CN101805707A - 利用淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌及其生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物絮凝剂ZS-7。本发明利用分离出一株高效絮凝剂产生菌X14(Bacillus licheniformis，CCTCC AB 208260)；该菌株以高浓度淀粉废水作为替代培养基合成絮凝剂，经培养条件优化，培养工艺如下：COD浓度为8g/l的淀粉废水，外加缓冲盐为3g/L的K2HPO4和1g/L的KH2PO4，培养基初始的pH值为7.5，培养基在115℃灭菌30min后，接种量采用1％，温度采用37℃，摇床转速采用变速控制(140-160r/min)培养48h后的发酵液经过高速离心、浓缩、乙醇沉淀、透析、CPC沉淀和凝胶色谱得到纯化的微生物絮凝剂ZS-7。利用淀粉废水生产微生物絮凝剂，既解决了微生物絮凝剂生产的成本问题，又减少了企业的排污量和处理费用，实现了废水资源化的可行性和高效性。
Description
所属技术领域
本发明涉及水处理、食品生产和发酵等工业中使用的絮凝剂，具体涉及一种微生物絮凝剂。
背景技术
絮凝剂被广泛的应用于工业生产工程包括饮用水处理、废水处理、下游工艺、食品以及发酵工艺等。絮凝剂通常被分成三类：(1)无机絮凝剂如硫酸铝和聚合氯化铝，(2)有机合成高聚合絮凝剂如聚丙烯酰胺衍生物和聚乙烯亚胺，(3)自然存在的絮凝剂如壳聚糖，海藻酸钠和微生物絮凝剂。在这些絮凝剂当中，有机合成高聚合絮凝剂如PAC(聚合氯化铝)和PAM(聚丙烯酰胺)由于絮凝活性高、成本低而被广泛的应用。尽管这些合成絮凝剂被广泛应用，但研究发现铝盐会导致老年痴呆症、聚丙烯酰胺单体对人类具有致癌和强烈的神经毒性，并在自然环境中不能生物降解。相反，微生物絮凝剂是由微生物在生长过程中产生的安全无毒可生物降解的聚合物，其主要成分有糖蛋白、胞外多糖、蛋白质、纤维素和核酸等。由于微生物种类繁多，絮凝剂特性各异，具有很好的开发前景。
但是目前国内外对微生物絮凝剂的研究大多处于实验室研究阶段，还未达到实际应用和工业化生产阶段，制约其发展的关键在于微生物絮凝剂絮凝能力低、用量大且生产成本高。因此，筛选絮凝能力强，又能利用低廉原料作为替代培养基的微生物絮凝剂产生菌，并研究其生产工艺条件是微生物絮凝剂工业化生产过程中急需解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于利用一株高效絮凝剂产生菌，选择高浓度淀粉废水作为替代培养基，同时研究其最佳的产絮凝剂工艺以解决微生物絮凝剂的工业化生产的关键技术问题。
本发明的是通过以下技术方案实现：
一株利用高浓度淀粉废水产生生产微生物絮凝剂的生产菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis X14，CCTCC AB 208260)。利用高浓度淀粉废水生产絮凝剂的生产方法包括种子液的培养，产絮凝剂培养条件优化及絮凝剂的提取。
(1)种子液的培养：经斜面培养的地衣芽胞杆菌接种至经灭菌的种子培养液中，在37℃、160r/min的条件下培养18-24小时，至细菌浓度约为0.5-1×107CFU/ml；
(2)产絮凝剂微生物的培养条件优化：采用pH为7.5，CODcr浓度为8000mg/L的淀粉废水，外加缓冲盐为3g/L的K2HPO4和1g/L的KH2PO4，在115℃高温灭菌30min后，按体积比接种1％的种子液，在温度37℃，摇床转速采用140-160r/min的变速控制的条件下发酵培养48小时；
(3)微生物絮凝剂ZS-7的提取：发酵液在10000r/min离心30分钟，收集上清液，在旋转蒸发仪中浓缩为原来体积的0.2倍并在4℃去离子水中透析过夜，加入三倍体积的无水预冷的乙醇，获得的沉淀重新溶解在去离子水中，再加入10％的氯代十六烷基吡啶，数小时后收集沉淀并将之溶解在0.5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍体积的无水乙醇收集沉淀，并用75％的乙醇冲洗三次，将沉淀溶解于去离子水(0.1％)上柱(Sephacryl S-500 column 1.6×100cm)，以蒸馏水作为流动相(流速为2ml/min)收集活性峰，冷冻干燥得到絮凝剂纯品ZS-7。
