL，等，1996.Infect Immun，64，2070-2078.)，从而揭示了CDT的确切特性。此外，Pickett等报道了豚肠弯曲杆菌同样产生具有CDT活性的毒素，并且使用简并引物可以从豚肠弯曲杆菌扩增得到相应于cdtB基因的PCR产物。然而，来自豚肠弯曲杆菌的细菌DNA并不与针对空肠弯曲杆菌cdtB基因的探针发生反应，因此豚肠弯曲杆菌所产生的CDT的确切特性依然不明。 
因此，本发明的一个目的是提供属于弯曲杆菌属的豚肠弯曲杆菌的CDT(其核苷酸序列尚未阐明)和编码该CDT的多核苷酸，以便通过基因扩增能快速检测弯曲杆菌属细菌。本发明的另一个目的是提供使用cdt基因检测豚肠弯曲杆菌的新方法。 
此外，本发明提供了用于同时检测包括豚肠弯曲杆菌在内的弯曲杆菌属细菌的引物。 
本发明人关注于最近被认为是弯曲杆菌属细菌产生的致病因子的细胞致死肿胀毒素(CDT)，并开发了一种通过靶向cdt基因以物种特异性方式检测豚肠弯曲杆菌的简单快速方法。CDT是一种全毒素，由CdtA、CdtB和CdtC三个亚基组成。CdtA和CdtC亚基涉及细胞结合，而CdtB亚基则具有DNA酶活性，并且是毒素发挥毒性的主要单元。本发明人目的在于通过检测cdt基因来鉴定分离自泰国的一位肠炎患者的类弯曲杆菌属细菌的种类，并开发和利用一种能通过靶向cdtA、cdtB和cdtC基因从而特异性检测空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的多重PCR方法，以及一种使用通用引物同时检测三种菌种的cdtB基因的PCR方法。结果，本发明人发现了一株菌株，其cdt基因不被特异性针对三种细菌的多重PCR方法所扩增，但是其cdtB基因被通用引物所扩增。通过16S rRNA基因分析鉴定了该菌株为豚肠弯曲杆菌。 
然后，通过cdtB基因的上下游基因组步移测定了豚肠弯曲杆菌cdt基因的完整的核苷酸序列。一般通过反向PCR测定与已知基因邻接的未鉴定基因的序列。然而在本发明中，第一次通过进行随机引物延伸和基因组扩增、并对扩增模板进行测序的方法测定了cdt基因的完整的核苷酸序列。 
此外，将所测定的核苷酸序列以及推测的氨基酸序列与以前报道过的空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的CdtA、CdtB和CdtC的序列进行比较。结果显示豚肠弯曲杆菌的cdtA和cdtC基因与空肠弯曲杆菌的cdtA和cdtC基因最具同源性，同源性分别为51.7％和52.5％。豚肠弯曲杆菌的CdtB基因与大肠弯曲杆菌的CdtB基因最具同源性，同源性为64.1％。因此，该同源性并不是非常高的。 
同时，测定了推测的CdtA、CdtB和CdtC氨基酸序列的同源性。结果显示豚肠弯曲杆菌的三种Cdt亚基具有与大肠弯曲杆菌的三种Cdt亚基最高的同源性。然而，没有获得高同源性，因为各自的氨基酸序列同源性分别为35.7％、60.5％和28.9％。 
本发明涉及通过扩增豚肠弯曲杆菌cdt基因用于检测弯曲杆菌属细菌的方法。具体而言，本发明提供以下内容： 
[1]一种编码细胞致死肿胀毒素的多核苷酸，其为以下(a)-(h)的任何一种： 
(a)编码包含SEQ ID NO：2-4中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸； 
(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO：1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的多核苷酸； 
(c)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQ ID NO：2-4的任一氨基酸序列中具有一个或更多个氨基酸取代、缺失、添加和/ 或插入的氨基酸序列； 
(d)在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO：1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位中任一核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸； 
(e)编码包含SEQ ID NO：6-8中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸； 
(f)包含核苷酸序列SEQ ID NO：5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的多核苷酸； 
(g)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含在SEQ ID NO：6-8的任一氨基酸序列中具有一个或更多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；和 
(h)在严格条件下与包含核苷酸序列SEQ ID NO：5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸； 
[2]一种包含[1]的多核苷酸的载体； 
[3]一种包含[1]的多核苷酸或[2]的载体的宿主细胞； 
[4]一种由[1]的多核苷酸编码的多肽； 
[5]一种产生[4]的多肽的方法，包括培养[3]的宿主细胞，和从宿主细胞或培养上清液中收集所产生的多肽的步骤； 
[6]一种结合[4]的多肽的抗体； 
[7][6]的抗体，其中该抗体具有中和细胞致死肿胀毒素的活性； 
[8]一种在试样中同时检测一种或更多种弯曲杆菌属细菌存在的方法，其包括步骤： 
(a)使用特异于编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对的混合物对试样进行核酸扩增反应；和 
(b)基于扩增自编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的片段的存在或其分子量确定弯曲杆菌属细菌的存在； 
[9][8]的方法，其中下列(i)-(iv)引物对中的任一种或更多种被用作引物对： 
(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，或能扩增与引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或能扩增与引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(iii)用于扩增编码乌普萨拉弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，或能扩增与引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所扩增的相同基因组DNA区域的引物对；以及 
(iv)用于扩增编码红嘴鸥弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，或能扩增与引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所扩增的相同基因组DNA区域的引物对。 
[10][9]的方法，其中还使用下列(v)-(vii)引物对作为引物对： 
(v)用于扩增编码空肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，或能扩增与引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(vi)用于扩增编码大肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组 DNA的引物对SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，或能扩增与引物对SEQ ID NO：28和29所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(vii)用于扩增编码胚胎弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，或能扩增与引物对SEQ ID NO：30和31所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
[11]一种用于[8]的方法的试剂盒，其包含操作指南和一种或更多种特异于编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对的混合物； 
[12][11]的试剂盒，其包含作为引物对的下列(i)-(iv)引物对中的任一种或更多种： 
(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，或能扩增与引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或能扩增与引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(iii)用于扩增编码乌普萨拉弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，或能扩增与引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所扩增的相同基因组DNA区域的引物对；以及 
(iv)用于扩增编码红嘴鸥弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，或能扩增与 引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
[13][12]的试剂盒，其进一步包含下列(v)-(vii)引物对作为引物对： 
(v)用于扩增编码空肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，或能扩增与引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(vi)用于扩增编码大肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，或能扩增与引物对SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
(vii)用于扩增编码胚胎弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，或能扩增与引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所扩增的相同基因组DNA区域的引物对； 
[14]一种用于检测试样中豚肠弯曲杆菌存在的方法，其包括步骤： 
(a)将试样与[6]的抗体接触； 
(b)测定试样和[6]的抗体之间的结合；以及 
(c)如果在(b)中检测到结合则确定豚肠弯曲杆菌存在； 
[15]一种用于[14]的方法的试剂盒，其包括操作指南和[6]的抗体。 
附图说明
图1是显示使用能扩增空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎 弯曲杆菌cdtB基因的通用引物，针对来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株和其他弯曲杆菌属细菌的PCR结果的照片。 
图2是显示弯曲杆菌属细菌的推测的CdtB氨基酸序列比对图。加框的氨基酸残基被认为是DNA酶活性所必需的。“C.hyo#”指豚肠弯曲杆菌。 
图3是显示重组豚肠弯曲杆菌CdtB和抗血清的制备的图和照片。 
图4是显示抗HisCdtB抗血清的特异性的照片。图4A是显示通过SDS-PAGE检测Ch-CdtB的照片。图4B是显示通过蛋白质印迹检测Ch-CdtB的照片。泳道1：分子量标记；泳道2：25ng的Ch-rCdtB；泳道3：10μl来自豚肠弯曲杆菌(Ch022)的粗毒素溶液。图4C是显示在凝胶双扩散中Ch-rCdtB抗血清的特异性的照片。rCjB：1μg空肠弯曲杆菌rCdtB；α-Cj：10μl rCjB抗血清；rChB：1μg豚肠弯曲杆菌rCdtB；α-Ch：10μl rChB抗血清。 
图5是显示使用简并引物扩增豚肠弯曲杆菌ATCC菌株cdt基因的图和照片。图5A是显示cdt基因和简并引物的位置的图。图5B是显示PCR结果的照片。 
图6是显示来自豚肠弯曲杆菌的粗毒素溶液作用于HeLa细胞48、72和120小时后的毒活性检测结果的照片。 
图7是显示来自豚肠弯曲杆菌的粗毒素溶液作用于HeLa细胞的毒活性检测结果的图和照片。图7A-C是显示在添加粗毒素溶液和抗Ch-rCdtB血清48小时后的吉姆萨(Giemsa)染色和显微镜观察(x100)的HeLa细胞照片。图7D-F显示了在48小时后通过流式细胞仪进行的HeLa细胞中DNA含量的测定。A和D：PBS；B和E：粗毒素溶液(是CD50的四倍)；F和G：粗毒素溶液(是CD50的四倍)和抗Ch-rCdtB血清。 
图8是显示针对弯曲杆菌属细菌cdtB基因的通用引物的位置的图。 
图9是显示豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株的cdtB基因的PCR结果的照片。 
图10是显示使用针对cdtB基因的通用引物的PCR结果的照片。 
图11是显示使用针对cdtB基因的通用引物的PCR结果的照片。 
图12是显示使用特异性引物检测豚肠弯曲杆菌泰国人型cdtB基因的PCR结果的照片。 
图13是显示使用特异性引物检测豚肠弯曲杆菌ATCC型cdtB基因的PCR结果的照片。 
图14是显示了使用通用引物检测豚肠弯曲杆菌ATCC型cdtB基因和泰国人型cdtB基因的PCR结果的照片。 
图15是显示基于空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌和豚肠弯曲杆菌cdt基因的多重PCR结果的照片。 
图16是显示基于空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌、豚肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌和乌普萨拉弯曲杆菌cdt基因的多重PCR结果的照片。 
图17是显示来自泰国人的Ch022(SEQ ID NO：5)和ATCC(SEQ ID NO：1)菌株的豚肠弯曲杆菌的cdtB基因比对以及引物位置的图。 
具体实施方式
在此，短语“细胞致死肿胀毒素”(CDT或CLDT)指属于蛋白质A-B型全毒素组的毒性因子。细胞致死肿胀毒素具有由三个亚 基A、B和C组成的亚基结构。据信亚基B是毒素的活性中心部位，并且亚基A和B涉及细胞粘附。当该毒素作用于细胞时，其导致细胞变形例如细胞膨胀，并最终引起细胞死亡。当在实验中将产毒大肠杆菌所产生的不耐热肠毒素(LT)等作用于细胞时，还观察到细胞变形如细胞膨胀。然而，在移除该毒素后细胞恢复并存活。相反，即使在CDT被移除的情况下，细胞也不会恢复，而是被杀死。 
当在本文中使用时，术语“多核苷酸”指由多个由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的碱基或碱基对组成的聚合物。多核苷酸包括单链DNA和双链DNA。多核苷酸在此可包括未修饰的、天然存在的多核苷酸以及修饰的多核苷酸。修饰的碱基的实例是三苯甲基化碱基和特殊碱基例如肌苷。 
当在本文中使用时，术语“多肽”指由多个氨基酸组成的聚合物。因此，寡肽和蛋白也包括在多肽的概念内。多肽包括未修饰的、天然存在的多肽和修饰的多肽。多肽修饰的实例包括乙酰化；酰化；ADP核糖基化；酰胺化；共价结合黄素；共价结合血红素部分；共价结合核苷酸或核苷酸衍生物；共价结合脂类或脂类衍生物；共价结合磷脂酰肌醇；交联；环化；二硫键形成；去甲基化；共价交联键形成；胱氨酸形成；焦谷氨酸形成；甲酰化；g-羧化；糖基化；GPI-锚着点形成；羟基化；碘化；甲基化；肉豆蔻酰化；氧化；蛋白水解处理；磷酸化；异戊二烯化；外消旋化；硒化；硫酸化；蛋白中的转移RNA介导的氨基酸添加例如精氨酰化；泛素化等。 
当在本文中使用时，术语“分离物”指将一种物质(例如，多核苷酸或多肽)从其原始环境(例如，对于天然产物而言的天然环境)中移出并“人工地”改变其天然状态。“分离的”化合物指包括那 些存在于基本上富含目标化合物的样本中，和/或那些存在于其中该目标化合物被部分或基本上纯化的样本中的化合物。在此，术语“基本上纯化”指从天然环境中分离得到的化合物(例如，多核苷酸或多肽)，其中至少60％、优选75％、最优选90％的在自然界中与该化合物相关的其他组分不存在。 
当在本文中使用时，术语“突变”指对氨基酸序列的氨基酸的改变，或对核苷酸序列中碱基的改变(即一个或更多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失、添加或插入)。因此，当在本文中使用时，术语“突变体”指其中一个或更多个氨基酸被改变的氨基酸序列，或其中一个或更多个核苷酸被改变的核苷酸序列。突变体中核苷酸序列的改变可能改变由标准多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列，也可能不改变。突变体可以是天然存在的，例如等位突变体，或自然界中尚未鉴定的。突变体可被保守地改变，其中取代的氨基酸保留与原始的氨基酸相似的结构或化学特性。罕见地，突变体可以是非保守取代的。本领域已知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可用于确定哪些或多少个氨基酸残基被取代、插入或缺失，而不会抑制生物活性或免疫活性。 
“缺失”是一种对氨基酸序列或核苷酸序列的改变，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列相比，丢失了一个或更多个氨基酸残基或核苷酸残基。 
“插入”或“添加”是一种对氨基酸序列或核苷酸序列的改变，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列相比，添加了一个或更多个氨基酸残基或核苷酸残基。 
“取代”是一种对氨基酸序列或核苷酸序列的改变，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或编码它的核苷酸 序列相比，一个或更多个氨基酸残基或核苷酸残基被改变为不同的氨基酸残基或核苷酸残基。 
