CN101809145B

CN101809145B - 具有nadh依赖性hmf还原酶活性的多肽

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Publication number: CN101809145B
Application number: CN200880109529.XA
Authority: CN
Inventors: B·哈恩哈格达尔; G·李登; T·默迪格; J·阿梅达; B·拉丹; M·F·高娃-格劳斯兰德
Original assignee: C5 Ligno Technologies Lund AB
Current assignee: C5 Ligno Technologies Lund AB
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2028-07-11
Also published as: EP2179036B1; EP2179036A1; CA2694944A1; AU2008283125B2; RU2483107C2; RU2010102991A; CN101809145A; WO2009017441A1; CA2694944C; BRPI0814296A2; US8110387B2; AU2008283125A1; ZA201000628B; US20100267111A1; EP2179036A4

Abstract

本发明涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的分离的多肽，编码所述多肽的核苷酸序列，包含所述多肽或核苷酸序列的载体，包含所述核苷酸序列或载体的宿主，以及所述多肽在木质纤维素材料或者任何含有呋喃或羟基的材料中还原呋喃或羟基化合物的用途。其中所述多肽显示与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列80％的同源性并且其与SEQ IDNO：2的区别在于至少S117L和Y295或S110被取代。

Description

具有NADH依赖性HMF还原酶活性的多肽

发明领域

本发明涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的分离的多肽，编码所述多肽的核苷酸序列，包含所述多肽或核苷酸序列的载体，包含所述核苷酸序列或载体的宿主，以及所述多肽在木质纤维素材料或者任何含有呋喃或羟基的材料中还原呋喃或羟基化合物的用途，其中所述多肽显示与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列80％的同源性，而且所述多肽与SEQ ID NO：2的区别在于：至少S117L和Y295或者S110被取代。

发明背景

通过面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))由可再生原料生产生物乙醇已成为化石燃料的有吸引力的替代。然而，基于淀粉或蔗糖的原料(例如玉米粒或甘蔗)的可用度预计不足以满足未来全世界对生物乙醇的需求(Gray等，2006.Bioethanol.CurrentOpinion Chemical Biology.10(2)：141-146)。一种已被预见的解决方式是使用木质纤维素原料，例如玉米杆、麦秸、甘蔗渣、木头等(Hahn-等，2006.Bioethanol-the fuel of tomorrow fromthe residues of today.Trends Biotechnol.24(12)：549-556)。这要求克服与这些复杂原料的利用相关联的新挑战。

这些挑战之一涉及抑制性化合物的存在，例如在木质纤维素原始材料的预处理和水解过程中被释放的小的脂肪族低分子量酸、呋喃衍生物、羟基化合物和酚醛塑料(Almeida等，2007.Increasedtolerance of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates bySaccharomyces cerevisiae.J Chem Technol Biotechnol，82：340-349)。在这些化合物中，已报导源于己糖脱水的呋喃衍生物5-羟甲基糠醛(HMF)的存在导致木质纤维水解物被酿酒酵母发酵的过程中乙醇产率的减少(Taherzadeh等2000.Physiological effectsof 5-hydroxymethyl furfural on Saccharomyces cerevisiae.ApplMicrobiol Biotechnol.53(6)：701-708)。当以等摩尔的量与糠醛(在水解产物中发现的另一个抑制性呋喃衍生物)相比较时，使用HMF时，体积乙醇产率和细胞的糖消耗速率都更低(Larsson等，1999.Thegeneration of fermentation inhibitors during dilute acidhydrolysis of softwood.Enzyme Microbial Technology24：151-159)。因此，去除HMF和/或改善细胞HMF去毒作用对于基于木质纤维素原料的工业发酵过程是关键的。

WO03072602公开了在位置295具有丝氨酸的多肽。然而，所述多肽在位置117缺乏亮氨酸。

Nilsson等人在Applied and Environmetal Microbiology，Dec2005，vol 71，page 7866-7871中公开了：来自木质纤维素水解产物耐受株TMB3000的细胞抽提物展示出之前未知的NADH-依赖性HMF还原活性，所述活性不存在于较差耐受株CBS 8066中。

开发基于木质纤维素原料的发酵过程的绝对要求是开发和优化耐受上述抑制化合物的微生物或者能够利用/降解所述抑制化合物的菌株。已显示酿酒酵母株将HMF和糠醛分别还原为2，5-二甲醇(2，5-二-羟甲基糠醛)和2-呋喃甲醇(Larsson et al.，1999.The generationof fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis ofsoftwood.Enzyme Microbial Technology 24：151-159)，然而，还原速率低且为菌株依赖性的。菌株TMB3000(Lindén等，1992.Isolation and characterization of acetic acid-tolerantgalactose-fermenting strains of Saccharomyces cerevisiae froma spent sulfite liquor fermentation plant.AppliedEnvironmental Microbiology.58(5)：1661-1669)目前为止似乎是耐受性最强的菌株，其可在未稀释的木头水解产物中生长(Brandberg等，2005.Continuous fermentation of undetoxified dilute acidlignocellulose hydrolysate by Saccharomyces cerevisiae ATCC96581 using cell recirculation.Biotechnology progress，21(4)：1093-1101)。

发明概述

本发明涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的新的多肽的分离，其中所述多肽有还原若干化合物的能力。多肽的实例之一包括来自酿酒酵母的突变的醇脱氢酶(ADH1)，其以天然形式不能还原HMF，当其被突变时能还原HMF。所发明的多肽可被用于数种自木质纤维素材料例如木质纤维素原料而生产散装(bulk)和平台化学品的过程，其中有对HMF或其他呋喃或其衍生物或羟基化合物去毒的需要。生物燃料、散装和平台化学品的实例包括乙醇、丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸)、甘油、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸，3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、及3-羟基丁内酯、脂肪酸、脂肪衍生分子、类异戊二烯、类异戊二烯衍生分子、烷烃、异戊醇、醋酸异戊酯。当使用所述新的多肽时，由于将抑制性呋喃化合物和羟基化合物从培养基中更快地去除，将实现增加的特异性产率(每克细胞和每小时的产物克数)。

本发明的第一个方面涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的分离的多肽，其中所述多肽显示与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列80％的同源性，而且所述多肽与SEQ ID NO：2的区别在于：至少S117L和Y295或者S110被取代。通过向SEQ ID NO：2中引入单一的取代并同时维持L在位置上，获得了改善的多肽，其有效地还原HMF和糠醛。

本发明的第二个方面涉及如上定义的分离的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2的区别在于：至少Y295C或Y295S或Y295T或S110P被取代。

本发明的第三个方面涉及编码如上定义的多肽的核苷酸序列。

本发明的第四个方面涉及包含所述核苷酸序列的载体。

本发明的第五个方面涉及包含所述核苷酸序列或所述载体的宿主细胞。

本发明的第六个方面涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的所述多肽、所述核苷酸序列、所述载体或所述宿主细胞的用于从木质纤维素原料生产散装化学品的用途，例如上述那些。相比于使用天然多肽的情况，通过使用改善的多肽，有了提高的糖消耗速率和生长速率并且当宿主被用于生产乙醇时，有了增加的微生物乙醇生产速率。

