CN101787081A - 胸腺素α1-胸腺生成素-2基因工程融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本专利涉及一种高效融合蛋白，特征为将胸腺素a1和胸腺生成素-2通过基因工程重组技术连接组成高效的融合蛋白，经表达、纯化出的融合蛋白具有很强的促进伤口愈合的功效。应用本发明得到的融合蛋白，用于创伤与溃疡性肠炎的治疗。

Description

胸腺素α1-胸腺生成素-2基因工程融合蛋白

一.技术领域

本发明涉及基因工程重组融合蛋白领域，其中该基因工程融合蛋白是由胸腺素α1和胸腺生成素-2两部分组成的。本发明还涉及基因工程融合蛋白用于制备治疗动物皮肤组织损伤及消化道损伤疾病的药物的用途。本发明还涉及利用所述基因工程融合蛋白治疗动物皮肤组织损伤和消化道损伤疾病的方法。

二.背景技术

皮肤损伤和消化道损伤是动物的常见疾病，现在主要应用的生物治疗方法主要有应用各种生长因子来治疗，如表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞因子FGF，血小板衍生生长因子PDGF等，虽然目前最常用和有效的是使用EGF，但是一方面，EGF作为治疗皮肤损伤的药物，目前的治愈率还是有限，比如其对II度皮肤创伤的治愈率在40％左右(EGF溶液治疗皮肤II度创伤的药效观察。中国热带医学，2007年第7卷第l期，pp70-71)，有一部分外伤对EGF的反应不敏感，我们称之为难治性外伤。究其原因，最可能的原因是虽然EGF对创面的愈合作用比较明显，但也受到其他因素的影响，如创面的感染，机体的情况等，EGF无明显的抗感染作用，创面感染程度是影响EGF作用的重要因素，可能是因为创面分泌物或坏死组织的存在，使得药物不能直接与创面肉芽组织接触所致(重组人表皮生长因子在创面愈合中的临床应用进展。青海医药杂志，2004年第34卷第11期，pp61-62)。另一方面，对于动物的消化道损伤类疾病的治疗，如溃疡性肠炎，目前的EGF等细胞因子类药物均为外用制剂，无法产生可见的疗效，所以目前这一类疾病还没有有效的药物来控制。

本发明基于上述考虑，在针对皮肤创伤愈合和消化道损伤愈合的治疗上，使用了如下解决方法，使用胸腺素α1和胸腺生成素-2共同作用，其中胸腺素α1是提高机体免疫力，消除感染，并且直接对烧伤等的创伤愈合的作用明显(中国专利，ZL03116180.4，胸腺素α1用于制备烧伤和烫伤药物的用途)，胸腺生成素-2能够进一步提高机体免疫力，与胸腺素α1协同作用共同促进伤口或消化道损伤的愈合，更重要的是本项目使用了注射的给药途径，进一步消除了药物与损伤组织接触有限、给药量粗放的缺点，同时注射给药也使得本品可以到达体内的受损部位，有利于消化道损伤的治疗。

另外，肠炎疾病的发病机理主要是由细菌或者病毒引起的，在发生炎症水肿的同时晚期常常伴有肠道壁损伤，甚至消化道溃疡、出血，导致休克。本发明中的基因工程融合蛋白中的胸腺素α1能够起到加速修复肠壁的作用，其通过促进受损消化道的修复，从而达到治疗肠炎的作用。

下面简要地介绍一下组成本发明中基因工程融合蛋白的2个组分：

1.胸腺素a1

人体的免疫系统中参与免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中胸腺素α1是现在结构和功能研究得较为明确的一种主要的胸腺因子。

胸腺素α1是Goldstein等最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽，含28个氨基酸，分子量3.108KD，等电点4.2，无二硫键与糖基化。胸腺素α1的氨基酸序列与原胸腺素α的N端一致，后者是Haritos等从大鼠胸腺中分离出来的，含109～112个氨基酸，不同种属，不同组织来源的原胸腺素α基因序列略有异。胸腺素α1是一种免疫活性肽，它主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，可增加T细胞表面Thy-1，Thy-2.3和Lyt-1.2.3表达，能促进T淋巴细胞的增殖，提高淋巴细胞产生干扰素和白介素2等细胞因子的能力，提高机体抗病毒、抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素α1是一种重要的免疫调节剂和增强剂。临床上主要作为原发性或继发性免疫功能缺陷病，肿瘤和慢性活动性肝炎的免疫调节剂，其安全性和有效性已经超万例临床应用所证实，长期使用，无蓄积性，无抗原性，并得到国内外相关领域专家的公认。目前也发现胸腺素α1对创伤和烧伤的皮肤愈合有比较好的作用。

