KR101588065B1 - 세포팽창화 치사독을 표적으로 한 캄필로박터속 세균의 검출 - Google Patents

세포팽창화 치사독을 표적으로 한 캄필로박터속 세균의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C. 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독 CDT 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 제공, 및 cdt 유전자를 이용한 C. 하이오인테스티날리스의 신규 검출방법의 제공을 과제로 한다. 발명자 등은, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독(CDT)에 착안하여, C. 제주니, C. 콜리와 C. 페투스의 cdtA, cdtB 및 cdtC 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR법으로는 증폭되지 않으나, 이들 3균종 공통 프라이머로 cdtB 유전자가 증폭되는 균주를, 타이의 장염 환자로부터 분리한 캄필로박터속 유사 세균의 cdt 유전자를 검출함으로써 발견하였다. 16S rRNA 유전자 해석으로부터, 이 균주를 C. 하이오인테스티날리스로 동정하고, 추가적으로 cdtB 유전자의 상류, 하류에 대해서 게놈 워킹에 의해 cdt 유전자의 전염기서열을 결정하였다.

Description

세포팽창화 치사독을 표적으로 한 캄필로박터속 세균의 검출{Detection of bacterium belonging to genus campylobacter witch targets cytolethal distending toxin}
본 발명은 캄필로박터(Campylobacter)속 세균의 세포팽창화 치사독을 표적으로 한, 검체 중의 캄필로박터속 세균의 존재 유무를 판정하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 표적으로 한 검체 중의 캄필로박터 하이오인테스티날리스균의 존재 유무를 판정하기 위한 방법에 관한 것이다.
현재, 캄필로박터속 세균은 17균종이 확인되어 있다. 캄필로박터속 세균의 균종 동정에는, 통상 배양검사가 사용되나, 본 속 균이 미호기성인 것과, 균종에 따라서는 상이한 온도에서의 배양이 필요할 뿐 아니라, 생화학적 성상을 조사하는 것만으로는 동정이 곤란한 균주가 있어, 번잡하고 또한 다대한 노력을 필요로 한다. 또한 통상, 캄필로박터속 세균의 배양검사는, 분리, 동정까지 포함하면 7~10일이라는 긴 시간을 필요로 한다.
캄필로박터속 세균의 발생건수, 환자수는 모두 증가하는 경향이 있기 때문에(후생노동성 「병인 물질별 식중독 발생상황」), 캄필로박터속 세균 각 종의 간편하고 신속한 동정법에 대해서, 추가적인 개발이 기대되고 있다.
생화학적 성상에 기인하는 캄필로박터속 세균의 균종 동정은, 신속성이 부족할 뿐 아니라, 캄필로박터속 세균의 생화학적 성상은 균종간에서 매우 유사하기 때문에, 생화학적 성상으로의 감별은 곤란한 경우가 많다. 예를 들면 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni, 이하에 있어서 「C. 제주니」라 칭한다)와 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli, 이하에 있어서「C. 콜리」라 칭한다)의 감별은, 마뇨산 수해효소 활성의 유무로 행하고 있기 때문에, 효소활성이 약한 경우 등, C. 제주니를 C. 콜리로 오판정하기 쉬운 등의 문제가 있다. 그 때문에 검사현장에서는, PCR법으로 마뇨산 수해효소 유전자의 유무를 조사하는 방법이 채용되고 있다. 유전자 레벨에서 균종 동정을 행하는 방법으로서, 최근, 16S rRNA 유전자의 해석이 자주 사용되고 있다. 그러나, 16S rRNA 유전자의 해석에 있어서도, C. 제주니와 C. 콜리에서는, 상동성이 매우 높아, 감별 불가능한 경우가 많다.
현재, 설사증 환자로부터 분리되는 캄필로박터속 세균은 약 94%가 C. 제주니, 4%가 C. 콜리로 양 균종이 그 대부분을 차지하고 있다. 따라서, 통상, 검사현장에서 행하고 있는 캄필로박터속 세균의 검사는, 식중독 세균으로 지정되어 있는 C. 제주니와 C. 콜리만을 대상으로 하고 있는 것이 대부분이다. 또한, 검사에 자주 사용되고 있는 선택배지도, 주로 C. 제주니 및 C. 콜리용으로 개발된 물질로, 통상 42℃에서 배양하고 있다. 한편으로, 기타 균종의 분리 빈도는 낮으나, 균의 분리법이 C. 제주니와 C. 콜리 이외의 균종에 적합하지 않은 것도 그 원인으로 생각된다. 즉, 캄필로박터속에서는 균종간의 항생제에 대한 감수성 또는 가장 적합한 배양온도가 상이하기 때문에, 사용하는 선택배지나 배양조건에 따라서는 C. 제주니/콜리 이외의 균종을 분리할 수 없기 때문이다. 즉, 온도 감수성이 상이한 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus, 이하에 있어서 「C. 페투스」라 칭한다)나 다른 캄필로박터속 세균 전부를 대상으로 하고 있다고는 말하기 어렵다.
한편, C. 제주니/콜리 이외의 균종도 반려동물, 가축, 야생동물 등의 장관에 분포하고 있어, 인간에게 감염될 기회는 C. 제주니/콜리와 마찬가지로 높은 것으로 생각되고 있다. 2005년에는, 오사카에 있어서 C. 페투스에 의한 집단 식중독도 발생하고 있다. C. 페투스에 의한 감염은 인간에 대해 설사 등의 위장염 뿐 아니라 패혈증이나 수막염 등의 심각한 증상을 일으키며, 또한, 동물의 감염증에 있어서도 소 등의 불임이나 유산 등의 원인이 된다. 또한 C. 제주니나 C. 콜리, C. 페투스 이외에도 캄필로박터 라리(C. lari, 이하에 있어서 「C. 라리」라 칭한다), 캄필로박터 우프살리엔시스(C. upsaliensis, 이하에 있어서 「C. 우프살리엔시스」라 칭한다)와 캄필로박터 하이오인테스티날리스(C. hyointestinalis, 이하에 있어서 「C. 하이오인테스티날리스」라 칭한다)의 3균종은, 인간에게 장염이나 패혈증 등을 일으키는 인수 공통 감염증균이다. 그 때문에, C. 제주니나 C. 콜리, C. 페투스 이외의 캄필로박터속 세균의 검사체제를 정비하는 것이 중요하다.
실제, 항균제에 의존하지 않는 Cape town protocol로 캄필로박터속 세균의 배양, 분리 및 동정을 시도한 바, 캄필로박터속 세균에 의한 설사증 환자의 약 1.3%가 C. 하이오인테스티날리스에 감염되어 있었다(비특허문헌 1).
C. 하이오인테스티날리스는 돼지의 증식성 장염의 기인균으로서 분리되고, 또한 드물게 인간의 장염 환자로부터도 분리되는 것으로부터, 인간의 병태와의 연관이 시사되고 있다. 그러나, C. 하이오인테스티날리스의 신속 진단법은 전혀 알려져 있지 않다.
이와 같이, C. 제주니, C. 콜리 이외의 캄필로박터속 균종에 대해서는, 잠재적인 인간으로의 감염 기회가 강하게 의심됨에도 불구하고, 적절한 분리 배양 검사법 조차 존재하지 않는 것이 실정이었다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본원 발명자 등은, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독(Cytolethal Distending Toxin: CDT)에 착안하여 CDT의 학술적 연구를 진행시키는 동시에(비특허문헌 2, 3), 세포팽창화성 치사독 유전자(cdtA, cdtB, 및 cdtC)를 이용한 캄필로박터속 세균의 검출방법을 개발하였다(특허문헌 1). 그러나, 이들 검사방법은, C. 제주니, C. 콜리 및/또는 C. 페투스의 검출용으로, 아직 C. 하이오인테스티날리스 등 기타 캄필로박터속 세균의 검출에 적당한 방법은 개발되어 있지 않았다.
또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌 정보를 이하에 나타낸다.
WO2005/054472
Lastovica AJ. et al., Campylobacter, 2nd ed, 89-120 (2000) Asakura M. et al., Microbial Pathogenesis 42(2007) 174-183 Yamasaki S. et al., Toxin Reviews, 25:61-88, 2006
본 발명은 상기 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명이 해결하려고 하는 과제는, 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독 CDT 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 제공, 및 cdt 유전자를 이용한 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 신규 검출방법의 제공이다.
전술한 바와 같이, 캄필로박터속 세균의 의한 감염증에 있어서 C. 제주니나 C. 콜리 이외의 균종의 신속 진단이 요구되고 있는 한편, 캄필로박터속 세균의 병원인자는 완전히 해명되어 있다고는 하기 어렵다. 지금까지, 각 균종의 혈청형 등을 이용한 균종 동정용 PCR 프라이머나, CDT 생산을 조사하는 공통 프라이머 등이 이용되어 왔으나(J. Applied Microbiol., 94: 1003-1014 (2003)), 증균 배양공정이 필요하여, 캄필로박터속 세균의 신속한 검출은 불가능하였다.
C. 하이오인테스티날리스는, 돼지의 증식성 장염의 기인균으로서 분리되고, 또한 드물게 인간의 장염 환자로부터도 분리되는 것으로부터, 인간의 병태와의 연관이 시사되어 있었다. 그러나, C. 하이오인테스티날리스의 병원인자로서는 사이토톡신 유사 활성이 보고되어 있으나, 그 상세는 명확하게 되어 있지 않다. 한편, 존슨과 리오르(Johnson WM, Lior H. 1988. Microbial Pathogen 4, 115-126.)가 CDT라는 신규 독소를 대장균에서 발견하고, 추가적으로 C. 제주니도 CDT를 생산하고 있는 것을 보고하였다. 그 후, 픽케트 등(Pickett CL, et al., 1996. Infect Immun, 64, 2070-2078.)에 의해 C. 제주니의 cdt 유전자의 전염기서열이 결정되어, 그 실태가 명확해졌다. 또한, 픽케트 등은, C. 하이오인테스티날리스도 CDT 활성을 갖는 독소를 생산하고 있는 것과 퇴행성 프라이머(degenerative primer)에 의해 cdtB 유전자에 상당하는 증폭산물이 얻어지는 것을 보고하고 있었다. 그러나, C. 하이오인테스티날리스의 균체 DNA는, C. 제주니의 cdtB 유전자 프로브와 반응하지 않아, C. 하이오인테스티날리스가 생산하는 CDT의 실태는 명확하게 되어 있지 않았다.
이에, 본 발명은 유전자 증폭에 의해, 캄필로박터속 세균의 신속한 검출을 가능하게 하기 위해, 캄필로박터속에 속하고, 아직 그 CDT의 염기서열이 해명되어 있지 않은 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 CDT 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은, cdt 유전자를 이용한 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 신규 검출방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한 본 발명은, C. 하이오인테스티날리스를 포함한, 캄필로박터 세균을 동시에 검출하기 위한 프라이머를 제공한다.
발명자 등은, 최근 캄필로박터속 세균이 생산하는 병원인자의 하나로 생각되고 있는 Cytolethal Distending Toxin(CDT)에 착안하여, cdt 유전자를 표적으로 한 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 간편하고 신속한 종특이적 동정법을 개발하였다. CDT는 CdtA, CdtB 및 CdtC의 3개의 서브유닛으로 되는 홀로톡신을 형성하고, CdtA와 CdtC 서브유닛이 세포로의 결합에 관여하여, DNase 활성을 갖는 CdtB 서브유닛이 독성 본체로서 독성을 발휘한다. 발명자 등이 개발한 cdtA, cdtB 및 cdtC 유전자를 표적으로 하여 C. 제주니, C. 콜리와 C. 페투스를 특이적으로 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR법과 이들 3균종의 cdtB 유전자를 동시에 검출할 수 있는 공통 프라이머를 사용한 PCR법으로, 타이의 장염 환자로부터 분리한 캄필로박터속 유사 세균의 cdt 유전자를 검출함으로써 균종 동정을 시도하였다. 그 결과, 3균종에 특이적인 멀티플렉스 PCR법으로는 증폭되지 않으나, 공통 프라이머로 cdtB 유전자가 증폭되는 균주를 발견하고, 16S rRNA 유전자 해석으로부터, 이 균주를 C. 하이오인테스티날리스로 동정하였다.
또한, 이 C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 유전자의 상류, 하류에 대해서 게놈 워킹에 의해, cdt 유전자의 전염기서열을 결정하였다. 통상, 기지 유전자에 인접하는 미지 유전자의 서열 결정법은 인버스 PCR을 일반적으로 이용하고 있으나, 본 발명에서는, 랜덤 프라이머를 사용하여 게놈의 신장, 증폭을 행하여, 증가한 템플레이트에 대해 시퀀스를 행한다는 방법으로, 처음으로 cdt 유전자의 전염기서열을 결정할 수 있었다.
또한, 얻어진 염기서열과 추정 아미노산 서열을 이미 보고되어 있는 C. 제주니, C. 콜리 및 C. 페투스의 CdtA, CdtB 및 CdtC의 그들과 비교하였다. 그 결과, cdtA와 cdtC 유전자에서 가장 높은 상동성을 나타낸 C. 제주니에 대해서는 각각 51.7% 및 52.5%의 상동성이고, cdtB 유전자에서 가장 높은 상동성을 나타낸 C. 콜리에 대해서도 64.1%로, 그다지 높은 상동성은 얻어지지 않았다.
한편, CdtA, CdtB 및 CdtC의 추정 아미노산 서열의 상동성을 비교한 바, 3개의 서브유닛 모두 C. 콜리의 Cdt가 가장 높은 상동성을 나타내었으나, 각각 35.7%, 60.5% 및 28.9%로 아미노산 서열에 있어서도 높은 상동성은 얻어지지 않았다.
즉 본 발명은, 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자 증폭에 의한 캄필로박터속 세균의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
[1] 세포팽창화 치사독을 코드하는 하기(a)~(h) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(a) 서열번호:2 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
(b) 서열번호:1에 기재된 염기서열에 있어서 962번 위치에서 1600번 위치까지의 염기서열, 1601번 위치에서 2425번 위치까지의 염기서열, 2425번 위치에서 3177번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(c) 서열번호:2 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 되는 폴리펩디드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
(d) 서열번호:1에 기재된 염기서열에 있어서, 962번 위치에서 1600번 위치까지의 염기서열, 1601번 위치에서 2425번 위치까지의 염기서열, 2425번 위치에서 3177번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열로 되는 DNA에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드
(e) 서열번호:6 내지 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
(f) 서열번호:5에 기재된 염기서열에 있어서 1059번 위치에서 1835번 위치까지의 염기서열, 1853번 위치에서 2656번 위치까지의 염기서열, 2666번 위치에서 3202번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
(g) 서열번호:6 내지 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
(h) 서열번호:5에 기재된 염기서열에 있어서 1059번 위치에서 1835번 위치까지의 염기서열, 1853번 위치에서 2656번 위치까지의 염기서열, 2666번 위치에서 3202번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열로 되는 DNA에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드
[2] [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
[3] [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [2]에 기재된 벡터를 보유하는 숙주세포.
[4] [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드.
[5] [3]에 기재된 숙주세포를 배양하고, 그 숙주세포 또는 그의 배양상청으로부터, 생산시킨 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는, [4]에 기재된 폴리펩티드의 제조방법.
[6] [4]에 기재된 폴리펩티드에 결합하는 항체.
[7] 세포팽창화 치사독의 중화활성을 갖는 [6]에 기재된 항체.
또한 본 발명자 등은, C. 하이오인테스티날리스 및 다른 캄필로박터속 세균을 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 설계하였다. 따라서 본 발명은, 상기 프라이머를 사용한 캄필로박터속 세균의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
[8] 피험시료 중의 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 존재를 동시에 검출하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법.
(a) 피험시료에 대해, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA에 특이적인 프라이머쌍의 혼합물을 사용한 핵산 증폭 반응을 행하는 공정
(b) 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA의 증폭 단편의 유무 또는 분자량으로부터, 캄필로박터속 세균의 존재를 판정하는 공정
[9] 상기 프라이머쌍으로서, 이하의 (i)~(iv) 중 어느 하나 이상의 프라이머쌍을 사용하는, [8]에 기재된 방법.
(i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(iii) 캄필로박터 우프살리엔시스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:32 및 33으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(iv) 캄필로박터 라리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:34 및 35로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
[10] 상기 프라이머쌍으로서, 추가적으로 이하의 (v)~(vii)의 프라이머쌍을 사용하는, [9]에 기재된 방법.