当在本文中使用时，术语“杂交”指一种其中通过形成碱基对将一条核酸链结合至其互补链上的过程。 
在此，术语“检测”指定性和定量测定。“定量”还指半定量测定。 
<多核苷酸> 
本发明提供编码豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸。本发明人鉴定了编码来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的豚肠弯曲杆菌菌株细胞致死肿胀毒素的多核苷酸的核苷酸序列，本发明中包括该多核苷酸，称为SEQ ID NO：1。该多核苷酸编码的三种多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2-4。序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列。 
此外，本发明人鉴定了编码临床分离的豚肠弯曲杆菌菌株细胞致死肿胀毒素的多核苷酸的核苷酸序列，如SEQ ID NO：5所示。该多核苷酸编码的三种多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6-8。序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别为CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列。 
本发明的多核苷酸包括：编码含氨基酸序列SEQ ID NO：2-4的多肽的多核苷酸；含核苷酸序列SEQ ID NO：1的任一编码区，特别是核苷酸序列SEQ ID NO：1中第962-1600位、第1601-2425位和第2425-3177位的任一核苷酸序列的多核苷酸；以及包含不同于核苷酸序列SEQ ID NO：1，但由于遗传密码简并而编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2-4的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。 
本发明的多核苷酸还包括：编码含氨基酸序列SEQ ID NO：6-8 的多肽的多核苷酸；包含核苷酸序列SEQ ID NO：5的任一编码区，特别是核苷酸序列SEQ ID NO：5中第1059-1835位、第1853-2656位和第2666-3202位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及包含不同于核苷酸序列SEQ ID NO：5，但由于遗传密码简并而编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：6-8的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。 
本发明的多核苷酸进一步包括编码与上述多核苷酸编码的多肽在功能上等价的多肽的多核苷酸，并具有与所述多核苷酸的完整序列具有至少40％或更高、优选60％或更高、更优选80％或更高、还更优选90％或更高、仍更优选95％或更高、再更优选97％或更高(例如98～99％)的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列同一性可例如通过使用Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877，1993)确定。基于该算法已开发了称为BLASTN的程序(Altschul等J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。当通过BLASTN分析核苷酸序列时，参数设定示例如下：得分＝100；字长＝12。当使用BLAST和间隙BLAST程序时，对于各个程序使用缺省参数。用于这些分析方法的特定技术是已知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。本发明的多核苷酸包括具有与上述多核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸。 
本发明的多核苷酸可通过标准的克隆和筛选方法从天然来源例如细菌细胞中的基因组DNA得到。或者，多核苷酸可从来源于细菌细胞中mRNA的cDNA库得到。多核苷酸还可采用商业化的已知技术合成得到。 
具有与本发明人所鉴定的多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5)显著同源的核苷酸序列的多核苷酸可以通过下述技术制备，例如使用杂交技术(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第6.3-6.4节)和基因扩增技术(PCR)(Current protocols in MolecularBiology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第6.1-6.4节)。具体而言，基于本发明人所鉴定的多核苷酸序列(例如，SEQID NO：1和SEQ ID NO：5)或其部分，可使用已知的杂交技术分离与该序列高度同源的DNA。或者，可使用基于本发明人所鉴定的多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5)的部分设计的引物，通过基因扩增技术分离与多核苷酸序列高度同源的多核苷酸。因此，本发明包括在严格条件下与具有核苷酸序列SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸。本领域技术人员可选择合适的严格杂交条件。例如，可在含有25％甲酰胺(或50％甲酰胺，用于更严格条件)、4x SSC、50mM Hepes(pH 7.0)、10x Denhardt氏溶液，和20μg/ml变性鲑鱼精子DNA的杂交液中于42℃下过夜预杂交；然后添加标记探针并在42℃下温育过夜进行杂交。杂交后的洗涤可在以下的洗涤溶液和温度条件下进行：“1x SSC，0.1％SDS，37℃”等，对于更严格的条件，“0.5x SSC，0.1％SDS，42℃”等，或对于还更严格的条件，“0.2x SSC，0.1％SDS，65℃”。随着如上所述杂交洗涤条件严格性的增加，预期分离出与探针序列具有更高同源性的DNA。然而，上述SSC、SDS和温度条件的组合仅是示例性的。本领域技术人员可通过适当地组合上述或其他决定杂交严格性程度的因素，例如探针浓度和长度、以及杂交反应时间，来得到与上述相同的杂交严格性。 
还可通过向核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5引入突变的方法制备包括与本发明人所鉴定的多核苷酸序列具有显著同源的核苷酸序列的多核苷酸(例如，位点定向诱变(CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第8.1-8.5节))。也可通过天然存在的突变获得这样的多核苷酸。本发明包括编码具有其中由于这样的核苷酸序列突变，从而在氨基酸序列SEQ ID NO：2-4或SEQ ID NO：6-8中取代、缺失、插入和/或添加一个或更多个氨基酸的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 
当本发明的多核苷酸被用于制备本发明的多肽时，该多核苷酸单独包括成熟多肽或其片段的编码序列，或位于与其他编码序列(例如，前导或分泌序列，前蛋白序列、原蛋白序列或前原蛋白序列，或编码其他融合肽部分的序列)相同的阅读框内的成熟多肽或其片段的编码序列。例如，可编码便于融合多肽纯化的标记序列。在本发明的该实施方案中，优选的标记序列的实例包括，例如六组氨酸肽或Myc标签，由pcDNA3.1/Myc-His载体(Invitrogen)提供并描述于Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：821-824中。多核苷酸还可以包括5’和3’非编码序列，例如，被转录而未被翻译的序列、剪切和多聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点以及mRNA稳定序列。 
<多肽> 
本发明提供了由本发明人所鉴定的豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素多肽。本发明还提供了与本发明人所鉴定的多肽在功能上等价的多肽。在此，“功能上等价”指目标多肽具有与本发明人所鉴定的多肽相当的细胞致死肿胀毒素特性。 
将突变引入蛋白的氨基酸序列是一种用于制备与本发明人所鉴定的多肽在功能上等价的多肽的方法。这样的方法包括例如，位点定向诱变(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第8.1-8.5节)。多肽中氨基酸突变也可能天然发生。本发明包括无论是人工还是天然产生的 突变蛋白，其包括经本发明人所鉴定的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO：2-4和SEQ ID NO：6-8)，其中通过取代、缺失、插入和/或添加改变一个或更多个氨基酸残基，但仍在功能上等价于本发明人所鉴定的多肽。 
从保留蛋白的功能的角度出发，用于取代的氨基酸残基优选具有与被取代的氨基酸残基相似的性质(保守取代)。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp均归类于非极性氨基酸，并被认为具有相似的性质。另外，无电荷的氨基酸的实例是Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln。此外，酸性氨基酸的实例是Asp和Glu，碱性氨基酸的实例是Lys、Arg和His。 
对于这些多肽的氨基酸突变的数量和位点而言，不存在限制，只要突变后的多肽保留原始多肽的功能即可。突变的数目一般低于总氨基酸残基的10％，优选低于5％，更优选低于1％。 
其他用于制备功能上等价于本发明人所鉴定的多肽的方法包括利用杂交技术或基因扩增技术的方法。更具体地说，基于编码本发明人所鉴定的多肽(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5)的DNA序列，本领域技术人员可通过使用杂交技术(Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第6.3-6.4节)从来自相同或不同物种的DNA样本中分离高度同源的DNA，从而获得功能上等价于本发明人所鉴定的多肽的多肽。因此，这样的由可与编码本发明人所鉴定的多肽的DNA杂交的DNA所编码的、与本发明人所鉴定的多肽在功能上等价的多肽也包括在本发明的多肽之内。 
本领域技术人员可选择合适的严格杂交条件来分离编码与本发明人所鉴定的多肽在功能上等价的多肽的DNA。例如，可在含有25％甲酰胺(或50％甲酰胺，用于更严格条件)、4x SSC、50mM Hepes(pH 7.0)、10x Denhardt氏溶液，和20μg/ml变性鲑鱼精子DNA的杂交液中于42℃下过夜预杂交；然后添加标记探针并在42℃下温育过夜进行杂交。杂交后的洗涤可在以下的洗涤溶液和温度条件下进行：“1x SSC，0.1％SDS，37℃”等，对于更严格的条件：“0.5x SSC，0.1％SDS，42℃”等，或对于还更严格的条件：“0.2x SSC，0.1％SDS，65℃”。随着如上所述杂交洗涤条件严格性的增加，预期分离出与探针序列具有更高同源性的DNA。然而，上述SSC、SDS和温度条件的组合仅是示例性的。本领域技术人员可通过适当地组合上述或其他决定杂交严格性程度的因素(例如探针浓度、探针长度、杂交反应时间等)来得到与上述相同的杂交严格性。 
使用这样的杂交技术分离的DNA编码的多肽通常具有与本发明人所鉴定的多肽高度同源的氨基酸序列。在此，高度同源指至少40％或更多、优选60％或更多、更优选80％或更多、还更优选90％或更多、仍更优选至少95％或更多、以及再更优选至少97％或更多(例如98％～99％)的序列同一性。例如可使用Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(1993))测定氨基酸序列的同源性。基于该算法，已经开发了称为BLASTX的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。当使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数设定例如得分＝50和字长＝3。当使用BLAST和间隙BLAST程序时，使用各个程序的缺省参数。用于这些分析方法的特定技术是本领域熟知的。 
基于被分离作为与编码本发明人所分离的多肽的DNA序列高度同源的DNA的DNA片段，可使用基因扩增技术(PCR)(CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons Section出版，第6.1-6.4节)来获得与本发明人所分离的多肽在功能上等价的多肽。可基于编码本发明人所鉴定的多肽(SEQID NO：1和SEQ ID NO：5)的DNA序列的一部分设计引物，从而实现上述结果。 
<多肽片段> 
本发明还提供了本发明多肽的片段。这些片段是具有与上述本发明的多肽部分相同、而不是完全相同的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽片段通常包括8个氨基酸残基或更多，优选12个氨基酸残基或更多(例如，15个氨基酸残基或更多)。优选的片段的实例包括截短的多肽，例如缺少一组包括氨基端或羧基端的氨基酸残基的氨基酸序列，或缺少两组氨基酸残基的氨基酸序列，其中一组包括氨基端，另一组包括羧基端。此外，还优选特征在于结构或功能特性的片段，包括那些具有α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α-两亲区、β-两亲区、可变区、表面形成区、底物结合区以及高抗原性指数区的片段。还优选生物活性片段。生物活性片段介导本发明多肽的活性，并包括那些具有相似或改善的活性，或降低的不希望的活性的片段。例如，包括在动物、尤其是人中具有抗原性或免疫原性的片段。这些多肽片段优选保留本发明多肽的生物活性，例如抗原性。特定序列或片段的突变体同样构成了本发明的一个方面。优选的突变体是那些由于用保守氨基酸进行取代而不同于目标多肽的突变体，即其中的一个残基被性质相似的其他残基所取代的那些突变体。典型的取代是那些在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间，在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或在芳香族残基Phe和Tyr之间的取代。 
<多肽的制备> 
本发明的多肽可通过任何一种合适的方法制备。这样的多肽包括分离的天然存在的多肽，和通过基因重组、合成或其组合所制备的多肽。这些多肽的制备方法是本领域熟知的。例如可通过将插入有本发明的多核苷酸的载体转移至合适的宿主细胞中，并纯化在所得到的转化体中表达的多肽，从而制备重组多肽。另一方面，可使用例如固定有针对本发明多肽的抗体(下文中有描述)的亲和柱制备天然存在的多肽(Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等编辑(1987)，John Wiley & Sons出版，第16.1-16.19节)。用于亲和纯化的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明的多肽还可通过体外翻译方法(例如，参见“On thefidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbitreticulocyte lysate system.”Dasso，M.C.和Jackson，R.J.(1989)NAR 17：3129-3144)等进行制备。可通过例如使用合适的肽酶切割本发明的多肽来制备本发明的多肽片段。 
<探针和引物> 
本发明提供具有至少15个核苷酸或20个核苷酸的链长度的多核苷酸，例如，具有15～100个核苷酸、20～100个核苷酸、15～35个核苷酸或20～35个核苷酸的链长度的多核苷酸，其与本发明人所鉴定的多核苷酸互补(例如，具有核苷酸序列SEQ ID NO：1的多核苷酸或其互补链，和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的多核苷酸或其互补链)。在此，术语“互补链”定义为由A:T(对于RNA为A:U)和G:C碱基对组成的双链核酸的另一条链。另外，术语“互补”不仅包含与一段至少15个连续核苷酸的连续区完全匹配，还包含在该区内的至少70％、优选至少80％、更加优选90％和最优选95％或更高的同源性。可使用本文描述的算法确定同源性。用于检测 或扩增本发明的多核苷酸的探针和引物包括于这些多核苷酸中。典型的用作引物的多核苷酸长度为15～100个核苷酸，优选15～35个核苷酸。或者，用作探针的多核苷酸长度为至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸。它们包括本发明的DNA的至少一部分或完整的序列。当使用本发明的核苷酸作为引物时，对核酸扩增反应并没有特别限制，只要能获得期望的扩增产物即可。例如，反应可以选自DNA扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及RNA扩增反应，如NASBA。优选的方法是PCR。 
在一个实施方案中，这样的核苷酸是那些特异于编码本发明多肽的DNA的核苷酸。术语“特异于”指在常规杂交条件下、优选在严格杂交条件下，与编码某一多肽的DNA而非编码其他多肽的DNA杂交。 
用于扩增本发明人所鉴定的多核苷酸的一部分的引物的具体实例包括下列引物(i)和(ii)，其描述于本文的实施例中。 
(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，或能扩增与引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所扩增的相同基因组DNA区域的引物对；和 
