CN101134954B - 固定化微生物制剂及用其降解养殖水体孔雀石绿污染的方法 - Google Patents
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Abstract
固定化微生物制剂及用其降解养殖水体孔雀石绿污染的方法，以海藻酸钙为载体，以泛菌(Pantoea sp.)M3菌株为有效成份，采用如下步骤制备：1)将菌种M3接入富集培养培养基，在30～37℃、150rpm下培养18～30h，离心，磷酸缓冲液洗涤，得浓缩菌悬液；2)取海藻酸钠加入水调成糊状，加热溶解并冷却至室温，再加入浓缩菌悬液，混合均匀，最终混合物海藻酸钠的重量浓度为2％，菌含量为1～2g/L；3)取混合物以恒定的速度滴到盛有5％CaCl2溶液中，形成海藻酸钙小球，4～8℃温度下胶联固定16h；4)海藻酸钙固定化小球用磷酸盐缓冲液洗涤后即得。本发明对孔雀石绿含量为0.45、0.95μg/g干重的底泥的12d去除率可达80％，对重污染底泥(2.10μg/g干重)也可达52.3％，联合光照作用后去除率可提高至62.39％。
Description
技术领域
本发明涉及泛菌(Pantoea sp.)M3菌株的固定化技术，还涉及孔雀石绿污染底泥的微生物修复技术。
背景技术
孔雀石绿(Malachite Green，MG)是一种合成的三苯甲烷类染料，曾被广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌等。但孔雀石绿及其代谢产物隐孔雀石绿容易在生物体组织中积累，不易代谢，具有高致癌、致畸、致突变作用。因此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但由于孔雀石绿进入养殖水体后很快被底泥吸附，代谢缓慢，多年难以消除，对生物体和人类造成持续危害，因此，对于渔业水域尤其是底泥中孔雀石绿的残留问题应当加以高度重视。
目前对于孔雀石绿的去除研究主要是对高浓度孔雀石绿染料废水的脱色研究，而关于养殖水体底泥修复的研究国内外还未见报道。用微生物修复水体受污染底泥是一个方向，但游离态微生物很难沉降下来与底泥充分接触，同时又容易被水生生物捕食，很难达到满意的修复效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是用微生物修复水体受污染底泥时所在存在的游离态微生物很难沉降下来与底泥充分接触，同时又容易被水生生物捕食，很难达到满意的修复效果的问题。
为解决上述技术问题，本发明将孔雀石绿高效降解菌泛菌(Pantoea sp.)M3菌株通过固定化技术制成固定化微生物制剂，并将该制剂应用于水体底泥的修复，有效降低底泥中孔雀石绿含量。
本发明所述固定化微生物制剂以海藻酸钙为载体，以泛菌(Pantoea sp.)M3菌株为有效成份，泛菌(Pantoea sp.)M3的重量含量为0.188％～0.375％，其制备方法包括如下步骤：
1、将菌种M3接入富集培养培养基，在30～37℃、150rpm下培养18～30h，离心，磷酸缓冲液洗涤，得到浓缩菌悬液备用；
2、取海藻酸钠加入水调成糊状，加热溶解并冷却至室温，再加入浓缩菌悬液，混合均匀，最终混合物海藻酸钠的重量浓度为2％，菌含量为1～2g/L，余量为水；
3、取混合物以恒定的速度滴到盛有5％CaCl2溶液中，形成海藻酸钙小球，4～8℃温度下固定16h；
4、海藻酸钙固定化小球用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂，其中的菌含量为0.188％～0.375％(m/m)。
4)海藻酸钙固定化小球用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂。
前述步骤1中的富集培养基配方为：1000ml中：葡萄糖5g；KH2PO41g；K2HPO41g；NH4NO31g；MgSO4·7H2O10mg；CaCl20.5mg；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；调pH至7.0～7.5；培养方法是在121℃、103kPa、湿热灭菌20min后，接种，培养温度：30～37℃；培养时间18～30小时。
前述步骤1和步骤4中用磷酸盐缓冲液洗涤的次数为2～3次。
前述步骤3中海藻酸钙小球的成球直径为2～3mm。
经步骤4制得的最终固定化微生物制剂需浸泡于磷酸盐缓冲液中并保存于4℃冰箱中。
本发明主要用于修复水产养殖底泥去除孔雀石绿，具体方法是：取固定化微生物制剂，按底泥干重的1％～10％直接添加到孔雀石绿含量为0.45～2.10μg/g干重、含水率为91.55～95.77％的底泥中，25～30℃室温降解4～12天，降解效果较好。
本发明直接投放到水体中，可迅速沉于水底与底泥充分接触，快速降解底泥中孔雀石绿。本发明可有效去除底泥中的孔雀石绿，对孔雀石绿含量为0.45、0.95μg/g干重的底泥的12d去除率可达80％。对重污染底泥(2.10μg/g干重)也可达52.3％，联合光照作用后去除率可提高至62.39％。本发明使用方便，无需添加其他成分，较为经济。
附图说明
图1为固定菌对不同初始底泥孔雀石绿浓度的降解。
图2为固定菌生物量对降解的影响。
图3为降解体系中不同含水率对降解的影响。
图4为固定菌和光照联合降解底泥孔雀石绿。
具体实施方式
实施例1：
