CN112125383B - 一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents

一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物絮凝剂的制备方法，具体涉及一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法。所述方法包括：培养地衣芽孢杆菌种子液；将种子液接入糯米加工废水发酵培养基，发酵培养；将发酵液进行离心，收集上清；向上清液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物并溶于水中，用透析袋透析；向透析后的溶液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物，即得。本发明所用地衣芽孢杆菌SPW‑1对糯米加工废水利用度高，利用糯米加工废水发酵培养基发酵培养，所得生物絮凝剂产量可达8.62g/L，最高絮凝活性为1886.57U/mL。

Description

一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及生物絮凝剂的制备方法，具体涉及一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法。
背景技术
糯米粉是一种深受我国大部分消费者喜爱的一种传统食品，它以柔软、韧滑、香糯而著称，具有天然的米香味和爽滑的口感，可以用来制作汤圆及麻团之类的食品和小吃。糯米含有蛋白质、脂肪、糖类、维生素B1、维生素B2、钙、磷、铁等营养元素，具备营养丰富的特点，且糯米蛋白具有低过敏性，可以用于婴幼儿配方食品，因此近年来对糯米粉的需求量逐年增加。传统的糯米粉多是靠手工制备，劳动强度大，为满足日益增长的市场需求，机械化生产糯米粉应运而生。
糯米粉生产首先要对糯米进行清洗和浸泡，清洗及浸泡过后会产生大量的洗米废水，洗米废水中主要成分有碎米、糠皮、淀粉、蛋白质、维生素及微量元素等物质，如果洗米废水不进行处理直接排放，洗米废水会形成污水的COD、BOD和悬浮物SS，对环境会造成严重污染，因此必须对糯米加工废水进行处理。
传统上主要利用絮凝法和生物处理法对糯米加工废水进行处理，即首先以絮凝法进行预处理降低有机物浓度，再利用厌氧与好氧相结合的生物处理工艺对难降解有机物进行降解，并利用生物脱氮除磷工艺去除氮磷等无机营养物。
现有处理方法步骤复杂，成本高，且传统的絮凝方法和生化法都无法将废水中的这些资源进行回收利用。这不仅造成资源的浪费，还加重了后续处理底泥的负担。如果能对废水中的资源加以综合利用，那么不仅节约资源创造出新的经济价值，还能大大降低废水的有机物浓度，降低后续处理负担。因此，推进糯米加工废水的资源化利用是十分有必要的。
发明内容
本发明主要目的是提供一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，所述方法能够有效利用糯米加工废水不仅制备得到高产量、高活性的絮凝剂，而且实现了对糯米加工废水的净化，取得了较好的经济效益和社会效益。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，所述方法包括：培养地衣芽孢杆菌种子液；将种子液接入糯米加工废水发酵培养基，发酵培养；将发酵液进行离心，收集上清；向上清液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物并溶于水中，用透析袋透析；向透析后的溶液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物，即得。
优选地，所用地衣芽孢杆菌杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2020298，保藏时间为2020年07月09日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
优选地，培养种子液所用种子培养基包括以下成分及其含量：葡萄糖5～15g/L、酵母膏0.5～2g/L、尿素0.5～2g/L、KH2PO4 0.1～0.5g/L、K2HPO4 0.1～0.5g/L、MgSO4 0.1～0.5g/L、NaCl 0.1～0.5g/L；pH值为7.0～8.0；
优选地，种子液培养条件为25～40℃下200rpm培养12～24h。
优选地，糯米加工废水发酵培养基包括以下成分及其含量：葡萄糖5～15g/L、尿素0.5～2.0g/L、酵母膏0.2～1.0g/L，用糯米加工废水溶解，发酵培养基pH值为7.0～8.0。
优选地，种子液接入量为糯米加工废水发酵培养基体积的2％～6％。
优选地，发酵培养条件为25～40℃下200rpm培养36～56h。
优选地，离心条件为4000～6000rpm离心10～20min；所用乙醇为无水乙醇，加入量为上清液或透析后溶液体积的2～4倍；透析条件为：6000～8000Da的透析袋于4℃下透析8～12h。
本发明还提供以上任一项所述方法制备得到的生物絮凝剂。
优选地，所述生物絮凝剂其分子量＞6000Da。
与现有技术相比，本发明具有的优势：
1)本发明方法一方面以糯米加工废水为主要原料，通过地衣芽孢杆菌发酵制备得到生物絮凝剂，所得絮凝剂产量高，絮凝活性强，取得了较好的经济效益，另一方面还同时实现了对糯米加工废水的有效净化，从而大大降低对糯米加工废水净化处理的成本。
2)本发明所用地衣芽孢杆菌SPW-1对糯米加工废水利用度高，利用糯米加工废水发酵培养基发酵培养，所得生物絮凝剂产量可达8.62g/L，最高絮凝活性为1886.57U/mL；另外，地衣芽孢杆菌SPW-1可直接利用糯米加工废水发酵培养基进行发酵，无需对培养基进行灭菌处理。
3)本发明所用发酵基成分简单，仅需向糯米加工废水中加入少量葡萄糖、酵母膏、尿素三种营养成分，大大减少了生产成本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
所述糯米加工废水取自河南黄国粮业股份有限公司糯米粉生产废水，主要污染物COD、BOD5、SS、氨氮的浓度分别为5600mg/L、2000mg/L、1500mg/L、60g/L。
实施例1
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1的筛选及鉴定方法：
富集培养：取厦门市沙坡尾避风港海滩淤泥样品加入到灭菌处理后的糯米加工废水中于30℃、200rpm条件下富集培养48h，所得菌液经稀释涂布于固体筛选培养基中，于30℃下培养48h。