(v) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(vi) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(vii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
[11] [8]에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트로서, 사용설명서와, 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA에 특이적인 프라이머쌍의 혼합물을 포함하는 키트.
[12] 상기 프라이머쌍으로서, 이하의 (i)~(iv) 중 어느 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는, [11]에 기재된 키트.
(i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(iii) 캄필로박터 우프살리엔시스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:32 및 33으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(iv) 캄필로박터 라리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:34 및 35로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
[13] 상기 프라이머쌍으로서, 추가적으로 이하의 (v)~(vii)의 프라이머쌍을 포함하는, [12]에 기재된 키트.
(v) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(vi) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(vii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
또한 본 발명은, C. 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독에 대한 항체를 사용한 C. 하이오인테스티날리스의 검출방법에 관한 것으로, 이하의 발명을 제공한다.
[14] 피험시료 중의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 존재를 검출하는 방법으로서, 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는 방법.
(a) 피험시료와 [6]에 기재된 항체를 접촉시키는 공정
(b) 피험시료와 [6]에 기재된 항체의 결합활성을 측정하는 공정
(c) (b)의 결합활성이 검출된 경우에, 캄필로박터 하이오인테스티날리스가 존재한다고 판정하는 공정
[15] [14]에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트로서, 사용설명서와, [6]에 기재된 항체를 포함하는 키트.
도 1은 C. 하이오인테스티날리스 타이 유래주 Ch022 및, 다른 캄필로박터속 세균에 대해서, C. 제주니, C. 콜리 및 C. 페투스의 cdtB 유전자를 증폭할 수 있는 공통 프라이머를 사용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 캄필로박터속 세균의 CdtB 추정 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다. 사각으로 둘러싼 아미노산 잔기는, DNase 활성에 필수로 생각되고 있는 아미노산 잔기를 나타낸다. C. hyo#:C. 하이오인테스티날리스.
도 3은 재조합 C. 하이오인테스티날리스 CdtB와 항혈청의 제작에 관한 도면 및 사진이다.
도 4는 항HisCdtB 항혈청의 특이성을 나타내는 사진이다. A:SDS-PAGE에 의한 Ch-CdtB의 검출결과를 나타내는 사진이다. B:웨스턴블로팅에 의한 Ch-CdtB의 검출결과를 나타내는 사진이다. 레인 1;분자량 마커, 2;Ch-rCdtB 25 ng, 3; C. 하이오인테스티날리스(Ch022) 조독소액 10 ㎕. C:겔 내 이중확산법에 의한 Ch-rCdtB 항혈청의 특이성을 나타내는 사진이다. rCjB:C. 제주니 rCdtB 1 ㎍, α-Cj:rCjB 항혈청 10 ㎕, rChB:C. 하이오인테스티날리스 rCdtB 1 ㎍, α-Ch:rChB 항혈청 10 ㎕.
도 5는 축중 프라이머를 사용한, C. 하이오인테스티날리스 ATCC주의 cdt 유전자의 증폭결과를 나타내는 도면 및 사진이다. A:cdt 유전자와 축중 프라이머 위치의 모식도를 나타내는 도면이다. B:PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 48, 72, 120시간 후에 있어서의, HeLa 세포에 대한 C. 하이오인테스티날리스 조독소액의 독소활성의 측정결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 HeLa 세포에 대한 C. 하이오인테스티날리스 조독소액의 독소활성의 측정결과를 나타내는 사진 및 도면이다. A-C:HeLa 세포에 조독소액 및 항Ch-rCdtB 혈청을 첨가하고, 48시간 후에 김자염색, 현미경 검사한 사진을 나타낸다(×100). D-F:48시간 후의 HeLa 세포 내 DNA량을 플로우 사이토미터에 의해 측정하였다. A, D:PBS, B, E:조독소액(CD50의 4배량), F, G:조독소액(CD50의 4배량) 및 항Ch-rCdtB 혈청.
도 8은 캄필로박터속 세균의 cdtB 유전자에 대한 공통 프라이머 영역을 나타내는 도면이다.
도 9는 타이 유래 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주와 ATCC주의 cdtB 유전자 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 CdtB 유전자 공통 프라이머에 의한 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 CdtB 유전자 공통 프라이머에 의한 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 C. 하이오인테스티날리스의 타이형 cdtB 유전자 검출용 특이적 프라이머에 의한 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 C. 하이오인테스티날리스 ATCC형 cdtB 유전자 검출용 특이 프라이머에 의한 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 14는 C. 하이오인테스티날리스의 ATCC형, thai형 cdtB 유전자 검출용 공통 프라이머에 의한 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 15는 C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스 및 C. 하이오인테스티날리스의 Cdt 유전자를 토대로 하는 멀티플렉스 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 16은 C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스, C. 하이오인테스티날리스, C. 라리 및 C. 우프살리엔시스의 Cdt 유전자를 토대로 하는 멀티플렉스 PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 타이 유래 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주(서열번호:5)와 ATCC주(서열번호:1)의 cdtB 유전자의 얼라이먼트 및 각종 프라이머의 위치를 나타내는 도면이다.
[발명의 실시형태]
본 명세서에 있어서 「세포팽창화 치사독」이란, cytolethal distending toxin(CDT 또는 CLDT)으로 불리는, 단백성의 A-B형 홀로톡신의 그룹에 속하는 독소인자를 가리킨다. 이것은, 그 밖에 세포팽화 치사독(소), 세포팽윤화 치사독(소) 등으로 칭해지는 경우도 있다. 세포팽창화 치사독은, A, B, C의 3유닛으로 되는 서브유닛 구조를 갖고, B 서브유닛이 독소활성 중심 유닛이고, A 및 B 서브유닛이 세포접착에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다. 세포에 작용하면 세포가 크게 부푸는 등의 변형이 생겨, 최종적으로 세포사를 일으킨다. 독소 원성 대장균이 생산하는 이열성 엔테로톡신(LT) 등을 실험적으로 세포에 작용시킨 경우에도 세포가 크게 부푸는 등의 변형이 보이나, 독소를 제거한 경우, 세포는 회복되어, 치사하는 경우는 없다. 그러나, CDT를 제거해도 세포는 회복되지 않아, 죽음에 이른다.
본 명세서에 있어서 사용되는 「폴리뉴클레오티드」란, 복수의 염기 또는 염기쌍으로 되는 폴리뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드에는, 단일 가닥형 및 이중 가닥형의 DNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 천연에 존재하는 상태에서 수식되어 있지 않은 것, 및 수식되어 있는 것의 양쪽을 포함하는 의미이다. 수식된 염기로서는, 예를 들면, 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특수한 염기가 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 「폴리펩티드」는, 복수의 아미노산으로 되는 중합체를 의미한다. 따라서, 올리고펩티드 및 단백질도 또한 폴리펩티드의 개념에 포함된다. 폴리펩티드는 천연에 존재하는 상태에서 수식되어 있지 않은 것, 및 수식되어 있는 것의 양쪽을 포함하는 의미이다. 수식으로서는, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합, 헴부분의 공유결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스파티딜이노시톨의 공유결합, 가교, 환화, 디설피드결합의 형성, 탈메틸화, 공유가교의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, γ-카르복실화, 글루코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 단백질로의 아미노산의 전이 RNA 매개 부가, 유비퀴틴화 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서 「단리」란, 본래의 환경(예를 들면 자연적으로 발생하는 것이라면 그 자연 환경)으로부터 취출된 물질(예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)을 가리키고, 그 자연상태로부터 「사람 손에 의해」 변화된 것이다. 「단리」란, 대상화합물에 실질적으로 풍부한 시료 중에 존재하는 화합물 및/또는 대상화합물이 부분적 또는 실질적으로 정제되어 있는 시료 중에 존재하는 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 여기서 「실질적으로 정제한」이라는 용어는, 그 천연 환경으로부터 분리되어, 천연에 관련되어 있는 다른 성분을 적어도 60%, 바람직하게는 75%, 및 가장 바람직하게는 90% 포함하지 않는 화합물(예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)을 가리킨다.
본 명세서에 있어서 사용되는 「변이」란, 아미노산 서열에 있어서의 아미노산의 변화 또는 염기서열에 있어서의 염기의 변화(즉 단일 또는 복수의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환, 결실, 부가 또는 삽입)를 가리킨다. 따라서, 본 명세서에 있어서 사용되는 「변이체」는, 하나 이상의 아미노산이 변화되어 있는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 염기가 변화되어 있는 염기서열을 가리킨다. 이 변이체의 염기서열의 변화는, 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경해도 되고, 하지 않아도 된다. 변이체는 대립 변이체(allelic mutant)와 같이 천연에 존재하는 것이어도 되고, 천연에 존재하는 것이 알려져 있지 않은 변이체여도 된다. 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 보존적 변화를 가질 수 있다. 드물게, 변이체는 비보존적 치환을 가질 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 저해하지 않고, 어느, 및 얼만큼 많은 아미노산 잔기를 치환, 삽입, 또는 결실할지의 결정은, 당 기술분야에 있어서 주지의 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 DNA 스타·소프트웨어를 사용하여 발견할 수 있다.
「결실」은 그 중에서 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 각각, 천연에 존재하는 세포팽창화 치사독 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 존재하지 않는, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 변화이다.
「삽입」또는「부가」는, 천연에 존재하는 세포팽창화 치사독 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기 하나 이상이 부가된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화이다.
「치환」이란, 천연에 존재하는 세포팽창화 치사독 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 아미노산 또는 뉴클레오티드 하나 이상이 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드로 교체된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화이다.
본 명세서에 있어서 사용되는 「하이브리다이즈」란, 핵산 사슬이 염기쌍 형성을 통해 상보 사슬과 결합하는 프로세스를 의미한다.
본 명세서에 있어서 「검출」이란, 정성 및 정량 양쪽의 의미를 포함한다. 또한, 「정량」에는 반정량도 포함된다.
<폴리뉴클레오티드>
본 발명은 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 포함되는, 본 발명자 등에 의해 동정된 캄필로박터 하이오인테스티날리스 ATCC(American Type Culture Collection) 분양주의 세포팽창화 치사독을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호:1에, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 3개의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열번호:2 내지 4에 나타낸다. 서열번호 2는 cdtA, 서열번호 3은 cdtB, 서열번호 4는 cdtC의 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명자 등에 의해 동정된 캄필로박터 하이오인테스티날리스 임상 분리주의 세포팽창화 치사독을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호:5에, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 3개의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열번호:6 내지 8에 나타낸다. 서열번호 6은 cdtA, 서열번호 7은 cdtB, 서열번호 8은 cdtC의 아미노산 서열이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 서열번호:2 내지 4에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호:1에 기재된 염기서열의 코드영역, 즉, 서열번호:1에 기재된 염기서열에 있어서 962번 위치에서 1600번 위치까지의 염기서열, 1601번 위치에서 2425번 위치까지의 염기서열, 2425번 위치에서 3177번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 유전 코드의 축중에 의해 서열번호:1에 기재된 염기서열과 상이한 염기서열로 되나 서열번호:2 내지 4에 기재된 아미노산 서열로 되는 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 서열번호:6 내지 8에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호:5에 기재된 염기서열의 코드영역, 즉, 서열번호:5에 기재된 염기서열에 있어서 1059번 위치에서 1835번 위치까지의 염기서열, 1853번 위치에서 2656번 위치까지의 염기서열, 2666번 위치에서 3202번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 유전 코드의 축중에 의해 서열번호:5에 기재된 염기서열과 상이한 염기서열로 되나 서열번호:6 내지 8에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 추가적으로, 이들 폴리뉴클레오티드가 코드하는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하고, 그 폴리뉴클레오티드의 서열과 그 전장에 있어서 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상(예를 들면, 98~99%) 동일한 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 염기서열의 동일성은, 예를 들면, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1933)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로, BLASTN으로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). BLASTN에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=100, worldlength=12로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 표준적인 클로닝 및 스크리닝에 의해, 예를 들면, 균체 중의 게놈 DNA와 같은 천연원으로부터 얻을 수 있다. 또한, 균체 중의 mRNA로부터 유도된 cDNA 라이브러리로부터 얻는 것도 가능하다. 또한, 상업적으로 입수 가능한 공지의 기법을 사용하여 합성하는 것도 가능하다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드의 서열(서열번호:1, 서열번호:5)과 유의한 상동성을 갖는 염기서열로 되는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 하이브리다이제이션기술(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4)이나 유전자 증폭기술(PCR)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4)을 이용하여 조제할 수 있다. 즉, 하이브리다이제이션기술을 이용하여, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드의 서열(서열번호:1, 서열번호:5) 또는 그 일부를 토대로, 이것과 상동성이 높은 DNA를 단리할 수 있다. 또한, 유전자 증폭기술을 사용하여, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드의 서열(서열번호:1, 서열번호:5)의 일부를 토대로 프라이머를 설계하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열과 상동성이 높은 폴리뉴클레오티드를 단리할 수 있다. 따라서, 본 발명자에게는 서열번호:1 또는 5에 기재된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은 당업자라면, 적절히 선택할 수 있다. 일례를 나타내자면, 25% 포름아미드, 보다 엄격한 조건에서는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10×덴하르트용액, 20 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션용액 중, 42℃에서 하룻밤 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 표지한 프로브를 첨가하고, 42℃에서 하룻밤 보온함으로써 하이브리다이제이션을 행한다. 그 후의 세정에 있어서의 세정액 및 온도조건은, 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도이며, 더욱 엄격한 조건으로서는 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」정도에서 실시할 수 있다. 이와 같이 하이브리다이제이션의 세정 조건이 엄격해질수록 프로브서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 다만, 상기 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시로서, 당업자라면 하이브리다이제이션의 스트린젠시를 결정하는 상기 또는 다른 요소(예를 들면, 프로브 농도, 프로브의 길이, 하이브리다이제이션 반응시간 등)를 적절히 조합함으로써, 상기와 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드의 서열과 유의한 상동성을 갖는 염기서열로 되는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호:1, 서열번호:5에 기재된 염기서열에 변이를 도입하는 방법(예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 8.1-8.5))을 이용하여 조제하는 것도 가능하다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드는, 자연계에 있어서의 변이에 의해 발생하는 경우도 있다. 본 발명에는, 이러한 염기서열의 변이에 의해, 서열번호:2 내지 4 또는 서열번호:6 내지 8에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등이 된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해 사용하는 경우, 그 폴리뉴클레오티드에는, 성숙 폴리펩티드의 코드서열 또는 그의 단편 단독, 다른 코드서열(예를 들면, 리더 또는 분비서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질서열, 또는 다른 융합 펩티드부분을 코드하는 것)과 동일한 리딩프레임 내에 있는 성숙 폴리펩티드의 코드서열 또는 그의 단편이 포함된다. 예를 들면, 융합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 마커서열이 코드될 수 있다. 본 발명의 이 태양의 바람직한 구체예로서, 마커서열은, pcDNA3.1/Myc-His 벡터(Invitrogen사)에 의해 제공되며 또한 Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989) 86:821:824에 기재되는 바와 같은 헥사-히스티딘 펩티드, 또는 Myc 태그이다. 또한, 이 폴리뉴클레오티드는 5' 및 3' 비코드서열, 예를 들면, 전사되지만 번역되지 않는 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날, 리보솜 결합부위, 및 mRNA 안정화서열을 포함하고 있어도 된다.
<폴리펩티드>
본 발명은 본 발명자 등이 동정한 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독의 폴리펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제공한다. 여기서 「기능적으로 동등」하다는 것은, 대상이 되는 폴리펩티드가 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 동등한 세포팽창화 치사독의 특성을 가지고 있는 것을 의미한다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 방법 중 하나의 태양으로서는, 단백질 중의 아미노산 서열에 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)이 포함된다. 또한, 폴리펩티드 중의 아미노산의 변이는, 자연계에 있어서 발생하는 경우도 있다. 본 발명에는, 이와 같이 인공적이냐 자연적으로 발생한 것이냐를 불문하고, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호:2 내지 4, 서열번호:6 내지 8)에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등에 의해 변이된 단백질로서, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드가 포함된다.