通过提供如SEQ ID NO：2中所示的、具有NADH依赖性HMF还原酶活性的新的多肽，将首次有可能使用NADH作为辅助因子还原呋喃化合物或羟基化合物或呋喃衍生物，例如5-羟甲基-2-糠醛(HMF)。已报导HMF在面包酵母(最常用于工业乙醇生产)中减少细胞生长和乙醇产率。当将所述新的分离的多肽加入所述过程中，或将所述新的分离的核苷酸序列转移到将被用于通常存在HMF问题的过程的宿主细胞中时，所述两个问题现在将被减轻或消除。

附图简要说明

图1：有氧条件下，菌株TMB3280(空质粒)(A，B)和TMB3206(突变的ADH1)(C，D)中底物和HMF的消耗以及主要产物的形成。A，C＝未加入HMF；B，D＝加入20mM HMF。符号：◇葡萄糖，○OD₆₂₀，x HMF，■乙醇。

图2：无氧条件下，菌株TMB3280(空质粒)(A，B)和TMB3206(突变的ADH1)(C，D)中底物和HMF的消耗以及主要产物的形成。A，C＝未加入HMF；B，D＝加入20mM HMF。符号：◇葡萄糖，○OD₆₂₀，△HMF，■乙醇。

图3：云杉水解产物的脉冲实验中，对照株TMB3280(A)和过表达来自TMB3000的突变ADH1基因的菌株TMB3206(B)的发酵谱。菌株先在成分明确的培养基中生长，然后在15-20小时后加入云杉水解产物。符号：糠醛(◇)，HMF(△)，葡萄糖(●)，乙醇(▲)，CO2进化速率或CER(-)。

图4：无氧条件下，菌株TMB3290(空质粒)(A)和TMB3291(ADH1-S110P-Y295C)(B)中底物和HMF的消耗以及乙醇的形成。符号：(■)葡萄糖，(▲)木糖，(◇)HMF，(□)乙醇。

发明详述

定义

在本申请和发明的语境中应用下列定义：

术语“核苷酸序列”意指核苷酸序列的三个或更多区域的连续延伸。所述核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、RNA、半合成的或合成的或其混合物。此术语包括DNA或RNA的单链和双链形式。

术语“其类似物”意指SEQ ID NO：2的部分或全部多肽是基于非蛋白氨基酸残基的，例如氨基异丁酸(Aib)，正缬氨酸γ-氨基丁酸(Abu)或鸟氨酸。其他非蛋白氨基酸残基的实例可见http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.h tm。

术语多肽“同源性”被理解为两个序列间的相同程度，其表明第一个序列来自第二个序列。所述同源性可通过本领域已知的计算机程序被适宜地确定，例如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual forthe Wisconsin Package，第8版，August 1994，Genetics ComputerGroup，575 Science Drive，Madison，Wis.，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使用下述用于氨基酸序列比较的设置：GAP制造罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。与同源性确定相关的氨基酸序列部分是成熟多肽。

此处所用术语“载体”指单链或双链的核酸分子，其被分离自天然存在的基因或其以否则不在自然中存在的方式经修饰以含有核酸片段。当所述载体含有表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语载体与术语“表达盒”同义。当构建体被用于将构建体/片段整合入宿主基因组时，术语载体还与术语“整合核酸构建体”或“整合片段”同义。

术语“控制序列”此处被定义为包括所有对于编码本发明的多肽的多核苷酸的表达是必需的或有优势的组件。每种控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。此类控制序列包括，但不限于，多腺苷酸化序列，肽原序列，启动子，及转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子，和转录及翻译终止信号。所述控制序列可连同连接子被提供，用于引入便于所述控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接的特异性限制位点。

此处所用术语“宿主细胞”包括任何可用核酸转化、转染、转换及诸如此类的细胞类型。

在当前语境中，氨基酸名称和原子名称的使用如在蛋白质数据库(PNB)(www.pdb.org)所定义的，其是基于IUPAC命名法(IUPACNomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名称，原子名称等)，Eur J Biochem.，138，9-37(1984)连同其在Eur J Biochem.，152，1(1985)中的更正)。术语“氨基酸”意指来自由下列构成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，组氨酸(His或H)，异亮氨酸(Ile或I)，赖氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，甲硫氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，丝氨酸(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，缬氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)以及酪氨酸(Tyr或Y)，或其衍生物。

用于鉴定氨基酸位置的术语阐明如下：S110表示SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的位置110被丝氨酸残基占据。S110P指位置110处的丝氨酸残基被脯氨酸残基取代。

多肽

本发明涉及具有NADH依赖性HMF还原酶活性的新的多肽，其中所述多肽显示与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列80％的同源性，此同源性至少为81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％，或者所述多肽与SEQ ID NO：2相同。所发明的多肽具有一些独特的性质，因为所述酶使用NADH作为辅助因子用于还原HMF和其它呋喃化合物及羟基化合物，例如在木质纤维素材料处理过程中所产生的那些。

所述分离的多肽的另一个特点是SEQ ID NO：2的位置295或110的氨基酸残基被取代。然而，特定的氨基酸可能被改变，例如通过被替换为另一个氨基酸残基，例如小的不带电的氨基酸残基。实例为Y295C或Y295S或Y295T或S110P。

此外，SEQ ID NO：2所示多肽中氨基酸残基S117应被取代为L。位置295处的氨基酸残基的取代是重要的并且增加糠醛还原酶，而且位置295和110两处氨基酸残基的取代是为了产生乙醇。

SEQ ID NO：2显示了多肽的一个实例，其中氨基酸残基295是C或S，110是P。另一个具体实例是当SEQ ID NO：2的氨基酸残基59是T，210是P，148是E，152是V及295是C或S时。所述多肽具有新的活性，即具有NADH依赖性HMF还原酶活性，其因此能被用于需要对呋喃化合物和羟基化合物解毒的过程。由于将更快地还原呋喃和羟基化合物，其毒性作用减缓整个过程，还将有增加的特异性产率。所述多肽可部分或全部地为合成的，只要保持活性。

所述多肽还可以是杂合多肽。术语“杂合酶”或“杂合多肽”意指例如本发明的多肽，其包含与第二组氨基酸残基相融合/连接的第一组氨基酸序列从而基于对适宜的氨基酸序列(例如连接子、同源氨基酸序列等)的知识产生完全合成的核苷酸序列，所述第一组氨基酸序列包含SEQ ID NO：2中所示的从约110至约295的氨基酸残基。

所发明的多肽克隆自酵母菌株酿酒酵母TMB3000(ATCC96581)，其被显示具有独特的NADH依赖性HMF还原酶活性。在多肽的分析过程中，发现所述多肽与通常不能还原HMF的ADH1多肽相似。在所述多肽中只引入几个突变改变了所述多肽的活性并且令人惊讶地发现所述多肽具有NADH依赖性HMF还原酶活性。然而，所述多肽可得自任何来源或甚至是合成的，只要所述多肽具有所定义的多肽的性质。

