CN101805348B - 一种制备去氧鬼臼毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种制备去氧鬼臼毒素的方法。该方法，包括如下步骤：1)将桃耳七原料粉碎成粗粉，进行冷浸、渗漉或回流提取，得到桃耳七提取液；2)浓缩所述步骤1)得到的桃耳七提取液后，得到所述桃耳七提取液的浓缩液，与硅胶混匀、干燥、研细后，装填于色谱柱中；所述色谱柱中已装有柱层析用空白硅胶；3)用洗脱液对所述色谱柱进行洗脱，以与所述色谱柱中空白硅胶柱体积相等的流出液为1个流分，收集含有去养鬼臼毒素的流分，再除去所述含有去氧鬼臼毒素的流分中的洗脱液，用二氯甲烷或三氯甲烷溶解残留物，重结晶，得到所述去氧鬼臼毒素。该方法所得产物纯度大于70％，既适用于实验室小规模制备，也适用于大规模工业生产。

Description

一种制备去氧鬼臼毒素的方法

技术领域

本发明属于原料药品制备领域，涉及一种制备去氧鬼臼毒素的方法。

背景技术

去氧鬼臼毒素为强毒性植物成分，可用于生产抗癌药物或生物农药。目前尚未见高纯度去氧鬼臼毒素销售，所有文献报道的作者所用去氧鬼臼毒素均为研究者均自给自用，制备方法均自我摸索，实验室少量制备，其制备方法较为复杂，且报道内容简略，不易重现，此外，生产成本较高，不利于规模生产。刘发等(刘发，尚天民，傅永丰，华鬼臼化学成分研究，药学学报，1979，14(4)：241-145)用氧化铝柱(径高比为1∶25)从华鬼臼中分离制备了去氧鬼臼毒素，洗脱剂为苯-乙醇，该方法不仅径高比大、洗脱周期长，而且使用了毒性极大的有机溶剂——苯；将子华等(蒋子华，陈泗英.川八角莲的化学成分[J].云南植物研究，1989，11(4)：479-481)用多次硅胶柱层析和重结晶方法从川八角莲中分离制备了去氧鬼臼毒素，文献未报道硅胶用量、径-高比、柱层析次数和洗脱剂组成，该方法的主要不足是需要经多次硅胶柱层析，制备周期长、生产成本高；尚明英等(尚明英，李军，蔡少青等，藏药小叶莲的化学成分研究，中草药，2000，31(8)：569-571)用硅胶柱层析法，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经反复精制(即多次硅胶柱层析)，从小叶莲中分离制备了去氧鬼臼毒素，文献未报道硅胶用量、径-高比、精制次数和洗脱剂比例，该方法的主要不足也是需要经多次硅胶柱层析，制备周期长、生产成本高。

用硅胶柱分离、制备化合物的常规方法是使用径-高比大于1∶10的硅胶柱，空白硅胶用量大，达浸膏量的30倍以上(中国科学院上海药物研究所编著.中草药有效成分提取与分离(第二版).上海科学技术出版社，1983：90-95)，对于桃耳七(亦为桃儿七)药材而言，由于药材的提取浸膏得率为5％～15％，折算成常规硅胶用量应为药材的150％～450％，而且需要经过多次上柱精制，具有生产周期长，溶剂用量大，产品成本高等不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备去氧鬼臼毒素的方法。

本发明提供的制备去氧鬼臼毒素的方法，包括如下步骤：

1)将桃耳七粉碎成桃耳七粉末，进行冷浸、渗漉或回流提取，得到桃耳七提取液；

2)浓缩所述步骤1)得到的桃耳七提取液后，得到所述桃耳七提取液的浓缩液，与硅胶混匀、干燥、研细后，装填于色谱柱中；所述色谱柱中已装有柱层析用空白硅胶；

3)用洗脱液对所述色谱柱进行洗脱，以与所述色谱柱中空白硅胶柱体积相等的流出液为1个流分，收集含有去养鬼臼毒素的流分，再除去所述含有去氧鬼臼毒素的流分中的洗脱液，用二氯甲烷或三氯甲烷溶解残留物，重结晶，得到所述去氧鬼臼毒素。

上述方法的步骤1)中，所述桃耳七粉末的目数为10-60目，优选10-20目；提取步骤中，所用溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

所述步骤2)中，所述硅胶的目数为100目～200目或200目～300目；所述步骤2)所述桃耳七提取液的浓缩液中，每毫升所述桃耳七提取液的浓缩液中含有所述桃耳七原料的干重为2g～10g，优选10g，所述硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的5％～15％，优选10％，所述色谱柱中，所述柱层析用空白硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的10％～40％，优选10-20％；所述色谱柱的径高比为1∶0.5～1∶5，优选1∶2～1∶4；

