CN101825533B - 一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法 - Google Patents

一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法 Download PDF

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本发明公开了一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法，包括以下实施步骤：1)细胞培养；2)细胞预处理；3)Giemsa染色；Giemsa染色的最适条件为小圆玻片用前处理烘干后，甲醇固定3min，过滤的中性染液(pH7.0～7.4)染色3min，1×PBS缓冲液洗涤。利用本发明的Giemsa染色方法可以明显的区分出被染色后的细胞核和细胞质。

Description

一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法
技术领域
本发明涉及一种Giemsa的染色方法，具体涉及一种小鼠巨噬细胞的Giemsa的染色方法。
背景技术
光学显微镜仍是目前观察细胞形态使用的最普遍和方便的工具。但大多数细胞在可见光下几乎是透明的，不经染色在光学显微镜下无法看清结构。染色可使细胞不同结构显示区别的颜色特征，便于直接观察细胞的生物学特征。
Giemsa染液由天青和伊红组成，细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合，呈粉红色；酸性物质与碱性染料天青结合，呈紫蓝色；中性物质可与两种染料同时结合，呈淡紫色。
Giemsa染色法能将细胞核和细胞质同时染色，操作简便快捷，但染料配制技术和染色条件不易准确掌握。
发明内容
为克服现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法，经该方法染色后的细胞，胞核和胞质界限清晰可见。
为解决上述技术问题，本发明采用了一下技术方案：
一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法，包括以下实施步骤：
1)细胞培养；
2)细胞预处理；
3)Giemsa染色；
进一步的，所述步骤1的细胞培养过程如下：将小鼠巨噬细胞用含10％FBS的RPMI培养基于37℃、5％CO2的条件下培养，隔日传代。
进一步的，所述步骤2的细胞预处理过程如下：将培养至对数生长期的小鼠巨噬细胞用胰酶消化后，于含10％FBS的RPMI培养基中以1500r/min的转速离心5min后洗涤2次，将细胞浓度调整为1×105个/ml，加入铺有小圆玻片的24孔板中，每孔1ml，在37℃、5％CO2的条件下平衡12h待用。
进一步的，所述步骤3的Giemsa染色过程如下：取出平衡12h后的小圆玻片，烘干，甲醇固定3min，将Giemsa染液PH值调制到7.0-7.4之间并过滤，过滤后的Giemsa染液对小圆玻片上的小鼠巨噬细胞进行染色，染色3min后用1×PBS缓冲液冲洗，用吸水纸吸干后油镜下观察并摄片。
优选的，所述小圆玻片以浓盐酸、洗洁精、浓硫酸依次浸泡处理24h，每次浸泡后用单蒸水冲洗；再用无水乙醇浸泡2h，三蒸水洗3遍后放温箱烘干；最后高压灭菌30min后干燥保存，在使用前将处理过的小圆玻片放入24孔板中，紫外灯灭菌30min。
本发明的有益效果是：利用本发明的Giemsa染色方法可以明显的区分出被染色后的细胞核和细胞质。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
具体实施方式
一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法：
1.材料的准备
1)小鼠巨噬细胞，由浙江大学医学院严杰教授惠赠。
2)培养基和主要液体配制
含10％FBS的RPMI 1640细胞培养基：每1000ml含有RPMI 1640 900ml，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)100ml，另含L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml；
D-Hank’s缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.40g，Na2HPO4·12H2O 0.135g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，pH 7.2，加双蒸水定容至1L，高压灭菌；
Giemsa染色原液：Giemsa粉0.5g，纯甘油33ml，甲醇33ml。先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨呈无颗粒的糊状后再将全部甘油加入，放56℃温箱中2h，加甲醇过滤后保存于棕色瓶中。染色工作液：1份原液加9份甲醇，使用前过滤；
1×PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4 1.44g，用HCl调至pH 7.4，加双蒸水定容至1L，高压灭菌，4℃预冷。
3)主要试剂和仪器
RPMI 1640干粉为美国Gibco公司产品；FBS购自杭州赛乐生物科技有限公司，56℃灭活30min之后使用。胰酶细胞消化液购自杭州碧云天生物技术研究所；
HeraeusBB16UV型CO2培养箱系德国Heraeus公司产品；倒置显微镜为日本Olympus公司产品。
2.染色
1)细胞培养；
2)细胞预处理；
3)Giemsa染色；
进一步的，所述步骤1的细胞培养过程如下：将小鼠巨噬细胞用含10％FBS的RPMI培养基于37℃、5％CO2的条件下培养，隔日传代。
进一步的，所述步骤2的细胞预处理过程如下：将培养至对数生长期的小鼠巨噬细胞用胰酶消化后，于含10％FBS的RPMI培养基中以1500r/min的转速离心5min后洗涤2次，将细胞浓度调整为1×105个/ml，加入铺有小圆玻片的24孔板中，每孔1ml，在37℃、5％CO2的条件下平衡12h待用。
进一步的，所述步骤3的Giemsa染色过程如下：取出平衡12h后的小圆玻片，烘干，甲醇固定3min，将Giemsa染液PH值调制到7.0-7.4之间并过滤，过滤后的Giemsa染液对小圆玻片上的小鼠巨噬细胞进行染色，染色3min后用1×PBS缓冲液冲洗，用吸水纸吸干后油镜下观察并摄片。
优选的，所述小圆玻片以浓盐酸、洗洁精、浓硫酸依次浸泡处理24h，每次浸泡后用单蒸水冲洗；再用无水乙醇浸泡2h，三蒸水洗3遍后放温箱烘干；最后高压灭菌30min后干燥保存，在使用前将处理过的小圆玻片放入24孔板中，紫外灯灭菌30min。

Claims (2)

1.一种小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法，包括以下实施步骤：
1)细胞培养；
将小鼠巨噬细胞用含10％FBS的RPMI培养基于37℃、5％CO2的条件下培养，隔日传代；
2)细胞预处理；
将培养至对数生长期的小鼠巨噬细胞用胰酶消化后，于含10％FBS的RPMI培养基中以1500r/min的转速离心5min后洗涤2次，将细胞浓度调整为1×105个/ml，加入铺有小圆玻片的24孔板中，每孔1ml，在37℃、5％CO2的条件下平衡12h待用；
3)Giemsa染色；其特征在于：
所述Giemsa染色的过程如下：取出平衡12h后的小圆玻片，烘干，甲醇固定3min，将Giemsa染液pH值调制到7.0-7.4之间并过滤，过滤后的Giemsa染液对小圆玻片上的小鼠巨噬细胞进行染色，染色3min后用1×PBS缓冲液冲洗，用吸水纸吸干后油镜下观察并摄片；所述1×PBS缓冲液通过以下方法配置：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，用HCl调至pH7.4，加双蒸水定容至1L，高压灭菌，4℃预冷。
2.根据权利要求1所述的小鼠巨噬细胞的Giemsa染色方法，其特征在于：所述小圆玻片以浓盐酸、洗洁精、浓硫酸依次浸泡处理24h，每次浸泡后用单蒸水冲洗；再用无水乙醇浸泡2h，三蒸水洗3遍后放温箱烘干；最后高压灭菌30min后干燥保存，在使用前将处理过的小圆玻片放入24孔板中，紫外灯灭菌30min。 
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