치환되는 아미노산은, 단백질의 기능 유지 관점에서, 치환 전의 아미노산과 유사한 성질을 갖는 아미노산인 것이 바람직하다(보존적 치환). 예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp는, 모두 비극성 아미노산으로 분류되기 때문에, 서로 유사한 성질을 갖는 것으로 생각된다. 또한, 비하전성으로서는, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln을 들 수 있다. 또한, 산성 아미노산으로서는, Asp 및 Glu를, 염기성 아미노산으로서는 Lys, Arg, His를 들 수 있다.
이들 폴리펩티드에 있어서의 아미노산의 변이 수나 변이 부위는, 그 기능이 유지되는 한 제한은 없다. 변이 수는 전형적으로는 전아미노산의 10% 이내이고, 바람직하게는 전아미노산의 5% 이내이며, 더욱 바람직하게는 전아미노산의 1% 이내라 생각된다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 방법의 다른 태양으로서는, 하이브리다이제이션 기술 또는 유전자 증폭기술을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자라면, 하이브리다이제이션 기술(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4)을 이용하여 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열(서열번호:1, 서열번호:5) 또는 그의 일부를 토대로 동정 또는 이종 생물 유래의 DNA 시료로부터, 이것과 상동성이 높은 DNA를 단리하여, 그 DNA로부터 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 얻는 것은, 통상 행할 수 있는 것이다. 이와 같이 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA에 의해 코드되는 폴리펩티드로서, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 단리하기 위한 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은 당업자라면, 적절히 선택할 수 있다. 일례를 나타내자면, 25% 포름아미드, 보다 엄격한 조건에서는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10×덴하르트용액, 20 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중, 42℃에서 하룻밤 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 표지한 프로브를 첨가하고, 42℃에서 하룻밤 보온함으로써 하이브리다이제이션을 행한다. 그 후의 세정에 있어서의 세정액 및 온도조건은, 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도이며, 더욱 엄격한 조건으로서는 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」정도에서 실시할 수 있다. 이와 같이 하이브리다이제이션의 세정 조건이 엄격해질수록 프로브서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 다만, 상기 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시로서, 당업자라면 하이브리다이제이션의 스트린젠시를 결정하는 상기 또는 다른 요소(예를 들면, 프로브 농도, 프로브의 길이, 하이브리다이제이션 반응시간 등)를 적절히 조합함으로써, 상기와 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.
이러한 하이브리다이제이션 기술을 이용하여 단리되는 DNA가 코드하는 폴리펩티드는, 통상, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 아미노산 서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 이상(예를 들면, 98~99%)의 서열의 상동성을 가리킨다. 아미노산 서열의 동일성은, 예를 들면, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1933)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로, BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, worldlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다.
또한, 유전자 증폭기술(PCR)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4)을 사용하여 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열(서열번호:1, 서열번호:5)의 일부를 토대로 프라이머를 설계하고, 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열과 상동성이 높은 DNA 단편을 단리하여, 그 DNA를 토대로 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 얻는 것도 가능하다.
<폴리펩티드의 단편>
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 단편을 제공한다. 이러한 단편은 전체적으로 상기 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부와 동일하나, 전부와는 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드 단편은, 통상, 8 아미노산 잔기 이상, 바람직하게는 12 아미노산 잔기 이상(예를 들면, 15 아미노산 잔기 이상)의 서열로 되는 폴리펩티드 단편이다. 바람직한 단편으로서는, 예를 들면, 아미노 말단을 포함하는 일련의 잔기 또는 카르복실 말단을 포함하는 일련의 잔기의 결실, 또는 아미노 말단을 포함하는 일련의 잔기와 카르복실 말단을 포함하는 일련의 잔기의 이련의 잔기가 결실된 아미노산 서열을 갖는 절단(truncation) 폴리펩티드가 포함된다. 또한, α헬릭스와 α헬릭스 형성영역, β시트와 β시트 형성영역, 턴과 턴 형성영역, 코일과 코일 형성영역, 친수성 영역, 소수성 영역, α양친매성 영역, β양친매성 영역, 가변성 영역, 표면 형성영역, 기질 결합영역, 및 고항원지수영역을 포함하는 단편과 같은, 구조적 또는 기능적 특성에 의해 특징지어지는 단편도 적합하다. 그 밖의 바람직한 단편은 생물학적으로 활성인 단편이다. 생물학적으로 활성인 단편은, 동일한 활성을 갖는 단편, 그 활성이 향상된 단편, 또는 바람직하지 않은 활성이 감소한 단편을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 매개하는 것이다. 추가적으로, 동물, 특히 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성이 있는 단편도 포함된다. 이들 폴리펩티드 단편은, 항원활성을 포함한 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 것이 바람직하다. 특정된 서열 및 단편의 변이형도 본 발명의 일부를 구성한다. 바람직한 변이형은 동류 아미노산 치환에 의해 대상물과 상이한 것, 즉, 어느 잔기가 동일한 성질의 다른 잔기로 치환되어 있는 것이다. 전형적인 이러한 치환은, Ala, Val, Leu와 Ile 사이, Ser과 Thr 사이, 산성 잔기 Asp와 Glu 사이, Asn과 Gln 사이, 염기성 잔기 Lys와 Arg 사이, 또는 방향족 잔기 Phe와 Tyr 사이에서 일어난다.
<폴리펩티드의 제조>
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 적당한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는, 단리된 천연으로 존재하는 폴리펩티드, 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 합성적으로 제조된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 재조합에 의해 제조된 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 제조를 위한 수단은 당업계에서 잘 이해되어 있다. 재조합적인 폴리펩티드는, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입한 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환체 내에서 발현한 폴리펩티드를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다. 한편, 천연 유래의 폴리펩티드는, 예를 들면, 후술하는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 결합한 친화성 칼럼을 이용하여 조제할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19). 친화성 정제에 사용하는 항체는, 다중클론항체여도 되고 단일클론항체여도 된다. 또한, 인비트로 트랜슬레이션(예를 들면,「On the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system. Dasso,M.C.,Jackson,R.J.(1989) NAR 17:3129-3144」참조) 등에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 조제하는 것도 가능하다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다.
<프로브·프라이머>
본 발명은 본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드(서열번호:1에 기재된 염기서열로 되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥, 서열번호:5에 기재된 염기서열로 되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥)에 상보적인, 적어도 15 뉴클레오티드 또는 20 뉴클레오티드의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 15~100 뉴클레오티드, 20~100 뉴클레오티드, 15~35 뉴클레오티드, 20~35 뉴클레오티드의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 여기서 「상보가닥」이란, A:T(단 RNA의 경우는 U), G:C의 염기쌍으로 되는 이중 가닥 핵산의 한쪽 가닥에 대한 다른쪽 가닥을 가리킨다. 또한, 「상보적」이란, 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드 영역에서 완전히 상보서열인 경우에 한정되지 않고, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 염기서열 상의 상동성을 가지면 된다. 상동성을 결정하기 위한 알고리즘은 본 명세서에 기재한 것을 사용하면 된다. 이러한 뉴클레오티드는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출, 단리하기 위한 프로브로서, 또한, 본 발명의 뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머로서 이용하는 것이 가능하다. 프라이머로서 사용하는 경우에는, 통상, 15~100 뉴클레오티드, 바람직하게는 15~35 뉴클레오티드의 사슬길이를 갖는다. 또한, 프로브로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 DNA의 적어도 일부 또는 전부의 서열을 포함하는 적어도 15 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30 뉴클레오티드의 사슬길이의 뉴클레오티드가 사용된다. 본 발명의 뉴클레오티드를 프라이머로 하는 경우, 핵산 증폭 반응의 종류는, 목적으로 하는 증폭산물이 얻어지는 한, 특별히 제한은 없다. 예를 들면, PCR(폴리머라아제 연쇄반응)법, ICAN법, LAMP법, SDA법, LCR법 등의 DNA 증폭반응, NASBA법 등의 RNA 증폭반응 중에서 선택할 수 있다. 바람직한 방법으로서는, PCR법을 나타낼 수 있다.
이러한 뉴클레오티드의 하나의 태양은, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 특이적인 것이다. 「특이적」이란, 통상의 하이브리다이제이션 조건하, 바람직하게는 스트린젠트한 조건하에서, 특정 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하고, 다른 폴리펩티드를 코드하는 DNA와는 하이브리다이즈하지 않는 것을 의미한다.
본 발명자 등에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드의 일부를 증폭하기 위한 프라이머의 구체예로서, 실시예에 기재된 하기 (i) 또는 (ii)의 프라이머를 들 수 있다.
(i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
(ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
전술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 적용할 수 있는 핵산 증폭 반응은, 목적으로 하는 증폭산물이 얻어지는 한, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, PCR(폴리머라아제 연쇄반응)법, ICAN법, LAMP법, SDA법, LCR법 등의 DNA 증폭반응, NASBA법 등의 RNA 증폭반응 중에서 선택할 수 있다. 바람직한 방법으로서는, PCR법을 나타낼 수 있다. 당업자라면, 상기 프라이머를 토대로, 실시하는 핵산 증폭 방법에 의해 적합한 변이 프라이머를 설계하는 것도 가능하다. 변이 프라이머는 합성에 의해 조제할 수 있다. 또한, 변이 프라이머가, 변이 전의 프라이머와 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는지는, 변이 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응을 행하여, 그 증폭산물을 분석함으로써, 간편하게 평가할 수 있다.
이들 프라이머는, 피험시료 중의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 존재의 검출에 바람직하게 이용할 수 있다.
<벡터, 숙주세포, 폴리펩티드의 제조>
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그 벡터를 보유하는 숙주세포, 및 그 숙주세포를 이용한 본 발명의 폴리펩티드의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 벡터로서는, 삽입한 DNA를 안정하게 보유하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주에 대장균을 사용하는 것이라면, 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사제) 등이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는, 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사제), 대장균이라면 pET 벡터(Invitrogen사제), 배양세포라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입은, 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 제한효소 사이트를 사용한 리가아제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
본 발명의 벡터가 도입되는 숙주세포로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각종 숙주세포가 사용된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면, 세균세포(예:스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 길초균), 진균세포(예:효모, 아스페르길루스), 곤충세포(예:드로소필라 S2, 스포도프테라 SF9), 동물세포(예:CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 멜라노머세포) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면, 인산칼슘침전법, 전기펄스천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), 리포펙트아민법(GIBCO-BRL사제), 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
숙주세포에 있어서 발현한 폴리펩티드를 소포체의 내강에, 세포 주변강에, 또는 세포외의 환경으로 분비시키기 위해, 적당한 분비시그날을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그날은 목적의 폴리펩티드에 대해 내인성이어도 되고, 이종 시그날이어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드의 회수는, 본 발명의 폴리펩티드가 배지에 분비되는 경우는, 배지를 회수한다. 본 발명의 폴리펩티드가 세포내에 생산되는 경우는, 그 세포를 먼저 용해하고, 그 후에 폴리펩티드를 회수한다.
재조합 세포배양물로부터 본 발명의 폴리펩티드를 회수하여 정제하기 위해서는, 황산암모늄 또는 에탄올침전, 산추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지의 방법을 사용할 수 있다.
<항체>
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 여기에서 「항체」에는, 다중클론항체 및 단일클론항체, 키메라항체, 단일가닥항체, 인간화항체, 추가적으로 Fab 또는 다른 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물을 포함하는 Fab 프래그먼트가 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 유사체, 또는 그들을 발현하는 세포는, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하기 위한 면역원으로서도 사용할 수 있다. 항체는, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 면역 특이적이다. 「면역 특이적」이란, 그 항체가 다른 폴리펩티드에 대한 그 친화성 보다도 본 발명의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 높은 친화성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체로서 보다 바람직하게는, C. 하이오인테스티날리스 세포팽창화 치사독의 중화활성을 갖는 항체를 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 다중클론항체의 경우에는, 예를 들면, 다음과 같이 하여 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 GST와의 융합 단백질을 토끼 등의 소동물에 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을, 예를 들면, 황산암모늄 침전, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 본 발명의 폴리펩티드를 커플링한 친화성 칼럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다. 또한, 단일클론항체의 경우에는, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 마우스 등의 소동물에 면역을 행하고, 동 마우스로부터 비장을 적출하여, 이것을 갈아 으깨어 세포를 분리하고, 마우스 미엘로마세포와 폴리에틸렌글리콜 등의 시약에 의해 융합시켜, 이것에 의해 생성된 융합세포(하이브리도마) 중에서, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하는 클론을 선택한다. 이어서, 얻어진 하이브리도마를 마우스 복강 내에 이식하고, 동 마우스로부터 복수를 회수하여, 얻어진 단일클론항체를, 예를 들면, 황산암모늄 침전, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 본 발명의 폴리펩티드를 커플링한 친화성 칼럼 등에 의해 정제함으로써, 조제하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체는, 피험시료 중의 본 발명의 폴리펩티드의 검출이나 정제에 사용하는 것도 가능하다.
<피험시료 중의 캄필로박터속 세균의 존재의 검출>
본 발명은 피험시료 중의 캄필로박터속 세균의 존재의 검출방법을 제공한다. 피험시료 중의 캄필로박터속 세균의 존재의 검출은, 캄필로박터 감염증의 진단, 캄필로박터 하이오인테스티날리스에 오염된 식품의 신속 진단, 식품가공공정의 승인, 식중독 발생시에 있어서의 기인균의 동정 등 각종 목적에 있어서 유용하다.
본 발명의 검출방법의 하나의 태양은, 피험시료 중의 캄필로박터속 세균의 존재를 검출하는 방법으로서, (a) 피험시료에 대해, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA에 특이적인 프라이머쌍의 혼합물을 사용한 핵산 증폭 반응을 행하는 공정, 및 (b) 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA의 증폭단편의 유무 또는 분자량으로부터, 캄필로박터속 세균의 존재를 판정하는 공정을 포함하는 방법이다.
본 발명에 있어서 「게놈 DNA에 특이적인 프라이머」란, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA의 영역에 특이적인 프라이머에 한정되지 않고, 상기 게놈 DNA의 영역에 상당하는 mRNA의 영역에 특이적인 프라이머도 포함한다.
캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA에 대해 특이적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머는 전술한 기재의 방법에 따라 제작할 수 있다. 프라이머 결합서열부분은 특별히 한정되지 않으나, PCR 증폭 후에 프라이머부분을 제한효소에 의해 잘라낼 수 있도록 적당한 제한효소 사이트를 갖도록 조제해도 된다. 프라이머 결합서열부분의 길이는 특별히 한정하지는 않으나, 약 20~50, 바람직하게는 20~30 염기 정도이다. 또한, PCR 증폭 후의 단일가닥 DNA를 전기영동 등으로 분리 가능하게 하기 위해, 5'측 말단에, 방사표지, 형광표지 등에 의한 표지를 행해도 된다. 또한, RNA 분자를 조제하는 경우에는, 5'말단측의 프라이머에 적당한 프로모터, 예를 들면, T7 프로모터서열 등을 배치하고, DNA 분자로부터 RNA 분자로의 전사가 가능해지도록 조제해도 된다.
본 발명의 방법은, 또한 PCR-RFLP법을 사용하여 캄필로박터속 세균의 종을 동정하는 공정을 포함할 수 있다. PCR법으로 증폭한 DNA를 각종 제한효소로 처리하고, 생성되는 단편의 길이로부터 다형을 검출하는 방법은, PCR-RFLP법(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism:PCR-제한효소 단편길이 다형)으로 불린다. 본 발명에서 검출 대상이 되는 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독 cdt 유전자는, 균종에 따라 유전자서열이 상이한 것으로부터, PCR-RFLP법을 균종의 동정에 의해 응용하는 것이 가능하다.
본 공정에 있어서는, 먼저 서열 비교에 의해 균종별로 서열이 상이한 부위(다형부위)를 결정한다. 이어서, 어느 하나의 균종에 있어서의 상기 다형부위를 인식하는 제한효소를 선택한다. 이러한 제한효소가 존재하는 경우, 복수의 캄필로박터속 세균을 포함하는 시료에 대해서 cdt 유전자를 대상으로 한 PCR을 행하여, 얻어진 PCR 산물을 상기 제한효소로 소화하고, 전기영동을 행하여 단편길이를 비교함으로써, 상기 다형부위를 갖는 균종이 포함되는지 여부를 판단할 수 있다. 당업자라면, 공지의 캄필로박터속 세균의 cdt 유전자 및 본 발명에서 제공하는 C. 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자를 비교하여 서열이 상이한 부위를 결정하여, 그 부위를 인식하는 제한효소를 적절히 선택할 수 있다.