所述步骤3)中，洗脱液选自下述四种混合液中的任意一种：石油醚与酯类化合物组成的混合液、石油醚与含氯烷烃组成的混合液、己烷与酯类化合物组成的混合液或和已烷与含氯烷烃组成的混合液；所述石油醚为沸程为30～60℃的石油醚或沸程为60～90℃的石油醚，所述己烷为环己烷或正己烷，所述酯类化合物为乙酸乙酯、甲酸乙酯或甲酸丁酯，所述含氯烷烃为二氯甲烷或三氯甲烷。所述石油醚与酯组成的混合液和所述石油醚与含氯烷烃组成的混合液中，所述石油醚的体积百分比为15％～50％，优选25％-40％；所述己烷与酯组成的混合液和已烷与含氯烷烃组成的混合液中，所述己烷的体积百分比为15％～50％，优选25％-40％。所述洗脱液优选为下述三种洗脱液中的任意一种：由沸程为60～90℃的石油醚与甲酸丁酯组成的混合液、由正己烷与二氯甲烷组成的混合液和由环己烷与乙酸乙酯组成的混合液，更优选为下述三种洗脱液中的任意一种：由沸程为60～90℃的石油醚与甲酸丁酯以体积比为65∶35混合的混合液、由正己烷与二氯甲烷以体积比为80∶20混合的混合液和由环己烷与乙酸乙酯以体积比为75∶25混合的混合液。所述重结晶步骤中，溶剂为甲醇或乙醇。在实际操作中，可参照用其他方法制备所得去养鬼臼毒素的色谱图，以确定本方法中洗脱所得流分中是否还有去氧鬼臼毒素，若洗脱所得流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图的特征峰一致，则该流分中含有去氧鬼臼毒素。由于含有去氧鬼臼毒素的流分可能不止一个，可根据实际需要进行取舍。

此外，上述方法的步骤1)中，冷浸法、渗漉法和回流提取法均为常规方法，如所述冷浸法可按照包括如下步骤的方法进行：将所述桃耳七粉末浸泡于溶剂中，滤过，取滤液，将滤渣再浸泡于溶剂中，滤过，取滤液，将所述两次滤过得到的滤液合并，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，每次浸泡时间均为1小时-48小时，浸泡的温度为16℃-35℃；

如所述渗漉法可按照包括如下步骤的方法进行：将所述桃耳七粉末浸润于溶剂后，装入底部装有脱脂棉的渗漉器中，并像所述渗漉器中加入溶剂，使所述渗漉器中的溶剂液面高出所述桃耳七粉末面5厘米-15厘米，放置12小时-48小时后，收集渗漉液，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷；

如所述回流提取法可按照包括如下步骤的方法进行：将所述桃耳七粉末于溶剂中进行回流，回流完毕后滤过，将所述滤过步骤得到的滤渣用溶剂再进行回流，回流完毕后再滤过，合并两次滤过得到的滤液，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

本发明通过缩小硅胶柱的径高比，使用径高比小于等于1∶5的硅胶柱，减少洗脱时间和洗脱液的用量，以达到降低生产成本的目的，且该方法所用空白硅胶用量小(为药材干重的10％～40％)，经过1次上柱后，再进行重结晶，即可得到纯度大于70％的去氧鬼臼毒素。该方法具有生产周期短，溶剂用量小，产品成本低等优点，既适用于实验室小规模制备，也适用于大规模工业生产。

附图说明

图1为去氧鬼臼毒素的紫外吸收图谱。

图2为去氧鬼臼毒素的红外图谱

图3为去氧鬼臼毒素的ESI-MS(+)离子图。

图4为去氧鬼臼毒素的ESI-MS/MS碎片离子图。

图5为去氧鬼臼毒素的¹H-NMR图谱。

图6为去氧鬼臼毒素¹³C-NMR图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1、

1)取桃耳七2kg，粉碎成目数为20目～60目的粗粉后，以甲醇为溶剂，用渗漉法提取，具体方法为：将所述桃耳七粉末置于密封容器中，加入溶剂甲醇，浸润2小时，使桃耳七粉末充分膨胀，分次均匀地装入底部垫有脱脂棉渗漉器中，每次装好后用木棒压紧，装完后在桃耳七粉末上面覆盖纱布并压上重物，打开渗滤器下口开关，再慢慢地从渗漉器上部加入溶剂甲醇，当液体刚开始自下口流出时，关闭开关，并保持上层液面高出桃耳七粉末面5厘米为止，然后加盖放置24小时后，打开下口开关，使渗漉液缓缓流出，收集6L渗漉液，得到桃耳七提取液；