核苷酸序列

本发明的另一个目的涉及SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列至少有60，65，70，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％同源性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有NADH依赖性HMF还原酶活性的多肽。所述核苷酸序列可通过标准克隆过程得到，所述标准克隆过程用于遗传工程中将DNA序列从其天然位置重置到其将被复制的不同的位点。所述克隆过程可能涉及包含编码目标多肽的DNA序列的所需DNA片段的切除和分离、将所述片段插入载体分子、及将重组的载体整合入宿主细胞，在宿主细胞内所述DNA序列的多个拷贝或克隆将被复制。分离的DNA序列可以各种方式被处理以用于目标多肽的表达。取决于表达载体，在将DNA序列插入载体前对其的处理可能是需要的或者必需的。利用重组DNA方法修饰DNA序列的技术是本领域公知的。

要引入宿主细胞DNA中的核苷酸序列可被并入如下载体中：其包含可行地连接至一个或多个控制序列的核苷酸序列，所述控制序列在与其相容的条件下，在适宜的宿主细胞中指导编码序列的表达。编码多肽的核苷酸序列可以以多种方式被处理从而用于所述多肽的表达。

所述控制序列可以是适当的启动子序列，被用于核苷酸序列表达的宿主细胞识别的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。所述启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任意核苷酸序列，包括天然的，突变的，截短的和杂合的启动子，以及可以得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞内或细胞外多肽的基因。所述启动子可以是在所用宿主中组成性的或被调控的弱的或强的启动子。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌中转录的合适启动子的实例描述于Scientific American，1980，242：74-94中的“Usefulproteins from recombinant bacteria”；以及Sambrook J等的1989Molecular Cloning：A Laboratory Manuel.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，同上。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例为得自下列基因的启动子：米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂合启动子)，以及其突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可以获得自例如如下基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH1)、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)(Bitter和Egan.Expression ofheterologous genes in Saccharomyces cerevisiae from vectorsutilizing the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genepromoter.(1984)Gene 32：263-274)、酿酒酵母乙醇脱氢酶1(ADH1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK1)或酿酒酵母细胞色素C(CYC1)(Karhumaa等Investigation of limiting metabolic steps in theutilization of xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiaeusing metabolic engineering.(2005)Yeast 5：359-68)。酵母启动子的另一个实例是组成性的截短的HXT7启动子(Hauf等EnzymMicrob Technol(2000)26：688-698)。其它用于在酵母中表达的适宜的载体和启动子被Hitzeman进一步描述于EP A-73,657中，在此将其通过援引而并入。

本发明还涉及如上定义的载体，其可以包含编码所述多肽的DNA序列、启动子、转录和翻译终止信号以及其它DNA序列。所述载体包含本领域技术人员已知的各种DNA及控制序列，这些序列可以被结合到一起形成载体，所述载体可包括一个或多个方便的限制位点以允许在此类位点插入或取代编码所述多肽的DNA序列。备选地，本发明的DNA序列可通过将DNA序列或包含所述序列的DNA构建体插入适当的表达用载体而被表达。在创建所述载体时，编码序列被置于载体中从而使所述编码序列为了表达和可能的分泌与适当的控制序列可行地连接。

所述载体可以是任何载体(例如，质粒、病毒或整合载体)，其可方便地经历重组DNA程序并可以实现DNA序列的表达。载体的选择将通常取决于载体与将载体引入其中的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线形的或闭合环形质粒。所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体、粘粒或人工染色体。所述载体可以含有任何确保自我复制的手段。备选地，所述载体可以是当将其引入宿主细胞时，其被整合入基因组并与其被整合进入的染色体一同被复制的载体。所述载体系统可以是单个载体或质粒或者两个或更多个载体或质粒，他们共同含有将被引入宿主细胞基因组或转位子的全部DNA。所述载体还可以是仅包含待整合的基因或此基因的一部分的整合载体。

本发明的载体优选含有一个或多个可选标志物，此类标志物允许容易地选择被转化的细胞。可选标志物是基因，其产物提供生物杀灭剂或病毒的抗性、对重金属、原养型、自养型生物及诸如此类的抗性。

对于真核宿主而言有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和细胞巨化病毒的控制序列的载体。特别的载体是，例如，pCDNA3.1(+)Hyg(Invitrogen，Carlsbad，Calif.，U.S.A.)和pCI-neo(Stratagene，La Jolla，Calif.，U.S.A.)。对于酵母细胞而言有用的表达载体包括，例如，2μ(微米)质粒及其衍生物、Gietz和Sugino所描述的YIp、YEp和YCp载体(1988，“New yeast vectors constructed with in vitro mutagenized yeastgenes lacking six-base pair restriction sites”，Gene74：527-534)、Mumberg等描述的载体(Mumberg、Muller和Funk，1995，“Yeast vectors for the controlled expression of heterologousproteins in different genetic backgrounds.”Gene 156：419-422)、YEplac-HXT载体(Karhumaa等，2005.Investigation of limitingmetabolic steps in the utilization of xylose by recombinantSaccharomyces cerevisiae using metabolic engineering.Yeast.22(5)：359-68))、POT1载体(U.S.Pat.No.4,931,373)、Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996中描述的pJSO37载体、pPICZ A、B或C载体(Invitrogen)。对昆虫细胞而言有用的载体包括pVL941、pBG311(Cate等，″Isolation of the Bovine and HumanGenes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of theHuman Gene in Animal Cells″，Cell，45，pp.685-98(1986))、pBluebac 4.5和pMelbac(都可得自Invitrogen)。对细菌宿主而言有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒(包括pBR322、pET3a和pET12a，都来自Novagen Inc.，Wis.，U.S.A.)；更广宿主范围的质粒，例如RP4、噬菌体DNAs(例如噬菌体λ(例如NM989)及其它DNA噬菌体(例如M13和丝状单链DNA噬菌体)的众多衍生物)。适宜的病毒载体的实例是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹载体和巨细胞病毒载体。

本发明的载体可以含有此类元素，其允许所述载体稳定地整合入宿主细胞基因组或所述载体独立于细胞基因组在所述细胞内自主复制。当将本发明的载体引入宿主细胞时，其可以被整合到宿主细胞基因组中。对于整合而言，所述载体可以依赖编码目标多肽的DNA序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的载体的任何其它元素。

备选地，所述载体可以含有另外的DNA序列，此DNA序列指导通过同源重组而进入宿主细胞基因组的整合。所述另外的DNA序列使得载体能够在染色体中精确的位置被整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，所述整合元件应优选地含有足够数量的核苷酸，例如100至1500个碱基对，优选地400至1500个碱基对，和最优选地800至1500个碱基对，其与对应的靶序列高度同源以增加同源重组的可能性。所述整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，所述整合元件可以是非编码或编码DNA序列。另一方面，所述载体可以通过非同源重组被整合到宿主细胞基因组中。这些DNA序列可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列，并且，可以是非编码或编码序列。可以将编码目标多肽的多于一个拷贝的DNA序列插入宿主细胞中以扩大所述DNA序列的表达。

分离的宿主细胞

本发明还涉及分离的宿主细胞，其包含如上定义的核苷酸序列，此序列在载体中，例如表达载体，或者备选地此核苷酸序列被整合到基因组中，例如通过同源或异源重组。所述核苷酸序列可以单一拷贝或多个拷贝存在。

