CN101818140B - 固定化铜绿假单胞菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重金属污染废水的处理领域,具体公开了一种固定化铜绿假单胞菌,该固定化铜绿假单胞菌包括铜绿假单胞菌活菌和用于固定该菌的混合载体,混合载体为一包埋该活菌的球状物,混合载体主要由质量比为(50~60)∶(30~40)∶(1.6~6)的聚乙烯醇、海藻酸钙和多壁碳纳米管组成,其制备方法,包括以下步骤:先将聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管与水混合配制成混合溶液,加热搅拌均匀,静置得到固定化试剂;向固定化试剂中添加铜绿假单胞菌得到菌液,再将菌液滴入到硝酸钙溶液得到固定铜绿假单胞菌微球;最后经冷冻解冻处理得到固定化铜绿假单胞菌。本发明的固定化铜绿假单胞菌可将六价铬还原成三价铬,不仅效率高、效果好,而且操作简单,无二次污染。
Description
技术领域
本发明属于重金属污染废水的处理领域,尤其涉及一种固定化微生物及其制备方法和其在处理重金属污染废水中的应用。
背景技术
微生物在适应环境的过程中,能以各种污染物为营养源,通过吸收、代谢等一系列反应,将环境中的污染物转化为稳定低毒或者无毒的物质。通过人工强化此类能力,能使微生物技术广泛应用于环境保护中,现今微生物技术就已在水污染控制、大气污染治理、有毒有害物质的降解、清洁可再生能源的开发、废物资源化、环境监测、污染环境的修复等环境保护的各个方面发挥着极为重要的作用。
六价铬(Cr(VI))是一种典型的有毒有害重金属,对人和动物的毒害很大。六价铬的化合物具有很强的氧化作用,对人体的消化道、呼吸道、皮肤和粘膜都有危害,对肺有致癌作用,并且六价铬难降解、易被生物积累。随着工业的发展,自然水体和工业废水中的六价铬已经成为一大环境问题。
传统的固定化微生物用于重金属污染治理时,一般是固定失去活性的微生物,即通过选择合适的载体,把分泌有多糖、脂类、蛋白质等物质的微生物固定在载体上,再对重金属进行物理吸附或者与之发生络合、螯合作用。在此过程中,微生物是作为吸附剂,并不是通过微生物的代谢过程来降解或者还原重金属。而传统的化学沉淀过滤法、化学氧化还原法、电化学法、反渗透法、离子交换法和蒸发法等处理成本高,并且容易产生二次污染。因此,如何高效、低成本地处理六价铬污染,在本领域就显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种对六价铬的还原效率高、还原效果好且能充分结合现有固定化载体优势的固定化铜绿假单胞菌,还提供一种成本低、无二次污染、操作简单的该固定化铜绿假单胞菌的制备方法及应用。
为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案为一种固定化铜绿假单胞菌,包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)活菌和用于固定该铜绿假单胞菌活菌的混合载体,所述混合载体主要由质量比为(50~60)∶(30~40)∶(1.6~6)的聚乙烯醇(简称PVA)、海藻酸钙和多壁碳纳米管组成。事实上,本发明的该技术方案不仅能用于固定铜绿假单胞菌,而且还能用于固定其他功能性菌(例如黄孢原毛平革菌、芽孢杆菌等)。
作为一个总的技术构思,本发明还提供一种固定化铜绿假单胞菌的制备方法,包括以下步骤:
(1)固定化试剂的制备:将聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管与水混合配制成混合溶液,并控制所述聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管在混合溶液中的浓度分别为50~60g/L、30~40g/L、1.6~6g/L;再将混合溶液加热搅拌至沸腾使其混合均匀,然后室温下静置(一般放置1~2d即可),使聚乙烯醇中的羟基分子有足够的时间进行自动凝聚,增加粘稠度,降低成球后分子的吸水性,同时消除前述加热搅拌过程中产生的气泡;静置后得到固定化试剂;
(2)固定微生物成球:向所述固定化试剂中添加铜绿假单胞菌并使其混合均匀得到菌液,该铜绿假单胞菌的添加量满足每100mL固定化试剂中添加4~8g湿重的铜绿假单胞菌,再将所述菌液滴入到硝酸钙溶液中(硝酸钙溶液的质量浓度在4%~20%的范围变化时,对成球效果的影响都不大),一般反应1~2h即可,反应完成后得到固定铜绿假单胞菌微球;
(3)冷冻解冻处理:将清洗后的固定铜绿假单胞菌微球置于-20℃以下进行冷冻处理24h以上,再转移到1℃~4℃环境下解冻,解冻时间视情况而定,一般解冻12~15h即可,最后于室温下静置得到固定化铜绿假单胞菌。
上述的制备方法中,所述混合溶液的优选配制方法为分别将6g、4g、0.4g的聚乙烯醇、海藻酸钠和多壁碳纳米管混合,再用水定容至100mL得到混合溶液。所选用的多壁碳纳米管无需经过任何化学处理,配制前反复研磨,多壁碳纳米管的量也可以在0.2~0.6g的范围内选择。该配方及用量配比是发明人在经过反复探索后确定出来,下表1即为发明人在探索过程中的部分实验数据:
表1:固定化试剂制备的优化实验及其部分实验数据
PVA浓度单位:g/100mL | 海藻酸钠浓度单位:g/100mL | 碳纳米管量单位:g/100mL | 成球效果 |
7 | 2 | 0.4 | 刚滴入成球但很快溶解 |
8 | 2 | 0.4 | 无法成球 |
9 | 2 | 0.4 | 无法成球 |
0 | 4 | 0 | 马上成球,较硬 |
0 | 4 | 0.4 | 马上成球,较硬 |
8 | 4 | 0.4 | 能成球但是较软 |
7 | 4 | 0.4 | 能成球,拖尾较严重 |
7 | 3 | 0.4 | 成球,较软,拖尾 |
6 | 4 | 0.4 | 成球效果较理想 |
从上表1可以看出,成球效果主要取决于PVA和海藻酸钠的质量比。其中,PVA主要影响成球的柔韧性,而海藻酸钠主要影响硬度。
与现有技术相比,本发明的优点在于提供了一种新型复合材料用于固定铜绿假单胞菌,该复合材料中用到有聚乙烯醇、海藻酸钠和多壁碳纳米管。其中,聚乙烯醇和海藻酸钠是常用的固定微生物的载体;海藻酸钠的生物兼容性好、无毒、容易固定,但是它的压缩强度和耐曝气强度差;而聚乙烯醇具有一定的毒性,尤其是在使用硼酸溶液交联时,但是它的压缩强度和耐曝气强度好。本发明将这两种载体同时用于微生物铜绿假单胞菌的固定,充分结合了二者的优势,提高了本发明混合载体的性能。该复合材料中还用到纳米尺度的多壁碳管,其具有极大的比表面积和独特的结构,能使球状混合载体的内部结构不规整,有利于物质的传递和微生物的生长。
另外,本发明的上述制备方法中采用硝酸钙溶液作为交联剂,滴定之初,钠离子迅速被钙离子取代,形成不溶性的海藻酸钙凝胶,其和多壁碳纳米管的加入能限制聚乙烯醇的流动性,缩短聚乙烯醇分子间的距离,增加聚乙烯醇聚合链的氢键,这些变化均有利于增加交联位点,而且避免使用对微生物有毒性的硼酸交联剂。本发明制备方法的冷冻解冻处理过程中,由聚乙烯醇聚合物间的半微晶结构形成的三维网络结构进一步稳定,颗粒性能得到改善。我们的测试实验也表明,没有经过低温冷冻解冻处理的固定化铜绿假单胞菌在不到一天的摇床培养中便全部破碎。