2)将所述步骤1)得到的桃耳七提取液浓缩至200ml，与200目～300目柱层析硅胶200g混匀，干燥，研细后，装填于已填有200g柱层析用空白硅胶的色谱柱中，该硅胶色谱柱的径高比为1∶0.5；

3)用由沸程为60～90℃的石油醚与甲酸丁酯以体积比为65∶35混合的混合液为洗脱液进行洗脱，流速为200ml/小时，以200ml为1个流分，由于最先洗脱出的第1个流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图不一致，表明该流分中不含有去氧鬼臼毒素，而之后洗脱出的流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图一致，表明其中含有去氧鬼臼毒素的特征峰，故弃去最先洗脱出的第1个流分，收集含有去氧鬼臼毒素的第2～第5个流分，于60℃-70℃减压去除洗脱剂后，用三氯甲烷溶解残留物后，用甲醇重结晶，得到白色方晶，经结构检测确认，该白色方晶为纯度为84％的去氧鬼臼毒素，其结构式如式I所示。

(式I)

上述结构检测确认图谱如图1-图6所示，具体数据如下：

白色方晶，mp166～168℃(甲醇)。

UVλ_max ^MeOHnm：293，212；

IRv_Max ^KBrcm^-1：1765(γ-内酯羰基)，1587，1505，1483(苯环)，1225，1123(碳氧键)，926(亚甲二氧基)；

EI-MS(m/z)：819[2M+Na]⁺，438[M+K]⁺，421[M+Na]⁺，416[M+NH₃]⁺，399[M+1]⁺，231；399的MS2碎片离子峰(m/z)：231。

¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ：2.76(3H，m，H-1b，H-2，H-3)，3.08(1H，m，H-1a)，3.74(6H，s，OMe-3′，5′)，3.80(3H，s，OMe-4′)，3.92(1H，m，H-11-β)，4.46(1H，m，H-11-α，)，4.60(1H，brs，H-4)，5.93(2H，d，J＝12.0Hz，OCH₂O)，6.34(2H，s，H-2′，6′)，6.52(1H，s，H-5)，6.67(1H，s，H-8)。

¹³C-NMR(CDCl₃，600Hz)δ：33.1(C-1)，32.7(C-2)，47.2(C-3)，43.7(C-4)，110.5(C-5)，136.7(C-6)，137.0(C-7)，108.5(C-8)，128.3(C-9)，130.6(C-10)，72.1(C-11)，174.9(C-12)，136.3(C-1′)，108.3(C-2′，6′)，152.5(C-3′，5′)，137.0(C-4′)，56.2(OMe-3′，5′)，60.8(OMe-4′)，101.2(OCH₂O)。

实施例2、

1)取桃耳七10kg，粉碎成20目～60目的粗粉后，以乙酸乙酯为溶剂，用冷浸法进行提取，具体方法为：于25℃下，将上述桃耳七粉末浸泡于溶剂乙酸乙酯中24小时后，滤过，取滤液20L，将滤渣再浸泡于溶剂乙酸乙酯中24小时后，滤过，取滤液20L，将所述两次滤过得到的滤液合并，得到桃耳七提取液；

2)将所述步骤1)得到的桃耳七提取液浓缩至1L，与200目～300目的柱层析硅胶1000g混匀，干燥，研细后，装填于已填有2000g柱层析用空白硅胶的色谱柱中，该硅胶色谱柱的径高比为1∶1；

3)用由体积比为80∶20的正己烷与二氯甲烷的混合液为洗脱液进行洗脱，流速为1000ml/小时，以1000ml为1个流分，由于最先洗脱出的第1～2个流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图不一致，表明这2个流分中不含有去氧鬼臼毒素，而之后洗脱出的流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图一致，表明其中含有去氧鬼臼毒素的特征峰，故弃去最先洗脱出的第1～2个流分，收集第3～第7个流分，于60℃-70℃减压去除洗脱剂后，用三氯甲烷溶解残留物后，用乙醇重结晶，得到白色方晶，经结构检测确认，该白色方晶为纯度为80％的去氧鬼臼毒素，其结构式如式I所示。