宿主细胞可以是任何合适的原核或真核细胞，例如，细菌细胞、丝状真菌细胞、酵母、植物细胞或哺乳动物细胞。任何适宜的宿主细胞都可被用于本发明的载体的维持和生产，例如真核或原核细胞，例如细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物、或其它合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。所述宿主细胞可以是属于经GMP(良好制造规范(Good Manufacturing Practice))鉴定过的细胞系，例如哺乳动物细胞系。

细菌宿主细胞的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、发酵单胞菌属(Zymomonas sp.)的种及克雷伯氏菌属的种(Klebsiellasp.)。

适合的丝状真菌宿主细胞实例包括曲霉菌属的种(Aspergillussp.)(例如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉)、镰刀霉属的种或肉座菌属(Hypocrea)(以前称木霉属(Trichoderma))的种。

适合的酵母宿主细胞的实例包括酵母属的种(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)或卡尔酵母(S.carlsbergensis))、裂殖酵母属的种(Schizosaccharomyces sp.)(例如粟酒裂殖酵母(Sch.pombe))、克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces sp.)(例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)(例如树干毕赤酵母(P.stipitis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或甲醇毕赤酵母(P.methanolica))、汉逊氏酵母属的种(Hansenula sp.)(例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)、假丝酵母属的种(Candida sp.)(例如休哈塔假丝酵母(C.shehatae))或耶氏酵母属的种(Yarrowia sp.)。酿酒酵母菌株的实例是DBY746、AH22、S150-2B、GPY55-15Bα、CEN.PK、USM21、TMB3500、TMB 3400、VTT-A-63015、VTT-A-85068、VTT-c-79093及其衍生物，以及酵母属的种1400、424A(LNH-ST)、259A(LNH-ST)及其衍生物。

适合的昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目昆虫(Lepidoptora)细胞系(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9或Sf21))或粉纹夜蛾(Trichoplusioani)细胞(High Five)(U.S.Par.No.5,077,214)。

适合的哺乳动物宿主细胞实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如CHO-K1、ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))、小鼠细胞(例如NS/O)、幼仓鼠肾(BHK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)、和人细胞(例如HEK 293(ATCC CRL-1573))、以及组织培养中的植物细胞。

所发明的多肽、核苷酸序列、载体或宿主细胞可被用于生产生物燃料、散装和平台化学品，例如包括乙醇、丁醇、乳酸、1，4-二酸(琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸)、甘油、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸、木糖醇、氢气、2，5-呋喃二羧酸，3-羟基丙酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、及3-羟基丁内酯、脂肪酸、脂肪衍生分子、类异戊二烯、类异戊二烯衍生分子、烷烃、异戊醇、醋酸异戊酯。将木质纤维素原料转化为散装化学品(例如乙醇)的过程可以包括下列步骤：例如预处理或分级分离步骤，其中被剁碎的原材料在高温下添加或不添加空气/氧气时，被暴露于中性、酸性或碱性pH，从而使半纤维素部分被部分水解为单体或寡聚糖，使得纤维素级分易被水解；或者其中被剁碎的原材料在高温下被暴露于有机溶剂中(例如丙酮、乙醇、或与之相似的)，从而使木质素级分被溶解并被提取，使得纤维素和半纤维素级分易于被水解。可以用浓缩的或稀释的酸、或用纤维素降解和半纤维素降解酶混合物进行对经预处理和分级分离的材料的水解。

下面的实施例意为阐明本发明，而不是以任何方式、形状或形式明确地或含蓄地限制本发明。

实施例

实施例1

鉴定NADH-依赖性HMF还原酶

NADH-依赖性HMF还原酶的纯化

将工业菌株TMB3000(ATCC96581)(Lindén等，1992，Isolationand characterization of acetic acid-tolerantgalactose-fermenting strains of Saccharomyces cerevisiae froma spent sulfite liquor fermentation plant.AppliedEnvironmental Microbiology 58(5)：1661-1669)培养在丰富培养基中，此丰富培养基含有10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨和补充了10％云杉水解产物的20g/l葡萄糖(Nilvebrant等，2003，Limits foralkaline detoxification of dilute-acid lignocellulosehydrolysates.Applied Biochemistry Biotechnology.105-108：615-628)，pH调整为5.5。将所述水解产物在5000g离心10分钟，且在将上清加入高压灭菌的培养基之前将其注射通过2μ过滤器(Sarstedt，Nümbrecht，德国)。生长在含有250mL培养基的1L摇瓶(无挡板的)中，于200rpm，30℃进行。接种自在丰富培养基(没有水解产物)中OD620为0.1的5ml过夜预培养物，并在24小时后，在OD620约为4时收获细胞。

收获细胞并在将其以1ml/0.6g细胞重悬于Y-PER去污剂(Pierce，Rockford，IL)中之前，用双蒸水将其洗涤两次。在室温下温和摇动50分钟后，将悬浮液以15000g离心20分钟。收集上清并用于酶测定和进一步的纯化步骤。在Bradford测定中使用考马斯蛋白测定试剂(Pierce，Rockford，IL)用于按照制造商的建议确定蛋白浓度。NADH-依赖性呋喃还原的测量依照Wahlbom和Hahn-(2002，Furfural，5-hydroxymethyl furfural，and acetoin act as externalelectron acceptors during anaerobic fermentation of xylose inrecombinant Saccharomyces cerevisiae.Biotechnology andBioengineering.78(2)：172-178)进行，并做了如下修改：NADH浓度设定为200μM。所有测量均在U-2000分光光度计(Hitachi，东京，日本)中于30℃进行。

为了鉴定负责NADH-依赖性HMF还原的酶，根据下列方案使用硫酸铵沉淀、尺寸排阻色谱法和亲和色谱法分级分离蛋白溶液：将细胞提取物(15mL)与10ml饱和硫酸铵溶液混合至终浓度为40％。在于4℃温和摇动1小时之后，将混合物于15000g离心20分钟。将沉淀保存在冰上以备立即使用或者保存于-20℃以备以后使用(称为40％沉淀)，而将上清与等体积的混合得到70％硫酸铵溶液。在于4℃温和摇动3小时后，以15000g重复离心20分钟。沉淀再次保存在冰上或在-20℃(称为70％沉淀)，而使用Spectrum Laboratories，CA，USA的Spectra/Por膜管(MWCO 12kDa-14kDa)在4℃相对于12升蒸馏水过夜透析上清(～40mL)。使用HiLoad 16/60 Superdex 200柱(AmershamPharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典)进行尺寸排阻色谱。缓冲液含有100mM Tris-HCl和0.5M NaCl(用NaOH将pH提升至6.7)，二者均来自Merck，达姆施塔特，德国。使用由LCC-501 Plus控制器控制的FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典)将流速调整至1ml/min。将50ml膨胀的Red Sepharose CL-6B装入XK50柱中，二者均来自Amersham Pharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典。结合缓冲液含有20mM Tris-HCl，pH 6.4，5mM MgCl₂，0.4mM EDTA和2μM β-巯基乙醇。洗脱缓冲液另外含有10mM β-NAD₊(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。使用上述FPLC系统将流速调整至5ml/min。

纯化步骤的结果呈现在表1中。

表1-从酿酒酵母TMB3000纯化NADH-依赖性HMF还原酶。纯化水平被定义为某一步骤的特异性活性与第一步的特异性活性之间的比率。1个单位(U)被定义为在30℃和pH 6.7时每分钟被氧化1μmol的NADH。