作为一个总的技术构思,本发明还提供一种上述的固定化铜绿假单胞菌在还原六价铬至三价铬中的应用。六价铬具有强氧化性,对人体和动物的毒害很大,而三价铬的毒性只有六价铬的百分之一,因此运用本发明的固定化铜绿假单胞菌还原六价铬具有重大意义。本发明的应用中是使用二苯碳酰二肼(DPC)分光光度法测定六价铬的消耗,其原理是六价铬在酸性条件下与二苯碳酰二肼发生显色反应,生成紫红色络合物,在540nm下测定其吸光值,根据吸光值来确定六价铬的浓度。为了证实溶液中六价铬的减少是因为被还原成三价铬而不是被铜绿假单胞菌所吸附,我们还对处理完成后溶液中的三价铬进行了测定,采用的方法是通过与2,6-二羧酸吡啶(PDCA)进行反应,然后用离子色谱法在540nm下对其进行测定。实验结果表明,溶液中测定的三价铬的增加值与六价铬被铜绿假单胞菌还原前后的减少值几乎相等,并且后续的固定化铜绿假单胞菌还原六价铬的测定结果所呈现的规律性也符合六价铬被还原的特征。定量和定性地分析结果均表明六价铬的减少是因为被还原为三价铬。
上述应用的具体操作步骤优选为:先将所述的固定化铜绿假单胞菌加入到发酵培养基中进行活化,一般活化1d以上,然后将待处理的六价铬溶液(一般是60mg/L以下)加入到活化铜绿假单胞菌后的发酵培养基中,控制所述固定化铜绿假单胞菌在含有六价铬溶液的发酵培养基中浓度为0.1g/mL以上(优选为0.1~0.12g/mL),35℃~37℃温度下振荡处理(振荡处理时的转速可以为150~180rpm)。
在本发明的应用实验过程中,我们曾将未经过预先活化的固定化铜绿假单胞菌直接用于还原六价铬,结果显示,前两天六价铬的浓度并未发生显著变化,处理效率不高,于是通过在发酵培养基中先对固定化铜绿假单胞菌进行活化来充分激活铜绿假单胞菌的活性,然后再加入到含六价铬溶液的发酵培养基中,其还原六价铬的效率明显提高。而且我们的应用实验结果显示,当六价铬溶液的初始浓度为40~50mg/L,固定化铜绿假单胞菌的用量为0.1~0.12g/mL的条件下,不仅还原效率要明显优于游离的铜绿假单胞菌菌体,而且处理成本相对较小。
上述的应用中,如果待处理六价铬溶液的浓度较大(例如50~60mg/L),则可优选采用以下操作步骤进行处理:先将所述的固定化铜绿假单胞菌加入到发酵培养基中进行活化,然后将待处理的浓度为50~60mg/L的六价铬溶液稀释,将稀释后的六价铬溶液分成三份以上,并将其中的一份加入到活化铜绿假单胞菌后的发酵培养基中,使六价铬在其中的浓度为15~20mg/L,控制所述固定化铜绿假单胞菌在含有六价铬发酵培养基中的浓度为0.1g/mL以上,35℃~37℃温度下振荡处理,然后过滤处理后的溶液收集得到固定化铜绿假单胞菌,再用生理盐水清洗后继续用于另一份的六价铬溶液的还原处理,重复前述操作步骤直至剩余的各份六价铬溶液全部处理完毕即可。此优选的技术方案是基于本发明应用的另一优势:即经过本发明制备方法制得的固定化铜绿假单胞菌可以连续用于六价铬的还原,大大减小了成本,提高了资源的可重复利用率。尤其是在进行高浓度六价铬溶液的还原时,可以将其先稀释为低浓度的六价铬溶液,因为低浓度时连续多次还原效果要优于高浓度时一次性还原的效果,且还原效率上不会有太大贬损。
综上,利用本发明的微生物固定化技术,我们将游离的铜绿假单胞菌定位于限定的空间区域,并使其保持较高的活性和良好的机械性能,这大大增加了铜绿假单胞菌对有毒物质(例如六价铬)的耐受性,达到了反复利用的效果。而且,和传统的物理、化学处理方法相比,本发明的生物方法成本低,二次污染少,对于六价铬等重金属污染的治理具有积极意义。
附图说明
图1为本发明的固定化铜绿假单胞菌表面还原六价铬前的SEM图。
图2为本发明的固定化铜绿假单胞菌表面还原六价铬后的SEM图。
图3为本发明实施例2中固定化铜绿假单胞菌降解不同初始浓度六价铬溶液的浓度-时间变化曲线图。
图4为本发明实施例2中固定化铜绿假单胞菌和游离铜绿假单胞菌还原同一浓度的六价铬溶液的效果对比图。
图5为本发明实施例3中固定化铜绿假单胞菌连续多次还原六价铬的效果图。
