CN101812447A - 检测待测植物样本是否含有植原体第v组成员的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。本发明提供了特异性引物对和特异性探针。所述特异性引物对是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明提供的方法,是以提取待测植物样本的基因组DNA作为模板,用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测,确定待测植物样本是否含有植原体第V组成员。本发明公开的特异性引物对和特异性探针,可快速、方便、高灵敏度检测出植物样品是否携带或含有植原体第V组成员。检测过程中无需核酸染料,因此还具有环保安全的优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。
背景技术
植原体(phytoplasma),原称类菌原体(mycoplasma-like organism,MLO),为单细胞原核生物,无细胞壁,由生物膜包围,它可引起多种病害。植原体属于细菌界(Bacteria),硬壁菌门(Firmicutes),柔膜菌纲(Mollicutes),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)。在1992年的第九届国际菌原体系统大会(International Organization forMycoplasmology,IOM)上,提出了用植原体(Phytoplasma)作为一个新的属名。在整个柔膜菌纲的分类鉴定中,16SrDNA是系统鉴定的首选标记。之后,众多研究者陆续根据16SrDNA序列结果将植原体分为若干16S组。根据最新分类研究,以植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析,将植原体分为28个组。其中,植原体第V组成员包括枣疯病植原体、樱桃致死黄化植原体、重阳木丛枝植原体等。
尤其对于枣树来讲,在我国栽培范围极广,以山东、河北、山西、陕西、甘肃、安徽、浙江产量最多。在枣树病害中,枣疯病(Jujube Witches’Broom)发生普遍,并且由于其防治难度大,具有毁灭性,全国每年因枣疯病致枣树死亡带来的损失达数亿元。因此急需一种简便快速的检疫检测方法,来有效的检测植原体第V组病害,达到早期预防和控制的目的。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术是一种20世纪八十年代处发展起来的分子生物学技术,用于富集特定的DNA片段。它运用从温泉细菌中分离出的DNA聚合酶(DNA Polymerase),通过变性、复性(退火)和延伸等三步反应,模拟体内DNA复制。能够将极微量的核酸在短时间内迅速扩增复制,获得大量的目的DNA片段。
实时荧光PCR是在常规PCR体系中加入了一条Taqman探针。Taqman探针5’端标记有荧光分子,3’端标有淬灭基团。在PCR扩增过程中,与模板DNA配对正确的Taqman探针在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性作用下,将荧光分子切下,检测荧光信号。实时荧光具有高灵敏度、快速的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒。
本发明提供了用于检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的特异性引物对和特异性探针。
所述特异性引物对是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。
上游引物(F):5’-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3’;
下游引物(R):5’-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3’;
所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
特异性探针(P):5’-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3’。
所述特异性引物对和/或所述特异性探针在制备检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。
本发明还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒,包括所述特异性引物对和/或所述特异性探针。所述试剂盒具体可由所述特异性引物对和所述特异性探针组成。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。
本发明还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法,是提取待测样本的基因组DNA作为模板,用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测,确定待测样本是否含有植原体第V组成员。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。所述实时荧光PCR的PCR反应体系中,反应起始时,序列表的序列1所示核苷酸的浓度具体可为0.3mM,序列表的序列2所示核苷酸的浓度具体可为0.9mM,所述特异性探针的浓度具体可为0.2mM;所述实时荧光PCR的参数具体可为:50℃、2min;95℃、5min;95℃、15s,60℃、1min,40个循环。
用所述特异性引物对和特异性探针对待测植物样品进行检测时,若结果有Ct值读出并且阴性对照无Ct值,则可判断该样品携带有植原体第V组成员。
本发明提供的方法具有以下优点:
1)检测结果准确性高:在发明开发过程中,选取枣疯病植原体(植原体第V组)、樱桃致死性黄花植原体(植原体第V组),重阳木丛枝植原体(植原体第V组),以及泡桐丛枝植原体(植原体第I组)和杏褪绿卷叶植原体(植原体第X组)为对象,进行特异性检测,结果表明本发明检测准确性高。
2)稳定性及重现性高:在用本发明检测时,因为本发明基于模板数检测,相比于普通PCR,检测结果重复性好,稳定性高。
3)检测方法安全:应用本发明探针及引物检测时,无需进行凝聚、染色等步骤,减少了试剂对人体的伤害,因此具有安全性。
4)省时:本发明基于实时荧光PCR技术,省去凝聚、染色等步骤,减少了检测时间。
5)检测结果易于判断:本发明基于实时荧光PCR技术,检测结果呈现为数字和图形,排除了主观因素,易于判断分析。
6)检测灵敏度高:应用本发明检测,具有较高的灵敏度,能够满足实际检测检验的需要。
7)易于操作掌握:其操作过程与普通PCR反应操作相似,因此易于操作。
8)应用:可应用于检疫、科研等领域,尤其是对高通量和高灵敏性有要求的领域。
本发明公开的特异性引物对和特异性探针,可快速、方便、高灵敏度检测出植物样品是否携带或含有植原体第V组成员。检测过程中无需核酸染料,因此还具有环保安全的优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR特异性;1:枣疯病植原体DNA;2:樱桃致死性黄花植原体DNA;3:重阳木丛枝植原体DNA;4,5:无反应的泡桐丛枝植原体和杏褪绿卷叶植原体。
图2为枣疯病植原体DNA梯度实时荧光PCR检测(图中标注为分子拷贝数)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