将菌种接种于富集培养基(培养基成分为：1000ml中：葡萄糖5g；KH2PO41g；K2HPO41g；NH4NO31g；MgSO4·7H2O10mg；CaCl20.5mg；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；调pH至7.0～7.5；121℃、103kPa、湿热灭菌20min后)中，35℃、150rpm富集培养24h，离心，磷酸缓冲液洗涤，得到的浓缩菌悬液加入含海藻酸钠水溶液中，使最终海藻酸钠浓度为2％，菌含量为1.0g/L。混合液滴入5％CaCl2溶液中，4℃下固定16h。最后用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂，菌含量为0.188％(m/m)，成球直径2～3mm。该制剂按2％(m/m)接种量接入2mg/L的孔雀石绿水溶液中，6天后孔雀石绿降解率分别为76.2％。
实施例2：
将菌种接种于富集培养基(培养基成分同实施例1)35℃、150rpm富集培养24h，离心，磷酸缓冲液洗涤，得到的浓缩菌悬液加入含海藻酸钠水溶液中，使最终海藻酸钠浓度为2％，菌含量为1.5g/L。混合液滴入5％CaCl2溶液中，4℃下固定16h。最后用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂，菌含量为0.282％(m/m)，成球直径2～3mm。该制剂按2％(m/m)接种量接入2mg/L的孔雀石绿水溶液中，6天后孔雀石绿降解率分别为89.2％。
实施例3：
将菌种接种于富集培养基(培养基成分同实施例1)35℃、150rpm富集培养24h，离心，磷酸缓冲液洗涤，得到的浓缩菌悬液加入含海藻酸钠水溶液中，使最终海藻酸钠浓度为2％，菌含量为2.0g/L。混合液滴入5％CaCl2溶液中，4℃下固定16h。最后用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂，菌含量为0.375％(m/m)，成球直径2～3mm。该制剂按2％(m/m)接种量接入2mg/L的孔雀石绿水溶液中，6天后孔雀石绿降解率分别为88.7％。可见菌含量0.282％的制剂对孔雀石绿降解效果最好。
实施例4：
固定菌对底泥中不同含量孔雀石绿的降解情况从图1可见，固定菌对底泥中不同浓度孔雀石绿均有明显的降解，并且对低浓度(0.45、0.95μg/g干重)底泥中孔雀石绿降解效果较好，12d降解率均可达80％左右。随着底泥孔雀石绿浓度的进一步上升，降解率下降，2.10μg/g干重底泥的12d降解率仅为52.3％。
实施例5：
在降解体系中设置不同固定菌生物量投菌量来比较底泥孔雀石绿的降解情况。由图2可以看出，投加固定菌量为底泥干重的1％时，对2.10μg/g干重孔雀石绿降解缓慢，12d后降解率仅为36.33％。而当投菌量增加至2ml后，12d后降解率增至49.66％。但若投菌量继续增加至5ml，降价效率不再有明显提高，12d后降解率为52.33％。可以看出，当投加固定菌量太少时，会影响底泥中孔雀石绿的去除效果，但是当固定菌投加量达到4％时，固定菌量的继续投加对降解率无太大影响，因此，从经济角度考虑，当孔雀石绿含量在2.10μg/g干重时，选择4％投加量最佳。
实施例6：
降解体系中含水率不同时，比较固定菌对底泥中孔雀石绿的降解情况(图3)。体系中含水率的增加对降解的影响主要在初始阶段，前3d，随着含水率的增加，降解率下降。而3d后，不同含水率的降解率的差异开始逐步缩小，5d后已无显著差异。由此可见，对于不同水深的体系，该固定菌对底泥中孔雀石绿均有较好的降解效果，之间无明显差异。可见，该固定菌用于修复孔雀石绿污染底泥无需排水，可以直接投加沉至水底进行降解修复。
实施例7
对比固定菌、光照和固定菌光照联合作用的降解情况(图4)，可以看出，自然光照对底泥孔雀石绿具有一定降解效果，12d降解率为35.99％。固定菌的降解效果要优于光照降解，12d降解率为52.33％。当固定菌和光照联合作用时，前7d降解效果和固定菌降解无显著差异，但12d时，降解率为62.39％，优于固定菌降解率。可见，光照对固定菌降解底泥中孔雀石绿无抑制作用，且联合作用后降解率提高，由此更为适合实际环境情况。
Claims (3)
1.一种固定化微生物制剂，其特征在于以海藻酸钙为载体，以泛菌(Pantoea sp.)M3菌株为有效成份，其中泛菌(Pantoea sp.)M3的重量含量为0.188％～0.375％，并通过如下方法制备：
1)将菌种M3接入富集培养基，在30～37℃、150rpm下培养18～30h，最适pH：7.0～7.5，离心，磷酸缓冲液洗涤，得到浓缩菌悬液备用；前述富集培养基配方为：1000ml中：葡萄糖5g；KH2PO41g；K2HPO41g；NH4NO31g；MgSO4·7H2O 10mg；CaCl20.5mg；酵母浸膏5g；蛋白胨10g，调pH至7.0～7.5，121℃、103kPa、湿热灭菌20min，接种；
2)取海藻酸钠加入水调成糊状，加热溶解并冷却至室温，再加入浓缩菌悬液，混合均匀，最终混合物海藻酸钠的重量浓度为2％，菌含量为1～2g/L，余量为水；
3)取混合物以恒定的速度滴到盛有5％CaCl2溶液中，形成直径为2～3mm海藻酸钙小球，4～8℃温度下胶联固定16h；
4)海藻酸钙固定化小球用磷酸盐缓冲液洗涤后即得最终的固定化微生物制剂。
2.如权利要求1所述固定化微生物制剂，其特征在于步骤1)和步骤4)中用磷酸盐缓冲液洗涤的次数为2-3次。
3.权利要求1所述固定化微生物制剂用于修复水体去除孔雀石绿的方法，其特征在于取固定化微生物制剂，按底泥干重的1％～10％直接添加到孔雀石绿含量为0.45～2.10μg/g干重、含水率在91.55～95.77％的底泥中，25～30℃室温降解4～12天。
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