固体筛选培养基组成：葡萄糖10g/L、尿素0.5g/L、酵母膏0.5g/L、KH2PO4 0.1g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.2g/L、NaCl 0.1g/L，琼脂15～20g/L，pH 7.2，115℃灭菌30min。
初筛方法：挑取固体筛选培养基中生长快、透明圈大且有粘性的菌落接入发酵培养基中，于30℃、200rpm条件下培养48h，所得发酵液进行絮凝活性的判定，判定方法如下：将体积约40ml的5g/L高岭土悬浊液加入具有塞子的50ml的刻度试管中，然后再依次加入2.5ml的10g/LCaCl2溶液和1ml的待测发酵液，用水补齐至50ml，轻微振荡使其混匀，静置，于光线充足之处观测其是否发生大颗粒迅速凝聚、沉降现象，如有则判定该发酵液具备絮凝活性，将具备絮凝活性的样品留作复筛。
发酵培养基组成：葡萄糖10g/L、尿素1g/L、酵母膏1g/L、K2HPO4 0.1g/L、KH2PO40.1g/L、MgSO4 0.2g/L、NaCl 0.1，pH 7.2，115℃灭菌30min。
复筛方法：将初筛所得具有絮凝活性的样品进一步划线分离得到单菌落；挑取单菌落再次接种于发酵培养基中，于30℃、200rpm条件下培养48h；所得发酵液进行絮凝活性的测定，将絮凝活性较好的样品转接平板培养基进行培养；重复上述步骤2～3次，最终获得一株絮凝活性较好且稳定的菌株，于甘油管中保藏。
絮凝活性的测定：称取40mL高岭土溶液(10g/L)于50mL比色管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液(10g/L)及1mL待测液，加去离子水至50mL刻度线，充分混合，迅速置于比色皿中，静置5min后，于550nm下测定其吸光度。以空白发酵培养基作空白测定。计算公式如下：式中，A：待测样品的OD550值，B：去离子水的OD550值，C：发酵液稀释倍数。
复筛后共得到四株絮凝剂合成能力较强的菌株，分别为SPW-1、SPW-2、SPW-3、SPW-4，其絮凝活性分别为683.25U/mL、603.45U/mL、505.26U/mL、486.73U/mL，进一步考察这四株菌利用糯米加工废水发酵培养基合成絮凝剂的能力，发现SPW-1能很有效利用糯米加工废水促进其絮凝剂的合成，絮凝活性高达1800U/mL以上，而SPW-2、SPW-3及SPW-4利用糯米加工废水合成絮凝剂的效果较差，因此进一步对SPW-1菌株进行三次传代培养，并利用糯米加工废水发酵培养基培养，其絮凝活性依次为：1882.95U/mL、1879.28U/mL、1885.44U/mL，能保持相对稳定，证明该菌株具有较好的稳定性。
对筛选所得菌株进行16S rDNA及生理生化特征鉴定，根据16S rDNA及生理生化特征鉴定结果，最终确定筛得菌株为地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)SPW-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2020298，保藏时间为2020年07月09日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
实施例2
利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，所述方法包括：
1)将甘油管中保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1菌种接入种子培养基中培养37℃下200rpm培养12h，然后接入斜面培养基中继续培养；
所述种子培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl 0.5g/L，用去离子水溶解，pH 7.0～8.0；115℃灭菌30min。
所述斜面培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl 0.5g/L，琼脂1.5g/L，pH 7.0～8.0。
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，37℃下200rpm培养12h，取种子液按接种量4％(v/v)接入糯米加工废水发酵培养基培养37℃下200rpm培养48h，得发酵液；
所述糯米加工废水发酵培养基：葡萄糖10g、尿素2.0g、酵母膏1.0g，用糯米加工废水定容至1L，pH 7.0～8.0，115℃灭菌30min。
3)将发酵液5000rpm离心15min，除去菌体，收集上清液，在上清液中加入体积倍数为4倍的无水乙醇，于4℃冰箱静置12h后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用6000Da的透析袋于4℃下透析12h，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
所得生物絮凝剂产量为8.62g/L，絮凝活性为1886.57U/mL。
实施例3
利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，所述方法包括：
1)将甘油管中保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1菌种接入种子培养基中培养37℃下200rpm培养12h，然后接入斜面培养基中继续培养；
所述种子培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO40.4g/L、NaCl 0.5g/L，用去离子水溶解，pH 7.0～8.0；115℃灭菌30min。
所述斜面培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl0.5g/L，琼脂1.5g/L，pH 7.0～8.0。
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，37℃下200rpm培养12h，取种子液按接种量4％(v/v)接入未经灭菌的糯米加工废水发酵培养基中培养37℃下200rpm培养48h，得发酵液；
所述糯米加工废水发酵培养基：葡萄糖10g、尿素2.0g、酵母膏1.0g，用糯米加工废水定容至1L，pH 7.0～8.0。
3)将发酵液5000rpm离心15min，除去菌体，收集上清液，在上清液中加入体积倍数为4倍的无水乙醇，于4℃冰箱静置12h后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用8000Da的透析袋于4℃下透析12h，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