2.胸腺生成素-2(thymopoietin-2)：

胸腺生成素-2是最早Goldstein等从小牛胸腺分离出的一种多肽，是一种49个氨基酸的多肽，由13种氨基酸组成的。相对分子质量为4818。胸腺生成素-2具有调节神经肌肉传导的作用和免疫激活作用，能够促进胸腺细胞和外周T细胞及B细胞分化发育，并且能够双向调节机体失衡的免疫功能，具有独特的生物学作用，是一种重要的免疫调节剂，其32～36位氨基酸称为胸腺五肽，是胸腺生成素-2重要的功能活性部分，能双向调节机体失衡的免疫功能，具有独特的生物学作用，是一种重要的免疫调节剂。其中胸腺五肽作为化学合成的药品已有产品上市，适应症为免疫增强，但是由于胸腺五肽的体内半衰期很短，只有几分钟，影响了其治疗效果，本项目的融合蛋白采用了胸腺生成素-2的全长序列，半衰期较长，能够更加充分地发挥其免疫增强的效果。

三.发明内容

本发明的一个方面，涉及一种基因工程融合蛋白，是由2个组分组成，分别为胸腺素α1和胸腺生成素-2，之间通过lingker序列GGGSG连接起来，其为SEQ ID NO：1所示的序列。

本领域普通技术人员知晓，所述的基因工程融合蛋白可以通过基因重组表达的方法进行制备。在本发明中，所述的基因工程融合蛋白是通过基因工程重组表达的方法获得的。

在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得所述的基因工程融合蛋白，包括如下步骤：

1)表达载体的构建

依据已知所述的基因工程融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列的DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5’端加上编码3C酶切位点的碱基序列和限制性酶切位点NotI；3’端加上终止密码子和限制性酶切位点EcoRI，得到编码所述的基因工程融合蛋白的核酸序列。

再分别将如上述制备的所述的基因工程融合蛋白序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子pBSK-TT。用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的pET32连接，经筛选得到正确的重组子pET32-TT。

2)所述的基因工程融合蛋白表达及分离纯化

将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，离心收集目的蛋白高表达的菌体。高压均质机破碎菌体并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到镍离子金属鳌和层析(Ni ChelatingSepharose Fast Flow)，洗脱目的前体蛋白，样品脱盐后使用3C酶进行酶切，然后通过一步阴离子交换层析(Q Sepharose High Performance)进一步纯化，最终得到的目的蛋白纯度大于95％。

3)所述的基因工程融合蛋白体外生物活性测定

用E玫瑰花结实验对样品进行生物活力测试。

4)所述的基因工程融合蛋白体内生物活性测定

对犬创伤愈合的疗效：成年犬若干，每只均于背部形成相同的创面4个，分为3组，A组为空白对照组，B组为阳性对照药组，C组为本发明中的基因工程融合蛋白用药组，通过观察完全愈合的天数来判定药物的疗效。

5)对犬消化道损伤的疗效：

对犬消化道损伤的疗效：，成年犬若干，制备肠炎模型后，随机将模型动物分为两组，每组10只，一组为治疗组，一组为对照组。两组均肌肉注射头孢抗菌素，口服补液盐。治疗组肌肉注射本基因工程融合蛋白，50ug/kg，一天一次，连续使用，对照组肌肉注射生理盐水。

四.具体实施方式

1.所述的基因工程融合蛋白表达质粒的构建与工程菌的获得

首先通过全基因合成扩增出融合蛋白的全基因序列，并在5‘端加上编码3C酶切位点的碱基序列和限制性酶切位点NotI；3’端加上终止密码子和限制性酶切位点EcoRI，设计如下：

CGG CCG CTG GAG GTG CTG TTT CAG GGC CCC AGC GAC GCC GCC GTG

GAC ACC AGC AGC GAG ATC ACC ACC AAG GAC CTG AAG GAG AAG

AAG GAG GTG GTG GAG GAG GCC GAG AAC GGC AGC GGC GGC GGC

AGC GAC AAG CCC GAC ATG GCC GAG CTG GAG AAG TTC GAC AAG

AGC AAG CTG AAG AAG ACC GAG ACC CAG GAG AAG AAC CCC CTG

CCC AGC AAG GAG ACC ATC GAG CAG GAG AAG CAG GCC GGC GAG

AGC TAA TAG GAA TTC

分别将如上述制备的所述的基因工程融合蛋白的核苷酸序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子pBSK-TT。目的片段经NotI、EcoRI双酶切后分别回收小片段，质粒pET32经NotI、EcoRI双酶切后回收大片段，14℃在T4连接酶体系中两段目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为pET32-TT。然后用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LA中培养，至OD600为0.6～0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时，离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条40K左右的蛋白带，表达量为菌体可溶性蛋白的40％左右。经胸腺素α1的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达所述的基因工程融合蛋白的工程菌命名为PET32-TT/BL21(DE3)。

2.发酵

1)摇瓶表达：含所述的基因工程融合蛋白基因的pET32-TT/BL21(DE3)，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mMIPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含基因工程融合蛋白以可溶性表达为主，表达量占菌体可溶性蛋白的40％。

2)发酵工艺：

a.培养基：

a)种子液培养基(LA)：

胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、氨苄青霉素：100微克/毫升。

b)培养基(15升)：

磷酸氢二钠：375克、磷酸二氢钾：80克、氯化钠：10克、

氯化铵：45克、     胰蛋白胨；50克。

以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。

硫酸镁：20克、     葡萄糖：100克、

补料(500克/升)：葡萄糖

b.发酵过程：

a)种子培养：

从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LA中，37度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LA中，36度、200转/分，过夜。

b)发酵过程：

将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，37度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，加入终浓度0.3mM的IPTG诱导(五小时)。