步骤	总蛋白(mg)	总活性(单位)	特异性活性(mU/mg蛋白)	产量(％)	纯化水平
						粗提取物	279	65500	235	100	1
硫酸铵沉淀	145	43935	303	67	1.28
						尺寸排阻色谱	2.566	2065	805	3.15	3.4
亲和色谱	0.18	932	5180	1.42	22

纯化的级分使用Tris-HCl 4％-15％梯度预制凝胶和Mini-PROTEAN3电泳设备(二者均来自Bio-Rad(Hercules，CA，USA))进行SDS-PAGE。使用Precision Plus Protein双色(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)作为标准。使用0.25％考马斯亮蓝R-250(ICN Biomedicals，Aurora，OH，USA)，在H₂O∶MeOH∶HAc为6∶3∶1的混合物中进行凝胶染色。所有质谱结果都从瑞典隆德的SWEGENE蛋白质组资源中心获得。

最终纯化的级分在SDS-PAGE上显示出一条对应于分子量为37kDa的带。使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)将所纯化的蛋白鉴定为酿酒酵母乙醇脱氢酶1(Adh1)。

从酿酒酵母TMB3000中克隆ADH1基因

通过PCR从基因组DNA中扩增TMB3000的ADH1基因并将其克隆到携带强的组成性截短的HXT启动子的YEplac-HXT载体中(Hauf等，2000.Simultaneous genomic overexpression of seven glycolyticenzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Enzyme MicrobTechnol，26：688-698)(Karhumaa等，2005.Investigation oflimiting metabolic steps in the utilization of xylose byrecombinant Saccharomyces cerevisiae using metabolicengineering.Yeast.22(5)：359-368)。

更确切地，依照制造商的建议使用Y-DER试剂盒(Pierce，Rockford，IL)提取TMB3000的基因组DNA。为从TMB3000中扩增ADH1基因，使用Pwo DNA聚合酶(Roche Diagnostics AB，Bromma，瑞典)以42℃的退火温度进行PCR。以所有可能的组合使用两种正向和两种反向引物(用于之后的剪切和连接的限制位点被加上下划线)：

正向A-5’-GGGCGGATCCATACAATGTCTATCCCAGAAA-3’，

正向B-5’-GGGGGGATCCATGTCTATCCCAGAAACTC-3’，

反向A-5’-CTTTAGATCTTTATTTAGAAGTGTCAACAACG-3’，

反向B-5’-CTTTAGATCTGCTTATTTAGAAGTGTCAACA-3’。

混合纯化的扩增子并用BamHI和BglII(Fermentas，Vilnius，立陶宛)剪切，然后将其与之前用同样的限制酶剪切并去磷酸化了的质粒YEplac-HXT相连接。将此连接产物用于依照Inoue等的方法(1990，High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids.Gene 96：23-28)转化大肠杆菌DH5α(Life Technologies，Rockville，MD，USA)。在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上选择转化株(Ausubel等，1995.Current protocolsin molecular biology.Wiley，New York)。在数个克隆上进行PCR，从而验证正确的连接，并提取质粒以使用醋酸锂法(Gietz等，1992.Improved method for high efficiency transformation of intactyeast cells.Nucleic Acids Research 20(6)：1425)转化酿酒酵母菌株BY4741 ΔADH1(Invitrogen，Groningen，荷兰)。在含有20mMHMF(Sigma-Aldrich，地点)，400μg/ml Tween 80和10μg/l麦角固醇的SD-ura平板(Ausubel等，1995.Current protocols inmolecular biology.Wiley，New York)上无氧选择转化株。通过在5ml没有尿嘧啶的SD培养基中过夜培养细胞、用双蒸水洗涤及在1ml原生质体溶液(1.2M山梨醇、100mM Tris pH7.5、10mM CaCl₂、4U/ml藤黄节杆菌酶、0.5％β巯基乙醇)中重悬，从显示最高NADH-依赖性HMF还原酶活性的克隆中提取质粒。在30℃摇动30分钟后，收获细胞并用于使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)的质粒提取。将质粒转化入大肠杆菌并在具有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上选择。菌落在5mL含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中进行培养并用于使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)的质粒提取。所产生的质粒被称为YEplac-HXT-ADH1-mut。

使用Abi-Prism BigDye循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)对来自YEPlac-HXT-ADH1-mut的ADH1基因进行测序。通过比较经过测序的来自TMB3000的ADH1基因与天然ADH1基因(在SGD中报导，酵母基因组数据库(SGD)，www.yeastgenome.org，系统名称YOL086C)发现导致氨基酸取代的六处突变(表2)。

表2天然Adh1氨基酸序列与来自TMB3000的突变Adh1的预测序列的比较

实施例2

表达NADH-依赖性还原酶的菌株的体内HMF摄取

在酿酒酵母CEN.PK 113-5D中过表达

编码突变的ADH1基因的质粒YEplac-HXT-ADH1-mut(如实施例1中描述的)，以及对应的空质粒YEplacHXT(Karhumaa等，2005，Investigation of limiting metabolic steps in the utilizationof xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae usingmetabolic engineering.Yeast.22(5)：359-368)被用于转化酿酒酵母CEN.PK 113-5D(SUC2、MAL2-8c、MEL、ura3)，分另产生菌株TMB3206和TMB3280。如同所预期的，NADH-依赖性HMF还原酶活性只在携带突变ADH1基因的菌株中被检测到(数据未显示)。

有氧体内HMF还原

菌株TMB3206和TMB3280在5ml成分明确的培养基(Verduyn等，1992.Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts：acontinuous-culture study on the regulation of respiration andalcoholic fermentation.Yeast，8，501-517)中，于30℃和200rpm过夜预培养。达到OD620nm＝0.1的细胞被用于接种在1L有挡板摇瓶中补充了40g/l葡萄糖的100ml成分明确的培养基。在30℃和200rpm下进行的实验对于两种菌株都在添加和不添加HMF(2g/l)时进行。每2至4小时取样。

通过620nm处的吸光率测量来确定细胞浓度，所述吸光率相对于一式两份的干重测量而被校准。对于干重样品，将10ml细胞悬液通过经预量的Gelman过滤器(Supor-450，0.45μm)进行真空过滤。过滤器用水洗涤并使之干燥。从反应器中有规律地取出用于分析代谢物浓缩物的样品。通过0.2μm过滤器过滤所述样品。于65℃在Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，加州)上测量葡萄糖、乙醇和HMF的浓度。流动相是流速为0.6ml/min的5mM H₂SO₄。除了HMF是使用UV-检测器在210nm处被检测以外，所有化合物都是使用折射率检测器被检测的。

图1显示了代表性的实验结果。当不向培养基中添加HMF时，对于两种菌株而言，葡萄糖消耗、乙醇的形成和生物量的产生是相似的(图1A、1C)。反之，当向培养基中加入HMF时，与对照菌株TMB3280相比，在过表达突变的ADH1基因的菌株TMB3206中观察到显著更高的葡萄糖消耗速率、乙醇和生物量产生速率(图1B、1D)。此实验证实了对于过表达突变的ADH1基因的菌株TMB3206而言，增加的体外NADH-依赖性HMF还原酶活性对应于增加的体内HMF还原速率。