上述结构检测确认图谱如图1-图6所示，具体数据如下：

白色方晶，mp166～168℃(甲醇)。

UVλ_max ^MeOHnm：293，212；

IRv_max ^KBrcm^-1：1765(γ-内酯羰基)，1587，1505，1483(苯环)，1225，1123(碳氧键)，926(亚甲二氧基)；

EI-MS(m/z)：819[2M+Na]⁺，438[M+K]⁺，421[M+Na]⁺，416[M+NH₃]⁺，399[M+1]⁺，231；399的MS2碎片离子峰(m/z)：231。

¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ：2.76(3H，m，H-1b，H-2，H-3)，3.08(1H，m，H-1a)，3.74(6H，s，OMe-3′，5′)，3.80(3H，s，OMe-4′)，3.92(1H，m，H-11-β)，4.46(1H，m，H-11-α，)，4.60(1H，brs，H-4)，5.93(2H，d，J＝12.0Hz，OCH₂O)，6.34(2H，s，H-2′，6′)，6.52(1H，s，H-5)，6.67(1H，s，H-8)。

¹³C-NMR(CDCl₃，600Hz)δ：33.1(C-1)，32.7(C-2)，47.2(C-3)，43.7(C-4)，110.5(C-5)，136.7(C-6)，137.0(C-7)，108.5(C-8)，128.3(C-9)，130.6(C-10)，72.1(C-11)，174.9(C-12)，136.3(C-1′)，108.3(C-2′，6′)，152.5(C-3′，5′)，137.0(C-4′)，56.2(OMe-3′，5′)，60.8(OMe-4′)，101.2(OCH₂O)。

实施例3、

1)取桃耳七50kg，粉碎成20目～60目的粗粉后，以乙醇为溶剂，用回流提取法进行提取，具体方法为：将所述桃耳七粉末于400L溶剂乙醇中回流2小时，回流完毕后滤过，再将所述滤过步骤得到的滤渣用溶剂乙醇回流2小时，回流完毕后再滤过，合并两次滤过得到的滤液，得到所述桃耳七提取液；

2)将所述步骤1)得到的桃耳七提取液减压浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎成细粉，得桃耳七细粉4.85kg。取所得干浸膏细粉，加甲醇保温提取2次，每次25L。取甲醇提取液，减压浓缩至5L，与200目～300目的柱层析硅胶5kg混匀，干燥，研细后，装填于已填有20kg柱层析硅胶用空白硅胶的色谱柱中，该硅胶色谱柱的径高比为1∶5；

3)用由体积比为75∶25的环己烷与乙酸乙酯混合而得的混合液为洗脱液进行洗脱，流速为5000ml/小时，以5000ml为1个流分，由于最先洗脱出的第1～4个流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图不一致，表明这4个流分中不含有去氧鬼臼毒素，而之后洗脱出的流分的色谱图与作为参照的去氧鬼臼毒素的色谱图一致，表明其中含有去氧鬼臼毒素的特征峰，故弃去最先洗脱的第1～第4个流分，收集第5～第10个流分，于60℃-70℃减压去除洗脱剂后，用三氯甲烷溶解残留物后，用甲醇重结晶，得到白色方晶，经结构检测确认，该白色方晶为纯度为85％的去氧鬼臼毒素，其结构式如式I所示。

上述结构检测确认图谱如图1-图6所示，具体数据如下：

白色方晶，mp166～168℃(甲醇)。

UVλ_max ^MeOHnm：293，212；

IRv_max ^KBrcm^-1：1765(γ-内酯羰基)，1587，1505，1483(苯环)，1225，1123(碳氧键)，926(亚甲二氧基)；

EI-MS(m/z)：819[2M+Na]⁺，438[M+K]⁺，421[M+Na]⁺，416[M+NH₃]⁺，399[M+1]⁺，231；399的MS2碎片离子峰(m/z)：231。

¹H-NMR(CDCl₃，600MHz)δ：2.76(3H，m，H-1b，H-2，H-3)，3.08(1H，m，H-1a)，3.74(6H，s，OMe-3′，5′)，3.80(3H，s，OMe-4′)，3.92(1H，m，H-11-β)，4.46(1H，m，H-11-α，)，4.60(1H，brs，H-4)，5.93(2H，d，J＝12.0Hz，OCH₂O)，6.34(2H，s，H-2′，6′)，6.52(1H，s，H-5)，6.67(1H，s，H-8)。

¹³C-NMR(CDCl₃，600Hz)δ：33.1(C-1)，32.7(C-2)，47.2(C-3)，43.7(C-4)，110.5(C-5)，136.7(C-6)，137.0(C-7)，108.5(C-8)，128.3(C-9)，130.6(C-10)，72.1(C-11)，174.9(C-12)，136.3(C-1′)，108.3(C-2′，6′)，152.5(C-3′，5′)，137.0(C-4′)，56.2(OMe-3′，5′)，60.8(OMe-4′)，101.2(OCH₂O)。