(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或能扩增与引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所扩增的相同基因组DNA区域的引物对。 
如上所述，适用于本发明引物的核酸扩增反应并无特别限制，只要能够产生期望的扩增产物即可。例如，该反应可以选自DNA扩增反应，如PCR(聚合酶链式反应)、ICAN、LAMP、SDA和LCR， 以及RNA扩增反应，如NASBA。优选的方法是PCR。基于上述引物，本领域技术人员可设计适合用于实施的核酸扩增方法的突变引物。这样的突变引物可合成制备。通过使用突变引物进行核酸扩增反应并分析扩增产物，可很容易地评估突变引物是否能扩增与原始引物相同的基因组DNA区。 
这些引物可优选地用于检测试样中豚肠弯曲杆菌的存在。 
<载体、宿主细胞和多肽的制备> 
本发明还提供了用于生产携带本发明的多核苷酸的载体、保留本发明的多核苷酸或所述载体的宿主细胞的方法以及利用所述宿主细胞生产本发明的多肽的方法。 
本发明的载体没有限制，只要插入载体的DNA能够稳定保留即可。例如，当使用大肠杆菌作为宿主时，pBluescript载体(Stratagene)是优选的克隆载体。当使用载体来产生本发明的多肽时，表达载体是特别有用的。这些表达载体并无特别限制，只要它们在体外、在大肠杆菌中、在培养的细胞中或在体内表达多肽即可。然而，优选的实例包括用于体外表达的pBEST载体(ProMega)、用于在大肠杆菌中表达的pET载体(Invitrogen)、用于在培养的细胞中表达的pME18S-FL3载体(GenBank编号AB009864)、以及用于体外表达的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8：466-472(1988))等。本发明的DNA可通过常规方法插入载体中，例如，通过使用限制性内切酶位点的连接酶反应(Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等编辑，(1987)，John Wiley & Sons出版，第11.4-11.11节)。 
本发明的载体被导入的宿主细胞没有特别限制，可根据本发明的目的使用不同的宿主细胞。例如，细菌细胞(例如链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、大肠杆菌、链霉菌 属(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、真菌细胞(例如酵母、曲霉菌属(Aspergillus))、昆虫细胞(例如果蝇S2、草地夜蛾SF9)、动物细胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤细胞)和植物细胞是用于表达多肽的细胞的实例。可通过常规方法将载体转染入宿主细胞中，例如磷酸钙沉淀法、电穿孔法(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，(1987)John Wiley & Sons出版，第9.1-9.9节)、脂质转染胺法(GIBCO-BRL)、微注射法等。 
在宿主细胞中，可以将合适的分泌信号整合入目标多肽中，以便利于表达的多肽分泌入内质网腔、细胞周围空间或胞外环境中。这些信号可以是内源信号或来自与目标多肽不同物种的信号。 
当将本发明的多肽分泌入培养基时，收集该培养基以收集本发明的多肽。当本发明的多肽于胞内产生时，先裂解细胞，然后收集多肽。 
为了从重组的细胞培养物中收集和纯化本发明的多肽，可使用本领域已知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。 
<抗体> 
本发明提供了结合本发明多肽的抗体。在此，术语“抗体”指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体和包括Fab或其他的免疫球蛋白表达库产物在内的Fab片段。 
本发明的多肽、其片段和衍生物以及表达它们的细胞可用作免疫原用于产生结合本发明多肽的抗体。这样的抗体优选对本发明的多肽有免疫特异性。“免疫特异性”指与其他多肽相比，抗体对本发明多肽具有实质上更高的亲和力。另外，更优选地，本发 明的抗体包括具有中和豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素活性的抗体。 
可通过本领域技术人员已知的方法制备与本发明多肽结合的抗体。例如，可通过将本发明的多肽或其GST-融合蛋白注射到小动物如兔以获得血清从而得到多克隆抗体。通过硫酸铵沉淀；蛋白A或蛋白G柱；DEAE离子交换层析；偶联有本发明多肽的亲和柱等纯化血清，从而制备多克隆抗体。另一方面，可通过例如下列方法制备单克隆抗体：将本发明的多肽注射到小动物如小鼠，然后将其脾脏切除并碾碎以分离细胞。接着使用诸如聚乙二醇的试剂将细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并从这些融合的细胞(杂交瘤)中筛选得到能够产生结合本发明多肽的抗体的克隆。然后将所得到的杂交瘤移植到小鼠腹腔中，并收集小鼠腹水。可通过使用例如硫酸铵沉淀；蛋白A或蛋白G柱；DEAE离子交换层析；偶联有本发明多肽的亲和柱等纯化腹水来制备单克隆抗体。 
本发明的抗体还可用于检测和纯化试样中的本发明的多肽。 
<试样中弯曲杆菌属细菌的存在的检测> 
本发明提供了用于检测试样中弯曲杆菌属细菌的方法。试样中弯曲杆菌属细菌的存在的检测可用于多种目的，例如诊断弯曲杆菌感染、快速检测被豚肠弯曲杆菌污染的食物、食品加工各步骤的验证、以及鉴定造成食物中毒暴发的细菌。 
在一个实施方案中，本发明的检测方法是一种用于检测试样中一种或更多种弯曲杆菌属细菌存在的方法，其包括步骤：(a)使用特异于编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对的混合物对试样进行核酸扩增反应；和(b)基于扩增自编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的片段的存在或分子量确定弯曲杆菌属细菌的存在。 
在本发明中，“特异于基因组DNA的引物”不限于特异于编码弯曲杆菌属细菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA区域的引物，还包括特异于相应于基因组DNA区域的mRNA区的引物。 
可通过上述方法制备与编码弯曲杆菌属细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸引物。结合序列片段的引物没有特别限制；然而，其可被设计为具有合适的限制酶切位点，容许在PCR扩增后用限制性内切酶对引物片段进行切割。对于结合序列片段的引物长度没有特别限制，其长度为约20～50个核苷酸，优选约20～30个核苷酸。此外，可在5’端用放射性标记、荧光标记等对引物进行标记，使得在PCR扩增后可通过电泳等分离单链DNA。或者，为制备RNA分子，5’端引物可被设计为具有合适的启动子，例如，T7启动子序列，以允许DNA分子转录为RNA分子。 
本发明的方法可进一步包括通过PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法来鉴定弯曲杆菌属细菌种类的步骤。在PCR-RFLP法中，使用不同的限制性内切酶消化PCR-扩增的DNA，然后基于所产生片段的长度检测多态性。在本发明中待检测的弯曲杆菌属细菌的cdt基因序列随着细菌种类的不同而发生变化。因此，PCR-RFLP法可用于鉴定细菌种类。 
在该步骤中，首先通过序列比对确定依细菌种类不同而具有不同序列的位点(多态性位点)，然后选择识别任一细菌种类中的多态性位点的限制性内切酶。如果这样的限制性内切酶已经存在，则可通过进行靶向cdt基因的PCR、用限制性内切酶消化所产生的PCR产物、并通过电泳比较片段长度来确定包含多种弯曲杆菌属菌种的样本中具有多态性位点的菌种是否存在。本领域技术人员可通过将已知的弯曲杆菌属细菌cdt基因与本发明提供的豚肠 弯曲杆菌cdt基因进行比较，并选择合适的识别位点的限制性内切酶来鉴定具有不同序列的位点。 
本发明还提供了优选用于多态性检测方法的引物，该多态性检测方法基于获得自用不同的限制性内切酶消化通过包括PCR-RFLP在内的核酸扩增方法扩增的DNA的片段的长度。 
本发明中的一个应用PCR-RFLP法的实例是通过包含SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：19序列的引物对(用于本文实施例中的引物：cdtB通用U和cdtB通用R)扩增片段，并单独使用限制性内切酶EcoRI、XbaI、HindIII或Sau3AI或它们的组合来消化该片段；并可通过电泳来鉴定细菌种类。 
更具体地说，本发明的检测方法包括例如，用于同时检测试样中一种或更多种弯曲杆菌属细菌种类存在的方法，其包括使用下述任一种或更多种特异于编码弯曲杆菌属细胞致死肿胀毒素的DNA的引物对来进行试样核酸扩增反应的步骤： 
“(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，或能扩增与引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或能扩增与引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(iii)用于扩增编码乌普萨拉弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，或能扩增与引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”；和 
“(iv)用于扩增编码红嘴鸥弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，或能扩增与引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”。 
上述方法是通过扩增特异于豚肠弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌cdtB的基因组DNA或mRNA的区域来检测细菌的方法。 
用于上述方法的引物包括例如，用于豚肠弯曲杆菌的“包含序列SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的引物对(用于本文实施例中的引物：ChspBU7和ChspBR7)”和“包含序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的引物对(用于本文实施例中的引物：cdtB通用U和cdtB通用R)”，不限于此。可使用任何其他序列，只要它们是包含两条能特异性结合豚肠弯曲杆菌cdtB基因组DNA或mRNA的多核苷酸，并扩增使用豚肠弯曲杆菌cdtB基因组DNA为模板以及“包含序列SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的引物对”或“包含序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的引物对”所扩增的区域或相应的mRNA区域的引物对即可。在此，“特异性结合”指从“结合”中排除了偶发的或非特异性的结合。 
图17显示了上述用于检测豚肠弯曲杆菌的引物所结合的cdtB基因的位点。 
或者，关于乌普萨拉弯曲杆菌，代表性的引物包括“包含序列SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的引物对(用于本文实施例中的引物：CupspBU3和CupspBR4)”，但不限于这些序列。可使用任何其他序列，只要它们是能扩增使用胚胎弯曲杆菌cdtB基因组DNA为模板以及“包含序列SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的引物对”所扩增的区域或相应的mRNA区域的引物对即可。 
此外，关于胚胎弯曲杆菌，代表性的引物包括“包含序列SEQID NO：34和SEQ ID NO：35的引物对(用于本文实施例中的引物：ClaspBU4和ClaspBR4)”，但不限于这些序列。可使用任何其他序列，只要它们是能扩增使用胚胎弯曲杆菌cdtB基因组DNA为模板以及“包含序列SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的引物对”所扩增的区域或相应的mRNA区域的引物对即可。 
在本发明的方法中，上述引物对(i)-(iv)可独立使用。或者，可以在单次核酸扩增反应中同时使用多个引物对。其中在单次反应(例如本文实施例中)使用多个PCR引物的PCR方法称为“多重PCR”。因此，可通过对PCR产物进行电泳并检测条带大小来鉴定不同的菌种。本发明提供了通过核酸扩增来检测弯曲杆菌属细菌的方法，代表性地包括上述使用优选用于扩增不同核酸区域的引物及其组合的多重PCR。在本发明中，对核酸扩增方法的类型没有限制，只要其产生目标扩增产物即可。有可能选择任何类型的已知核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)法(包括RT-PCR法)、ICAN法、LAMP法、SDA法、LCR法和NASBA法。PCR法是优选用于本发明的核酸扩增方法的具体实例。本发明的方法可通过实时PCR等方法作为一种定量方法使用。 
在本发明的方法中，可使用上述引物对(i)-(iv)并结合以下引物对进行单次核酸扩增反应： 
“(v)用于扩增编码空肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27(用于本文实施例中的引物：Cj-CdtBU5和Cj-CdtBR6)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：27所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(vi)用于扩增编码大肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组 DNA的引物对SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29(用于本文实施例中的引物：Cc-CdtBU5和Cc-CdtBR5)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”，和 
“(vii)用于扩增编码胚胎弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31(用于本文实施例中的引物：Cf-CdtBU6和Cf-CdtBR3)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：31所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”。具体而言，本发明提供了在试样中能同时检测六种弯曲杆菌属细菌：豚肠弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的方法。本发明人证实了可使用上述引物组合的核酸扩增反应同时检测上述6种弯曲杆菌属细菌。如在本文实施例中所证实的，本发明的方法具有非常高的特异性，因为其能检测目标弯曲杆菌属细菌而不会错误地测得其他种类的弯曲杆菌属细菌。 
在上述使用特异于六种弯曲杆菌属细菌的引物进行核酸扩增的步骤之后，本发明的方法还包括“基于扩增自弯曲杆菌属cdt基因组DNA或mRNA的片段的存在或分子量确定弯曲杆菌属细菌存在的步骤”或“对扩增自弯曲杆菌属cdt基因组DNA或mRNA的片段的数量定量的步骤”。 
本发明提供了用于本发明检测方法的试剂盒。除引物对之外该试剂盒还包括操作指南。该试剂盒可进一步包括其他材料，例如荧光探针、嵌入剂、用于制备多核苷酸的试剂和阳性或阴性引物对。 
本发明的试剂盒的第一个实施方案包括包含至少一种下列引物对的试剂盒： 
“(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，或能扩增与引物对SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，或能扩增与引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(iii)用于扩增编码乌普萨拉弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33，或能扩增与引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”；和 
“(iv)用于扩增编码红嘴鸥弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，或能扩增与引物对SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”。 
或者，上述试剂盒可进一步包含： 
“(v)用于扩增编码空肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27(用于本文实施例中的引物：Cj-CdtBU5和Cj-CdtBR6)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：27所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”， 
“(vi)用于扩增编码大肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29(用于本文实施例中的引物：Cc-CdtBU5和Cc-CdtBR5)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29所扩增的相同基因组DNA区域的引物 对”，和 
“(vii)用于扩增编码胚胎弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31(用于本文实施例中的引物：Cf-CdtBU6和Cf-CdtBR3)，或能扩增与引物对SEQ IDNO：30和SEQ ID NO：31所扩增的相同基因组DNA区域的引物对”。因此，单独特异于六种细菌：豚肠弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌中每一种的引物均包含于本发明的试剂盒中，使得通过多重PCR等对上述弯曲杆菌属细菌的混合感染的同时检测成为可能。 