图6为本发明实施例4中固定化铜绿假单胞菌的用量对还原六价铬的影响效果对比图。
具体实施方式
实施例1:
一种如图1、图2所示的本发明的固定化铜绿假单胞菌,包括铜绿假单胞菌活菌和用于固定该铜绿假单胞菌活菌的混合载体,该混合载体为一包埋铜绿假单胞菌活菌的球状物,混合载体主要由质量比为60∶40∶4的聚乙烯醇、海藻酸钙和多壁碳纳米管组成(虽与所用原料的配比会有稍许差异,但该差异可忽略不计)。
本实施例的上述固定化铜绿假单胞菌是通过以下方法制备得到:
1、固定化试剂的制备:
分别将6g、4g、0.4g的聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管混合,用水定容至100mL,配制成混合溶液;再将混合溶液加热至沸腾,期间不断搅拌使其混合均匀,自然冷却后室温下静置24h得到固定化试剂。
2、铜绿假单胞菌的培养和收集
本实施例中所用的铜绿假单胞菌购自中国典型培养物保藏中心(武汉),保藏号为CCTCCAB93066。
基础培养基配方为:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L;
富集培养基配方为:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L,用1mol/L的NaOH调节pH值为7.0~7.4;
发酵培养基配方为:葡萄糖10g/L、NH4NO3 1.0g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4·12H2O1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和MnSO4·7H2O 0.01g/L,同样用NaOH调节pH为7.0~7.4。
以上培养基都经过120℃下高压灭菌20min的处理。首先,接种铜绿假单胞菌于基础培养基上,37℃活化36h,然后在无菌操作下用接种环取两环上述活化过的铜绿假单胞菌到富集培养基中,37℃,150rpm下培养20h后,在4℃和10000rpm条件下离心8min收集菌体。用0.9%的生理盐水清洗菌体两次。
3、固定微生物成球
将步骤2中所得的菌体5g加入到步骤1中制得的100mL固定化试剂中,充分混匀得到菌液;然后用2mL的注射器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴加到质量浓度为4%的硝酸钙溶液中,反应1.5h,使其成球稳定,得到固定铜绿假单胞菌微球。
4、冷冻解冻处理
将步骤3得到的固定铜绿假单胞菌微球用蒸馏水清洗三次后,转移到-20℃以下冷冻处理24h,再转移到4℃环境下解冻12h,然后室温下解冻1h,得到本实施例的固定化铜绿假单胞菌。
上述实施例1制得的固定化铜绿假单胞菌经过10天的摇床培养,其形状依然能保持良好,没有破碎现象发生,某些微球表面还可以观察到长出来的菌体(图1和图2也证实了本发明固定化铜绿假单胞菌的生长过程中表面形态的逐步完善过程)。
实施例2:
将20~30g的上述实施例1制得的固定化铜绿假单胞菌转移到含有100mL上述发酵培养基的锥形瓶中,37℃活化两天,使固定化铜绿假单胞菌充分恢复活性。然后加入不同初始浓度的六价铬溶液,37℃,150rpm摇床培养,定期取样。每隔一定时间取样经过8000rpm离心8min后(或者微孔滤膜过滤),取上清液测量取上清液用于六价铬含量的测定。采用二苯碳酰二肼分光光度法在540nm下测定其吸光值。测定中所用的器皿全部在稀硝酸中浸泡过夜,再清洗。测定中,二苯碳酰二肼用体积比为1∶1的丙酮和蒸馏水配置,质量浓度为5%,该溶液需要避光保存。如果该溶液变成红色,应该重新配置。所用的硫酸和磷酸溶液均为体积比50%的水溶液。测定中的空白溶液为蒸馏水。测定的步骤为:样品经过离心后,取上清液1mL加入到25mL的比色管中,然后用蒸馏水定容至25mL,依次加入二苯碳酰二肼、硫酸和磷酸溶液1.5mL、0.5mL和0.5mL,显色反应8min,然后在540nm下进行分光光度测定。