본 발명은 또한, PCR-RFLP법으로 대표되는, 핵산 증폭법에 의해 증폭된 DNA를 각종 제한효소로 처리하고, 생성되는 단편의 길이로부터 다형을 검출하는 방법에 바람직하게 사용되는 프라이머를 제공한다.
본 발명으로의 PCR-RFLP법의 응용 일례로서는, 서열번호:18 및 19에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:cdtB commonU 및 cdtB commonR)에 의해 증폭한 단편을, 제한효소 EcoRI, XbaI, HindIII 또는 Sau3AI를 단독, 또는 이들 효소의 복수 조합에 의해 소화하고, 전기영동을 행함으로써 균종을 동정하는 것이 가능하다.
본 발명의 검출방법의 보다 구체적인 예로서는, 피험시료 중의 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 존재를 동시에 검출하는 방법으로서, 피험시료에 대해, 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA에 특이적인, 「(i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(iii) 캄필로박터 우프살리엔시스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:32 및 33으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 및 「(iv) 캄필로박터 라리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:34 및 35로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 중 어느 하나 이상의 프라이머쌍을 사용한 핵산 증폭 반응을 행하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
상기 방법은, C. 하이오인테스티날리스, C. 우프살리엔시스 및 C. 라리에 대해서, 각각의 cdtB 게놈 DNA 또는 mRNA에 특이적인 영역을 증폭함으로써, 세균을 검출하는 방법이다.
상기 방법에 있어서 사용하는 프라이머로서는, C. 하이오인테스티날리스에 대해서는, 첫째로 「서열번호:24 및 25에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:ChspBU7 및 ChspBR7)」, 둘째로 「서열번호:18 및 19에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:cdtB commonU 및 cdtB commonR)」을 들 수 있으나, 각각 상기 서열에 한정되지 않고, C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 게놈 DNA 또는 mRNA에 특이적으로 결합 가능한 2개의 폴리뉴클레오티드로 되는 프라이머쌍으로서, C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 게놈 DNA를 주형으로 하여 「서열번호:24 및 25에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍」 또는 「서열번호:18 및 19에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍」에 의해 증폭되는 영역 또는 상당하는 mRNA 영역을 증폭 가능한 프라이머쌍이라면, 다른 서열이더라도 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「특이적으로 결합」이란, 「결합」으로부터 우발적인 결합(비특이적인 결합)을 배제할 의도이다.
상기 C. 하이오인테스티날리스를 검출하는 프라이머가 결합하는 cdtB 유전자의 위치를 도 17에 나타낸다.
또한, C. 우프살리엔시스에 대해서는, 첫째로 「서열번호:32 및 33에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:CupspBU3 및 CupspBR4)」을 들 수 있으나, 상기 서열에 한정되지 않고, C. 페투스의 cdtB 게놈 DNA를 주형으로 하여 「서열번호:32 및 33에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍」에 의해 증폭되는 영역 또는 상당하는 mRNA 영역을 증폭 가능한 프라이머쌍이라면, 다른 서열이더라도 사용할 수 있다.
또한, C. 페투스에 대해서는, 첫째로 「서열번호:34 및 35에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:ClaspBU4 및 ClaspBR4)」을 들 수 있으나, 상기 서열에 한정되지 않고, C. 페투스의 cdtB 게놈 DNA를 주형으로 하여 「서열번호:34 및 35에 기재된 서열로 되는 프라이머쌍」에 의해 증폭되는 영역 또는 상당하는 mRNA 영역을 증폭 가능한 프라이머쌍이라면, 다른 서열이더라도 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은, 전술한 (i)~(iv)의 프라이머쌍을 따로 따로 사용해도 되나, 단일 핵산 증폭 반응에 있어서 양쪽 프라이머쌍을 동시에 사용하는 것도 가능하다. 실시예와 같이, 복수의 PCR 프라이머를 단일 반응계에서 사용하는 PCR은, 멀티플렉스 PCR법으로 불려, PCR 산물을 전기영동하고, 밴드의 사이즈를 봄으로써 복수의 균종을 동시에 감별할 수 있다. 본 발명은 이 멀티플렉스 PCR법을 대표로 하는, 복수의 핵산영역의 증폭에 바람직하게 사용되는 프라이머 및 그의 조합을 사용한 핵산 증폭법에 의한 캄필로박터속 세균의 검출방법을 제공한다. 본 발명에 있어서의 핵산 증폭의 방법은, 목적으로 하는 증폭물이 얻어지는 한 종류는 상관없다. 예를 들면, PCR(폴리머라아제 연쇄반응)법(RT-PCR법을 포함한다), ICAN법, LAMP법, SDA법, LCR법, NASBA법 등, 공지의 핵산 증폭 반응 중에서 선택할 수 있다. PCR법은 본 발명에 있어서 바람직한 핵산 증폭법의 구체예이다. 본 발명의 방법은 실시간 PCR법 등에 의해 정량법으로서 실시해도 된다.
본 발명의 방법은, 상기 (i)~(iv)의 프라이머쌍과 함께 「(v) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cj-CdtBU5 및 Cj-CdtBR6), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(vi) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cc-CdtBU5 및 Cc-CdtBR5), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 및 「(vii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cf-CdtBU6 및 Cf-CdtBR3), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」을 단일 핵산 증폭 반응계에 있어서 사용할 수 있다. 즉 본 발명은, 피험시료 중의 C. 하이오인테스티날리스, 및 C. 우프살리엔시스, C. 라리, C. 제주니, C. 페투스, 및 C. 콜리의 6종의 캄필로박터속 세균을 동시에 검출 가능한 방법을 제공한다. 본 발명자 등은, 상기 프라이머를 동시에 사용하여 핵산 증폭 반응을 행하여, 상기 6종의 캄필로박터속 세균을 한번에 검출 가능한 것을 확인하였다. 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 목적으로 하는 캄필로박터속 세균을 확실하게 검출하는 한편, 다른 종의 캄필로박터속 세균을 오검출하지 않아, 매우 특이성이 높은 방법이다.
본 발명의 방법은, 전술한 캄필로박터속 세균 6종에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응을 행하는 공정 후에, 「캄필로박터속 세균의 cdt 게놈 DNA 또는 mRNA의 증폭 단편의 유무 또는 그 증폭 단편의 분자량으로부터, 캄필로박터속 세균의 존재를 판정하는 공정」 또는 「캄필로박터속 세균의 cdt 게놈 DNA 또는 mRNA의 증폭 단편량을 정량하는 공정」을 포함한다.
또한 본 발명은, 상기 본 발명의 검출방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이들 키트는, 상기한 프라이머쌍 외에, 사용설명서를 포함하는 것이다. 추가적인 다른 요소 예를 들면, 형광 프로브, 인터칼레이터, 폴리뉴클레오티드 조제용 시약, 양성 또는 음성 프라이머쌍 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 제1 태양은, 전술한 「(i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(iii) 캄필로박터 우프살리엔시스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:32 및 33으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 및 「(iv) 캄필로박터 라리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:34 및 35로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 중, 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 키트이다.
또한, 상기 키트는 추가적으로, 「(v) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cj-CdtBU5 및 Cj-CdtBR6), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」, 「(vi) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cc-CdtBU5 및 Cc-CdtBR5), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」 및 「(vii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍(실시예 프라이머:Cf-CdtBU6 및 Cf-CdtBR3), 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍」을 포함할 수 있다. 이와 같이, C. 하이오인테스티날리스, C. 우프살리엔시스, C. 라리, C. 제주니, C. 페투스, 및 C. 콜리의 6종 각각에 대해서 특이적인 프라이머쌍을 모두 포함하는 본 발명의 키트는, 멀티플렉스 PCR법 등에 의해, 상기 캄필로박터속 세균의 혼합 감염을 한번에 검출할 수 있다.
본 발명의 검출방법의 다른 태양은, 피험시료 중의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 존재를 검출하는 방법으로서, (a) 피험시료와, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 접촉시키는 공정, (b) 피험시료와 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체의 결합활성을 측정하는 공정, (c) (b)의 결합활성이 검출된 경우에, 캄필로박터 하이오인테스티날리스가 존재한다고 판정하는 공정을 포함하는 방법이다.
상기 검출방법에는, 전술한 방법에 의해 취득한 항체를 사용할 수 있다. 피험시료와 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체의 결합활성의 측정방법으로서는, 웨스턴블로팅법, 도트블로팅법, 면역침강법, 효소결합 면역측정법(ELISA), 또는 면역형광법 등을 들 수 있다. 이들 방법에 의해, 피험시료에 있어서의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 검출함으로써, 피험시료 중에 있어서의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 존재를 평가하는 것이 가능하다.
또한, 상기 항체와, 기타 요소를 조합시킴으로써, 상기 본 발명의 검출방법에 사용하기 위한 키트로 할 수 있다. 이러한 키트에는, 상기의 항체, 검출시약, 기타, 증류수, 염, 완충액, 단백질 안정제, 보존제 등이 포함되어 있어도 된다. 또한, 예를 들면 ELISA용 시약으로서, 효소표지를 검출하기 위한 발색기질이나, 고상을 세정하기 위한 세정액을 조합시킬 수 있다. 추가적으로, 측정조작을 설명하기 위한 지시서를 키트에 첨부하는 것도 가능하다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] C. 하이오인테스티날리스 타이 유래주 Ch022의 cdt 유전자의 서열 결정
Ch022주의 게놈 유전자를 통상적인 방법에 의해 단리하였다.
단리한 Ch022 게놈 유전자 100 ng을, C. 제주니, C. 콜리 및 C. 페투스의 cdtB 유전자를 증폭할 수 있는 공통 프라이머를 사용하여, Ex Taq PCR kit(TaKaRa) PCR을 행하였다(도 1). 프라이머 농도는 각각 0.5 μM, 10×Ex Taq 버퍼 5 μL, dNTP 4 μL, Ex Taq 1.25 U를 멸균수로 50 μL로 하였다. PCR 혼합물을 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초의 프로그램으로 30 사이클 PCR하였다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색한 후, UV하에서 증폭 밴드를 확인하였다(도 1).
얻어진 약 720 bp의 특이적 증폭 밴드를 통상적인 방법에 의해 정제하고, 공통 프라이머를 사용하여 시퀀스를 행하였다. 시퀀스는 BigDye terminator kit ver. 1.1(Applied Biosystems)을 사용하여 매뉴얼 대로 행하였다.
얻어진 시퀀스로부터, 게놈 워킹용 프라이머를 설계하고, 상류, 하류에 대해 게놈 워킹을 반복하여, cdt 유전자를 포함하는 전장 4,069 bp의 유전자서열을 결정하였다(서열번호:5). 또한, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주의 cdtABC 유전자의 ORF는, 각각 798 bp(266 aa, (서열번호:6)), 804 bp(268 aa, (서열번호:7)), 537 bp(178 aa, (서열번호:8))로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 이들 결과를, C. 제주니, C. 콜리 및 C. 페투스의 cdtA, cdtB, cdtC 유전자의 염기서열과 비교한 바, cdtA와 cdtC 유전자는 C. 제주니의 그들과 가장 가까운 상동성을 나타내었으나, cdtB 유전자에서는, C. 콜리와 가장 높은 상동성을 나타내었다(표 1). 한편, CdtA, CdtB 및 CdtC의 추정 아미노산 서열의 상동성을 비교한 바, 3개의 서브유닛 모두 C. 콜리의 Cdt와 가장 높은 상동성을 나타내고, 각각 35.7%, 60.5% 및 28.9%였다(표 1).
Figure 112010020122990-pct00001
C. 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자의 삽입부위는, C. 제주니, C. 콜리와 C. 페투스의 cdt 유전자의 삽입개소와는 달리, cdtA 유전자의 상류에는 헬리코박터과에 Glycosyl transferase에 53.6%(128 aa/239 aa)의 상동성을 갖는 ORF가 발견되었다. 한편, cdtC 유전자의 하류에는 T. denitrificans의 Sugar transferase에 56.0%(155 aa/277 aa)의 상동성을 갖는 ORF가 존재하였다. 추가적으로 C. 하이오인테스티날리스의 CdtB의 추정 아미노산 서열 중에, 다른 균종이 생산하는 CdtB의 DNase 활성에 필수로 보고되어 있는 아미노산 잔기도 보존되어 있었다(Yamasaki S, et al., 2006. Toxin Rev, 25, 61-88.)(도 2).
[실시예 2] C. 하이오인테스티날리스 타이 유래주 Ch022의 CdtB 재조합 단백질(Ch-rCdtB)의 제작
C. 하이오인테스티날리스 타이 유래주 Ch022의 CdtB의 시그날서열로 예측되는 CdtB1-17 aa를 제외한 cdtB 유전자를 PCR로 증폭하고, pET-28(a) plasmid vector에 클로닝하여, 재조합 C. 하이오인테스티날리스 타이 유래주 Ch022의 cdtB 유전자 클론 pWSY-2를 얻었다.
PWSY-2를 재조합 단백 발현용 대장균 BL-21(DE3)(Novagen)으로 형질전환하고, 얻어진 클론을 20 ㎍/mL 카나마이신을 포함하는 600 ㎖의 LB-Broth에서 대량 배양한 후, 0.5 mM IPTG로 3시간 37℃에서 재조합 단백질(Ch-rCdtB)을 발현 유도하였다. Ch-rCdtB를 발현시킨 대장균을 초음파파쇄하여, Ni-Chelating Sepharose(GE Healthcare)로 친화성 정제하고, 추가적으로 Superdex 75(GE Healthcare)로 겔 여과하여, 정제하였다(도 3).
[실시예 3] C. hyointestinalis 타이 유래주 Ch022의 CdtB 항체의 제작
정제 Ch-rCdtB 250 ㎍과 프로인트 완전 아쥬반트를 등량 혼합한 에멀젼을 토끼(kbs:NZW)에 피하 및 근육내 투여하고, 이후, 정제 Ch-rCdtB 250 ㎍과 프로인트 불완전 아쥬반트를 등량 혼합한 에멀젼을 초회 투여로부터 4주 후, 이후 2주간 간격으로 약 8주간에 걸쳐 합계 5회 면역하여, 항혈청을 제작하였다. 얻어진 항혈청의 역가(titer)와 특이성을 겔 내 이중확산법 및 웨스턴블로팅법으로 확인하였다(도 4).
항Ch-rCdtB 혈청의 역가는, 겔 내 이중확산법으로 64배를 나타내었다. 또한, C. 제주니의 rCdtB와도 침강선을 형성하지 않은 것으로부터, C. 제주니의 CdtB와는 면역학적으로 상이한 것을 알 수 있었다(도 4C). 정제 Ch-rCdtB와 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주의 조독소액을 사용하여 웨스턴블로팅을 행한 바, 분자량 약 30 Kd의 정제 Ch-rCdtB와 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주의 조독소액 중의 CdtB에 상당하는 크기의 밴드와 특이적으로 반응한 것으로부터, 얻어진 Ch-rCdtB에 대한 항체는 매우 특이성이 높은 것으로 생각되었다(도 4B).
[실시예 4] C. 하이오인테스티날리스 ATCC 35217의 cdt 유전자의 서열 결정
C. 하이오인테스티날리스 ATCC 35217주의 게놈 유전자를 통상적인 방법에 의해 단리하였다.
단리한 C. hyointestinalis ATCC 35217 게놈 유전자 100 ng를 축중 프라이머(GNW, WMI)를 사용하여, Ex Taq PCR kit(TaKaRa) PCR을 행하였다(도 5). 프라이머 농도는 각각 0.5 μM, 10×Ex Taq 버퍼 5 μL, dNTP 4 μL, Ex Taq 1.25 U를 멸균수로 50 μL로 하였다. PCR 혼합물을 94℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 60초의 프로그램으로 30 사이클 PCR하였다. 얻어진 PCR 산물을 1.5% 아가로오스 겔 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색한 후, UV하에서 증폭 밴드를 확인하였다(도 5).
얻어진 약 960 bp의 특이적 증폭 밴드를 통상적인 방법에 의해 정제하고, pT7Blue plasmid vector(Novagen)에 클로닝하여, pChATcdtA-B4를 얻었다. 얻어진 pChATcdtA-B4를 플라스미드에 코드되어 있는 M13 프라이머를 사용하여 시퀀스를 행하였다. 시퀀스는 BigDye terminator kit ver. 1.1(Applied Biosystems)을 사용하여 매뉴얼 대로 행하였다.