本发明检测方法的另一实施方案包括用于检测试样中豚肠弯曲杆菌存在的方法，其包括步骤： 
(a)将试样与结合到本发明多肽的抗体接触； 
(b)测定试样和结合到本发明多肽的抗体之间的结合；以及 
(c)如果在(b)步骤中检测到结合则确定豚肠弯曲杆菌存在。 
该检测方法可使用通过上述方法制备的抗体。用于测定试样和结合本发明多肽的抗体之间的结合的方法包括下述方法：蛋白质印迹、斑点印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光测定。可通过使用这些方法检测试样中的豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素来检测试样中豚肠弯曲杆菌的存在。 
此外，可将上述抗体与其他材料相组合并装入试剂盒以用于本发明的检测方法。除了上述抗体和检测试剂外，这样的试剂盒还可包括蒸馏水、盐、缓冲液、蛋白稳定剂、防腐剂等。或者，为制备ELISA试剂，可将抗体与用于检测酶标记的显色底物和用于洗涤固相的洗涤液相组合。此外，试剂盒中可附加描述测定程序的操作指南。 所有在此引用的现有技术文献均引入本说明书中作为参考。 
实施例
在下文，用实施例来对本发明进行具体描述；然而，其不应当被视为限制。 
[实施例1]来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株的cdt基因的测序 
通过常规方法从Ch022株分离基因组基因。 
对100ng分离的Ch022基因组基因进行PCR，使用了Ex TaqPCR试剂盒(TaKaRa)和能够扩增空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物(图1)。每种引物的浓度为0.5μM。将引物与5μl 10x Ex Taq缓冲液、4μl dNTPs和1.25U Ex Taq混合。用无菌水将体积调节至50μl。对PCR混合物进行由下述程序组成的PCR：30个94℃30秒、50℃30秒和72℃30秒的循环。在2％琼脂糖凝胶上对所得到的PCR产物进行电泳，并用溴乙啶染色。脱色后，在紫外线下观察扩增条带(图1)。 
通过常规方法纯化所得到的特异性扩增的720-bp条带，并使用通用引物进行测序。根据操作指南，使用BigDye终止子试剂盒1.1版(Applied Biosystems)进行测序。 
基于所测定的序列设计基因组步移引物。通过多轮上游和下游基因组步移测定了覆盖cdt基因(SEQ ID NO：5)的4,069bp的全长基因序列。此外，发现豚肠弯曲杆菌Ch022株的cdtA、cdtB和cdtC基因的ORF长度分别为798bp(266aa；SEQ ID NO：6)、804bp(268aa；SEQ ID NO：7)和537bp(178aa；SEQ ID NO：8)。将这些序列与空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtA、cdtB和cdtC基因的核苷酸序列进行比较。豚肠弯曲杆菌cdtA和cdtC基因具有与空肠弯曲杆菌cdtA和cdtC基因最高的同源性，而豚 肠弯曲杆菌CdtB基因则具有与大肠弯曲杆菌CdtB基因最高的同源性(表1)。同时，对推测的氨基酸序列CdtA、CdtB和CdtC的同源性比较揭示了豚肠弯曲杆菌的三个亚基显示与大肠弯曲杆菌的Cdt亚基具有最高的同源性。对于CdtA、CdtB和CdtC，同源性分别为35.7％、60.5％和28.9％(表1)。 
[表1] 
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豚肠弯曲杆菌cdt基因的插入位置与空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的不同。在cdtA基因的下游发现了一个与螺杆菌(Helicobacter)糖基转移酶同源性为53.6％(128aa/239aa)的ORF。同时，在cdtC基因的下游发现了一个与脱氮硫杆菌(T.denitrificans)糖转移酶同源性为56.0％(155aa/277aa)的ORF。此外，豚肠弯曲杆菌CdtB推测的氨基酸序列具有已报道为其他种类的细菌所产生的CdtB的DNA酶活性所必需的保守的氨基酸残基(Yamasaki S，等，2006.Toxin Rev，25，61-88.)(图2)。 
[实施例2]来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株的重组CdtB蛋白(Ch-rCdtB)的制备 
通过PCR扩增其中已除去被预测为CdtB信号序列的CdtB的氨基酸1-17的来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株的cdtB基因，并克隆入pET-28(a)质粒载体中，以获得pWSY-2-一种来自泰国 人的豚肠弯曲杆菌Ch022株cdtB基因的重组克隆。 
用pWSY-2转化用于重组蛋白表达的大肠杆菌BL-21(DE3)(Novagen)。在含有20μg/ml卡那霉素的600ml LB肉汤中大量培养所得到的克隆，然后用0.5mM IPTG在37℃下诱导3小时表达重组蛋白(Ch-rCdtB)。将表达Ch-rCdtB的大肠杆菌进行超声破碎。使用镍螯合的Sepharose(GE Healthcare)来亲和纯化蛋白，并通过Superdex 75(GE Healthcare)凝胶过滤进行进一步纯化(图3)。 
[实施例3]来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株的CdtB抗体的制备 
将250μg纯化的Ch-rCdtB与等体积的弗氏完全佐剂进行混合。将所得到的乳液以皮下和肌内注射到兔体内(kbs：NZW)。然后，在第一次注射后四周开始，以两周间隔持续约八周使用包含250μg的纯化的Ch-rCdtB和等体积的弗氏不完全佐剂的乳液对兔共进行五次免疫。从而制备得到抗血清，然后通过凝胶双扩散法和蛋白质印迹法检测其效价和特异性(图4)。 
通过凝胶双扩散法估计抗Ch-rCdtB抗血清的效价为1∶64。同时，抗体和空肠弯曲杆菌rCdtB之间不存在沉淀线。因而，其揭示了豚肠弯曲杆菌CdtB在免疫学上不同于空肠弯曲杆菌CdtB(图4C)。使用纯化的Ch-rCdtB和来自豚肠弯曲杆菌Ch022株的粗毒素溶液进行蛋白质印迹。抗体与相应于纯化的Ch-rCdtB(分子量约30kD)和来自豚肠弯曲杆菌Ch022株粗毒素溶液的CdtB的条带特异性反应。因此，其暗示所制备的针对Ch-rCdtB的抗体的特异性是非常高的(图4B)。 
[实施例4]豚肠弯曲杆菌ATCC 35217的cdt基因的测序 
通过常规方法从豚肠弯曲杆菌ATCC 35217株分离基因组基因。 
使用了简并引物(GNW和WMI)和Ex Taq PCR试剂盒(TaKaRa)，对100ng分离的豚肠弯曲杆菌ATCC 35217基因组基因进行PCR(图5)。每种引物的浓度为0.5μM。将引物与5μl10xEx Taq缓冲液、4μl dNTPs和1.25U Ex Taq混合。用无菌水将体积调节至50μl。对PCR混合物进行由下述程序组成的PCR：30个94℃30秒、42℃30秒和72℃60秒的循环。在1.5％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物，并用溴乙啶染色。脱色后，在紫外线下观察扩增条带(图5)。 
使用常规方法纯化所得到的特异性扩增的960-bp条带，并克隆到pT7Blue质粒载体(Novagen)中以获得pChATcdtA-B4。使用与该质粒杂交的M 13引物对所得到的pChATcdtA-B4质粒进行测序。根据操作指南，使用BigDye终止子试剂盒1.1版(AppliedBiosystems)进行测序。 
通过BLAST对所测定的序列进行同源性搜索。显示该序列与cdtA和cdtB基因的一部分具有同源性。 
基于所测定的序列设计基因组步移引物。通过多轮上游和下游基因组步移测定覆盖了cdt基因(SEQ ID NO：1)的3,399bp全长基因序列。此外，鉴定了CdtA、CdtB和CdtC的ORF。CdtA、CdtB和CdtC的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。 
[实施例5]使用HeLa细胞进行CTD活性测定(通用于泰国人和ATCC菌株) 
在37℃微需氧条件下(5％CO2、10％O2和85％N2)在马血琼脂培养基上培养豚肠弯曲杆菌Ch022和ATCC 35217株48小时。将所得到的细菌细胞以1.0的OD600悬浮于MEM中，并进行超声破碎。离心后，上清液用薄膜滤器(孔径0.22μm)灭菌。对所制备 的粗毒素溶液样本进行连续稀释并添加到HeLa细胞中。在48和120小时后观察细胞形态的改变(图6)。对于泰国人菌株，向该菌株中同时添加抗Ch-rCdtB抗血清以评价CDT活性的特异性。此外，在48小时后，使用流式细胞仪对细胞DNA含量进行定量(图7)。毒素的效价定义为导致50％或更多细胞发生膨胀的粗毒素溶液的最大稀释因数。 
将豚肠弯曲杆菌的粗毒素溶液加入HeLa细胞中，其在直至16x的稀释下仍表现出48小时后的细胞膨胀活性和120小时后的细胞致死活性(图6)。这些活性被抗Ch-rCdtB血清所中和。此外，在添加粗毒素溶液48小时后使用流式细胞仪对细胞DNA含量进行定量。结果清楚地表明细胞被G2/M相捕获。在没有添加粗毒素溶液的阴性对照中，或当粗毒素溶液和抗Ch-rCdtB血清都添加到细胞时，观察到对应于G0/G1而不是G2/M相捕获的一个高峰(图7)。 
上述结果表明豚肠弯曲杆菌产生了具有毒素活性的CDT。该毒素活性被归因于CDT，因为其被抗Ch-rCdtB抗血清所中和。 
[实施例6]弯曲杆菌属细菌的培养基、培养条件和试剂 
使用马血琼脂培养基培养弯曲杆菌属细菌，该培养基包含CM271 BLOOD AGAR BASE No.2(OXOID；Basingstoke，UK)[7.5g 蛋白胨、1.25g肝消化物、2.5g酵母膏、2.5g氯化钠、6.0g琼脂/500ml蒸馏水，pH 7.4±0.2，25℃]，补充有5％除菌的去纤维蛋白马血(Nippon Bio-Supp.Center，Tokyo)。对于简明弯曲杆菌(Campylobacter concisus，以下缩写为“C.concisus”)，另外在每个平板中加入0.25ml含有6％甲酸钠和6％富马酸的溶液。弯曲杆菌属细菌在37℃微需氧条件(10％CO2、5％O2和85％N2)下使用低温O2/CO2培养箱MODEL-9200(WAKENYAKU，CO.，LTD.)培养 2～4天。简明弯曲杆菌在10％CO2、10％H2和80％N2的无氧条件下培养3～7天。 
大肠杆菌在37℃下的LB-Lenox液体培养基(5.0g Bacto胰蛋白胨、2.5g Bacto酵母膏、2.5g NaCl/500ml蒸馏水；DifcoLaboratories，USA)或LB-Lenox琼脂培养基(5.0g Bacto胰蛋白胨、2.5g Bacto酵母膏、2.5g NaCl、7.5g琼脂/500ml蒸馏水；DifcoLaboratories)中培养16-20小时。 
所有其他试剂均购自Nacalai Tesque、Wako Pure ChemicalIndustries或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)。限制性内切酶、Takara Ex Taq和多重PCR分析试剂盒均购自Takara Bio。Seakem GTG琼脂糖(一种用于电泳的琼脂糖)购自Takara Bio。分子量标记购自New England Biolabs(USA)。 
[实施例7]PCR和PCR模板DNA的制备 
从平板上刮取菌落，加入200μl的TE溶液。悬浮液加热10分钟。加热处理后将悬浮液在12,800x g下离心10分钟。收集所得到的上清液并用作模板DNA。将大肠杆菌C600株用作阴性对照。 
使用GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer)或GeneAmpPCR System 9700(PerkinElmer)进行所有PCR实验。使用MUPID(ADVANCE)在100V下于1x TAE缓冲液[40mM Tris-乙酸盐(pH 8.5)，1mM EDTA]中进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，使用1.0μg/ml溴乙啶(Sigma)染色凝胶15分钟。用蒸馏水脱色后，使用凝胶成像系统Gel Doc 2000(Bio-Rad)在紫外线(260nm)下对PCR产物进行分析和拍照。 
[实施例8]使用针对空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物或针对ATCC菌株的cdtB基因引物对 豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株的cdtB基因进行PCR 
对豚肠弯曲杆菌cdt基因进行测序并与其他种类弯曲杆菌属细菌cdt基因序列进行比较。结果显示在空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物的结合位点处存在几处突变(标记为红色)(图8)。当使用空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物时，对豚肠弯曲杆菌ATCC菌株进行的PCR产生了一条与其他种类细菌相比更微弱的扩增条带或没有产生条带。3’端区域的同源性对于PCR引物而言是特别重要的。然而，在豚肠弯曲杆菌ATCC菌株cdtB基因的引物结合位点的3’端区发现了几处突变(图8)。在引物结合位点处，特别是在3’端区的突变被认为是造成豚肠弯曲杆菌ATCC菌株cdtB基因的易变的PCR扩增的原因。因此，设计了用于豚肠弯曲杆菌ATCC菌株cdtB基因的通用引物，并通过PCR与常规的通用引物进行比较。 
菌株： 
豚肠弯曲杆菌ATCC35217株 
豚肠弯曲杆菌Ch022株 
通用引物： 
ComBU：5’-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3’(SEQ ID NO：14) 
ComBR：5’-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3’(SEQ ID NO：15) 
用于ATCC菌株的引物： 
ChATcomBU：5’-ACTTGGAATATGCAAGGA-3’(SEQ ID NO：16) 
ChATcomBR：5’-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3’(SEQ ID NO： 17) 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的1μl PCR模板与引物(终浓度：1μM)、TaKaRa Ex taq(0.25U)、dNTPs(各200μM)和10x ExTaq缓冲液混合。以40μl的总体积进行PCR反应。PCR条件如下：94℃3分钟，和30个94℃30秒、50℃30秒和72℃30秒的循环，然后72℃5分钟。 
结果： 
空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物可以扩增来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株，而不能扩增豚肠弯曲杆菌ATCC35217株。同时，ATCC菌株的引物可以同时扩增来自泰国人的Ch022和ATCC35217株的豚肠弯曲杆菌(图9)。 
[实施例9]用于广谱检测包括豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株在内的弯曲杆菌属细菌的PCR 
空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdtB基因的通用引物在之前的实验中仅产生一条微弱的扩增条带，并且在此描述的针对豚肠弯曲杆菌ATCC35217株的实验中没有可检测到的条带。因此，使用新设计的通用引物进行PCR，以使豚肠弯曲杆菌cdtB基因的扩增更稳定。 
引物： 
cdtB通用U：5’-ACTTGGAATWTGCAAGGM-3’(SEQ ID NO：18) 
cdtB通用R：5’-CYAAAWKTTAYHGGAAARTG-3’(SEQ IDNO：19) 
(W：A或T；M：A或C；Y：C或T；K：G或T；H：A、C 或T；R：A或G) 
菌株： 
空肠弯曲杆菌81-176株 
大肠弯曲杆菌Co1-243株 
胚胎弯曲杆菌Co1-187株 
红嘴鸥弯曲杆菌ATCC43675株 
乌普萨拉弯曲杆菌ATCC43954株 
豚肠弯曲杆菌ATCC35217株 
豚肠弯曲杆菌Ch022株 
瑞士弯曲杆菌(C.helveticus)ATCC51209株 
大肠杆菌C600株 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的1μl PCR模板与引物(终浓度：1μM)、TaKaRa Ex taq(0.25U)、dNTPs(各200μM)和10x ExTaq缓冲液混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃3分钟，和30个94℃30秒、50℃30秒和72℃30秒的循环，然后72℃5分钟。 
结果： 
对于所使用的所有菌株都观察到有效的PCR扩增条带(图10)。 
[实施例10]通过DNA杂交评估豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株的cdtB基因的拷贝数 
常规的通用引物和新设计的豚肠弯曲杆菌ATCC35217株的引物都可以在豚肠弯曲杆菌Ch022株中进行扩增。这暗示豚肠弯曲杆菌Ch022株具有两个拷贝的cdtB基因。因而，通过DNA杂交估计了豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株cdtB基因的 拷贝数，其中使用特异于每种菌株的探针。 