无氧体内HMF还原

在30℃和150rpm下，在1L摇瓶中，将菌株TMB3280(对照)和TMB3206(过表达突变的ADH1基因)的接种体培养物培养24小时，所述摇瓶具有100ml补充了40g/l葡萄糖和200ml/l邻苯二甲酸盐缓冲液(10.2g/L KH邻苯二甲酸盐，2.2g/l KOH)的两次浓缩的成分明确的矿物培养基(如Verduyn等，1992，Effect of benzoicacid on metabolic fluxes in yeasts：a continuous-culture studyon the regulation of respiration and alcoholic fermentation.Yeast 8，501-517中所描述的)。含或不含HMF(2g/l)的同样的成分明确的培养基用于接下来的一批实验中。所述培养基补充了60g/l葡萄糖、麦角固醇(0.075g/l)和Tween 80(0.84g/l)。批次发酵中的起始OD620是0.5。在Braun Biotech发酵罐中，于30℃在1L培养基中进行发酵。通过以0.2升/分钟持续喷射氮气维持无氧条件。用3M KOH维持pH 5.5。搅拌速率为200rpm。

在存在和不存在HMF时，对于两种菌株的代表性实验结果显示在图2中。

当向培养基中添加HMF时，两种菌株均显示了更慢的生长、葡萄糖转化和乙醇生产。然而，与对照菌株TMB3280相比，在过表达突变的ADH1基因的菌株TMB3206中，HMF被转化的更快得多。因此，在TMB3206中，葡萄糖消耗开始得更早且葡萄糖向乙醇、生物量和其他次要产物的完全转化在35小时内完成(图2D)。反之，对照菌株TMB3280达到相似的数据情况用了超过45小时(图2B)。

实施例3

NADH-依赖性HMF还原酶的定点诱变

编码来自TMB3000的经突变的ADH1基因的质粒YEplacHXT-ADH1-mut(如实施例1中所描述的)以及编码来自CEN.PK113-5D的天然ADH1基因的质粒YEPlac-HXT(称为YEplacHXT-ADH1-nat)被用于定点突变从而研究各种氨基酸突变对NADH-依赖性呋喃还原酶活性的影响。

依照下列方案进行定点突变：使用两步PCR来产生带有所选氨基酸变化的ADH1基因。设计了六种引物用于对经突变的ADH1基因在位置110(P110S)、117(S117L)和295(C295Y)处的反向诱变且设计了另外引物用于对天然ADH1基因在位置110(S110P)和295(Y295C)处的诱变(表3)。还制造了两种引物用于ADH1基因(突变的或未突变的)的扩增：带有BamHI位点的ADH1正义引物(5’-GGGGGGATCCATGTCTATCCCAGAAACTC-3’)，和带有BglII位点的ADH1反义引物(5’-CTTTAGATCTTTATTTAGAAGTGTCAACAACG-3’)。对于来自TMB3000的ADH1基因的反向突变，使用质粒YEplacHXT-ADH1-mut作为模板。对于天然ADH1基因的突变，使用质粒YEplacHXT-ADH1-nat作为模板。

表3-用于天然的和经突变的ADH基因的定点诱变的引物

引物名称	序列(5’-3’)	功能
			P110S正义	GTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGC	位置110处的反向突变
P110S反义	GCGTGAGGACAGTTGGATTCGTTACCCAATTCAC	位置110处的反向突变
			S117L正义	CTGTCCTCACGCTGACTTGTCTGGTTACACCCAC	位置117处的反向突变
S117L反义	GTGGGTGTAACCAGACAAGTCAGCGTGAGGACAG	位置117处的反向突变
			C295Y正义	CTCCATTGTTGGTTCTTACGTCGGTAACAGAGCTG	位置295处的反向突变
C295Y反义	CAGCTCTGTTACCGACGTAAGAACCAACAATGGAG	位置295处的反向突变
			S110P正义	GGTAACGAACCCAACTGTC	在位置110处制造突变
S110P反义	GACAGTTGGGTTCGTTACC	在位置110处制造突变
			Y295C正义	TTGGTTCTTGCGTCGGTAAC	在位置295处制造突变
Y295C反义	GTTACCGACGCAAGAACCAA	在位置295处制造突变

在第一轮PCR中，对于每种靶向的突变扩增两种片段：一种片段使用对应于靶向的突变的ADH1正义和反义引物，另一种片段使用对应于靶向的突变的ADH1反义和正义引物。Pwo DNA聚合酶(RocheDiagnostics AB，Bromma，瑞典)用于在下列条件下的扩增：在94℃初始变性5分钟，然后30个循环(由94℃下30秒的变性步骤、55℃下30秒的退火步骤和72℃下1分钟的延长步骤构成)。纯化所述两种扩增的片段，并连同ADH1正义和ADH1反义引物、Pwo DNA聚合酶一起在下列条件下用于第二轮PCR：在94℃初始变性5分钟，然后30个循环(由94℃下30秒的变性步骤、55℃下30秒的退火步骤和72℃下1分钟的延长步骤构成)。纯化所扩增的片段并用BamHI和BglII(Fermentas，Vilnius，立陶宛)剪切。使用T4 DNA连接酶(Fermentas，Vilnius，立陶宛)将被剪切的PCR片段与双剪切的YEplacHXT相连接。依照Inoue等(1990.High efficiencytransformation of Escherichia coli with plasmids.Gene 96：23-28)将连接产物用来转化大肠杆菌DH5α细胞。在带有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上选择转化株并通过限制分析和DNA测序核查正确的突变和序列。顺次进行多次突变。

将携带ADH1基因内单独的或组合的突变的质粒通过依照醋酸锂法(Gietz等，1992，Improved method for high efficiencytransformation of intact yeast cells.Nucleic Acids Research20：1425)的转化引入菌株CEN.PK 113-5D中。在不含尿嘧啶的SD平板上进行选择。所产生的菌株于30℃，在25mL不含尿嘧啶的SD培养基(在250mL带挡板的培养瓶内)中有氧培养。通过在OD₆₂₀ 7.5-8.5时收获细胞、以1mL/0.6gr细胞的Y-PER溶液(Pierce，Rockford，IL，USA)重悬细胞、在室温下摇动50min而制备细胞提取物。以15000g离心20min后收集上清。通过在Hitachi U-2000分光光度计(Hitachi，东京，日本)中跟踪340nm处NADH的氧化来测量体外NADH-依赖性呋喃还原酶活性。所述测定由下列构成：30℃下，10mM糠醛(HMF或糠醛)、200μM NADH和100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.7)中的细胞提取物。结果展示在表4中。

表4-经突变的氨基酸和对应的NADH-依赖性HMF和糠醛体外活性。-无可检测的活性、+可检测的活性(范围从中等的(+)到很高(+++))。

实施例4

用过表达NADH-依赖性HMF还原酶的菌株对木质纤维素水解产物的发酵

在对主要来源于云杉的、未去毒的水解产物的无氧发酵中比较菌株TMB3280(对照)和TMB3206(过表达来自TMB3000的经突变的ADH1基因)，所述发酵在使用硫酸作为催化剂的两阶段稀释-酸水解过程中(Larsson等Development of a Saccharomyces cerevisiae strainwith enhanced resistance to phenolic fermentation inhibitorsin lignocellulose hydrolysates by heterologous expression oflaccase.Appl Environ Microbiol 2001，67：1163-1170)。