Claims (11)

1.一种制备去氧鬼臼毒素的方法，包括如下步骤：

1)将桃耳七粉碎成桃耳七粉末，进行冷浸、渗漉或回流提取，得到桃耳七提取液；

2)浓缩所述步骤1)得到的桃耳七提取液后，得到所述桃耳七提取液的浓缩液，与硅胶混匀、干燥、研细后，装填于色谱柱中；所述色谱柱中已装有柱层析用空白硅胶；与所述桃耳七提取液的浓缩液混匀所用硅胶与所述柱层析用空白硅胶为同种硅胶；

所述色谱柱中，已装填有柱层析用空白硅胶，所述柱层析用空白硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的10％～40％；所述色谱柱的径高比为1∶0.5～1∶5；

3)用洗脱液对所述色谱柱进行洗脱，以与所述色谱柱中空白硅胶柱体积相等的流出液为1个流分，收集含有去养鬼臼毒素的流分，再除去所述含有去氧鬼臼毒素的流分中的洗脱液，用二氯甲烷或三氯甲烷溶解残留物，重结晶，得到所述去氧鬼臼毒素；

所述步骤3)中，洗脱液选自下述四种混合液中的任意一种：石油醚与酯组成的混合液、石油醚与含氯烷烃组成的混合液、己烷与酯组成的混合液和己烷与含氯烷烃组成的混合液；所述石油醚为沸程为30～60℃的石油醚或沸程为60～90℃的石油醚，所述己烷为环己烷或正己烷，所述酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯或甲酸丁酯，所述含氯烷烃为二氯甲烷或三氯甲烷；所述重结晶步骤中，溶剂为甲醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述桃耳七粉末的目数为10-60目，所述提取步骤中，所用溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述桃耳七粉末的目数为10-20目。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述硅胶的目数为100目～200目或200目～300目。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为下述三种洗脱液中的任意一种：由沸程为60～90℃的石油醚与甲酸丁酯组成的混合液、由正己烷与二氯甲烷组成的混合液和由环己烷与乙酸乙酯组成的混合液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为下述三种洗脱液中的任意一种：由沸程为60～90℃的石油醚与甲酸丁酯以体积比为65∶35混合的混合液、由正己烷与二氯甲烷以体积比为80∶20混合的混合液和由环己烷与乙酸乙酯以体积比为75∶25混合的混合液。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述桃耳七提取液的浓缩液中，每毫升所述桃耳七提取液的浓缩液中含有所述桃耳七原料的干重为2g～10g，所述硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的5％～15％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述桃耳七提取液的浓缩液中，每毫升所述桃耳七提取液的浓缩液中含有所述桃耳七原料的干重为10g，所述硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的10％，所述色谱柱中，已装填有柱层析用空白硅胶，所述柱层析用空白硅胶的用量为所述桃耳七原料干重的10-20％；所述色谱柱的径高比为1∶2～1∶4。

9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述石油醚与酯组成的混合液和所述石油醚与含氯烷烃组成的混合液中，所述石油醚的体积百分比为15％～50％；所述己烷与酯组成的混合液和己烷与含氯烷烃组成的混合液中，所述己烷的体积百分比为15％～50％。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述石油醚与酯组成的混合液和所述石油醚与含氯烷烃组成的混合液中，所述石油醚的体积百分比为25％-40％；所述己烷与酯组成的混合液和己烷与含氯烷烃组成的混合液中，所述己烷的体积百分比为25％-40％。

11.根据权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述冷浸法包括如下步骤：将所述桃耳七粉末浸泡于溶剂中，滤过取滤液，将滤渣再浸泡于溶剂中，滤过取滤液，将所述两次滤过得到的滤液合并，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，每次浸泡时间均为1小时-48小时，浸泡的温度为16℃-35℃；

所述渗漉法包括如下步骤：将所述桃耳七粉末浸润于溶剂后，装入底部装有脱脂棉的渗漉器中，并向所述渗漉器中加入溶剂，使所述渗漉器中的溶剂液面高出所述桃耳七粉末面5厘米-15厘米，放置12小时-48小时后，收集渗漉液，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷；

所述回流提取法包括如下步骤：将所述桃耳七粉末于溶剂中进行回流，回流完毕后滤过，将所述滤过步骤得到的滤渣用溶剂再进行回流，回流完毕后再滤过，合并两次滤过得到的滤液，得到所述桃耳七提取液；所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

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