所得生物絮凝剂产量为7.46g/L，絮凝活性为1466.32U/mL。
实施例4
利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，所述方法包括：
1)将甘油管中保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1菌种接入种子培养基中培养37℃下200rpm培养12h，然后接入斜面培养基中继续培养；
所述种子培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO40.4g/L、NaCl 0.5g/L，用去离子水溶解，pH 7.0～8.0；115℃灭菌30min。
所述斜面培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl 0.5g/L，琼脂1.5g/L，pH 7.0～8.0。
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，37℃下200rpm培养12h，取种子液按接种量4％(v/v)接入糯米加工废水发酵培养基培养37℃下200rpm培养48h，得发酵液；
所述糯米加工废水发酵培养基：葡萄糖10g、尿素2.0g、酵母膏1.0g，用糯米加工废水定容至1L，pH 7.0～8.0,115℃灭菌30min。
3)将发酵液5000rpm离心15min，除去菌体，收集上清液，在上清液中加入体积倍数为4倍的无水乙醇，于4℃冰箱静置12h后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用8000Da的透析袋于4℃下透析12h，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
所得生物絮凝剂产量为8.02g/L，絮凝活性为1802.56U/mL。
对比例
1)将甘油管中保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SPW-1菌种接入种子培养基中培养37℃下200rpm培养12h，然后接入斜面培养基中继续培养；
所述种子培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl 0.5g/L，用去离子水溶解，pH 7.0～8.0；115℃灭菌30min。
所述斜面培养基的组成可为：葡萄糖10g/L、酵母膏1.5g/L、尿素1.0g/L、KH2PO40.3g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.4g/L、NaCl 0.5g/L，琼脂1.5g/L，pH 7.0～8.0。
2)将新鲜斜面上的菌落接于种子培养基中培养，37℃下200rpm培养12h，取种子液按接种量4％(v/v)接入糯米加工废水发酵培养基培养37℃下200rpm培养48h，得发酵液；
所述糯米加工废水发酵培养基：葡萄糖10g、尿素2.0g、酵母膏1.0g，用去离子水定容至1L，pH 7.0～8.0,115℃灭菌30min。
3)将发酵液5000rpm离心15min，除去菌体，收集上清液，在上清液中加入体积倍数为4倍的无水乙醇，于4℃冰箱静置12h后进行第二次离心，除去上清液，将沉淀物溶于水中，用6000Da的透析袋于4℃下透析12h，向透析后的溶液中加入无水乙醇，静置后进行第三次离心，收集最终沉淀物，干燥后即得到生物絮凝剂纯品。
所得生物絮凝剂产量为3.88g/L，絮凝活性为919.91U/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种利用糯米加工废水制备生物絮凝剂的方法，其特征在于，所述方法包括：培养地衣芽孢杆菌种子液；将种子液接入糯米加工废水发酵培养基，发酵培养；将发酵液进行离心，收集上清；向上清液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物并溶于水中，用透析袋透析；向透析后的溶液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀物，即得；
所用地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌SPW-1(Bacillus licheniformis SPW-1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2020298，保藏时间为2020年07月09日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；
所述糯米加工废水发酵培养基包括以下成分及其含量：葡萄糖5~15g/L、尿素0.5~2.0g/L和酵母膏0.2~1.0g/L，用糯米加工废水溶解，糯米加工废水发酵培养基pH值为7.0~8.0；
所述将发酵液进行离心的条件为4000~6000rpm离心10~20min；向上清液中加入乙醇的步骤中，所述乙醇为无水乙醇，加入量为上清液体积的2~4倍；向透析后的溶液中加入乙醇的步骤中，所述乙醇为无水乙醇，加入量为透析后的溶液的体积的2~4倍；透析条件为：6000~8000Da的透析袋于4℃下透析8~12h。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，培养种子液所用种子培养基包括以下成分及其含量：葡萄糖5~15g/L、酵母膏0.5~2g/L、尿素0.5~2g/L、KH2PO4 0.1~0.5g/L、K2HPO4 0.1~0.5g/L、MgSO4 0.1~0.5g/L和NaCl 0.1~0.5g/L；pH值为7.0~8.0。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，种子液培养条件为25~40℃下200rpm培养12~24h。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，种子液接入量为糯米加工废水发酵培养基体积的2%~6%。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，发酵培养条件为25~40℃下200rpm培养36~56h。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的生物絮凝剂。
7.根据权利要求6所述生物絮凝剂，其特征在于，生物絮凝剂的分子量＞6000Da。
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