通过加入之前用6M NaOH调整为pH 5的单脉冲(pulse)的木质纤维素水解产物进行实验，从而成批指数式地培养细胞。更确切地，细胞于160rpm和30℃在300ml药瓶中预培养24h。预培养液中的液体体积是100ml，伴有15g/l的葡萄糖浓度。用6ml所述预培养物接种并在30℃时，在Belach BR 0.5发酵罐(Belach Bioteknik AB，Solna，瑞典)中进行随后的发酵，且搅拌速度为600rpm。初始的工作体积是300ml且通过加入0.75NaOH使pH保持恒定为5.0。所述发酵罐持续以300ml/min用氮气(含有少于5ppm的氧气)喷射以提供无氧条件，此无氧条件通过质量流量计(Bronkhurst Hi-Tec，Ruurlo，荷兰)被控制。

培养基组分的初始浓度是接种体培养物的2.67倍，从而对稀释进行补偿。通过于30g葡萄糖上在300ml生长培养基中培养细胞开始实验。接下来，当通过OD₆₁₀测量监控的生物量浓度达到大约4g/l时，单一添加300ml水解产物。通过使用CP460气体分析仪(BelachBioteknik AB，Solna，瑞典)测量来自反应器的出气中的二氧化碳和氧气浓度，在线监测二氧化碳的发展速率。使用含有20％氧气和5％二氧化碳的气体来校准气体分析仪。通过610nm处的吸光率测量确定细胞浓度并且通过一式两份的10ml样品测量干重，所述样品经过离心、用蒸馏水洗涤并在105℃干燥24h。用于代谢物测量的样品被立即离心、经过0.2μm过滤器过滤并被储存于-20℃直至分析。于85℃，在Aminex HPX-87P柱上(Bio-Rad，USA)测量葡萄糖、甘露糖、半乳糖、HMF及糠醛的浓度，用超纯水以0.6ml/min洗脱。于60℃，在Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，USA)上测量乙醇浓度。所使用的洗脱液是流速为0.6ml/min的5mM H₂SO₄。除了HMF和糠醛是用UV检测器(210nm)检测的，使用折光率检测器检测化合物。

结果在图3中展示。TMB3206能够在大约5小时内转化糠醛和HMF，而在使用对照菌种TMB3280的实验中，加入水解产物20小时以后，HMF仍存在于培养基中。具有5倍高的HMF摄取速率的TMB3206显示了或多或少恒定的CER(图3B)；而对于对照菌株，CER逐渐减少(图3A)。相比于过表达突变的ADH1基因的TMB3206，对照菌株的特异的乙醇产率也更低。

实施例5

在表达NADH-依赖性HMF还原酶及树干毕赤酵母木糖通路的菌株中改变辅助因子平衡和产物形成

在酿酒酵母TMB3320中的过表达

将编码经突变的ADH1基因的质粒YEplac-HXT-ADH1-S110P-Y295C(如表4中描述的)，以及相应的空质粒YEplacHXT(Karhumaa等，2005，Investigation of limitingmetabolic steps in the utilization of xylose by recombinantSaccharomyces cerevisiae using metabolic engineering.Yeast.22(5)：359-368)用于转化消耗木糖的酿酒酵母菌株TMB3320，分别产生菌株TMB3291和TMB3290。通过用质粒YIplac128-XRXDH转化TMB3043(leu2，ura3)得到TMB 3320，所述质粒YIplac128-XRXDH指导来自树干毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的表达。如同所期待的，NADH-依赖性HMF还原酶的活性只在携带突变的ADH1基因的菌株中被检测到(未显示数据)。

在含HMF的无氧连续培养中辅助因子平衡的改变

在30℃和200rpm下，在具有100ml补充了20g/l葡萄糖的成分明确的培养基的1L摇瓶中(Verduyn等，1992.Effect of benzoicacid on metabolic fluxes in yeasts：a continuous-culture studyon the regulation of respiration and alcoholic fermentation.Yeast，8，501-517)过夜预培养菌株TMB3291和TMB3290。补充了麦角固醇(0.075g/l)和Tween 80(0.84g/l)的同样的成分明确的培养基(含或不含HMF(2g/l))用在随后的连续培养实验中。发酵罐中的起始OD620为0.2。在30℃下，于Belach Biotech发酵罐中在400mL培养基中进行发酵，稀释率为0.06h^-1和0.12h^-1。通过持续以0.2升/分钟喷射氮气而维持无氧条件。搅拌速率为600rpm并用0.75M NaOH维持pH 5.5。

通过一式两份样品的干重测量确定细胞浓度。对于干重样品，5ml细胞悬液通过经预量的Gelman过滤器(Supor-450，0.45μm)进行真空过滤。过滤器用水洗涤并干燥。用于代谢物浓度分析的样品在培养稳态(即在大约5次培养物体积变化后二氧化碳生产为恒定的)时取得。经过0.2μm过滤器过滤样品。于65℃，在Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，California)上分离葡萄糖、木糖、木糖醇、甘油、醋酸、乙醇和HMF的浓缩物。流动相是流速为0.6ml/min的5mM H₂SO₄。除了HMF是使用UV-检测器在210nm处被检测以外，所有化合物都是使用折射率检测器被检测的。

当未向供给-培养基中加入HMF时，对于两种菌株而言，葡萄糖和木糖的消耗以及产物的形成是相似的。反之，当向供给-培养基中加入HMF时，发生了显著变化。对于菌株TMB3291(ADH1-S110P-Y295C)，木糖醇的产量减少了；而对于菌株TMB3290(对照)，其产量增加了。对于菌株ADH1-S110P-Y295C，甘油产量少了50％，而在对照菌株中甘油产量未受影响。此外，在HMF存在时，ADH1-S110P-Y295C菌株的生物量产量增加了。两种菌株的醋酸产量均增加了。在最高的稀释率(0.12h^-1)时，木糖的消耗对于对照菌株减少了50％而在ADH1-S110P-Y295C菌株中未被影响。此外，使用参照菌株时，供给中所加入的HMF的一半仍存在于发酵罐中，但用ADH1-S110P-Y295C菌株时，HMF在发酵罐中被完全转化了。两种菌株的乙醇产量未受添加HMF的影响，且其对于两种菌株是相同的。

所述实验证实了增加的体内NADH-依赖性HMF还原在酿酒酵母菌株中改变辅助因子平衡并因此改变副产物分布。

实施例6

在表达NADH-依赖性HMF还原酶和树干毕赤酵母木糖通路的菌株中改善的乙醇生产

无氧体内HMF还原

于30℃和150rpm，在具有补充了40g/l葡萄糖和200ml/l邻苯二甲酸盐缓冲液(10.2g/L KH邻苯二甲酸盐，2.2g/l KOH)的100ml两次浓缩的成分明确的矿物培养基的1L摇瓶中(如Verduyn等，1992，Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts：a continuous-culture study on the regulation of respiration andalcoholic fermentation.Yeast 8，501-517中所描述的)过夜培养菌株TMB3290(对照)和TMB3291(过表达突变的ADH1-S110P-Y295C基因)的接种体培养物。含或不含HMF(2g/l)的同样的成分明确的培养基用于随后的批次实验。所述培养基补充了20g/l葡萄糖、50g/l木糖、麦角固醇(0.075g/l)和Tween 80(0.84g/l)。批次发酵中的起始OD620是0.5。在Braun Biotech发酵罐中，于30℃在1L培养基中进行发酵。用3M KOH维持pH 5.5。搅拌速率为200rpm。