얻어진 시퀀스를 BLAST에 의해 호몰로지 검색을 행한 바, cdtA의 일부와 cdtB 일부의 유전자에 상동성이 있는 것을 알 수 있었다.
얻어진 시퀀스로부터, 게놈 워킹용 프라이머를 설계하고, 상류, 하류에 대해 게놈 워킹을 반복하여, cdt 유전자를 포함하는 전장 3,999 bp의 유전자서열을 결정하였다(서열번호:1). 또한, CdtA-C의 ORF를 명확히 하였다. 각각의 아미노산 서열을 CdtA(서열번호:2), CdtB(서열번호:3), CdtC(서열번호:4)에 나타낸다.
[실시예 5] HeLa 세포에 의한 CDT 활성의 측정(타이주, ATCC주 공통)
C. 하이오인테스티날리스 Ch022주 및 C. 하이오인테스티날리스 ATCC 35217을 말 혈액 한천배지에서 37℃, 미호기 조건하(5% CO2, 10% O2, 85% N2)에서 48시간 배양하였다. 얻어진 균체를 OD600가 1.0이 되도록 MEM 배지에 현탁하고, 초음파로 파쇄 후, 원심분리로 얻어진 상청을 공경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과멸균하였다. 얻어진 샘플을 조독소액으로서 단계 희석하고, 각각을 HeLa 세포에 첨가하여, 48시간과 120시간 후에 세포의 형태변화를 관찰하였다(도 6). 타이주에 관해서는 항Ch-rCdtB 혈청을 동시에 첨가하고, CDT 활성이 특이적인지 여부도 검토하였다. 또한, 48시간 후에는, 플로우 사이토미터를 사용하여 세포의 DNA량을 측정하였다(도 7). 독소활성은 50% 이상의 세포가 팽화되는 조독소액의 최대 희석률을 역가로 하였다.
C. 하이오인테스티날리스의 조독소액을 HeLa 세포에 첨가한 바, 16배 희석까지, 48시간 후에 세포팽화활성을 120시간 후에는 세포치사활성을 나타내었다(도 6). 그들의 활성은 항Ch-rCdtB 혈청에 의해 중화되었다. 또한, 마찬가지로 플로우 사이토미터를 사용하여 조독소액 첨가 후 48시간의 세포의 DNA량을 측정한 결과, 저명한 G2/M기 정지가 보였다. 조독소액을 첨가하지 않은 음성 대조나 조독소액과 항Ch-rCdtB 혈청을 첨가한 경우에서는, G0/G1에 상당하는 높은 피크가 얻어졌으나, G2/M기 정지는 보이지 않았다(도 7).
이상의 결과로부터, C. 하이오인테스티날리스는 독소활성을 갖는 CDT를 생산하고 있는 것이 명확해졌다. 또한 이들 독소활성은 항Ch-rCdtB 항혈청으로 중화되는 것으로부터, CDT에 의한 것이라고 생각되었다.
[실시예 6] 캄필로박터속 세균의 배지, 배양조건 및 시약
캄필로박터속 세균의 배양에는, CM271 BLOOD AGAR BASE No.2(OXOID, Basingstoke, UK)[7.5 g Proteose peptone, 1.25 g Liver digest, 2.5 g Yeast extract, 2.5 g Sodium chloride, 6.0 g Agar/500 ㎖ DW) pH 7.4±0.2 at 25℃]에 5% 말 무균 탈섬혈(일본 생물재료 센터, 도쿄)을 첨가한 말 혈액 한천배지를 사용하였다. C. concisus(이하, C. 콘시서스라 약칭한다)에는 추가적으로 6% 포름산나트륨, 6% 푸마르산용액을 1 플레이트당 0.25 mL 도포한 것을 사용하였다. 캄필로박터속 세균의 배양은 37℃에서 2일~4일간, LOW TEMPERATURE O2/CO2 INCUBATER MODEL-9200(와켄야쿠)을 사용하여 미호기 조건(10% CO2, 5% O2, 85% N2)에서 행하였다. C. 콘시서스는 10% CO2, 10% H2, 80% N2의 혐기 조건에서 3~7일간 배양하였다.
대장균은 LB-Lenox 액체배지(Difco Laboratories, USA)[5.0 g Bacto tryptone, 2.5 g Bacto yeast extract, 2.5 g NaCl/500 mL DW], LB-Lenox 한천배지(Difco Laboratories)[5.0 g Bacto tryptone, 2.5 g Bacto yeast extract, 2.5 g NaCl, Agar 7.5 g/500 mL DW]를 사용하여, 37℃에서 16~20시간 배양하였다.
기타 시약은 모두 나칼라이테스크(주), 와코순약공업(주), 또는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 제한효소, Takara Ex Taq, Multiplex PCR assay Kit는 다카라바이오(주)로부터 구입하였다. 전기영동에 사용하는 아가로오스, Seakem GTG agarose는 다카라바이오로부터 구입하였다. 분자량 마커는 New England Biolabs(USA)로부터 구입하였다.
[실시예 7] PCR용 주형 DNA의 조제와 PCR
플레이트로부터 긁어낸 콜로니를 TE용액 200 μL에 첨가하여, 10분간 가열처리하였다. 가열처리 후, 12,800×g으로 10분간 원심하고, 상청을 회수하여, 주형 DNA로 하였다. 또한, 음성 대조로서 E. coli C600주를 사용하였다.
PCR은 모두 Gene amp PCR System 2400(PerkinElmer) 또는 Gene amp PCR System 9700(PerkinElmer)을 사용해서 행하였다. 아가로오스 겔 전기영동은 뮤피드(어드밴스, 도쿄)를 사용하여 1×TAE Buffer [40 mM Tris-acetate(pH 8.5), 1 mM EDTA], 100 V의 조건에서 행하였다. 전기영동 후, 1.0 ㎍/㎖의 에티디움 브로마이드(SIGMA)로 15분간 염색하고, DW로 탈색한 후, 겔 다큐멘테이션 해석 시스템 Gel Doc 2000(Bio-Rad)을 사용하여, PCR 산물을 자외선하(260 nm)에서 해석·촬영하였다.
[실시예 8] C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스의 cdtB 유전자 공통 프라이머 또는 ATCC주의 cdtB 유전자 프라이머를 사용한 C. 하이오인테스티날리스 ATCC주, 타이 유래 ch22주의 cdtB 유전자 PCR
C. 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자를 시퀀스하고, 타균종의 캄필로박터속 세균의 cdt 유전자서열과 비교한 바, 적색(도 8에서는 한 줄로 밑줄친 부분)으로 나타내는 C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스의 cdtB 유전자 공통 프라이머의 결합영역에 수개의 변이가 확인되었다(도 8). C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스의 cdtB 유전자 공통 프라이머를 사용하여 C. 하이오인테스티날리스 ATCC주를 PCR한 경우, 증폭 밴드는 다른 균종에 비해 약하고, 또한, 증폭되지 않는 경우도 있었다. PCR 프라이머는 그 3'말단영역의 상동성이 특히 중요하나, C. 하이오인테스티날리스 ATCC주의 cdtB 유전자의 프라이머의 결합영역에는 3'말단영역에 복수의 변이가 확인되었다(도 8). C. 하이오인테스티날리스 ATCC주의 cdtB 유전자 PCR의 증폭의 불안정함은 프라이머의 결합영역, 특히 3'말단영역의 변이에 기인하는 것으로 생각하고, C. 하이오인테스티날리스 ATCC주용 cdtB 유전자 공통 프라이머를 설계하고, 종래의 공통 프라이머와 비교하기 위해, PCR을 행하였다.
균주
C. 하이오인테스티날리스 ATCC 35217주, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주
공통 프라이머
ComBU: 5'-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3'(서열번호:14)
ComBR: 5'-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3'(서열번호:15)
ATCC주용 프라이머
ChATcomBU: 5'-ACTTGGAATATGCAAGGA-3'(서열번호:16)
ChATcomBR: 5'-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3'(서열번호:17)
PCR
프라이머(최종농도 1 μM), TaKaRa Ex taq(0.25 U), dNTP(각 200 μM), ×10 Ex Taq Buffer, 각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 1 μL 첨가하여, total volume 40 μL로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 3 min - (94℃ 30 sec, 50℃ 30 sec, 72℃ 30 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다.
결과
C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스의 cdtB 유전자 공통 프라이머에서는, 타이 유래 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주에서는 증폭이 보였으나, C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주에서는 증폭이 보이지 않았다. 한편, ATCC주용 프라이머를 사용한 경우, 타이 유래 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주, C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주 모두 증폭이 확인되었다(도 9).
[실시예 9] C. 하이오인테스티날리스 ATCC주, thai 유래 ch22주를 포함하는, 폭넓게 캄필로박터속 세균을 검출하기 위한 PCR
C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스의 cdtB 유전자 공통 프라이머에서는, C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주에서는 이전에는 약한 밴드만이 증폭되고, 또한, 금번에는 증폭이 확인되지 않았기 때문에, C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 유전자의 보다 확실한 증폭을 목표로, 새로운 공통 프라이머를 재설계하여, PCR을 행하였다.
프라이머
cdtB CommonU: 5'-ACTTGGAATWTGCAAGGM-3'(서열번호:18)
cdtB CommonR: 5'-CYAAAWKTTAYHGGAAARTG-3'(서열번호:19)
(W: A or T, M: A or C, Y: C or T, K: G or T, H: A, C, or T, R: A or G)
균주
C. 제주니:81-176주, C. 콜리:Co1-243주, C. 페투스:Co1-187주, C. 라리:ATCC43675주, C. 우프살리엔시스 ATCC43954주, C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주, C. 헬베티쿠스(C. helveticus) ATCC51209주, E. coli C600주
PCR
프라이머(최종농도 1 μM), TaKaRa Ex taq(0.25 U), dNTP(각 200 μM), ×10 Ex Taq Buffer, 각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 1 μL 첨가하여, total volume 40 μL로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 3 min - (94℃ 30 sec, 50℃ 30 sec, 72℃ 30 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다.
결과
사용한 모든 균주에서, PCR 밴드의 효율 좋은 증폭이 확인되었다(도 10).
[실시예 10] 서던 하이브리다이제이션에 의한 C. 하이오인테스티날리스 ATCC주와 타이 유래 Ch022주의 cdtB 유전자의 분포
C. 하이오인테스티날리스 Ch022주에 있어서, 지금까지의 공통 프라이머에서도, 새롭게 설계한 C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주용 프라이머에서도 증폭이 확인된 것으로 인해, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주에는 2 카피의 cdtB 유전자의 존재가 확인되었다. 이에, 각각의 특이적 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션을 행하여, C. 하이오인테스티날리스 ATCC주와 타이 유래 Ch022주의 cdtB 유전자의 분포를 조사하였다.
균주
C. jejuni:81-176주, C. 하이오인테스티날리스 ATCC35217주, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주
프라이머
C. 하이오인테스티날리스 Ch022주 cdtB 프로브용
ComBU: 5'-ACTTGGAATTTGCAAGGC-3'(서열번호:14)
ComBR: 5'-TCTAAAATTTACHGGAAAATG-3'(서열번호:15)
C. 하이오인테스티날리스 ATCC주 cdtB 프로브용
ChATcomBU: 5'-ACTTGGAATATGCAAGGA-3'(서열번호:16)
ChATcomBR: 5'-CCAAATGTTATAGGAAAGTG-3'(서열번호:17)
프로브의 조제
양 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 각각 1 μL, 각각 균주에 대한 프라이머(최종농도 0.5 μM), TaKaRa Ex taq(0.25 U), 디곡시게닌 표지-dNTP(로쉐 다이어그노틱스)(각 200 μM), ×10 Ex Taq Buffer를 첨가하여, total volume 40 μL로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 3 min - (94℃ 30 sec, 50℃ 30 sec, 72℃ 30 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다.
얻어진 PCR 산물을 1.5% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색한 후, 검출된 밴드를 잘라내고, 퀴아겐 PCR 정제 키트(퀴아겐)를 사용해서 정제하여, 프로브로서 사용하였다.
염색체 게놈 DNA의 조제 및 제한효소에 의한 소화
염색체 게놈 DNA의 정제는 ISOPLANT Kit(NIPPON GENE)를 사용해서 행하였다. 플레이트로부터 긁어낸 약 30 ㎎의 균체를 150 μL Extraction Buffer에 현탁하고, 300 μL Lysis Buffer를 첨가하여 균을 용균시켰다. 50℃에서 15분간 반응시킨 후, 150 μL의 sodium acetate buffer(pH 5.2)를 첨가하고, 빙상에서 15분간 정치하였다. 수층을 에탄올 침전처리하고, TE[10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA] 용액으로 재용해한 것을 DNA 용액으로서 사용하였다.
흡광도계로 정량하였다. 각 게놈 DNA 1 ㎍을 EcoRV, 또는 DraI(20 U)를 사용해서(final volume 50 μL), 37℃, 5시간 소화하였다.
서던 하이브리다이제이션
효소 소화한 각 균체 게놈을 1.5% 아가로오스 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색하여, 제한효소에 의한 게놈 DNA의 절단을 확인하였다. 그 후, 0.25 N HCl로 15분간 처리하고, DW로 세정을 2회 행하여, 0.5 N NaOH로 30분간 처리하였다. 겔 내의 DNA를, 10×SSC를 사용하여 90분간 Vacuum Blotter로 나일론막으로 블로팅하였다. 나일론막 1장에 대해 2 ㎖의 Prehybridization buffer[50% Formamide, 5×SSC, 0.01% SDS, 1 mM EDTA, Denhardt's solution, 0.02% BSA, 100 ㎍/mL Heat-denatured herring sperm DNA]를 첨가하고, 42℃에서 1시간 반응시켰다. 다음으로 나일론막에 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주 cdtB 프로브 또는 C. 하이오인테스티날리스 ATCC주 cdtB 프로브를 열변성시킨 후에 각각 25 ng/mL가 되도록 하이브리다이제이션액에 첨가하고 42℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 0.1% SDS를 포함하는 2×SSC로 나일론막을 15분간 실온에서 2회 세정한 후, 0.1% SDS를 포함하는 0.1×SSC로 65℃에서 30분간 2회 세정하였다. 세정 버퍼[0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M NaCl, 0.3% Tween 20]로 나일론막을 2분간 세정한 후, Blocking buffer(Buffer[0.1 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M NaCl], 1×Blocking stock solution)로 30분간 실온에서 나일론막을 평형화하였다. 새로운 Blocking buffer로 10,000배로 희석한 Anti DIG-Alkaline Phosphatase conjugate(7,500 U/mL)를 나일론막에 첨가하고, 실온에서 30분간 진탕하였다. Buffer 1로 15분간 2회 세정하고, AP9.5 buffer[0.1 M Tris-HCl(pH 9.5), 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl2]로 5분간 평형화하였다. 마지막으로 AP9.5 buffer로 희석한 발색기질용액 NBT/BCIP(4.5 μL NBT, 3.5 μL BCIP/AP9.5 buffer 1 mL)를 첨가하고, 빛을 차단하여, 실온에서 30분간 발색시켰다.
결과
C. 하이오인테스티날리스 ATCC주 및 타이 유래 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주의 염색체 게놈 DNA를 EcoRV로 절단하고, ATCC주 cdtB 프로브로 서던 하이브리다이제이션한 결과, 양 균주 모두 동일한 위치에 밴드가 검출되었다. 또한, 다른 제한효소인 DraI을 사용한 경우에도, 동일한 위치에 밴드가 검출된 것으로부터, 양 균주 모두 ATCC주의 cdtB 유전자의 호모로그(이하 ATCC형)가 존재하는 것이 시사되었다(도 11). 또한, 타이 유래 Ch022주 cdtB 프로브로 서던 하이브리다이제이션한 경우, 타이 유래의 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주에서만 밴드가 검출되었다. 또한 DraI으로 소화한 경우, ATCC주 cdtB 프로브와 Ch022주 cdtB 프로브에서는 상이한 위치에 밴드가 보였다(도 11). 이 사실로부터, 타이 유래의 C. 하이오인테스티날리스 Ch022주에는 ATCC형 cdtB 유전자와 타이 유래 Ch022주 cdtB 유전자 호모로그(이하 Thai형)의 2 카피가 보유되어 있는 것으로 생각되었다.