固定化铜绿假单胞菌表面还原六价铬前、后的SEM图分别如图1、图2所示,从图1和图2可以看出,在还原六价铬的过程中,固定化铜绿假单胞菌的形态也在逐步完善,微孔的形成有利于物质的传递和微生物的生长。
图3为本发明实施例2中固定化铜绿假单胞菌降解不同初始浓度六价铬溶液的浓度-时间变化曲线图。从图3中可以看出,对于初始浓度在50mg/L以下的六价铬溶液,在不超过150h的时间内都能完全被降解。而当六价铬溶液的初始浓度超过此值时,溶液中的六价铬并不能被完全降解。图3中所示的初始六价铬浓度分别为20mg/L、30mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L时,六价铬的平均被还原速率分别为0.277mg/L/h、0.31mg/L/h、0.33mg/L/h、0.305mg/L/h、0.295mg/L/h和0.267mg/L/h。这说明六价铬的平均被还原速率随着初始六价铬浓度的增加而变大,直到达到50mg/L后,又开始下降。其原因可能是因为当初始六价铬浓度较低时,微生物的还原能力没有被充分利用起来,而过高浓度的六价铬母液的毒性和强氧化性对微生物的生长代谢有抑制作用,限制了长期处于六价铬环境中的铜绿假单胞菌还原六价铬的能力。
图4为本实施例固定化铜绿假单胞菌和游离铜绿假单胞菌还原40mg/L的六价铬溶液的效果对比图,从图4可以看出固定化铜绿假单胞菌的还原率和效率都明显优于游离的铜绿假单胞菌。其原因可能是因为固定化铜绿假单胞菌的抗毒害能力要优于游离铜绿假单胞菌,利于铜绿假单胞菌的生长和繁殖,使固定化铜绿假单胞菌的密度高于游离铜绿假单胞菌,并且固定化铜绿假单胞菌的回收再利用和处理也比游离铜绿假单胞菌方便。
实施例3:
采用实施例1制得的固定化铜绿假单胞菌对六价铬溶液进行还原,其操作步骤为:先将固定化铜绿假单胞菌加入到100mL的发酵培养基中进行活化,一般活化1d以上,然后将待处理的六价铬溶液加入到活化铜绿假单胞菌后的发酵培养基中,使六价铬的浓度为15mg/L,控制固定化铜绿假单胞菌在含有六价铬的发酵培养基中浓度为0.1g/mL,37℃温度下振荡处理2d,振荡处理时的转速为150rpm。再继续使用该固定化铜绿假单胞菌连续四次对15mg/L的六价铬进行还原,还原过程中,对固定化铜绿假单胞菌的连续使用是通过直接过滤前一次处理后的溶液得到固定化铜绿假单胞菌,然后用0.9%的生理盐水清洗后,再用于下一次六价铬的还原。一共连续五次的还原效果如图5所示,由图5可见,随着还原过程的进行,该固定化铜绿假单胞菌还原同样浓度的六价铬所需的时间越来越长,效率渐渐降低。在前120h内,固定化铜绿假单胞菌可以连续三次还原15mg/L的六价铬溶液,而在后续的120h中,只能还原两次15mg/L的六价铬。
本实施例与实施例2中的图3相比,在168h内,实施例2中的应用方法可以把60mg/L的六价铬还原到8.056mg/L,而如果将60mg/L的六价铬稀释成15mg/L,然后分四次进行还原,那么在168h内,可以还原到0.576mg/L,这说明低浓度时的连续还原效果要优于高浓度时一次性还原的效果。并且,当固定化铜绿假单胞菌不再具有还原能力时,回收处理固定化铜绿假单胞菌也极为方便。
实施例4:
先将本发明实施例1的固定化铜绿假单胞菌加入到发酵培养基中进行活化,活化48h后将待处理的的六价铬加入到活化铜绿假单胞菌后的发酵培养基中(共100mL),控制六价铬的浓度为40mg/L。本实施例中加入的固定化铜绿假单胞菌的量分别为12g、10g、8g、5g、3g时,37℃温度下150rpm振荡处理48h后,不同添加量的固定化铜绿假单胞菌分别把40mg/L的铬还原为2.12mg/L、2.15mg/L、4.94mg/L、9.54mg/L和10.51mg/L(参见图6)。由图6可见,随着固定化铜绿假单胞菌用量的增加,还原速率越来越快,高生物密度有利于固定化铜绿假单胞菌还原六价铬,但是对于同一初始浓度,通过增加生物密度来提高还原效率是有限的,如图6所示,12g和10g之间的变化就非常小了,10~12g的固定化铜绿假单胞菌用量适合100mL初始浓度为40mg/L的六价铬的还原。
Claims (4)
1.一种固定化铜绿假单胞菌的制备方法,包括以下步骤:
(1)固定化试剂的制备:将聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管与水混合配制成混合溶液,并控制所述聚乙烯醇、海藻酸钠、多壁碳纳米管在混合溶液中的浓度分别为60 g/L、40 g/L、4g/L;再将混合溶液加热搅拌至沸腾使其混合均匀,然后室温下静置24h得到固定化试剂;
(2)固定微生物成球:向所述固定化试剂中添加铜绿假单胞菌并使其混合均匀得到菌液,该铜绿假单胞菌的添加量满足每100 mL固定化试剂中添加4~8 g湿重的铜绿假单胞菌,再将所述菌液滴入到质量浓度为4%的硝酸钙溶液中,反应1.5h后得到固定铜绿假单胞菌微球;
所述的铜绿假单胞菌经过了以下活化和培养处理:先接种铜绿假单胞菌于基础培养基上,37℃活化36 h,然后在无菌操作下用接种环取两环上述活化过的铜绿假单胞菌到富集培养基中,37℃,150 rpm下培养20 h;
所述基础培养基配方为:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠 10 g/L、琼脂20 g/L;
所述富集培养基配方为:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠 10 g/L,用1 mol/L的NaOH调节pH值为7.0~7.4;
(3)冷冻解冻处理:将清洗后的固定铜绿假单胞菌微球置于-20℃以下进行冷冻处理24h以上,再转移到1℃~4℃环境下解冻,最后于室温下静置得到固定化铜绿假单胞菌。
2.一种如权利要求1所述制备方法制得的固定化铜绿假单胞菌。
3.一种如权利要求2所述的固定化铜绿假单胞菌在还原六价铬至三价铬中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用的具体操作步骤为:先将所述的固定化铜绿假单胞菌加入到发酵培养基中进行活化,然后将待处理的浓度为50~60 mg/L的六价铬溶液稀释,将稀释后的六价铬溶液分成三份以上,并将其中的一份加入到活化铜绿假单胞菌后的发酵培养基中,使六价铬在其中的浓度为15~20mg/L,控制所述固定化铜绿假单胞菌在含有六价铬发酵培养基中的浓度为0.1g/mL以上,35℃~37℃温度下振荡处理,然后过滤处理后的溶液收集得到固定化铜绿假单胞菌,再用生理盐水清洗后继续用于另一份的六价铬溶液的还原处理,重复前述操作步骤直至剩余的各份六价铬溶液全部处理完毕即可;
所述发酵培养基的配方为:葡萄糖 10 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4·12H2O 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和MnSO4·7H2O 0.01g/L,用NaOH调节pH为7.0~7.4。
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