菌株： 
空肠弯曲杆菌81-176株 
豚肠弯曲杆菌ATCC35217株 
豚肠弯曲杆菌Ch022株 
引物： 
针对豚肠弯曲杆菌Ch022株的cdtB探针 
ComBU：5’-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3’(SEQ ID NO：14) 
ComBR：5’-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3’(SEQ ID NO：15) 
针对豚肠弯曲杆菌ATCC菌株的cdtB探针 
ChATcomBU：5’-ACTTGGAATATGCAAGGA-3’(SEQ ID NO：22) 
ChATcomBR：5’-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3’(SEQ ID NO：23) 
探针制备： 
通过煮沸法从菌株中制备得到PCR模板。将1μl的各种模板与用于菌株的引物(终浓度：0.5μM)、TaKaRa Ex taq(0.25U)、地高辛配基标记的dNTPs(Roche Diagnositics)(各200μM)和10x ExTaq缓冲液混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃3分钟，30个94℃30秒、50℃30秒和72℃30秒的循环，然后72℃5分钟。 
在1.5％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物，并用溴乙啶染色。脱色后，将检测到的条带切下并用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用作探针。 
染色体基因组DNA的制备和限制性内切酶消化： 
使用ISOPLANT试剂盒(NIPPON GENE)纯化染色体基因组DNA。从平板上刮取细菌细胞，将约30mg的细胞悬浮于150μl提取缓冲液中，并加入300μl裂解缓冲液裂解。50℃温育15分钟后，加入150μl醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，并将其在冰上放置15分钟。对水相进行乙醇沉淀。将沉淀溶于TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]，作为DNA溶液使用。 
使用分光光度计对DNA进行定量。在终体积50μl和37℃下，使用EcoRV或DraI(20U)对1μg的各基因组DNA消化5小时。 
DNA杂交： 
在1.5％琼脂糖凝胶上电泳经酶消化的细菌基因组，然后用溴乙啶染色。脱色后，确认基因组DNA已经被限制性内切酶消化。然后，用0.25N HCl处理凝胶15分钟。用蒸馏水洗涤两次后，将凝胶用0.5N NaOH处理30分钟。在真空印迹装置中使用10xSSC处理90分钟，将DNA从凝胶转移至尼龙膜。每片尼龙膜加入2ml预杂交缓冲液[50％甲酰胺、5x SSC、0.01％SDS、1mMEDTA、Denhardt溶液、0.02％BSA、100μg/ml热变性的鲱鱼精子DNA]。在42℃温育膜1小时。然后，对豚肠弯曲杆菌Ch022或ATCC菌株的cdtB探针进行热变性，并在杂交缓冲液中以25ng/ml的浓度添加到尼龙膜上。在42℃下温育尼龙膜过夜，然后在室温下用含有0.1％SDS的2x SSC洗涤2次共15分钟，并在65℃下用含有0.1％SDS的0.1x SSC洗涤2次共30分钟。然后，用洗涤缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH 7.5)，0.15M NaCl，0.3％吐温20]洗涤尼龙膜2分钟，并在室温下用封闭缓冲液(缓冲液1[0.1MTris-HCl(pH 7.5)，0.15M NaCl]，1x封闭存储溶液)平衡30分钟。将抗-地高辛-碱性磷酸酶复合物(7,500U/ml)在新鲜的封闭缓冲液中稀释10,000倍，并加至尼龙膜上。室温下摇动30分钟后，用缓 冲液1洗涤膜2次共15分钟，并使用AP9.5缓冲液[0.1MTris-HCl(pH 9.5)，0.1M NaCl，50mM MgCl2]平衡5分钟。最后，加入用AP9.5缓冲液(4.5μl NBT，3.5μl BCIP/1ml AP9.5缓冲液)稀释的显色底物溶液NBT/BCIP，将膜在暗处室温下温育30分钟显色。 
结果： 
对豚肠弯曲杆菌ATCC和来自泰国人的Ch022株的染色体基因组DNA使用EcoRV消化，并用ATCC菌株cdtB探针进行了DNA杂交。结果，在两种菌株中检测到相同位置处的条带。此外，当使用其他限制性内切酶(DraI)时，也在相同位置检测到条带。因此，暗示这两种菌株具有ATCC菌株型的cdtB基因同系物(以下称为“ATCC型”)(图11)。当使用来自泰国人的Ch022株的cdtB探针进行DNA杂交时，仅在来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株中检测到条带。此外，当使用DraI对DNA进行消化时，用ATCC株的cdtB探针检测得到的条带的位置与用Ch022株的cdtB探针检测得到的条带不同(图11)。因此，暗示来自泰国人的豚肠弯曲杆菌Ch022株具有如下两个拷贝的cdtB基因：一个ATCC型cdtB基因和一个来自泰国人的Ch022株的cdtB基因同系物(以下称为“泰国人型”)。 
[实施例11]使用特异性引物用于检测豚肠弯曲杆菌ATCC型cdtB基因和泰国人型cdtB基因的PCR 
对豚肠弯曲杆菌ATCC和泰国人菌株的cdtB基因进行了比较。鉴定了特异于每种菌株的区，并基于所述区设计特异性引物。针对几种动物来源的豚肠弯曲杆菌菌株进行PCR，以评估它们是否含有ATCC型和泰国人型cdtB基因。 
特异于豚肠弯曲杆菌泰国人型cdtB基因的引物： 
Ch022spBU 1：5’-TATCAGGCAATAGCGCAG-3’(SEQ ID NO：20) 
Ch022spBR 1：5’-GGTTTGCACCTACATCAAC-3’(SEQ ID NO：21) 
特异于豚肠弯曲杆菌ATCC型cdtB基因的引物： 
ChATspBU2：5’-CCTAGTAGCGCTACTTAG-3’(SEQ  ID  NO：22) 
ChATspBR2：5’-TACAAAGCTTGGGCGAAG-3’(SEQ ID NO：23) 
菌株： 
豚肠弯曲杆菌Ch1-1、Ch87-4、Ch2037、Ch2039、Ch2973、Ch3839、Ch3857、ATCC35217、Ch022 
大肠杆菌C600 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的1μl PCR模板与引物(终浓度：0.5μM)、TaKaRa Ex taq(0.25U)、dNTPs(各200μM)和10xEx Taq缓冲液混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃3分钟，30个94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒的循环，然后72℃5分钟。在2％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物。用溴乙啶染色凝胶，然后脱色。 
结果： 
证实了被检测的所有7株豚肠弯曲杆菌菌株都具有泰国人型(图12)和ATCC型(图13)cdtB基因。仅ATCC菌株不具有泰国人-型cdtB基因。 
[实施例12]使用通用引物对豚肠弯曲杆菌ATCC型cdtB基因和泰国人型cdtB基因进行PCR 
对豚肠弯曲杆菌ATCC型和泰国人型cdtB基因进行互相比较。鉴定了基因的共有区，并基于这些区进行通用引物的设计。扩增产物的大小被设计为与以前报道的能够检测空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的多重PCR一致。对几种动物来源的豚肠弯曲杆菌菌株进行PCR以评估引物。 
用于检测豚肠弯曲杆菌ATCC型和泰国人型cdtB基因的通用引物： 
ChspBU7：5’-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3’(SEQ ID NO：24) 
ChspBR7：5’-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3’(SEQ ID NO：25) 
(W：A或T；K：G或T) 
菌株： 
豚肠弯曲杆菌Ch1-1、Ch87-4、Ch2037、Ch2039、Ch2973、Ch3839、Ch3857、ATCC35217、Ch022 
大肠杆菌C600 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的1μl PCR模板与特异性引物(终浓度：0.5μM)、TaKaRa Ex taq(0.25U)、dNTPs(各200μM)和10x Ex Taq缓冲液混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃3分钟，30个94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒的循环，然后72℃5分钟。在2％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物。用溴乙啶染色凝胶，然后脱色。 
结果： 
对于被检测的所有7株豚肠弯曲杆菌菌株都成功地扩增到豚肠弯曲杆菌cdtB基因(图14)。 
[实施例13]用于检测空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胚胎弯 曲杆菌和豚肠弯曲杆菌的基于CdtB基因的多重PCR的开发 
由于已经开发了能够有效地扩增豚肠弯曲杆菌ATCC型和泰国人型cdtB基因的引物，因此将该引物整合入常规的多重PCR中，以开发能够检测更广谱的弯曲杆菌属细菌种类的多重PCR。 
菌株： 
空肠弯曲杆菌81-176株 
大肠弯曲杆菌Co1-243株 
胚胎弯曲杆菌Co1-187株 
红嘴鸥弯曲杆菌ATCC43675株 
乌普萨拉弯曲杆菌ATCC43954株 
豚肠弯曲杆菌Ch022株 
瑞士弯曲杆菌ATCC51209株 
简明弯曲杆菌ATCC33237株 
大肠杆菌C600株 
引物： 
Cj-CdtBU5：5’-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3’(终浓度：0.25μM)(SEQ ID NO：26) 
Cj-CdtBR6：5’-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3’(终浓度：0.25μM)(SEQ ID NO：27) 
Cc-CdtBU5：5’-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3’(终浓度：0.5μM)(SEQ ID NO：28) 
Cc-CdtBR5：5’-TCATTGCCTATGCGTATG-3’(终浓度：0.5μM)(SEQ ID NO：29) 
Cf-CdtBU6：5’-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3’(终浓度：0.5μM)(SEQ ID NO：30) 
Cf-CdtBR3：5’-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3’(终浓度：0.5 μM)(SEQ ID NO：31) 
ChspBU7：5’-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3’(终浓度：0.5μM)(SEQ ID NO：24) 
ChspBR7：5’-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3’(终浓度：0.5μM)(SEQ ID NO：25) 
(W：A或T；K：G或T) 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的1μl PCR模板与特异性引物、0.2μl多重PCR Mix 1(Takara Bio)和20μl 2x多重PCR Mix2(Takara Bio)混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃1分钟，30个94℃30秒、56℃90秒和72℃90秒的循环，然后72℃5分钟。在2％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物。用溴乙啶染色凝胶，然后脱色。 
结果： 
当存在任何一种空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌和豚肠弯曲杆菌时，靶向四种细菌的多重PCR都能够有效检测cdtB基因。此外，甚至在多种细菌存在的情况下，还观察到菌种特异性的基因扩增(图15)。 
[实施例14]靶向几乎所有弯曲杆菌属病原菌的新型多重PCR 
在弯曲杆菌属细菌中，空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌和豚肠弯曲杆菌具有过氧化氢酶活性并在42℃下生长。这些种类的细菌被称为“嗜热弯曲杆菌”，大多数与食物中毒有关的菌种即属于这个组。本发明人开发了能够同时检测六种弯曲杆菌属细菌的多重PCR，其中除了属于嗜热弯曲杆菌的五种细菌外还包括胚胎弯曲杆菌，后者对于人类和动物例如家畜具有致病性。 
菌株： 
空肠弯曲杆菌81-176株 
大肠弯曲杆菌Co1-243株 
胚胎弯曲杆菌Co1-187株 
红嘴鸥弯曲杆菌ATCC43675株 
乌普萨拉弯曲杆菌ATCC43954株 
豚肠弯曲杆菌Ch022株 
引物： 
Cj-CdtBU5：5’-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3’(终浓度：0.25μM)(SEQ ID NO：26) 
Cj-CdtBR6：5’-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3’(终浓度：0.25μM)(SEQ ID NO：27) 
Cc-CdtBU5：5’-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：28) 
Cc-CdtBR5：5’-TCATTGCCTATGCGTATG-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：29) 
Cf-CdtBU6：5’-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：30) 
Cf-CdtBR3：5’-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：31) 
ChspBU7：5’-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：24) 
ChspBR7：5’-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：25) 
CupspBU3：5’-CATAGTTAGTCGCGTCCA-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：32) 
CupspBR4：5’-CCAGTTAATCTCAGGACG-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：33) 
ClaspBU4：5’-GTATCCATGCTTTATCAAGA-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：34) 
ClaspBR4：5’-GTAGGCCTATAAGAGAACC-3’(终浓度：0.375μM)(SEQ ID NO：35) 
(W：A或T；K：G或T) 
PCR： 
将通过煮沸法从各种菌株制备得到的0.5μl PCR模板在给定的终浓度下与0.2μl多重PCR Mix 1(Takara Bio)和20μl 2x多重PCR Mix 2(Takara Bio)混合。在40μl的总体积下进行PCR。PCR条件如下：94℃1分钟，30个94℃30秒、56℃90秒和72℃90秒的循环，然后72℃5分钟。在2％琼脂糖凝胶上电泳所得到的PCR产物。用溴乙啶染色凝胶，然后脱色。 
结果： 
当存在任何一种弯曲杆菌属细菌时，靶向六种细菌的多重PCR都能够有效检测cdtB基因。此外，甚至在所有六种细菌存在的情况下还观察到菌种特异性的基因扩增(图16)。 
工业实用性
本发明提供了可以有效地用于检测豚肠弯曲杆菌的cdt基因。证实了通过cdt基因的毒素产生。 
如上所述，从公共卫生的角度看，豚肠弯曲杆菌是一种重要的细菌，因为它导致食物中毒。然而，由于常规的培养和检测方法仅靶向空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌，因此很难检测到豚肠弯曲杆菌。此外，由于豚肠弯曲杆菌cdt基因相对于空肠弯曲杆菌、 大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌cdt基因的同源性不高(大约60％)，因此使用已知的用于相同属细菌的基因探针难以鉴定本发明的豚肠弯曲杆菌cdt基因。 
由于有可能特异性检测豚肠弯曲杆菌，因此本发明促使快速和精确地测定导致食物中毒等的细菌成为可能。本发明的方法不仅在临床上非常有用，而且还可用于食品生产等的工艺管理、工厂卫生管理等。 
本发明还提供了包括豚肠弯曲杆菌在内的六种弯曲杆菌属细菌的检测方法。本发明的检测方法靶向的弯曲杆菌属细菌除了胚胎弯曲杆菌以外都是能够生长于42℃微需氧条件下的细菌种类，因而被称为“嗜热弯曲杆菌”。几乎所有与食物中毒有关的弯曲杆菌属细菌都被认为属于嗜热弯曲杆菌。本发明使得简单和快速地鉴定食物中毒细菌成为可能。 
序列表
<110>公立大学法人大阪府立大学(OSAKA PREFECTURE UNIVERSITY)
     扶桑药品工业株式会社(FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES，LTD.)