在HMF存在和不存在时两种菌株的代表性实验结果显示在图4中。

当未向培养基中加入HMF时，两种菌株的葡萄糖和木糖消耗以及产物的形成都是相似的(未显示数据)。当HMF存在时，对照菌株(TMB3290)消耗葡萄糖和木糖比ADH1-S110P-Y295C菌株(TMB3291)更慢(图4)。此外，在发酵结束时，ADH1-S110P-Y295C菌株消耗的木糖是对照菌株的两倍，这导致了更高的乙醇终浓度。此结果支持：在ADH1-S110P-Y295C菌株中HMF转化更快(图4)。

实施例7

ADH1突变体的动力学表征

将携带ADH1基因内单独的或组合的突变的质粒通过依照醋酸锂法(Gietz等，1992，Improved method for high efficiencytransformation of intact yeast cells.Nucleic Acids Research20：1425)的转化引入菌株BY4741中，所述突变是通过定点诱变在实施例3中产生的。在不含尿嘧啶的SD平板上进行选择。所产生的菌株和相对应的突变被总结在表5中。

于30℃，在25mL不含尿嘧啶的SD培养基中(在250mL带挡板的摇瓶中)有氧培养细胞。通过在OD620 7.5-8.5收获细胞、在Y-PER溶液(Pierce，Rockford，IL，USA)中以1mL/0.6gr细胞重悬细胞、在室温摇动50分钟来制备细胞提取物。以15000g离心20min后收集上清。

通过在Hitachi U-2000分光光度计(Hitachi，东京，日本)中跟踪340nm处NADH的氧化，测量体外NADH-依赖性呋喃还原酶活性。用200μM NADH确定NADH-依赖性醛的还原(Wahlbom和Hahn-2002)。确定了乙醛(范围500μM-100mM)、糠醛(100μM-20mM)和HMF(500μM-20mM)的还原动力学。对于天然Adh1，使用糠醛多至40mM。

根据加入了底物抑制常数的Michaelis-Menten方程式进行建模：V＝(Vmax·[S])/(Km+[S]+[S]2/KI)，V-速度，Vmax-最大速度，Km-亲合力常数，Ki-底物抑制常数，及[S]-底物浓度。参数值的估算是根据最小二乘法，且使用Excel 2002中的解算器功能。由于底物抑制模型与实际数据的明显不符，不带底物抑制常数而估算菌株BY474-ADH1-S117L的HMF活性参数。

结果被总结在表6中。不同突变体的改善的Km和Vmax值清楚地说明了突变Y295C对于HMF和糠醛还原的重要性。对菌株BY474-ADH1-S117L和BY4741-ADH1-110P-L117S-295C的动力学参数的比较显示了位置117处的L是有益的，因为它显著地增加针对两种糠醛的活性。

表5在不同Adh1变体中，菌株和氨基酸的区别

表6五种Adh1变体针对不同底物的酶动力学。用过表达各自ORF的ΔAdh1菌株(BY4741)的细胞提取物建立动力学参数

*[S]_Vmax-在观察到的V_max(obsV_max，mU/mg)处的底物浓度(mM)

**V_max和K_m值源自没有底物抑制因子的模型。详细内容参见正文

n.d.-未被检测到

序列表

<110>Hahn AB

<120>多肽

<130>P07919PC00

<160>2

<170>PatentIn版本3.4

<210>1

<211>1047

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>1

atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60

tacaaagata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaaatac 120

tctggtgtct gtcacactga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccaactaag 180

ttaccattag ctggtgggca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240

aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300

tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactc ctctggttac 360

acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420

cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcc ccagtcttgt gtgctggtat caccgtctac 480

aaggctttga agtctgctaa cttgatggcc ggtcactggg ttgctatctc cggtgctgct 540

ggtggtctag gttctttggc tgttcaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600

attgacggtg gtgaaggtaa ggaagaatta ttcagatcca tcggtggtga agtcttcatt 660

gacttcacta aggaaaagga cattgtcggt gctgttctaa aggccactga cggtggtgct 720

cacggtgtca tcaacgtttc tgtttccgaa gccgctattg aagcttctac cagatacgtt 780

agagctaacg gtaccaccgt tttggtcggt atgccagctg gtgccaagtg ttgttctgat 840

gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctcc attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900

gacaccagag aagctttgga cttcttcgcc agaggtttgg tcaagtctcc aatcaaggtt 960

gtcggcttgt ctaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020

agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047

<210>2

<211>348

<212>PRT

<213>酿酒酵母

<400>2

Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His

1 5 10 15

Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn

20 25 30

Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu

35 40 45

His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Ala

50 55 60

Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val

65 70 75 80

Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys

100 105 110

Pro His Ala Asp Ser Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln

115 120 125

Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr

130 135 140

Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr

145 150 155 160

Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile

165 170 175

Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys

180 185 190

Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu

195 200 205

Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys

210 215 220

Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala

225 230 235 240

His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser

245 250 255

Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro

260 265 270

Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser

275 280 285

Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu

290 295 300

Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val

305 310 315 320

Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly

325 330 335

Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys

340 345

Claims

1.具有NADH依赖性HMF还原酶活性的分离的多肽，其中所述多肽显示与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％的同源性并且其与SEQID NO：2的区别在于至少S117L和Y295C被取代。

2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2的区别在于S117L和Y295C和S110P被取代。

3.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽具有与SBQ ID NO：2至少98％的同源性。

4.权利要求3的分离的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2至少99％的同源性。

5.编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列。

6.包含如权利要求5中所定义的核苷酸序列的载体。

7.包含如权利要求5中所定义的核苷酸序列或如权利要求6中所定义的载体的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自真核和原核细胞。

9.权利要求8的宿主细胞，其中所述细胞选自细菌和真菌。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述细菌选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属的种和运动发酵单胞菌且所述真菌是丝状真菌。

11.权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞选自酵母。

12.权利要求11的宿主细胞，其中所述酵母细胞选自酵母属的种、裂殖酵母属的种、克鲁维酵母属的种、毕赤酵母属的种、汉逊氏酵母属的种、念珠菌属的种和耶氏酵母属的种。

13.权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自酿酒酵母、贝酵母和卡尔酵母。

14.权利要求1-4中任一项的具有NADH依赖性HMF还原酶活性的多肽、权利要求5的核苷酸序列、权利要求6的载体或权利要求7-13中任一项的宿主细胞在生产来自木质纤维素原料和含呋喃材料的散装化学品中的用途。

15.权利要求14的用途，其中所述散装化学品选自乙醇、丁醇、乳酸、琥珀酸、甘油、甘露醇、L-抗坏血酸、木糖醇和氢气。