下面结合附图详述本发明。
附图说明
图1菌株X14的显微照片(600×)；
图2X14基于16S rDNA的核苷酸序列的系统进化树
图3接种量对絮凝率的影响
图4pH值对絮凝率的影响
图5温度对絮凝率的影响
1、絮凝剂产生菌的分离及特征
絮凝菌X14是采用常规方法从中山大学校园土壤中筛选到的一种絮凝剂高产菌，其产生的胞外高聚物具有极好的脱水除浊能力。该菌株在牛肉膏蛋白胨的培养基菌落乳白色，椭圆形，粘稠，大小为(1.6-3)μm×(0.6-0.8)μm(图1)。革兰氏染色呈阳性，有芽胞，好氧或兼性厌氧，能利用葡萄糖产酸产气，接触酶阳性，水解淀粉。利用通用引物27F和1522R对提取到的X14菌株的DNA样品进行扩增，将得到的16S rDNA的测序结果提交到GenBank，登录号为EU717842。Blastn同源性检测结果表明，该菌株的16S rDNA与Bacilluslicheniformis DSM 13T的相似性最大，达到99％(图2)。综合以上形态学、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析鉴定结果可以认为菌株X14为地衣芽胞杆菌，将其命名为Bacillus licheniformis X14。该菌株已经提交到中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC AB 208260。
2、絮凝剂的生产方法
(1)种子液培养基及种子液培养
种子培养基为葡萄糖20g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 5g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L，MgSO4 0.2g/L，蒸馏水1L，pH7.5-8.0，115℃灭菌30分钟。于新鲜的X14培养斜面上挑取少许菌落，接种于种子培养基中，于温度37℃、160r/min的条件下培养18-24小时，至细菌浓度约为0.5-1×107CFU/ml。将此培养液作为X14产絮凝剂接种时的种子液。
(2)替代培养基(淀粉废水)的制备
淀粉废水是食品行业中一种最常见的一种废水，含有大量细小的悬浮米糠颗粒和几乎所有的玉米蛋白，回收的固体物质通常被用作动物饲料，但是大部分都是直接排放，没有被充分的利用，造成了严重的环境污染。利用淀粉废水作为替代培养基生产微生物絮凝剂，既解决了微生物絮凝剂生产的成本问题，又减少了企业的排污量和处理费用，实现了废水资源化的可行性和高效性。具有广泛的市场潜力和应用前景。
Bacillus licheniformis X14合成絮凝剂所用的淀粉废水为生产淀粉过程中所产生的废水，为乳白色液体，有恶臭。其CODcr为11200mg/L，BOD5为4580mg/L，SS为825mg/L，氨氮为3542mg/L，pH为5.1。废水预处理：将原废水加热至80℃，沉淀、过滤去渣，备用。考虑到X14产絮凝剂过程中会产生大量的酸，导致培养基严重酸化，影响絮凝剂的合成，所以将培养基的初始pH值调制碱性，并投加3g/L的K2HPO4和1g/L的KH2PO4作为缓冲盐。
(3)最佳培养条件的确定
通过比较微生物絮凝剂生产过程中的影响因素如：废水的浓度、接种量(图3)、pH(图4)、温度(图5)、摇床转速等，得到微生物絮凝剂生产的最佳条件如下：淀粉废水的浓度采用CODcr为8000mg/L，培养基的初始pH设为7.5，按体积比接种量为1％，培养温度为37℃，摇床转速采用140-160r/min的变速控制的条件下发酵培养48小时。
3、絮凝剂的提取