<120>靶向细胞致死肿胀毒素检测属于弯曲杆菌属的细菌
<130>F2-A0702P
<140>PCT/JP2008/065532
<141>2008-08-29
<150>JP 2007-226013
<151>2007-08-31
<160>35
<170>PatentIn 3.4版
<210>1
<211>3399
<212>DNA
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<220>
<221>CDS
<222>(962)..(1600)
<220>
<221>CDS
<222>(1601)..(2422)
<220>
<221>CDS
<222>(2425)..(3177)
<400>1
gcgtggctct cataggtcac gttctacact tttcatatag tgagattatg agtatggatg    60
tgggcgagta taatgagtat ttaaaggaag ctatggaaat tatcaaatct ttaaatgcgt    120
gtgataaatg ataaaaagcg ataaaacgca ttatttgtgc gagcaggcaa taaatcaaca    180
atgtataaaa aaagatagat aagcgtagca taaataatag atgaagcaat tatatactca    240
tcattgtttg taaatagcaa aacaataaac gaaatgatgc aaagtgcaat aaaaattgta    300
aatcttttca taggtaaatt atacaaaaaa aggataaaaa aatgcaagat atcggagtcg    360
gtcttagtat tgggttagca tttcaaggca tcgcatcaat aaaaacgtgc gaaacatcat    420
ttaataggct aaaaaaagct ataaataatg ttggaggaag tgttaaaaat ttaaaaagag    480
acttggctgc aataaaaagg tatagaaaaa aaggaatata ttaaattcat atgataagct    540
gcgccacaga tagcatgaaa catcatatta tggaaagtga tttgtatgct atcaatacac    600
ccctgatggc gtgatgatca aatagtacta tatacaagga aatgagctga tatttgtatc    660
gtacaatcct atctatacat atataagatt ttttattgat gagtgtaaaa ttattggaaa    720
atttgcaggg atacttagag gggtttagag atttatttgc gtttataatc aaactatttt    780
tagtatgttt ttgaagctgt ttgattttaa aaagcgcttt acagcaatct caaaaaatta    840
ttttatctaa atttataaat atacaaaaaa ttagaatata aaaatatttt tatataaatt    900
taagtaagtt taaaatataa tttttatgac aaactttgat ttaatattta ggagtaatat    960
t atg tta agg ctt tct att ttg att atg cta tct ata ttt tta ata tct    1009
  Met Leu Arg Leu Ser Ile Leu Ile Met Leu Ser Ile Phe Leu Ile Ser
  1               5                   10                  15
tgc agt acc act aaa tca aat aac tat aaa gct cct agg gtg caa tct    1057
Cys Ser Thr Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Lys Ala Pro Arg Val Gln Ser
            20                  25                  30
act aat agc aat agc tca gct cta agc aat act tta cca tct aaa cag    1105
Thr Asn Ser Asn Ser Ser Ala Leu Ser Asn Thr Leu Pro Ser Lys Gln
        35                  40                  45
ata tta tta aca act agg gat aac cta ggg gat agc tca atg cca tta    1153
Ile Leu Leu Thr Thr Arg Asp Asn Leu Gly Asp Ser Ser Met Pro Leu
    50                  55                  60
gct att ata aat cca aga ggc tca tct tta act gtt tgg gca tta gct    1201
Ala Ile Ile Asn Pro Arg Gly Ser Ser Leu Thr Val Trp Ala Leu Ala
65                  70                  75                  80
gag ggt aac tgg gta tgg gga tat act cta gat aga tca ata gat ttt    1249
Glu Gly Asn Trp Val Trp Gly Tyr Thr Leu Asp Arg Ser Ile Asp Phe
                85                  90                  95
ggt gga gct agg cta tgg cag gta ata aat tta ggc gga gat ata gct    1297
Gly Gly Ala Arg Leu Trp Gln Val Ile Asn Leu Gly Gly Asp Ile Ala
            100                   105                   110
ctt att aaa aat gtc cgc aca ggt aac tgc ttg cat gat gaa ggg cgt    1345
Leu Ile Lys Asn Val Arg Thr Gly Asn Cys Leu His Asp Glu Gly Arg
        115                 120                 125
ggt gta act cat aga act tgc aat aaa aat agt aaa aac caa caa tgg    1393
Gly Val Thr His Arg Thr Cys Asn Lys Asn Ser Lys Asn Gln Gln Trp
    130                 135                 140
gaa ctt ttt gct atg gat aat ggt gca gtt atg att aga tct act gca    1441
Glu Leu Phe Ala Met Asp Asn Gly Ala Val Met Ile Arg Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
tca aac aat tgc tta aga aca gag tat gga gat ata gtc cag att gat    1489
Ser Asn Asn Cys Leu Arg Thr Glu Tyr Gly Asp Ile Val Gln Ile Asp
                165                 170                 175
agt gta ttt agc att acg atg gag cga tgc acg cta gag cca aat tta    1537
Ser Val Phe Ser Ile Thr Met Glu Arg Cys Thr Leu Glu Pro Asn Leu
            180                 185                 190
gat cag cag tgg ata ttt ata cca gca cca att gaa gcc tca ccg ctt    1585
Asp Gln Gln Trp Ile Phe Ile Pro Ala Pro Ile Glu Ala Ser Pro Leu
        195                 200                 205
tta gga gat aaa tag atg aaa aga tta gtt atc cta gta gcg cta ctt    1633
Leu Gly Asp Lys     Met Lys Arg Leu Val Ile Leu Val Ala Leu Leu
    210                 215                 220
agt gct agt tta cta ttt agt gct att gat gat ttt aaa aca gct act    1681
Ser Ala Ser Leu Leu Phe Ser Ala Ile Asp Asp Phe Lys Thr Ala Thr
22                 5230                 235
tgg aat atg caa gga tca agc gca agt agt gaa gct aag tgg agt gtt    1729
Trp Asn Met Gln Gly Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ala Lys Trp Ser Val
240                 245                 250                 255
agc ata aga cag atg ttc tca ggc gat aat ggt cta gac ata cta gca    1777
Ser Ile Arg Gln Met Phe Ser Gly Asp Asn Gly Leu Asp Ile Leu Ala
                260                 265270
gtt caa gaa gca gga agc ttg cca aga act gca aga gct aca ggt agg    1825
Val Gln Glu Ala Gly Ser Leu Pro Arg Thr Ala Arg Ala Thr Gly Arg
            275                 280                 285
gta ttt gac ttt aat ggc aca gat gta aat gta act gag cat ata tgg    1873
Val Phe Asp Phe Asn Gly Thr Asp Val Asn Val Thr Glu His Ile Trp
        290                 295                 300
aat tta gga aca aac ctt cgc cca agc ttt gta ttt ata tac tat gct    1921
Asn Leu Gly Thr Asn Leu Arg Pro Ser Phe Val Phe Ile Tyr Tyr Ala
    305                 310                 315
aga acc gac ctt gga gcc aat agg gta aat tta gct tta gtt agt aga    1969
Arg Thr Asp Leu Gly Ala Asn Arg Val Asn Leu Ala Leu Val Ser Arg
320                 325                 330                 335
aat cca gct gat gaa gta ttc tta ttg cca cct cct acg act gtt tca    2017
Asn Pro Ala Asp Glu Val Phe Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Val Ser
                340                 345                 350
aga cca att cta ggt att aga tta aga aat gac gct ttc ttt agc ata    2065
Arg Pro Ile Leu Gly Ile Arg Leu Arg Asn Asp Ala Phe Phe Ser Ile
            355                 360                 365
cat gct ctt gca aat ggt gga att gat gca tcg gct ata gtt cat agt    2113
His Ala Leu Ala Asn Gly Gly Ile Asp Ala Ser Ala Ile Val His Ser
        370                 375                 380
gta gat aac ttc ttt aga aac tca caa aca cta atg aac tca aac tgg    2161
Val Asp Asn Phe Phe Arg Asn Ser Gln Thr Leu Met Asn Ser Asn Trp
    385                 390                 395
ata gta atg ggt gat ttc aat aga gaa cca gga gag cta ctt agc tca    2209
Ile Val Met Gly Asp Phe Asn Arg Glu Pro Gly Glu Leu Leu Ser Ser
400                 405                 410                 415
ttt gag cta gag cta aga ctt cgt gct aga ata att aca aat agt gcc    2257
Phe Glu Leu Glu Leu Arg Leu Arg Ala Arg Ile Ile Thr Asn Ser Ala
                420                 425                 430
att act caa gtt agt gct aga agg acg tta gat tac gcg gta gta gga    2305
Ile Thr Gln Val Ser Ala Arg Arg Thr Leu Asp Tyr Ala Val Val Gly
            435                 440                 445
aac tct aat aga tct gta gtt cca gct cca ctg cca cct att aca gct    2353
Asn Ser Asn Arg Ser Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Ile Thr Ala
        450                 455                 460
agc aca ttc ttt agc gga ttt aga tca cac tta gca agt gat cac ttt    2401
Ser Thr Phe Phe Ser Gly Phe Arg Ser His Leu Ala Ser Asp His Phe
    465                 470                 475
cct ata aca ttt ggg aga ttt ta atg aga act ata cta ata ttt ata    2448
Pro Ile Thr Phe Gly Arg Phe    Met Arg Thr Ile Leu Ile Phe Ile
480                 485                490
tca tct gct ttg ttt ata atg cta agc cta agc ggt tgc gtg gat aaa    2496
Ser Ser Ala Leu Phe Ile Met Leu Ser Leu Ser Gly Cys Val Asp Lys
495                 500                 505                 510
gaa aaa gta gta tca aca act aaa agt aac ttt tta gtt act aat gag    2544
Glu Lys Val Val Ser Thr Thr Lys Ser Asn Phe Leu Val Thr Asn Glu
                515                 520                 525
agt ttg gga ttt gct ggc cca cta gca cct aat gag aat aga gct cca    2592
Ser Leu Gly Phe Ala Gly Pro Leu Ala Pro Asn Glu Asn Arg Ala Pro
             530                 535                 540
gat agg cta gat gct act cca aag gtt cct agc ata gaa aaa cta ctt    2640
Asp Arg Leu Asp Ala Thr Pro Lys Val Pro Ser Ile Glu Lys Leu Leu
        545                 550                 555
aaa caa tca aat acc cca agc gat cct ttt act cct cta ctt agt cta    2688
Lys Gln Ser Asn Thr Pro Ser Asp Pro Phe Thr Pro Leu Leu Ser Leu
    560                 565                 570
aga tcg ctt gag agc ggt atg act tta ata gta aat ttc gct caa aga    2736
Arg Ser Leu Glu Ser Gly Met Thr Leu Ile Val Asn Phe Ala Gln Arg
575                 580                 585                 590
gat gag aca ttt aac tgg aat att cgt gaa gta aag tca ttt gag cca    2784
Asp Glu Thr Phe Asn Trp Asn Ile Arg Glu Val Lys Ser Phe Glu Pro
                595                 600                 605
aat ctt ata aaa aat att caa aga gta gat gat ttt aag tat ctt gag    2832
Asn Leu Ile Lys Asn Ile Gln Arg Val Asp Asp Phe Lys Tyr Leu Glu
            610                 615                 620
ttt gag tat att cag ttt gta agt tct aat gac att gat atg tgc tta    2880
Phe Glu Tyr Ile Gln Phe Val Ser Ser Asn Asp Ile Asp Met Cys Leu
        625                 630                 635
gcc ata caa gaa agt gga ttt ttt ggg cta aaa aat tgt gct gat gat    2928
Ala Ile Gln Glu Ser Gly Phe Phe Gly Leu Lys Asn Cys Ala Asp Asp
    640                 645                 650
ctt gaa aaa gct aag ttt gag agt gta ttt caa cta atc cct atg agt    2976
Leu Glu Lys Ala Lys Phe Glu Ser Val Phe Gln Leu Ile Pro Met Ser
655                 660                 665                 670
aca gac tca gtc cag att aga tca ttg gtg ctt ggt gga ggc gaa tgt    3024
Thr Asp Ser Val Gln Ile Arg Ser Leu Val Leu Gly Gly Gly Glu Cys
                675                 680                 685
ata agc aca ttt gaa aat ccc aat ctt ttc cca tgg caa cga ata ggt    3072
Ile Ser Thr Phe Glu Asn Pro Asn Leu Phe Pro Trp Gln Arg Ile Gly
            690                 695                 700
ata gat aag tgt caa cta atg caa ggt ttt aat aca aac cta gca aga    3120
Ile Asp Lys Cys Gln Leu Met Gln Gly Phe Asn Thr Asn Leu Ala Arg
        705                 710                 715
ctt tgg gct ata atg cca gaa aat aga cct gct aag gtg ctg gtg tct    3168
Leu Trp Ala Ile Met Pro Glu Asn Arg Pro Ala Lys Val Leu Val Ser
    720                 725                 730
gtg aag tga tgaagatgag caaaactaag ttttaaatga tgaagtattt            3217
Val Lys
735
gtagcaccaa atgtgtcaaa aataatatat tttgttttaa agactaaatt tgctaccaaa  3277
aataacactg atctaaagtt ttttataaaa tagtaattta tagattacta ttaaacaatg  3337
tttatatgtt aagctcaata caaatcatat aaatttagac aagtaaagtg cggctaacac  3397
aa                                                                 3399
<210>2
<211>212
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>2
Met Leu Arg Leu Ser Ile Leu Ile Met Leu Ser Ile Phe Leu Ile Ser
1               5                   10                  15
Cys Ser Thr Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Lys Ala Pro Arg Val Gln Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Ser Asn Ser Ser Ala Leu Ser Asn Thr Leu Pro Ser Lys Gln
        35                  40                  45
Ile Leu Leu Thr Thr Arg Asp Asn Leu Gly Asp Ser Ser Met Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Ile Ile Asn Pro Arg Gly Ser Ser Leu Thr Val Trp Ala Leu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Gly Asn Trp Val Trp Gly Tyr Thr Leu Asp Arg Ser Ile Asp Phe
                 85                  90                  95
Gly Gly Ala Arg Leu Trp Gln Val Ile Asn Leu Gly Gly Asp Ile Ala
            100                 105                 110
Leu Ile Lys Asn Val Arg Thr Gly Asn Cys Leu His Asp Glu Gly Arg
        115                 120                 125
Gly Val Thr His Arg Thr Cys Asn Lys Asn Ser Lys Asn Gln Gln Trp
    130                 135                 140
Glu Leu Phe Ala Met Asp Asn Gly Ala Val Met Ile Arg Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ser Asn Asn Cys Leu Arg Thr Glu Tyr Gly Asp Ile Val Gln Ile Asp
                165                 170                 175
Ser Val Phe Ser Ile Thr Met Glu Arg Cys Thr Leu Glu Pro Asn Leu
            180                 185                 190
Asp Gln Gln Trp Ile Phe Ile Pro Ala Pro Ile Glu Ala Ser Pro Leu
        195                 200                 205
Leu Gly Asp Lys
    210
<210>3
<211>274
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>3
Met Lys Arg Leu Val Ile Leu Val Ala Leu Leu Ser Ala Ser Leu Leu
1               5                   10                  15
Phe Ser Ala Ile Asp Asp Phe Lys Thr Ala Thr Trp Asn Met Gln Gly
            20                  25                  30
Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ala Lys Trp Ser Val Ser Ile Arg Gln Met
        35                  40                  45
Phe Ser Gly Asp Asn Gly Leu Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly
    50                  55                  60
Ser Leu Pro Arg Thr Ala Arg Ala Thr Gly Arg Val Phe Asp Phe Asn
65                  70                  75                  80
Gly Thr Asp Val Asn Val Thr Glu His Ile Trp Asn Leu Gly Thr Asn
                85                  90                  95
Leu Arg Pro Ser Phe Val Phe Ile Tyr Tyr Ala Arg Thr Asp Leu Gly
            100                 105                 110
Ala Asn Arg Val Asn Leu Ala Leu Val Ser Arg Asn Pro Ala Asp Glu
        115                 120                 125
Val Phe Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Val Ser Arg Pro Ile Leu Gly
    130                 135                 140
Ile Arg Leu Arg Asn Asp Ala Phe Phe Ser Ile His Ala Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ile Asp Ala Ser Ala Ile Val His Ser Val Asp Asn Phe Phe
                165                 170                 175
Arg Asn Ser Gln Thr Leu Met Asn Ser Asn Trp Ile Val Met Gly Asp
            180                 185                 190
Phe Asn Arg Glu Pro Gly Glu Leu Leu Ser Ser Phe Glu Leu Glu Leu
        195                 200                 205
Arg Leu Arg Ala Arg Ile Ile Thr Asn Ser Ala Ile Thr Gln Val Ser
    210                 215                 220
Ala Arg Arg Thr Leu Asp Tyr Ala Val Val Gly Asn Ser Asn Arg Ser
225                 230                 235                 240
Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Ile Thr Ala Ser Thr Phe Phe Ser
                245                 250                 255