[실시예 11] C. 하이오인테스티날리스 ATCC형 cdtB 유전자 검출용 특이 프라이머 및 C. 하이오인테스티날리스 타이형 cdtB 유전자 검출용 특이 프라이머에 의한 PCR
C. 하이오인테스티날리스 ATCC주의 cdtB 유전자 및 C. 하이오인테스티날리스 타이주의 cdtB 유전자를 비교하고, 각각에 특이적인 영역을 선택하여, 특이적 프라이머를 설계하였다. 또한 복수의 C. 하이오인테스티날리스 동물 유래주에 대해서 PCR을 행하여, ATCC형 cdtB 유전자, 타이형 cdtB 유전자의 보유에 대해서 조사하였다.
C. 하이오인테스티날리스 타이형 cdtB 유전자 특이 프라이머
Ch022spBU1: 5'-TATCAGGCAATAGCGCAG-3'(서열번호:20)
Ch022spBR1: 5'-GGTTTGCACCTACATCAAC-3'(서열번호:21)
C. 하이오인테스티날리스 ATCC형 cdtB 유전자 특이 프라이머
ChATspBU2: 5'-CCTAGTAGCGCTACTTAG-3'(서열번호:22)
ChATspBR2: 5'-TACAAAGCTTGGGCGAAG-3'(서열번호:23)
균주
C. 하이오인테스티날리스 Ch1-1, Ch87-4, Ch2037, Ch2039, Ch2973, Ch3839, Ch3857, ATCC35217, Ch022
E. coli C600
PCR
각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 각각 1 μL, 특이적 프라이머(최종농도 0.5 μM), TaKaRa Ex taq(0.25 U), dNTP(각 200 μM), ×10 Ex Taq Buffer를 첨가하여, total volume 40 μL로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 3 min - (94℃ 30 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 30 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색하였다.
결과
조사한 7주의 C. 하이오인테스티날리스에 있어서, 모든 균주에서 타이형 cdtB 유전자(도 12), ATCC형 cdtB 유전자(도 13)를 양쪽 모두 보유하고 있었다. ATCC주에서만 thai형 cdtB 유전자를 보유하고 있지 않았다.
[실시예 12] C. 하이오인테스티날리스 ATCC형 cdtB 유전자 및 C. 하이오인테스티날리스 타이형 cdtB 유전자의 공통 프라이머에 의한 PCR
C. 하이오인테스티날리스 ATCC형 cdtB 유전자 및 C. 하이오인테스티날리스 타이형 cdtB 유전자를 비교하고, 각각에 공통인 영역을 선택하여, 공통 프라이머를 설계하였다. 증폭 사이즈는 기존에 보고되어 있는 C. 제주니, C. 콜리, 및 C. 페투스를 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR에 삽입 가능한 사이즈로 하였다. 복수의 C. 하이오인테스티날리스 동물 유래주에 대해서 PCR을 행하고, 프라이머의 평가를 행하였다.
C. 하이오인테스티날리스의 ATCC형, Thai형 cdtB 유전자 검출용 공통 프라이머
ChspBU7: 5'-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3'(서열번호:24)
ChspBR7: 5'-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3'(서열번호:25)
(W: A or T, K: G or T)
균주
C. 하이오인테스티날리스 Ch1-1, Ch87-4, Ch2037, Ch2039, Ch2973, Ch3839, Ch3857, ATCC35217, Ch022
E. coli C600
PCR
각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 각각 1 μL, 특이적 프라이머(최종농도 0.5 μM), TaKaRa Ex taq(0.25 U), dNTP(각 200 μM), ×10 Ex Taq Buffer를 첨가하여, total volume 40 μL로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 3 min - (94℃ 30 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 30 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색하였다.
결과
조사한 7주의 C. 하이오인테스티날리스에 있어서, 모든 균주에서 C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 유전자를 증폭할 수 있었다(도 14).
[실시예 13] CdtB 유전자를 토대로 하는 C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스, C. 하이오인테스티날리스를 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR의 개발
C. 하이오인테스티날리스의 ATCC형, 타이형 양쪽의 cdtB 유전자를 효율적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 개발할 수 있었기 때문에, 본 프라이머를 종래의 멀티플렉스 PCR에 삽입하여, 더욱 폭넓게 캄필로박터속 세균을 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR의 개발을 시도하였다.
균주
C. 제주니: 81-176주, C. 콜리: Co1-243주, C. 페투스: Co1-187주, C. 라리: ATCC43675주, C. 우프살리엔시스 ATCC43954주, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주, C. 헬베티쿠스 ATCC51209주, C. 콘시서스 ATCC33237주, E. coli C600주
프라이머
Cj-CdtBU5 : 5'-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3'(최종농도 0.25 μM)(서열번호:26)
Cj-CdtBR6 : 5'-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3'(최종농도 0.25 μM)(서열번호:27)
Cc-CdtBU5: 5'-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:28)
Cc-CdtBR5 : 5'-TCATTGCCTATGCGTATG-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:29)
Cf-CdtBU6: 5'-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:30)
Cf-CdtBR3: 5'-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:31)
ChspBU7: 5'-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:24)
ChspBR7: 5'-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3'(최종농도 0.5 μM)(서열번호:25)
(W: A or T, K: G or T)
PCR
각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 각각 1 μL, 특이적 프라이머, Multiplex PCR Mix 1(다카라바이오)을 0.2 μL, ×2 Multiplex PCR Mix 2(다카라바이오)를 20 μL 첨가하여, total volume 40 μL 로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 1 min - (94℃ 30 sec, 56℃ 90 sec, 72℃ 90 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색하였다.
결과
4균종을 대상으로 한 멀티플렉스 PCR은 단독의 C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스 또는 C. 하이오인테스티날리스의 cdtB 유전자를 효율적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 복수의 균종이 혼재된 경우에도 균종 특이적인 증폭이 보였다(도 15).
[실시예 14] 병원성을 나타내는 캄필로박터속 세균의 대부분을 망라하는 새로운 멀티플렉스 PCR
캄필로박터속 세균 중, C. 제주니, C. 콜리, C. 페투스, C. 하이오인테스티날리스는, 카탈라아제 활성 양성으로 42℃에서 발육한다. 이들 균종은 thermophilic Campylobacters로 불리며, 식중독에 관계하는 균종의 대부분이 이에 속한다. 본 발명자 등은, 이 thermophilic Campylobacters에 속하는 5균종 외에 인간 및 가축 등의 동물에 병원성을 나타내는 C. fetus도 포함하는 6균종의 캄필로박터속 세균을 1번에 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR을 개발하였다.
균주
C. jejuni: 81-176주, C. coli: Co1-243주, C. fetus: Co1-187주, C. lari: ATCC43675주, C. upsaliensis ATCC43954주, C. 하이오인테스티날리스 Ch022주
프라이머
Cj-CdtBU5 : 5'-ATCTTTTAACCTTGCTTTTGC-3'(최종농도 0.25 μM)(서열번호:26)
Cj-CdtBR6 : 5'-GCAAGCATTAAAATCGCAGC-3'(최종농도 0.25 μM)(서열번호:27)
Cc-CdtBU5: 5'-TTTAATGTATTATTTGCCGC-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:28)
Cc-CdtBR5 : 5'-TCATTGCCTATGCGTATG-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:29)
Cf-CdtBU6: 5'-GGCTTTGCAAAACCAGAAG-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:30)
Cf-CdtBR3: 5'-CAAGAGTTCCTCTTAAACTC-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:31)
ChspBU7: 5'-GTTCAAGAAGCAGGAAGC-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:24)
ChspBR7: 5'-AATACCWAKAATWGGTCTTG-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:25)
CupspBU3: 5'-CATAGTTAGTCGCGTCCA-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:32)
CupspBR4: 5'-CCAGTTAATCTCAGGACG-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:33)
ClaspBU4: 5'-GTATCCATGCTTTATCAAGA-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:34)
ClaspBR4: 5'-GTAGGCCTATAAGAGAACC-3'(최종농도 0.375 μM)(서열번호:35)
(W: A or T, K: G or T)
PCR
각 균주를 보일법으로 조제한 PCR 템플레이트를 각각 0.5 μL, 각 프라이머를 표기한 최종농도가 되도록 첨가하고, Multiplex PCR Mix 1(다카라바이오)을 0.2 μL, ×2 Multiplex PCR Mix 2(다카라바이오)를 20 μL 첨가하여, total volume 40 μL 로 하고 PCR을 행하였다. PCR 조건은 94℃ 1 min - (94℃ 30 sec, 56℃ 90 sec, 72℃ 90 sec)×30 - 72℃ 5 min로 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 에티디움 브로마이드로 염색, 탈색하였다.
결과
6균종을 대상으로 한 멀티플렉스 PCR은 단독의 캄필로박터속 세균의 cdtB 유전자를 효율적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 6균종의 모든 균종이 혼재된 경우에도 각각에 특이적인 증폭이 보였다(도 16).
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, C. 하이오인테스티날리스의 검출에 유용한 cdt 유전자가 제공되었다. 또한, 상기 cdt 유전자의 독소 생산성에 대해서 명확하게 하였다.
전술한 바와 같이, C. 하이오인테스티날리스는 식중독의 원인균으로서 공중위생상 중요한 세균임에도 불구하고, 종래의 배양·검사법이 C. 제주니 및 C. 콜리만을 대상으로 한 것이었기 때문에, 검출이 곤란하였다. 또한, 본 발명의 C. 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자는, C. 제주니, C. 콜리 및 C. 페투스와의 상동성이 약 60%로 그다지 높지 않아, 동속균에 대한 기지의 유전자 프로브를 사용하여 C. 하이오인테스티날리스의 cdt 유전자를 동정하는 것은 곤란하였다.
본 발명에 의하면, C. 하이오인테스티날리스균을 특이적으로 검출할 수 있기 때무에, 정확하고 신속하게 식중독 등의 기인균을 규명하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은, 임상상 뿐 아니라, 식품 등의 제조공정관리, 공장위생관리 등에 있어서 매우 유용성이 높다.
또한, 본 발명에 의해, C. 하이오인테스티날리스를 포함하는 6균종의 캄필로박터속 세균을 동시에 검출할 수 있는 방법이 제공되었다. 본 발명의 검출방법에 있어서 표적으로 사용한 캄필로박터는, C. 페투스를 제외하고, 42도, 미호기 조건하에서 증식 가능한 균종으로, Thermophilic Campylobacters라 불린다. 식중독에 관계하는 캄필로박터의 대부분이 이 Thermophilic Campylobacters에 속해 있는 것으로 생각되고 있어, 본 발명에 의해 신속하고 간편하게 식중독균을 동정할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> OSAKA PREFECTURE UNIVERSITY FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Method for detecting CDT and bacteria of the genus Campylobacter using it as a target <130> F2-A0702P <150> JP 2007-226013 <151> 2007-08-31 <160> 35 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 3399 <212> DNA <213> Campylobacter hyointestinalis <220> <221> CDS <222> (962)..(1600) <220> <221> CDS <222> (1601)..(2422) <220> <221> CDS <222> (2425)..(3177) <400> 1 gcgtggctct cataggtcac gttctacact tttcatatag tgagattatg agtatggatg 60 tgggcgagta taatgagtat ttaaaggaag ctatggaaat tatcaaatct ttaaatgcgt 120 gtgataaatg ataaaaagcg ataaaacgca ttatttgtgc gagcaggcaa taaatcaaca 180 atgtataaaa aaagatagat aagcgtagca taaataatag atgaagcaat tatatactca 240 tcattgtttg taaatagcaa aacaataaac gaaatgatgc aaagtgcaat aaaaattgta 300 aatcttttca taggtaaatt atacaaaaaa aggataaaaa aatgcaagat atcggagtcg 360 gtcttagtat tgggttagca tttcaaggca tcgcatcaat aaaaacgtgc gaaacatcat 420 ttaataggct aaaaaaagct ataaataatg ttggaggaag tgttaaaaat ttaaaaagag 480 acttggctgc aataaaaagg tatagaaaaa aaggaatata ttaaattcat atgataagct 540 gcgccacaga tagcatgaaa catcatatta tggaaagtga tttgtatgct atcaatacac 600 ccctgatggc gtgatgatca aatagtacta tatacaagga aatgagctga tatttgtatc 660 gtacaatcct atctatacat atataagatt ttttattgat gagtgtaaaa ttattggaaa 720 atttgcaggg atacttagag gggtttagag atttatttgc gtttataatc aaactatttt 780 tagtatgttt ttgaagctgt ttgattttaa aaagcgcttt acagcaatct caaaaaatta 840 ttttatctaa atttataaat atacaaaaaa ttagaatata aaaatatttt tatataaatt 900 taagtaagtt taaaatataa tttttatgac aaactttgat ttaatattta ggagtaatat 960 t atg tta agg ctt tct att ttg att atg cta tct ata ttt tta ata tct 1009 Met Leu Arg Leu Ser Ile Leu Ile Met Leu Ser Ile Phe Leu Ile Ser 1 5 10 15 tgc agt acc act aaa tca aat aac tat aaa gct cct agg gtg caa tct 1057 Cys Ser Thr Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Lys Ala Pro Arg Val Gln Ser 20 25 30 act aat agc aat agc tca gct cta agc aat act tta cca tct aaa cag 1105 Thr Asn Ser Asn Ser Ser Ala Leu Ser Asn Thr Leu Pro Ser Lys Gln 35 40 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Gly Ile Asp Ala Ser Ala Ile Val His Ser 370 375 380 gta gat aac ttc ttt aga aac tca caa aca cta atg aac tca aac tgg 2161 Val Asp Asn Phe Phe Arg Asn Ser Gln Thr Leu Met Asn Ser Asn Trp 385 390 395 ata gta atg ggt gat ttc aat aga gaa cca gga gag cta ctt agc tca 2209 Ile Val Met Gly Asp Phe Asn Arg Glu Pro Gly Glu Leu Leu Ser Ser 400 405 410 415 ttt gag cta gag cta aga ctt cgt gct aga ata att aca aat agt gcc 2257 Phe Glu Leu Glu Leu Arg Leu Arg Ala Arg Ile Ile Thr Asn Ser Ala 420 425 430 att act caa gtt agt gct aga agg acg tta gat tac gcg gta gta gga 2305 Ile Thr Gln Val Ser Ala Arg Arg Thr Leu Asp Tyr Ala Val Val Gly 435 440 445 aac tct aat aga tct gta gtt cca gct cca ctg cca cct att aca gct 2353 Asn Ser Asn Arg Ser Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Ile Thr Ala 450 455 460 agc aca ttc ttt agc gga ttt aga tca cac tta gca agt gat cac ttt 2401 Ser Thr Phe Phe Ser Gly Phe Arg Ser His Leu Ala Ser Asp His Phe 465 470 475 cct ata aca ttt ggg aga ttt ta atg aga act ata cta ata ttt ata 2448 Pro 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Asn Trp Val Trp Gly Tyr Thr Leu Asp Arg Ser Ile Asp Phe 85 90 95 Gly Gly Ala Arg Leu Trp Gln Val Ile Asn Leu Gly Gly Asp Ile Ala 100 105 110 Leu Ile Lys Asn Val Arg Thr Gly Asn Cys Leu His Asp Glu Gly Arg 115 120 125 Gly Val Thr His Arg Thr Cys Asn Lys Asn Ser Lys Asn Gln Gln Trp 130 135 140 Glu Leu Phe Ala Met Asp Asn Gly Ala Val Met Ile Arg Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ser Asn Asn Cys Leu Arg Thr Glu Tyr Gly Asp Ile Val Gln Ile Asp 165 170 175 Ser Val Phe Ser Ile Thr Met Glu Arg Cys Thr Leu Glu Pro Asn Leu 180 185 190 Asp Gln Gln Trp Ile Phe Ile Pro Ala Pro Ile Glu Ala Ser Pro Leu 195 200 205 Leu Gly Asp Lys 210 <210> 3 <211> 274 <212> PRT <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 3 Met Lys Arg Leu Val Ile Leu Val Ala Leu Leu Ser Ala Ser Leu Leu 1 5 10 15 Phe Ser Ala Ile Asp Asp Phe Lys Thr Ala Thr Trp Asn Met Gln Gly 20 25 30 Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ala Lys Trp Ser Val Ser Ile Arg Gln Met 35 40 45 Phe Ser Gly Asp Asn Gly Leu Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly 50 55 60 Ser Leu Pro Arg Thr Ala Arg Ala Thr Gly Arg Val Phe Asp Phe Asn 65 70 75 80 Gly Thr Asp Val Asn Val Thr Glu His Ile Trp Asn Leu Gly Thr Asn 85 90 95 Leu Arg Pro Ser Phe Val Phe Ile Tyr Tyr Ala Arg Thr Asp Leu Gly 100 105 110 Ala Asn Arg Val Asn Leu Ala Leu Val Ser Arg Asn Pro Ala Asp Glu 115 120 125 Val Phe Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Val Ser Arg Pro Ile Leu Gly 130 135 140 Ile Arg Leu Arg Asn Asp Ala Phe Phe Ser Ile His Ala Leu Ala Asn 145 150 155 160 Gly Gly Ile Asp Ala Ser Ala Ile Val His Ser Val Asp Asn Phe Phe 165 170 175 Arg Asn Ser Gln Thr Leu Met Asn Ser Asn Trp Ile Val Met Gly Asp 180 185 190 Phe Asn Arg Glu Pro Gly Glu Leu Leu Ser Ser Phe Glu Leu Glu Leu 195 200 205 Arg Leu Arg Ala Arg Ile Ile Thr Asn Ser Ala Ile Thr Gln Val Ser 210 215 220 Ala Arg Arg Thr Leu Asp Tyr Ala Val Val Gly Asn Ser Asn Arg Ser 225 230 235 240 Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Ile Thr Ala Ser Thr Phe Phe Ser 245 250 255 Gly Phe Arg Ser His Leu Ala Ser Asp His Phe Pro Ile Thr Phe Gly 260 265 270 Arg Phe <210> 4 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Ile Ser Thr Phe Glu Asn Pro Asn 195 200 205 Leu Phe Pro Trp Gln Arg Ile Gly Ile Asp Lys Cys Gln Leu Met Gln 210 215 220 Gly Phe Asn Thr Asn Leu Ala Arg Leu Trp Ala Ile Met Pro Glu Asn 225 230 235 240 Arg Pro Ala Lys Val Leu Val Ser Val Lys 245 250 <210> 5 <211> 4069 <212> DNA <213> Campylobacter hyointestinalis <220> <221> CDS <222> (1059)..