枣疯植原体(枣疯病植原体)、泡桐丛枝植原体(泡桐丛枝病植原体)、重阳木丛枝植原体(重阳木丛枝病植原体)、樱桃致死性黄花植原体(樱桃致死黄花病植原体)和杏褪绿卷叶植原体(杏褪绿卷叶病植原体)均来自野外发病植物,并经过了测序验证,其中枣疯植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER:FJ445390所示,泡桐丛枝植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER:FJ263621所示,重阳木丛枝植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER:EF432569所示,樱桃致死性黄花植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER:31074425所示,杏褪绿卷叶植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESSIONNUMBER:EU168758所示。
ABI Mix(ABI公司);探针及引物(由大连宝生物公司合成)。7300实时荧光PCR仪(ABI公司);ND-1000核酸/蛋白检测仪(Thermal公司)。
实施例1、试剂盒的制备
试剂盒由如下特异性引物对和特异性探针组成:
特异性引物对:
上游引物(F):5’-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3’(序列表的序列1);
下游引物(R):5’-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3’(序列表的序列2);
特异性探针(P):5’-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3’(核苷酸序列为序列表的序列3)。
实施例2、试剂盒的特异性
将枣疯病植原体(植原体第V组)、樱桃致死性黄花植原体(植原体第V组),重阳木丛枝植原体(植原体第V组)、泡桐丛枝植原体(植原体第I组)和杏褪绿卷叶植原体(植原体第X组)分别提取基因组DNA作为模板(阴性对照中,用水代替DNA模板),用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR,以确定试剂盒的特异性。
实时荧光PCR扩增的体系见表1,循环参数见表2。
表1实时荧光PCR扩增的体系
ABIMix | 12.5uL |
上游引物(7.5mM) | 1uL |
下游引物(7.5mM) | 3uL |
ABIMix | 12.5uL |
探针(10mM) | 0.5uL |
DNA模板 | 5uL |
ddH2O | 3uL |
表2实时荧光PCR扩增的循环参数
结果见图1。从图1可看出,试剂盒中的特异性引物对和特异性探针能够检测出同属第V组的枣疯病植原体DNA、樱桃致死黄花植原体DNA和重阳木丛枝植原体;而属于第I组的泡桐丛枝植原体和属于第X组的杏褪绿卷叶植原体无扩增(位于基线下方),可见探针引物具有较好特异性。
实施例3、试剂盒的灵敏性和稳定性
一、标准质粒的制备
以枣疯植原体基因组DNA为模板,用引物R16F2n:5’-GAA ACG ACT GCT AAGACT GG-3’,R16F2:5’-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3’扩增枣疯病植原体16S rDNA片段,得到1.2kb PCR产物,克隆至PMDTM-18T载体(takara),提取质粒送北京诺赛生物技术有限公司测序验证,确定为目的质粒(标准质粒)。采用ND-1000核酸/蛋白检测仪测定浓度,并进行10倍梯度稀释。
二、试剂盒的灵敏性
10倍梯度稀释标准品质粒,分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR扩增的体系和循环参数同实施例2(反应初始体系中分别含有1×108拷贝、1×107拷贝、1×106拷贝、1×105拷贝、1×104拷贝、1×103拷贝、1×102拷贝、1×101拷贝)。反应结束后,以拷贝数以10为底的对数和Ct值关系作函数,构建标准曲线,以确定试剂盒的灵敏性。构建的标准曲线方程为:y=-3.328x+37.99(其中y为Ct值,x为拷贝数对数;标准曲线决定系数R2=0.998)。
提取枣疯病植原体的总DNA,进行10倍梯度稀释,分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR扩增的体系和循环参数同实施例2。对照标准曲线可知样品中枣疯病植原体的拷贝数。
结果见图2。结果表明,采用本发明的试剂盒可检测枣疯植原体8.5×101拷贝。
三、试剂盒的稳定性
对4种不同浓度的标准质粒(反应初始体系中含有1×108拷贝~1×105拷贝)分别用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR,每个浓度重复检测3次,通过实时荧光PCRCt值的平均值和变异系数来评价试剂盒的稳定性。变异系数(CV)=测定结果的标准差与其平均值的百分比。
结果见表3。结果均能判断为阳性,并且Ct值变异系数均小于5%,证明该试剂盒重复性好。
表3实时荧光PCR重复性检测
序列表
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试剂盒
<130>CGGNARY92568
<160>3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cagttcgtgt cgtgagatgt tagg 24
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tcgctaaagt ccccaccatt 20
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
taagtcctaa aacgaacgca acccctgtc 29
Claims (10)
1.序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的特异性引物对。
2.核苷酸序列如序列表的序列3所示的特异性探针。
3.权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针在制备检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述植原体第V组成员为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。
5.一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒,包括权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由权利要求1所述特异性引物对和权利要求2所述特异性探针组成。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于:所述植原体第V组成员为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。
8.一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法,是提取待测植物样本的基因组DNA作为模板,用权利要求1所述特异性引物和权利要求2所述特异性探针进行实时荧光PCR检测,确定待测植物样本是否含有植原体第V组成员。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:所述植原体第V组成员为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于:所述实时荧光PCR的PCR反应体系中,反应起始时,序列表的序列1所示核苷酸的浓度为0.3mM,序列表的序列2所示核苷酸的浓度为0.9mM,所述特异性探针的浓度为0.2mM;所述实时荧光PCR的参数为:50℃、2min;95℃、5min;95℃、15s,60℃、1min,40个循环。
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