Gly Phe Arg Ser His Leu Ala Ser Asp His Phe Pro Ile Thr Phe Gly
            260                 265                 270
Arg Phe
<210>4
<211>250
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>4
Met Arg Thr Ile Leu Ile Phe Ile Ser Ser Ala Leu Phe Ile Met Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Gly Cys Val Asp Lys Glu Lys Val Val Ser Thr Thr Lys
            20                  25                  30
Ser Asn Phe Leu Val Thr Asn Glu Ser Leu Gly Phe Ala Gly Pro Leu
        35                  40                  45
Ala Pro Asn Glu Asn Arg Ala Pro Asp Arg Leu Asp Ala Thr Pro Lys
    50                  55                  60
Val Pro Ser Ile Glu Lys Leu Leu Lys Gln Ser Asn Thr Pro Ser Asp
65                  70                  75                  80
Pro Phe Thr Pro Leu Leu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Ser Gly Met Thr
                85                  90                  95
Leu Ile Val Asn Phe Ala Gln Arg Asp Glu Thr Phe Asn Trp Asn Ile
            100                 105                 110
Arg Glu Val Lys Ser Phe Glu Pro Asn Leu Ile Lys Asn Ile Gln Arg
        115                 120                 125
Val Asp Asp Phe Lys Tyr Leu Glu Phe Glu Tyr Ile Gln Phe Val Ser
    130                 135                 140
Ser Asn Asp Ile Asp Met Cys Leu Ala Ile Gln Glu Ser Gly Phe Phe
145                 150                 155                 160
Gly Leu Lys Asn Cys Ala Asp Asp Leu Glu Lys Ala Lys Phe Glu Ser
                165                 170                 175
Val Phe Gln Leu Ile Pro Met Ser Thr Asp Ser Val Gln Ile Arg Ser
            180                 185                 190
Leu Val Leu Gly Gly Gly Glu Cys Ile Ser Thr Phe Glu Asn Pro Asn
        195                 200                 205
Leu Phe Pro Trp Gln Arg Ile Gly Ile Asp Lys Cys Gln Leu Met Gln
     210                 215                 220
Gly Phe Asn Thr Asn Leu Ala Arg Leu Trp Ala Ile Met Pro Glu Asn
225                 230                 235                 240
Arg Pro Ala Lys Val Leu Val Ser Val Lys
                245                 250
<210>5
<211>4069
<212>DNA
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<220>
<221>CDS
<222>(1059)..(1835)
<220>
<221>CDS
<222>(1853)..(2656)
<220>
<221>CDS
<222>(2666)..(3202)
<400>5
aggtacaaag caaaacttgg tcttttgaaa gtacggcgat atttggcctt tgagtttgat    60
acaaataggt ggttttttca aagtataatc cttttataat gcttctatcg tgcgtagaaa   120
aatttgctat caaaaaatca gatatagtgg tttccaattt aaaaaatta ttcaaagcata   180
ttaaagattt gggtattcaa aaacaagcat attggatctc gaatggtata aatttgagag   240
atatggatat gcaagaagaa ttgccacaac atataaaagg tcttgtgcca aaggataaat   300
ttataatagg ctataccgga aaattgggtg tatcaaattc gatcatatat ctattaaaag   360
cggcacgcat attgcaaaat aacactaata taaaatttat tatagttggt gatggacaag    420
agaaacaagc tttggtagac tatgcaagtg atctaaataa tgttattttt atagatccga    480
taccaaaatc aaatatccaa tcaatgctta gcttatttga tgtgtgttac ataggatggc    540
tagacaaaga actatataaa tttggcatag cggcaaataa gttatttgat tatatgtata    600
gttgtaaacc aatcttacac tctataaata catcagatag tatagtaaat atggtcgggt    660
ttggatgtgg tataaaaata aattcagaag atccagaagc catagcggaa gctataacgg    720
aactgtacgc gacaccaaaa aatctaatga aaaaaatggg ggaaaatggt aaaaaggcta    780
tcctagatca atttacatac catgaattgg ctaaaaaata tttgaaaatc atataaattt    840
ttatatttat aagataaatg atgatcttat cgagctaatc atagaatata taaagataca    900
ttgtttgttg aatttttcat cttaatatcc tgagtttatc catattttac aagttctatc    960
agatttttaa ggaattttga taataaaaat tattctgtta attaatcata aataaattct   1020
cattagaatg atataaataa actttaaaag aatcaata atg aaa tac ata gca tac   1076
                                          Met Lys Tyr Ile Ala Tyr
                                          1               5
cta gct ttt ata agc tta ctc ctt gtt ggt tgc tct agc aaa gcc aca    1124
Leu Ala Phe Ile Ser Leu Leu Leu Val Gly Cys Ser Ser Lys Ala Thr
            10                  15                  20
tat att aac tat tta gca aaa tat gga ggc gat cca acc gac acc gat    1172
Tyr Ile Asn Tyr Leu Ala Lys Tyr Gly Gly Asp Pro Thr Asp Thr Asp
        25                  30                  35
cca cta agg ctc ggt tca aac cca aaa gag ccg gcg att caa aaa ata    1220
Pro Leu Arg Leu Gly Ser Asn Pro Lys Glu Pro Ala Ile Gln Lys Ile
    40                  45                  50
cca gca cta ctt atc ggt gaa aat aaa ttt ttt aag caa aat tta cct    1268
Pro Ala Leu Leu Ile Gly Glu Asn Lys Phe Phe Lys Gln Asn Leu Pro
55                  60                  65                  70
aca ttt agc gga acg cta caa agt gat cca gtc cac ggt cca aac gaa    1316
Thr Phe Ser Gly Thr Leu Gln Ser Asp Pro Val His Gly Pro Asn Glu
                75                  80                  85
cgt gat cca gac aat cca ttt gat gat aca aag gtt ttt tac aac act    1364
Arg Asp Pro Asp Asn Pro Phe Asp Asp Thr Lys Val Phe Tyr Asn Thr
            90                 95                 100
cca cag ata tct gag ttc gtt tct att gta gct cac aac gat gcc ctt    1412
Pro Gln Ile Ser Glu Phe Val Ser Ile Val Ala His Asn Asp Ala Leu
        105                 110                 115
atg acc att tgg gct ttg gct tat ggt aac tgg gta tgg gcc tac tcg    1460
Met Thr Ile Trp Ala Leu Ala Tyr Gly Asn Trp Val Trp Ala Tyr Ser
    120                 125                 130
gca act gat agt atg agt ttt ggt gat gcg aga ata tgg aag ctt gtc    1508
Ala Thr Asp Ser Met Ser Phe Gly Asp Ala Arg Ile Trp Lys Leu Val
135                 140                 145                 150
ata tat cca aaa aat ttc gtc caa atc caa aac aaa atg acc ggc act    1556
Ile Tyr Pro Lys Asn Phe Val Gln Ile Gln Asn Lys Met Thr Gly Thr
                155                 160                 165
tgt ctt agt gcc tat caa aat ggc gtt gta cac tat cct tgt gat gat    1604
Cys Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Gly Val Val His Tyr Pro Cys Asp Asp
            170                 175                 180
aca aac caa gct cag ttc tgg caa tta aat cag ttt gca aac gga gcc    1652
Thr Asn Gln Ala Gln Phe Trp Gln Leu Asn Gln Phe Ala Asn Gly Ala
        185                 190                 195
gta cag ctc caa aat ttc gct tcc aaa gag tgt ttg tct act gac cct    1700
Val Gln Leu Gln Asn Phe Ala Ser Lys Glu Cys Leu Ser Thr Asp Pro
    200                 205                 210
aca aag gga agt agc tat tat ggt ata tat gct gta agg tgt ata aat    1748
Thr Lys Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Ile Tyr Ala Val Arg Cys Ile Asn
215                 220                 225                 230
gca ggc gag aag gcg ctt tct cag cag tgg ata atc tca gca ccg ttt    1796
Ala Gly Glu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Trp Ile Ile Ser Ala Pro Phe
                235                 240                 245
gta gaa act ccg cct ata aaa atg cca gat ccg att ctt ggtcaaggag    1845
Val Glu Thr Pro Pro Ile Lys Met Pro Asp Pro Ile Leu
            250                 255
gtgagat atg aag aaa ttt ctt ata gtt tta ttg ctt tgt ttt agt act    1894
        Met Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr
        260                 265                 270
cta cta gca aat att gaa gat tac agc atc gct act tgg aat atg caa    1942
Leu Leu Ala Asn Ile Glu Asp Tyr Ser Ile Ala Thr Trp Asn Met Gln
    275                 280                 285
ggc tca tct gct gca acc gaa agc aaa tgg aat gtc aat atc aga caa    1990
Gly Ser Ser Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Asn Ile Arg Gln
290                 295                 300                 305
cta ata tca ggc aat agc gca gct gat att ttg cta gtt caa gaa gca    2038
Leu Ile Ser Gly Asn Ser Ala Ala Asp Ile Leu Leu Val Gln Glu Ala
                310                 315                 320
gga agc ata cca gta agt gca gtt tat aca ggt act gtg gtt cag cca    2086
Gly Ser Ile Pro Val Ser Ala Val Tyr Thr Gly Thr Val Val Gln Pro
            325                 330                 335
gtt gga gta gga att cct atc gat gag ttt gcg tgg aat cta ggc acg    2134
Val Gly Val Gly Ile Pro Ile Asp Glu Phe Ala Trp Asn Leu Gly Thr
        340                 345                 350
gcg tct agg cct aat caa gtt ttt ata tac tat tca aga gtt gat gta    2182
Ala Ser Arg Pro Asn Gln Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val
    355                 360                 365
ggt gca aac cgt gta aat ctt gct ata gtt tca aga aga agg gct gat    2230
Gly Ala Asn Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Arg Arg Ala Asp
370                 375                 380                 385
gag gtt atc gtc ttg cca ccg cca act act gca tca aga cct att att    2278
Glu Val Ile Val Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ser Arg Pro Ile Ile
                390                 395                 400
ggt att cgc ctt ggc aat gac gtg ttt ttt agt gtg cat gca cta gct    2326
Gly Ile Arg Leu Gly Asn Asp Val Phe Phe Ser Val His Ala Leu Ala
            405                 410                 415
aat ggc ggt act gat gcg cct gcg ata gta gaa aat gtg cat aga ttt    2374
Asn Gly Gly Thr Asp Ala Pro Ala Ile Val Glu Asn Val His Arg Phe
        420                 425                 430
ttc caa aat aga cct gag atc agc tgg ttt atc ggc gga gat ttt aat    2422
Phe Gln Asn Arg Pro Glu Ile Ser Trp Phe Ile Gly Gly Asp Phe Asn
    435                 440                 445
aga gaa cca aat tca ctt ttg cgg gct ttg gag cct acg gta aga tca    2470
Arg Glu Pro Asn Ser Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Thr Val Arg Ser
450                 455                 460                 465
aga gta gat att gtc tca cct agt gga gct acg caa aat agt ggt ggc    2518
Arg Val Asp Ile Val Ser Pro Ser Gly Ala Thr Gln Asn Ser Gly Gly
                470                 475                 480
aca cta gac tac ggt gta gct gga aac tcg gct aca act agc ttt gta    2566
Thr Leu Asp Tyr Gly Val Ala Gly Asn Ser Ala Thr Thr Ser Phe Val
            485                 490                 495
gct cct gcc att gct gca gtt ctc atg ctg gca aat atg cgc tca cag    2614
Ala Pro Ala Ile Ala Ala Val Leu Met Leu Ala Asn Met Arg Ser Gln
        500                 505                 510
atc aca tca gat cat gtg cct gtt aat ttt aga aga ttt tag gagacacat  2665
Ile Thr Ser Asp His Val Pro Val Asn Phe Arg Arg Phe
    515                 520                 525
atg aaa aca ttt att aaa ata tta cta ctt att tca tta gct att cca    2713
Met Lys Thr Phe Ile Lys Ile Leu Leu Leu Ile Ser Leu Ala Ile Pro
            530                 535                 540
agt ttt gga ttt gaa gat gac aat gtt atg ccg tta gtt tca tta aga    2761
Ser Phe Gly Phe Glu Asp Asp Asn Val Met Pro Leu Val Ser Leu Arg
        545                 550                 555
agt cta aaa act ggt att ttg ata gcg tat gaa gac aat gcg cca aat    2809
Ser Leu Lys Thr Gly Ile Leu Ile Ala Tyr Glu Asp Asn Ala Pro Asn
    560                 565                 570
ttg ttt gat aga aac tgg cgt atc aaa gag gta att ttg cct ttc gag    2857
Leu Phe Asp Arg Asn Trp Arg Ile Lys Glu Val Ile Leu Pro Phe Glu
575                 580                 585                 590
ata aga aag cat tat ccg ttt ggt aat gtg caa ttt atg cat cca acc    2905
Ile Arg Lys His Tyr Pro Phe Gly Asn Val Gln Phe Met His Pro Thr
                595                 600                 605
aaa acc gat att tgc tta ggc tta gat ggt gct aag cta acg acc atg    2953
Lys Thr Asp Ile Cys Leu Gly Leu Asp Gly Ala Lys Leu Thr Thr Met
            610                 615                 620
gag tgt aat ctt ata aat atc ggt gat ttt agg act gct ttt tcg ctt    3001
Glu Cys Asn Leu Ile Asn Ile Gly Asp Phe Arg Thr Ala Phe Ser Leu
        625                 630                 635
ctt ccg acc gca act tca gca gtg cag atc aag gcg gta aat gac cta    3049
Leu Pro Thr Ala Thr Ser Ala Val Gln Ile Lys Ala Val Asn Asp Leu
    640                 645                 650
aac gaa tgc ctt agc ata gga cca agt act agc gga acg tct ttt tca    3097
Asn Glu Cys Leu Ser Ile Gly Pro Ser Thr Ser Gly Thr Ser Phe Ser
655                 660                 665                 670
agg atg gga ctt aga agc tgt gag atg gac gag aag tca aac atc atc    3145
Arg Met Gly Leu Arg Ser Cys Glu Met Asp Glu Lys Ser Asn Ile Ile
                675                 680                 685
tta gaa aat tta ttt gtc cta tct gtg cct att ttg gat tca aaa tta    3193
Leu Glu Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Pro Ile Leu Asp Ser Lys Leu
            690                 695                 700
gta aag taa gattaaaagt cgtttttaga cggctcaaat tccctttttt            3242
Val  Lys
cctagtacga ctacaatagt cttgtagatg actttaagct ctagccaaag cgaccagtgt  3302
ttgatgtagt agagatcata cattagcttt tgttttgcat catcagtatt tgcgccgtat  3362
gggtacatga cttgcgccca gcctgtgatg cctggtttta tgatatgtcg ttcgcagtag  3422
tatgggatct cttgttcgta gcctttgacg agtatatccc actctgctct tggtccgatg  3482
agatgcatct ctcctcttaa cacgtttaaa atttgcggaa gctcatcgat ccttgttttt  3542
ctcatgaatt tgccaaaagg ataaattcta tcgtcttctt ttttggtgta tggatcatga  3602
taactatttt cgtgcatggt acgaaatttt atacatttaa atatatcacc gtttttacca  3662
actctatctt gtttaaaata tagacttcct ggagattggg cttttatctt gctttttact  3722
ataaaaacca gcggccacat agttagcagc aagattccag caccaattat atcgactatc  3782
tttttttgca atagttgcca tggactaaac ggcttgattt tgcttaaaaa cgcaagatca  3842
ctattatcac caggaatata acatttgttt agatatttct ccataaaatc ttcgatagtt  3902
atgatcttta aaggcttttt tcttttttga aattgtaaag tcgttagata ttttattata  3962
ttgctaccaa cagttgcagt cgtatttaaa accaaagtgt caaaatactc ttctcctgct  4022
atgctttgta gctctcctag aacctcatct tctgatctgt tgcgaat                4069
<210>6
<211>259
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>6
Met Lys Tyr Ile Ala Tyr Leu Ala Phe Ile Ser Leu Leu Leu Val Gly
1               5                   10                  15
Cys Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Asn Tyr Leu Ala Lys Tyr Gly Gly
            20                  25                  30
Asp Pro Thr Asp Thr Asp Pro Leu Arg Leu Gly Ser Asn Pro Lys Glu
        35                  40                  45
Pro Ala Ile Gln Lys Ile Pro Ala Leu Leu Ile Gly Glu Asn Lys Phe
    50                  55                  60
Phe Lys Gln Asn Leu Pro Thr Phe Ser Gly Thr Leu Gln Ser Asp Pro
65                  70                  75                  80
Val His Gly Pro Asn Glu Arg Asp Pro Asp Asn Pro Phe Asp Asp Thr
                85                  90                  95
Lys Val Phe Tyr Asn Thr Pro Gln Ile Ser Glu Phe Val Ser Ile Val
            100                 105                 110
Ala His Asn Asp Ala Leu Met Thr Ile Trp Ala Leu Ala Tyr Gly Asn
        115                 120                 125