发酵液在10000r/min离心30分钟，收集上清液，在旋转蒸发仪中浓缩为原来体积的0.2倍并在4℃去离子水中透析过夜，加入三倍体积的无水预冷的乙醇，获得的沉淀重新溶解在去离子水中，再加入10％的氯代十六烷基吡啶，数小时后收集沉淀并将之溶解在0.5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍体积的无水乙醇收集沉淀，并用75％的乙醇冲洗三次，将沉淀溶解于去离子水(0.1％)上柱(Sephacryl S-500column 1.6×100cm)，以蒸馏水作为流动相(流速为2ml/min)收集活性峰，冷冻干燥得到絮凝剂纯品ZS-7。该絮凝剂经鉴定为糖蛋白类物质，其化学性质稳定，能耐酸耐碱耐高温，具有极好的絮凝活性。当投加量为2mg/L时，对0.4％的高岭土悬浊液絮凝率达到96％以上，对印染废水、造纸废水、碳素墨水等具有很好的脱色除浊效果。
用本发明筛选出的用高浓度淀粉废水作为廉价的替代培养基生产微生物絮凝剂，不仅解决了微生物絮凝剂生产的成本问题，实现了微生物絮凝剂的大规模工业化生产；而且还减少了企业的排污量和处理费用，实现了废水资源化的可行性和高效性。具有广泛的市场潜力和应用前景。
具体实施方式
从菌株X14的保藏斜面上挑取少许菌落，接种于装有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃、160r/min的条件下培养24小时，至细菌浓度约为1×107CFU/ml。将此培养液作为X14产絮凝剂接种时的种子液。
调节淀粉废水的CODcr浓度为8000mg/L，在高温高压下(0.1MPa，115℃)灭菌30min。
将灭菌后的淀粉废水的pH值调为7.5，按体积比接种量为1％，培养温度为37℃，摇床转速采用140-160r/min的变速控制的条件下发酵培养48小时。
发酵液在10000r/min离心30分钟，收集上清液，在旋转蒸发仪中浓缩为原来体积的0.2倍并在4℃去离子水中透析过夜，加入三倍体积的无水预冷的乙醇，获得的沉淀重新溶解在去离子水中，再加入10％的氯代十六烷基吡啶，数小时后收集沉淀并将之溶解在0.5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍体积的无水乙醇收集沉淀，并用75％的乙醇冲洗三次，将沉淀溶解于去离子水(0.1％)上柱(Sephacryl S-500 column 1.6×100cm)，以蒸馏水作为流动相(流速为2ml/min)收集活性峰，冷冻干燥得到絮凝剂纯品ZS-7。
Claims (2)
1.一株微生物絮凝剂产生菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis X14CCTCC AB 208260)。
2.一种如权利要求1所述的生产微生物絮凝剂的生产方法，包括菌种的筛选和鉴定、培养条件的优化以及絮凝剂的提取，本发明的特征在于：
(1)种子液的培养：经斜面培养的地衣芽胞杆菌接种至经灭菌的种子培养液中，在37℃、160r/min的条件下培养18-24小时，至细菌浓度至0.5-1×107CFU/ml；
(2)产絮凝剂微生物的培养条件优化：采用pH为7.5，CODcr浓度为8000mg/L的淀粉废水，外加缓冲盐为3g/L的K2HPO4和1g/L的KH2PO4，在115℃高温灭菌30min后，按体积比接种1％的种子液，在温度37℃，摇床转速采用140-160r/min的变速控制的条件下发酵培养48小时；
(3)微生物絮凝剂ZS-7的提取：发酵液在10000r/min离心30分钟，收集上清液，在旋转蒸发仪中浓缩为原来体积的0.2倍并在4℃去离子水中透析过夜，加入三倍体积的无水预冷的乙醇，获得的沉淀重新溶解在去离子水中，再加入10％的氯代十六烷基吡啶，数小时后收集沉淀并将之溶解在0.5mol/L的NaCl溶液中，再加入三倍体积的无水乙醇收集沉淀，并用75％的乙醇冲洗三次，将沉淀溶解于去离子水(0.1％)上柱(Sephacryl S-500 column 1.6×100cm)，以蒸馏水作为流动相(流速为2ml/min)收集活性峰，冷冻干燥得到絮凝剂纯品ZS-7。
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