(1835) <220> <221> CDS <222> (1853)..(2656) <220> <221> CDS <222> (2666)..(3202) <400> 5 aggtacaaag caaaacttgg tcttttgaaa gtacggcgat atttggcctt tgagtttgat 60 acaaataggt ggttttttca aagtataatc cttttataat gcttctatcg tgcgtagaaa 120 aatttgctat caaaaaatca gatatagtgg tttccaattt aaaaaattat tcaaagcata 180 ttaaagattt gggtattcaa aaacaagcat attggatctc gaatggtata aatttgagag 240 atatggatat gcaagaagaa ttgccacaac atataaaagg tcttgtgcca aaggataaat 300 ttataatagg ctataccgga aaattgggtg tatcaaattc gatcatatat ctattaaaag 360 cggcacgcat attgcaaaat aacactaata taaaatttat tatagttggt gatggacaag 420 agaaacaagc tttggtagac tatgcaagtg atctaaataa tgttattttt atagatccga 480 taccaaaatc aaatatccaa tcaatgctta gcttatttga tgtgtgttac ataggatggc 540 tagacaaaga actatataaa tttggcatag cggcaaataa gttatttgat tatatgtata 600 gttgtaaacc aatcttacac tctataaata catcagatag tatagtaaat atggtcgggt 660 ttggatgtgg tataaaaata aattcagaag atccagaagc catagcggaa gctataacgg 720 aactgtacgc gacaccaaaa aatctaatga aaaaaatggg ggaaaatggt aaaaaggcta 780 tcctagatca atttacatac catgaattgg ctaaaaaata tttgaaaatc atataaattt 840 ttatatttat aagataaatg atgatcttat cgagctaatc atagaatata taaagataca 900 ttgtttgttg aatttttcat cttaatatcc tgagtttatc catattttac aagttctatc 960 agatttttaa ggaattttga taataaaaat tattctgtta attaatcata aataaattct 1020 cattagaatg atataaataa actttaaaag aatcaata atg aaa tac ata gca tac 1076 Met Lys Tyr Ile Ala Tyr 1 5 cta gct ttt ata agc tta ctc ctt gtt ggt tgc tct agc aaa gcc aca 1124 Leu Ala Phe Ile Ser Leu Leu Leu Val Gly Cys Ser Ser Lys Ala Thr 10 15 20 tat att aac tat tta gca aaa tat gga ggc gat cca acc gac acc gat 1172 Tyr Ile Asn Tyr Leu Ala Lys Tyr Gly Gly Asp Pro Thr Asp Thr Asp 25 30 35 cca cta agg ctc ggt tca aac cca aaa gag ccg gcg att caa aaa ata 1220 Pro Leu Arg Leu Gly Ser Asn Pro Lys Glu Pro Ala Ile Gln Lys Ile 40 45 50 cca gca cta ctt atc ggt gaa aat aaa ttt ttt aag caa aat tta cct 1268 Pro Ala Leu Leu Ile Gly Glu Asn Lys Phe Phe Lys Gln Asn Leu Pro 55 60 65 70 aca ttt agc gga acg cta caa agt gat cca gtc cac ggt cca aac gaa 1316 Thr Phe Ser Gly Thr Leu Gln Ser Asp Pro Val His Gly Pro Asn Glu 75 80 85 cgt gat cca gac aat cca ttt gat gat aca aag gtt ttt tac aac act 1364 Arg Asp Pro Asp Asn Pro Phe Asp Asp Thr Lys Val Phe Tyr Asn Thr 90 95 100 cca cag ata tct gag ttc gtt tct att gta gct cac aac gat gcc ctt 1412 Pro Gln Ile Ser Glu Phe Val Ser Ile Val Ala His Asn Asp Ala Leu 105 110 115 atg acc att tgg gct ttg gct tat ggt aac tgg gta tgg gcc tac tcg 1460 Met Thr Ile Trp Ala Leu Ala Tyr Gly Asn Trp Val Trp Ala Tyr Ser 120 125 130 gca act gat agt atg agt ttt ggt gat gcg aga ata tgg aag ctt gtc 1508 Ala Thr Asp Ser Met Ser Phe Gly Asp Ala Arg Ile Trp Lys Leu Val 135 140 145 150 ata tat cca aaa aat ttc gtc caa atc caa aac aaa atg acc ggc act 1556 Ile Tyr Pro Lys Asn Phe Val Gln Ile Gln Asn Lys Met Thr Gly Thr 155 160 165 tgt ctt agt gcc tat caa aat ggc gtt gta cac tat cct tgt gat gat 1604 Cys Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Gly Val Val His Tyr Pro Cys Asp Asp 170 175 180 aca aac caa gct cag ttc tgg caa tta aat cag ttt gca aac gga gcc 1652 Thr Asn Gln Ala Gln Phe Trp Gln Leu Asn Gln Phe Ala Asn Gly Ala 185 190 195 gta cag ctc caa aat ttc gct tcc aaa gag tgt ttg tct act gac cct 1700 Val Gln Leu Gln Asn Phe Ala Ser Lys Glu Cys Leu Ser Thr Asp Pro 200 205 210 aca aag gga agt agc tat tat ggt ata tat gct gta agg tgt ata aat 1748 Thr Lys Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Ile Tyr Ala Val Arg Cys Ile Asn 215 220 225 230 gca ggc gag aag gcg ctt tct cag cag tgg ata atc tca gca ccg ttt 1796 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Trp Ile Ile Ser Ala Pro Phe 235 240 245 gta gaa act ccg cct ata aaa atg cca gat ccg att ctt ggtcaaggag 1845 Val Glu Thr Pro Pro Ile Lys Met Pro Asp Pro Ile Leu 250 255 gtgagat atg aag aaa ttt ctt ata gtt tta ttg ctt tgt ttt agt act 1894 Met Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr 260 265 270 cta cta gca aat att gaa gat tac agc atc gct act tgg aat atg caa 1942 Leu Leu Ala Asn Ile Glu Asp Tyr Ser Ile Ala Thr Trp Asn Met Gln 275 280 285 ggc tca tct gct gca acc gaa agc aaa tgg aat gtc aat atc aga caa 1990 Gly Ser Ser Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Asn Ile Arg Gln 290 295 300 305 cta ata tca ggc aat agc gca gct gat att ttg cta gtt caa gaa gca 2038 Leu Ile Ser Gly Asn Ser Ala Ala Asp Ile Leu Leu Val Gln Glu Ala 310 315 320 gga agc ata cca gta agt gca gtt tat aca ggt act gtg gtt cag cca 2086 Gly Ser Ile Pro Val Ser Ala Val Tyr Thr Gly Thr Val Val Gln Pro 325 330 335 gtt gga gta gga att cct atc gat gag ttt gcg tgg aat cta ggc acg 2134 Val Gly Val Gly Ile Pro Ile Asp Glu Phe Ala Trp Asn Leu Gly Thr 340 345 350 gcg tct agg cct aat caa gtt ttt ata tac tat tca aga gtt gat gta 2182 Ala Ser Arg Pro Asn Gln Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val 355 360 365 ggt gca aac cgt gta aat ctt gct ata gtt tca aga aga agg gct gat 2230 Gly Ala Asn Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Arg Arg Ala Asp 370 375 380 385 gag gtt atc gtc ttg cca ccg cca act act gca tca aga cct att att 2278 Glu Val Ile Val Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ser Arg Pro Ile Ile 390 395 400 ggt att cgc ctt ggc aat gac gtg ttt ttt agt gtg cat gca cta gct 2326 Gly Ile Arg Leu Gly Asn Asp Val Phe Phe Ser Val His Ala Leu Ala 405 410 415 aat ggc ggt act gat gcg cct gcg ata gta gaa aat gtg cat aga ttt 2374 Asn Gly Gly Thr Asp Ala Pro Ala Ile Val Glu Asn Val His Arg Phe 420 425 430 ttc caa aat aga cct gag atc agc tgg ttt atc ggc gga gat ttt aat 2422 Phe Gln Asn Arg Pro Glu Ile Ser Trp Phe Ile Gly Gly Asp Phe Asn 435 440 445 aga gaa cca aat tca ctt ttg cgg gct ttg gag cct acg gta aga tca 2470 Arg Glu Pro Asn Ser Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Thr Val Arg Ser 450 455 460 465 aga gta gat att gtc tca cct agt gga gct acg caa aat agt ggt ggc 2518 Arg Val Asp Ile Val Ser Pro Ser Gly Ala Thr Gln Asn Ser Gly Gly 470 475 480 aca cta gac tac ggt gta gct gga aac tcg gct aca act agc ttt gta 2566 Thr Leu Asp Tyr Gly Val Ala Gly Asn Ser Ala Thr Thr Ser Phe Val 485 490 495 gct cct gcc att gct gca gtt ctc atg ctg gca aat atg cgc tca cag 2614 Ala Pro Ala Ile Ala Ala Val Leu Met Leu Ala Asn Met Arg Ser Gln 500 505 510 atc aca tca gat cat gtg cct gtt aat ttt aga aga ttt tag gagacacat 2665 Ile Thr Ser Asp His Val Pro Val Asn Phe Arg Arg Phe 515 520 525 atg aaa aca ttt att aaa ata tta cta ctt att tca tta gct att cca 2713 Met Lys Thr Phe Ile Lys Ile Leu Leu Leu Ile Ser Leu Ala Ile Pro 530 535 540 agt ttt gga ttt gaa gat gac aat gtt atg ccg tta gtt tca tta aga 2761 Ser Phe Gly Phe Glu Asp Asp Asn Val Met Pro Leu Val Ser Leu Arg 545 550 555 agt cta aaa act ggt att ttg ata gcg tat gaa gac aat gcg cca aat 2809 Ser Leu Lys Thr Gly Ile Leu Ile Ala Tyr Glu Asp Asn Ala Pro Asn 560 565 570 ttg ttt gat aga aac tgg cgt atc aaa gag gta att ttg cct ttc gag 2857 Leu Phe Asp Arg Asn Trp Arg Ile Lys Glu Val Ile Leu Pro Phe Glu 575 580 585 590 ata aga aag cat tat ccg ttt ggt aat gtg caa ttt atg cat cca acc 2905 Ile Arg Lys His Tyr Pro Phe Gly Asn Val Gln Phe Met His Pro Thr 595 600 605 aaa acc gat att tgc tta ggc tta gat ggt gct aag cta acg acc atg 2953 Lys Thr Asp Ile Cys Leu Gly Leu Asp Gly Ala Lys Leu Thr Thr Met 610 615 620 gag tgt aat ctt ata aat atc ggt gat ttt agg act gct ttt tcg ctt 3001 Glu Cys Asn Leu Ile Asn Ile Gly Asp Phe Arg Thr Ala Phe Ser Leu 625 630 635 ctt ccg acc gca act tca gca gtg cag atc aag gcg gta aat gac cta 3049 Leu Pro Thr Ala Thr Ser Ala Val Gln Ile Lys Ala Val Asn Asp Leu 640 645 650 aac gaa tgc ctt agc ata gga cca agt act agc gga acg tct ttt tca 3097 Asn Glu Cys Leu Ser Ile Gly Pro Ser Thr Ser Gly Thr Ser Phe Ser 655 660 665 670 agg atg gga ctt aga agc tgt gag atg gac gag aag tca aac atc atc 3145 Arg Met Gly Leu Arg Ser Cys Glu Met Asp Glu Lys Ser Asn Ile Ile 675 680 685 tta gaa aat tta ttt gtc cta tct gtg cct att ttg gat tca aaa tta 3193 Leu Glu Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Pro Ile Leu Asp Ser Lys Leu 690 695 700 gta aag taa gattaaaagt cgtttttaga cggctcaaat tccctttttt 3242 Val Lys cctagtacga ctacaatagt cttgtagatg actttaagct ctagccaaag cgaccagtgt 3302 ttgatgtagt agagatcata cattagcttt tgttttgcat catcagtatt tgcgccgtat 3362 gggtacatga cttgcgccca gcctgtgatg cctggtttta tgatatgtcg ttcgcagtag 3422 tatgggatct cttgttcgta gcctttgacg agtatatccc actctgctct tggtccgatg 3482 agatgcatct ctcctcttaa cacgtttaaa atttgcggaa gctcatcgat ccttgttttt 3542 ctcatgaatt tgccaaaagg ataaattcta tcgtcttctt ttttggtgta tggatcatga 3602 taactatttt cgtgcatggt acgaaatttt atacatttaa atatatcacc gtttttacca 3662 actctatctt gtttaaaata tagacttcct ggagattggg cttttatctt gctttttact 3722 ataaaaacca gcggccacat agttagcagc aagattccag caccaattat atcgactatc 3782 tttttttgca atagttgcca tggactaaac ggcttgattt tgcttaaaaa cgcaagatca 3842 ctattatcac caggaatata acatttgttt agatatttct ccataaaatc ttcgatagtt 3902 atgatcttta aaggcttttt tcttttttga aattgtaaag tcgttagata ttttattata 3962 ttgctaccaa cagttgcagt cgtatttaaa accaaagtgt caaaatactc ttctcctgct 4022 atgctttgta gctctcctag aacctcatct tctgatctgt tgcgaat 4069 <210> 6 <211> 259 <212> PRT <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 6 Met Lys Tyr Ile Ala Tyr Leu Ala Phe Ile Ser Leu Leu Leu Val Gly 1 5 10 15 Cys Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Asn Tyr Leu Ala Lys Tyr Gly Gly 20 25 30 Asp Pro Thr Asp Thr Asp Pro Leu Arg Leu Gly Ser Asn Pro Lys Glu 35 40 45 Pro Ala Ile Gln Lys Ile Pro Ala Leu Leu Ile Gly Glu Asn Lys Phe 50 55 60 Phe Lys Gln Asn Leu Pro Thr Phe Ser Gly Thr Leu Gln Ser Asp Pro 65 70 75 80 Val His Gly Pro Asn Glu Arg Asp Pro Asp Asn Pro Phe Asp Asp Thr 85 90 95 Lys Val Phe Tyr Asn Thr Pro Gln Ile Ser Glu Phe Val Ser Ile Val 100 105 110 Ala His Asn Asp Ala Leu Met Thr Ile Trp Ala Leu Ala Tyr Gly Asn 115 120 125 Trp Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Met Ser Phe Gly Asp Ala 130 135 140 Arg Ile Trp Lys Leu Val Ile Tyr Pro Lys Asn Phe Val Gln Ile Gln 145 150 155 160 Asn Lys Met Thr Gly Thr Cys Leu Ser Ala Tyr Gln Asn Gly Val Val 165 170 175 His Tyr Pro Cys Asp Asp Thr Asn Gln Ala Gln Phe Trp Gln Leu Asn 180 185 190 Gln Phe Ala Asn Gly Ala Val Gln Leu Gln Asn Phe Ala Ser Lys Glu 195 200 205 Cys Leu Ser Thr Asp Pro Thr Lys Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Ile Tyr 210 215 220 Ala Val Arg Cys Ile Asn Ala Gly Glu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Trp 225 230 235 240 Ile Ile Ser Ala Pro Phe Val Glu Thr Pro Pro Ile Lys Met Pro Asp 245 250 255 Pro Ile Leu <210> 7 <211> 267 <212> PRT <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 7 Met Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ala Asn Ile Glu Asp Tyr Ser Ile Ala Thr Trp Asn Met Gln Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Asn Ile Arg Gln Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Ala Ala Asp Ile Leu Leu Val Gln Glu Ala Gly Ser 50 55 60 Ile Pro Val Ser Ala Val Tyr Thr Gly Thr Val Val Gln Pro Val Gly 65 70 75 80 Val Gly Ile Pro Ile Asp Glu Phe Ala Trp Asn Leu Gly Thr Ala Ser 85 90 95 Arg Pro Asn Gln Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala 100 105 110 Asn Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Arg Arg Ala Asp Glu Val 115 120 125 Ile Val Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile 130 135 140 Arg Leu Gly Asn Asp Val Phe Phe Ser Val His Ala Leu Ala Asn Gly 145 150 155 160 Gly Thr Asp Ala Pro Ala Ile Val Glu Asn Val His Arg Phe Phe Gln 165 170 175 Asn Arg Pro Glu Ile Ser Trp Phe Ile Gly Gly Asp Phe Asn Arg Glu 180 185 190 Pro Asn Ser Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Thr Val Arg Ser Arg Val 195 200 205 Asp Ile Val