Trp Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Met Ser Phe Gly Asp Ala
    130                 135                 140
Arg Ile Trp Lys Leu Val Ile Tyr Pro Lys Asn Phe Val Gln Ile Gln
145                 150                 155                 160
Asn Lys Met Thr Gly Thr Cys Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Gly Val Val
                165                 170                 175
His Tyr Pro Cys Asp Asp Thr Asn Gln Ala Gln Phe Trp Gln Leu Asn
            180                 185                 190
Gln Phe Ala Asn Gly Ala Val Gln Leu Gln Asn Phe Ala Ser Lys Glu
        195                 200                 205
Cys Leu Ser Thr Asp Pro Thr Lys Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Ile Tyr
    210                 215                 220
Ala Val Arg Cys Ile Asn Ala Gly Glu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Trp
225                 230                 235                 240
Ile Ile Ser Ala Pro Phe Val Glu Thr Pro Pro Ile Lys Met Pro Asp
                245                 250                 255
Pro Ile Leu
<210>7
<211>267
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>7
Met Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Asn Ile Glu Asp Tyr Ser Ile Ala Thr Trp Asn Met Gln Gly Ser
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Asn Ile Arg Gln Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Ala Ala Asp Ile Leu Leu Val Gln Glu Ala Gly Ser
    50                  55                  60
Ile Pro Val Ser Ala Val Tyr Thr Gly Thr Val Val Gln Pro Val Gly
65                  70                  75                  80
Val Gly Ile Pro Ile Asp Glu Phe Ala Trp Asn Leu Gly Thr Ala Ser
                85                  90                  95
Arg Pro Asn Gln Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asn Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Arg Arg Ala Asp Glu Val
        115                 120                 125
Ile Val Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile
    130                 135                 140
Arg Leu Gly Asn Asp Val Phe Phe Ser Val His Ala Leu Ala Asn Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Asp Ala Pro Ala Ile Val Glu Asn Val His Arg Phe Phe Gln
                165                 170                 175
Asn Arg Pro Glu Ile Ser Trp Phe Ile Gly Gly Asp Phe Asn Arg Glu
            180                 185                 190
Pro Asn Ser Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Thr Val Arg Ser Arg Val
        195                 200                 205
Asp Ile Val Ser Pro Ser Gly Ala Thr Gln Asn Ser Gly Gly Thr Leu
    210                 215                 220
Asp Tyr Gly Val Ala Gly Asn Ser Ala Thr Thr Ser Phe Val Ala Pro
225                 230                 235                 240
Ala Ile Ala Ala Val Leu Met Leu Ala Asn Met Arg Ser Gln Ile Thr
                245                 250                 255
Ser Asp His Val Pro Val Asn Phe Arg Arg Phe
            260                 265
<210>8
<211>178
<212>PRT
<213>豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
<400>8
Met Lys Thr Phe Ile Lys Ile Leu Leu Leu Ile Ser Leu Ala Ile Pro
1               5                   10                  15
Ser Phe Gly Phe Glu Asp Asp Asn Val Met Pro Leu Val Ser Leu Arg
            20                  25                  30
Ser Leu Lys Thr Gly Ile Leu Ile Ala Tyr Glu Asp Asn Ala Pro Asn
        35                  40                  45
Leu Phe Asp Arg Asn Trp Arg Ile Lys Glu Val Ile Leu Pro Phe Glu
    50                  55                  60
Ile Arg Lys His Tyr Pro Phe Gly Asn Val Gln Phe Met His Pro Thr
65                  70                  75                  80
Lys Thr Asp Ile Cys Leu Gly Leu Asp Gly Ala Lys Leu Thr Thr Met
                85                  90                  95
Glu Cys Asn Leu Ile Asn Ile Gly Asp Phe Arg Thr Ala Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Leu Pro Thr Ala Thr Ser Ala Val Gln Ile Lys Ala Val Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Asn Glu Cys Leu Ser Ile Gly Pro Ser Thr Ser Gly Thr Ser Phe Ser
    130                 135                 140
Arg Met Gly Leu Arg Ser Cys Glu Met Asp Glu Lys Ser Asn Ile Ile
145                 150                 155                 160
Leu Glu Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Pro Ile Leu Asp Ser Lys Leu
                165                 170                 175
Val Lys
<210>9
<211>265
<212>PRT
<213>空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
<400>9
Met Lys Lys Ile Ile Cys Leu Phe Leu Ser Phe Asn Leu Ala Phe Ala
1               5                   10                  15
Asn Leu Glu Asn Phe Asn Val Gly Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Ser Val Ser Val Arg Gln Leu Val Ser
        35                  40                  45
Gly Ala Asn Pro Leu Asp Ile Leu Met Ile Gln Glu Ala Gly Thr Leu
    50                  55                  60
Pro Arg Thr Ala Thr Pro Thr Gly Arg His Val Gln Gln Gly Gly Thr
65                  70                  75                  80
Pro Ile Asp Glu Tyr Glu Trp Asn Leu Gly Thr Leu Ser Arg Pro Asp
                85                  90                  95
Arg Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala Asn Arg Val
            100                 105                 110
Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Met Gln Ala Glu Glu Val Ile Val Leu
        115                 120                 125
Pro Pro Pro Thr Thr Val Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile Arg Asn Gly
    130                 135                 140
Asn Asp Ala Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Asn Gly Gly Thr Asp
145                 150                 155                 160
Val Gly Ala Ile Ile Thr Ala Val Asp Ala His Phe Ala Asn Met Pro
                165                 170                 175
Gln Val Asn Trp Met Ile Ala Gly Asp Phe Asn Arg Asp Pro Ser Thr
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Thr Val Asp Arg Glu Leu Ala Asn Arg Ile Arg Val Val
        195                 200                 205
Phe Pro Thr Ser Ala Thr Gln Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Ala
    210                 215                 220
Ile Thr Gly Asn Ser Asn Arg Gln Gln Thr Tyr Thr Pro Pro Leu Leu
225                 230                 235                 240
Ala Ala Ile Leu Met Leu Ala Ser Leu Arg Ser His Ile Val Ser Asp
                245                 250                 255
His Phe Pro Val Asn Phe Arg Lys Phe
            260                 265
<210>10
<211>267
<212>PRT
<213>大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)
<400>10
Met Lys Lys Ile Val Phe Leu Ile Leu Ser Phe Asn Val Leu Phe Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Ser Ile Arg Gln Leu Ile Thr
        35                  40                  45
Gly Ala Asn Pro Met Asp Val Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly Val Leu
    50                  55                  60
Pro Ser Thr Ala Met Met Thr Pro Arg Gln Val Gln Pro Val Gly Val
65                  70                  75                  80
Gly Ile Pro Ile His Glu Tyr Ile Trp Asn Leu Gly Ser Val Ser Arg
                85                  90                  95
Pro Ser Ser Val Tyr Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala Asn
            100                 105                 110
Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Val Gln Ala Asp Glu Val Phe
        115                 120                 125
Val Leu Pro Pro Pro Thr Val Ala Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile Arg
    130                 135                 140
Ile Gly Asn Asp Ala Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Asn Asp Ala Gly Ala Ile Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe Arg Asn
                165                 170                 175
Arg Pro Asp Ile Asn Trp Met Ile Leu Gly Asp Phe Asn Arg Glu Ser
            180                 185                 190
Gly Ala Leu Val Thr Leu Leu Asp Pro Asp Leu Arg Ala Arg Thr Arg
        195                 200                 205
Val Val Val Pro Pro Ser Ser Thr Gln Thr Ser Gly Arg Thr Ile Asp
    210                 215                 220
Tyr Ala Ile Thr Gly Asn Ser Asn Thr Ala Ala Leu Tyr Asn Pro Pro
225                 230                 235                 240
Pro Ile Val Ala Ile Leu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Thr Phe Leu Ala
                245                 250                 255
Ser Asp His Phe Pro Val Asn Phe Arg Arg Pro
            260                 265
<210>11
<211>266
<212>PRT
<213>胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)
<400>11
Met Arg Asn Val Ile Met Ile Ile Phe Ile Ala Thr Leu Gly Phe Ala
1               5                   10                  15
Lys Pro Glu Asp Tyr Lys Ile Ala Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ala Ile Thr Glu Ser Lys Trp Asn Ile Ser Val Arg Gln Ile Ile Ser
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Pro Ala Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly Asn Leu
    50                  55                  60
Pro Gln Thr Ala Leu Pro Thr Gly Arg Ser Ile Asn Gln Gly Gly Thr
65                  70                  75                  80
Ile Val Thr Glu His Leu Trp Gln Leu Gly Ser Ile Ser Arg Pro Phe
                85                  90                  95
Gln Val Tyr Ile Tyr Tyr Ala Gln Ile Asp Thr Gly Ala Asn Arg Val
            100                 105                 110
Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Ile Lys Ala Asp Glu Ile Ile Ile Leu
        115                 120                 125
Pro Pro Pro Thr Val Ala Ser Arg Pro Leu Ile Gly Ile Arg Ile Gly
    130                 135                 140
Asn Asp Val Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Asn Gly Gly Val Asp
145                 150                 155                 160
Ala Pro Ala Ile Ile Asn Ser Ile Phe Asp Arg Phe Arg Asn Met Pro
                165                 170                 175
Asn Ile Thr Trp Met Ile Leu Gly Asp Phe Asn Arg Ser Pro Glu Ser
            180                 185                 190
Leu Arg Gly Thr Leu Gly Leu Glu Thr Arg Val Arg Val Thr Phe Leu
        195                 200                 205
Thr Pro Pro Ala Pro Thr Gln Arg Ser Gly Gly Thr Leu Asp Trp Ala
    210                 215                 220
Ile Val Gly Asn Ser Ala Gly Asp Leu Val Arg Thr Thr Leu Val Ala
225                 230                 235                 240
Val Leu Met Leu Ala Asn Leu Arg Thr His Leu Val Ser Asp His Phe
                245                 250                 255
Pro Val Asn Phe Arg Lys Phe Gly Asp Asn
            260                 265
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
<400>12
acttggaatt tgcaaggc                                                     18
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
<400>13
cattttccag taaattttag                                                   20
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>14
acttggaatt tgcaaggc                                                18
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>15
tctaaaattt achggaaaat g                                            21
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>16
acttggaata tgcaagga                                                18
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>17
ccaaatgtta taggaaagtg                                      20
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>18
acttggaatw tgcaaggm                                        18
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>19
cyaaawktta yhggaaar tg                                      20
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>20
tatcaggcaa tagcgcag                                         18
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>21
ggtttgcacc tacatcaac                                            19
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>22
cctagtagcg ctacttag                                             18
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>23
tacaaagctt gggcgaag                                             18
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>24
gttcaagaag caggaagc                                          18
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>25
aataccwaka atwggtcttg                                        20
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>26
atcttttaac cttgcttttg c                                      21
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>27
gcaagcatta aaatcgcagc                                        20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>28
tttaatgtat tatttgccgc                                       20
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>29
tcattgccta tgcgtatg                                         18
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>30
ggctttgcaa aaccagaag                                        19
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>31
caagagttcc tcttaaactc                                       20
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>32
catagttagt cgcgtcca                                        18
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>33
ccagttaatc tcaggacg                                        18
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>34
gtatccatgc tttatcaaga                                      20
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>35
gtaggcctat aagagaacc                                         19

Claims (5)

1.一种编码豚肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸，其为核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的多核苷酸。 
2.一种包含权利要求1的多核苷酸的载体。 
3.一种包含权利要求1的多核苷酸或权利要求2的载体的宿主细胞。 
4.一种在试样中检测豚肠弯曲杆菌存在的试剂盒，其包含操作指南和下列(i)和(ii)引物对中的任意一种以上： 
(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25； 
(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19； 
其中检测包括下述步骤： 
(a)使用(i)和(ii)引物对中的任意一种以上对试样进行核酸扩增反应；和 
(b)基于扩增自编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA或其mRNA的片段的存在或其分子量确定豚肠弯曲杆菌的存在。 
5.一种在试样中检测豚肠弯曲杆菌存在的试剂盒，其包含操作指南和下列(i)和(ii)引物对中的任意一种以上： 
(i)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25； 
(ii)用于扩增编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19； 
其中检测包括下述步骤： 
(a)使用(i)和(ii)引物对中的任意一种以上对试样进行核酸扩增反应；和 
(b)对扩增自编码豚肠弯曲杆菌细胞致死肿胀毒素的基因组DNA或其mRNA的片段的数量定量以确定豚肠弯曲杆菌的存在。 
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