Ser Pro Ser Gly Ala Thr Gln Asn Ser Gly Gly Thr Leu 210 215 220 Asp Tyr Gly Val Ala Gly Asn Ser Ala Thr Thr Ser Phe Val Ala Pro 225 230 235 240 Ala Ile Ala Ala Val Leu Met Leu Ala Asn Met Arg Ser Gln Ile Thr 245 250 255 Ser Asp His Val Pro Val Asn Phe Arg Arg Phe 260 265 <210> 8 <211> 178 <212> PRT <213> Campylobacter hyointestinalis <400> 8 Met Lys Thr Phe Ile Lys Ile Leu Leu Leu Ile Ser Leu Ala Ile Pro 1 5 10 15 Ser Phe Gly Phe Glu Asp Asp Asn Val Met Pro Leu Val Ser Leu Arg 20 25 30 Ser Leu Lys Thr Gly Ile Leu Ile Ala Tyr Glu Asp Asn Ala Pro Asn 35 40 45 Leu Phe Asp Arg Asn Trp Arg Ile Lys Glu Val Ile Leu Pro Phe Glu 50 55 60 Ile Arg Lys His Tyr Pro Phe Gly Asn Val Gln Phe Met His Pro Thr 65 70 75 80 Lys Thr Asp Ile Cys Leu Gly Leu Asp Gly Ala Lys Leu Thr Thr Met 85 90 95 Glu Cys Asn Leu Ile Asn Ile Gly Asp Phe Arg Thr Ala Phe Ser Leu 100 105 110 Leu Pro Thr Ala Thr Ser Ala Val Gln Ile Lys Ala Val Asn Asp Leu 115 120 125 Asn Glu Cys Leu Ser Ile Gly Pro Ser Thr Ser Gly Thr Ser Phe Ser 130 135 140 Arg Met Gly Leu Arg Ser Cys Glu Met Asp Glu Lys Ser Asn Ile Ile 145 150 155 160 Leu Glu Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Pro Ile Leu Asp Ser Lys Leu 165 170 175 Val Lys <210> 9 <211> 265 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni <400> 9 Met Lys Lys Ile Ile Cys Leu Phe Leu Ser Phe Asn Leu Ala Phe Ala 1 5 10 15 Asn Leu Glu Asn Phe Asn Val Gly Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser 20 25 30 Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Ser Val Ser Val Arg Gln Leu Val Ser 35 40 45 Gly Ala Asn Pro Leu Asp Ile Leu Met Ile Gln Glu Ala Gly Thr Leu 50 55 60 Pro Arg Thr Ala Thr Pro Thr Gly Arg His Val Gln Gln Gly Gly Thr 65 70 75 80 Pro Ile Asp Glu Tyr Glu Trp Asn Leu Gly Thr Leu Ser Arg Pro Asp 85 90 95 Arg Val Phe Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala Asn Arg Val 100 105 110 Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Met Gln Ala Glu Glu Val Ile Val Leu 115 120 125 Pro Pro Pro Thr Thr Val Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile Arg Asn Gly 130 135 140 Asn Asp Ala Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Asn Gly Gly Thr Asp 145 150 155 160 Val Gly Ala Ile Ile Thr Ala Val Asp Ala His Phe Ala Asn Met Pro 165 170 175 Gln Val Asn Trp Met Ile Ala Gly Asp Phe Asn Arg Asp Pro Ser Thr 180 185 190 Ile Thr Ser Thr Val Asp Arg Glu Leu Ala Asn Arg Ile Arg Val Val 195 200 205 Phe Pro Thr Ser Ala Thr Gln Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Ala 210 215 220 Ile Thr Gly Asn Ser Asn Arg Gln Gln Thr Tyr Thr Pro Pro Leu Leu 225 230 235 240 Ala Ala Ile Leu Met Leu Ala Ser Leu Arg Ser His Ile Val Ser Asp 245 250 255 His Phe Pro Val Asn Phe Arg Lys Phe 260 265 <210> 10 <211> 267 <212> PRT <213> Campylobacter coli <400> 10 Met Lys Lys Ile Val Phe Leu Ile Leu Ser Phe Asn Val Leu Phe Ala 1 5 10 15 Ala Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser 20 25 30 Ala Ala Thr Glu Ser Lys Trp Asn Val Ser Ile Arg Gln Leu Ile Thr 35 40 45 Gly Ala Asn Pro Met Asp Val Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly Val Leu 50 55 60 Pro Ser Thr Ala Met Met Thr Pro Arg Gln Val Gln Pro Val Gly Val 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ile His Glu Tyr Ile Trp Asn Leu Gly Ser Val Ser Arg 85 90 95 Pro Ser Ser Val Tyr Ile Tyr Tyr Ser Arg Val Asp Val Gly Ala Asn 100 105 110 Arg Val Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Val Gln Ala Asp Glu Val Phe 115 120 125 Val Leu Pro Pro Pro Thr Val Ala Ser Arg Pro Ile Ile Gly Ile Arg 130 135 140 Ile Gly Asn Asp Ala Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Ser Gly Gly 145 150 155 160 Asn Asp Ala Gly Ala Ile Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe Arg Asn 165 170 175 Arg Pro Asp Ile Asn Trp Met Ile Leu Gly Asp Phe Asn Arg Glu Ser 180 185 190 Gly Ala Leu Val Thr Leu Leu Asp Pro Asp Leu Arg Ala Arg Thr Arg 195 200 205 Val Val Val Pro Pro Ser Ser Thr Gln Thr Ser Gly Arg Thr Ile Asp 210 215 220 Tyr Ala Ile Thr Gly Asn Ser Asn Thr Ala Ala Leu Tyr Asn Pro Pro 225 230 235 240 Pro Ile Val Ala Ile Leu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Thr Phe Leu Ala 245 250 255 Ser Asp His Phe Pro Val Asn Phe Arg Arg Pro 260 265 <210> 11 <211> 266 <212> PRT <213> Campylobacter fetus <400> 11 Met Arg Asn Val Ile Met Ile Ile Phe Ile Ala Thr Leu Gly Phe Ala 1 5 10 15 Lys Pro Glu Asp Tyr Lys Ile Ala Thr Trp Asn Leu Gln Gly Ser Ser 20 25 30 Ala Ile Thr Glu Ser Lys Trp Asn Ile Ser Val Arg Gln Ile Ile Ser 35 40 45 Gly Glu Asn Pro Ala Asp Ile Leu Ala Val Gln Glu Ala Gly Asn Leu 50 55 60 Pro Gln Thr Ala Leu Pro Thr Gly Arg Ser Ile Asn Gln Gly Gly Thr 65 70 75 80 Ile Val Thr Glu His Leu Trp Gln Leu Gly Ser Ile Ser Arg Pro Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Ile Tyr Tyr Ala Gln Ile Asp Thr Gly Ala Asn Arg Val 100 105 110 Asn Leu Ala Ile Val Ser Arg Ile Lys Ala Asp Glu Ile Ile Ile Leu 115 120 125 Pro Pro Pro Thr Val Ala Ser Arg Pro Leu Ile Gly Ile Arg Ile Gly 130 135 140 Asn Asp Val Phe Phe Asn Ile His Ala Leu Ala Asn Gly Gly Val Asp 145 150 155 160 Ala Pro Ala Ile Ile Asn Ser Ile Phe Asp Arg Phe Arg Asn Met Pro 165 170 175 Asn Ile Thr Trp Met Ile Leu Gly Asp Phe Asn Arg Ser Pro Glu Ser 180 185 190 Leu Arg Gly Thr Leu Gly Leu Glu Thr Arg Val Arg Val Thr Phe Leu 195 200 205 Thr Pro Pro Ala Pro Thr Gln Arg Ser Gly Gly Thr Leu Asp Trp Ala 210 215 220 Ile Val Gly Asn Ser Ala Gly Asp Leu Val Arg Thr Thr Leu Val Ala 225 230 235 240 Val Leu Met Leu Ala Asn Leu Arg Thr His Leu Val Ser Asp His Phe 245 250 255 Pro Val Asn Phe Arg Lys Phe Gly Asp Asn 260 265 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni <400> 12 acttggaatt tgcaaggc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni <400> 13 cattttccag taaattttag 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 14 acttggaatt tgcaaggc 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 15 tctaaaattt achggaaaat g 21 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 16 acttggaata tgcaagga 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 17 ccaaatgtta taggaaagtg 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 18 acttggaatw tgcaaggm 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 19 cyaaawktta yhggaaartg 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 20 tatcaggcaa tagcgcag 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 21 ggtttgcacc tacatcaac 19 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 22 cctagtagcg ctacttag 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 23 tacaaagctt gggcgaag 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 24 gttcaagaag caggaagc 18 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 25 aataccwaka atwggtcttg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 26 atcttttaac cttgcttttg c 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 27 gcaagcatta aaatcgcagc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 28 tttaatgtat tatttgccgc 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 29 tcattgccta tgcgtatg 18 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 30 ggctttgcaa aaccagaag 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 31 caagagttcc tcttaaactc 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 32 catagttagt cgcgtcca 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 33 ccagttaatc tcaggacg 18 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 34 gtatccatgc tttatcaaga 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 35 gtaggcctat aagagaacc 19

Claims (15)

  1. 세포팽창화 치사독을 코드하는 하기(a)~(f) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.
    (a) 서열번호:2 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
    (b) 서열번호:1에 기재된 염기서열에 있어서 962번 위치에서 1600번 위치까지의 염기서열, 1601번 위치에서 2425번 위치까지의 염기서열, 2425번 위치에서 3177번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (c) 서열번호:1에 기재된 염기서열에 있어서, 962번 위치에서 1600번 위치까지의 염기서열, 1601번 위치에서 2425번 위치까지의 염기서열, 2425번 위치에서 3177번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열로 되는 DNA에, 50% 포름아미드, 5×SSC(saline-sodium citrate), 0.01% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.02% BSA(bovine serum albumin), 100 ㎍/mL 열변성된 청어의 정자(Heat-denatured herring sperm) DNA를 포함하는 용액 중에서, 42℃에서 하이브리다이즈시키고, 그 후, 0.1% SDS를 포함하는 2×SSC로 실온에서 세정하고, 추가로 0.1% SDS를 포함하는 0.1×SSC로 65℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드
    (d) 서열번호:6 내지 8 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드
    (e) 서열번호:5에 기재된 염기서열에 있어서 1059번 위치에서 1835번 위치까지의 염기서열, 1853번 위치에서 2656번 위치까지의 염기서열, 2666번 위치에서 3202번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    (f) 서열번호:5에 기재된 염기서열에 있어서 1059번 위치에서 1835번 위치까지의 염기서열, 1853번 위치에서 2656번 위치까지의 염기서열, 2666번 위치에서 3202번 위치까지의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열로 되는 DNA에, 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.01% SDS, 1 mM EDTA, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.02% BSA, 100 ㎍/mL 열변성된 청어의 정자(Heat-denatured herring sperm) DNA를 포함하는 용액 중에서, 42℃에서 하이브리다이즈시키고, 그 후, 0.1% SDS를 포함하는 2×SSC로 실온에서 세정하고, 추가로 0.1% SDS를 포함하는 0.1×SSC로 65℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항의 벡터를 보유하는 숙주세포.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항의 벡터를 보유하는 숙주세포를 배양하고, 그 숙주세포 또는 그의 배양상청으로부터, 생산시킨 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는, 제4항의 폴리펩티드의 제조방법.
  6. 제4항의 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    세포팽창화 치사독의 중화활성을 갖는 항체.
  8. 피험시료 중의 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 존재를 동시에 검출하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법.
    (a) 피험시료에 대해, 제1항의 폴리뉴클레오티드에 특이적인 프라이머쌍의 혼합물을 사용한 핵산 증폭 반응을 행하는 공정
    (b) 캄필로박터속 세균의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA의 증폭 단편의 유무 또는 분자량으로부터, 캄필로박터속 세균의 존재를 판정하는 공정
  9. 제8항에 있어서,
    상기 프라이머쌍으로서, 이하의 (i)~(v) 중 어느 하나 이상의 프라이머쌍을 사용하는 것을 특징으로 하는, 피험시료 중의 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 존재를 동시에 검출하는 방법.
    (i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (iii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:20 및 21로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (iv) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:22 및 23으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (v) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:16 및 17로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
  10. 제9항에 있어서,
    상기 프라이머쌍으로서, 추가적으로 이하의 (vi)~(viii)의 프라이머쌍을 사용하는 것을 특징으로 하는, 피험시료 중의 하나 이상의 캄필로박터속 세균의 존재를 동시에 검출하는 방법.
    (vi) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (vii) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (viii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
  11. 제8항의 방법에 사용하기 위한 키트로서, 사용설명서와, 제1항의 폴리뉴클레오티드에 특이적인 프라이머쌍의 혼합물을 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 프라이머쌍으로서, 이하의 (i)~(v) 중 어느 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 키트.
    (i) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:24 및 25로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (ii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:18 및 19로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (iii) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:20 및 21로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (iv) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:22 및 23으로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (v) 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:16 및 17로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
  13. 제12항에 있어서,
    상기 프라이머쌍으로서, 추가적으로 이하의 (vi)~(viii)의 프라이머쌍을 포함하는 키트.
    (vi) 캄필로박터 제주니의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:26 및 27로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (vii) 캄필로박터 콜리의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:28 및 29로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
    (viii) 캄필로박터 페투스의 세포팽창화 치사독을 코드하는 게놈 DNA를 증폭하기 위한, 서열번호:30 및 31로 되는 프라이머쌍, 또는 그 프라이머쌍과 동일한 게놈 DNA 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍
  14. 피험시료 중의 캄필로박터 하이오인테스티날리스의 존재를 검출하는 방법으로서, 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는 방법.
    (a) 피험시료와 제6항의 항체를 접촉시키는 공정
    (b) 피험시료와 제6항의 항체의 결합활성을 측정하는 공정
    (c) (b)의 결합활성이 검출된 경우에, 캄필로박터 하이오인테스티날리스가 존재한다고 판정하는 공정
  15. 제14항의 방법에 사용하기 위한 키트로서, 사용설명서와, 제6항의 항체를 포함하는 키트.
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