3.层析

1)亲和层析

采用镍离子金属鳌和层析(Ni Chelating Sepharose Fast Flow)，平衡液A采用25mM Tris-HCl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑平衡后，裂菌的离心上清上样，用A平衡后用洗脱液25mM Tris-HCl，pH8.0，0.5M NaCl，0.2M咪唑洗下目的融合蛋白。

2)脱盐

采用Sephadex G-25层析介质，平衡液为25mM Tris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl，平衡，上一步得到的样品上样，平衡，收集蛋白峰。

3)酶解

上一步的蛋白峰加入3C酶(2U/mL)，室温过夜酶切大约16小时。

4)阴离子交换层析

采用Q Sepharose High Performance层析介质，平衡液为20mM PB，pH7.4，上一步得到的酶切样品用水稀释4倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7.4，0～1M NaCl，20个柱体积的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

4.检测

得到的基因工程融合蛋白通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度均大于95％。

5.基因工程融合蛋白体外活性检测

E玫瑰花结实验对样品进行生物活力测试：

基础细胞培养液：1640基础培养基10.0g，NaHCO₃ 2.2g，Hepes5.9g，丙酸钠0.11g，0.05M巯基乙醇2.0ml，ddH₂O 1000ml；细胞培养基：基础细胞培养基90ml，小牛血清10ml，双抗(青霉素+链霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml；

测活培养基：基础培养基95ml小牛血清5.0ml，双抗及谷胱甘肽浓度与上相同。过滤灭菌；裂解液：SDS 10g，，DMSO 25ml，ddH₂O 19ml，调PH＝4.7。

方法：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×10⁶/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品与阳性对照药日达仙，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl，绵羊红细胞(2×10⁶/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。

按以下公式计算激活率。

样品和日达仙的E玫瑰花结形成数和激活率：

	E玫瑰花结形成数	激活率
			阴性对照	30.9±1.10	-
基因工程融合蛋白(10μg/ml)	51.3±0.87	66.0％
			日达仙(10μg/ml)	44.6±2.24	44.3％

由上表可知，本发明的基因工程融合蛋白能够显著提高人外周血淋巴细胞E玫瑰花结形成数量，且由于融合蛋白中的胸腺素α1与胸腺生成素-2的协同作用，其生物活性远大于阳性对照药日达仙(天然的胸腺素a1)。

6.基因工程融合蛋白对犬皮肤损伤的治疗效果

成年犬9只，每只均于脊柱两侧各取1.5cm×1.5cm中厚皮片2块，形成相同的创面4个，共计创面36个，分为3组，A，B，C，每组12个创面，创面A组为空白对照组：伤后当天始至伤后11天，每天外用0.1M磷酸缓冲液(PBS pH7.4内含0.1％小牛血清)2次，每次50μL，涂于创面上，稍干后涂少许四环素眼膏；B创面组为阳性对照药组：伤后当天始至伤后11天用药，为基因重组人表皮生长因子，深圳华生元基因工程发展有限公司产品，金因肽，2000U/mL，外用，每天一次；C创面组为本发明中的基因工程融合蛋白，皮下注射，50μg/kg，一天一次。

结果：A组完全愈合的天数是15天，B组完全愈合的天数是10天，C组完全愈合的天数是7天，由此可见，应用本发明中的基因工程融合蛋白注射的方法治疗，大大加快了伤口愈合的速度。

7.融合蛋白对狗肠炎的治疗效果

大量培养自行分离鉴定的犬细小病毒，检测毒价。将病毒配制成5×10⁶/ml备用，购买30日龄的犬20只，每只犬灌服2毫升。24小时后，犬出现发烧，腹泻，白细胞降低，便中偶带血，食欲不振，随机分为两组，每组10只，一组为治疗组，一组为对照组。两组均肌肉注射头孢抗菌素，口服补液盐。治疗组肌肉注射本品，50μg/kg，一天一次，连续使用。对照组肌肉注射生理盐水。

治疗组治疗一次以后，部分犬腹泻症状减轻，便血停止，便由稀变干，治疗三次后，治疗组8条犬，腹泻停止，无发烧症状，食欲正常，判定临床治愈。两条无腹泻症状，但食欲不佳。

对照组腹泻症状加重，2天后有3条死亡，3天后又有3条死亡。其余4条仍然腹泻，消瘦，食欲不振，发烧。

综上，本品对细小病毒的肠炎治愈率为80％。

序列表

<110>军事医学科学院军事兽医研究所

<120>胸腺素α1-胸腺生成素-2基因工程融合蛋白

<160>1

<210>1

<211>82

<212>PRT

<213>SEQ ID NO：1

<400>1

Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp

1               5                   10                  15

Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Ser

                20                  25                  30

Gly Gly Gly Ser Gln Phe Leu Glu Asp Pro Ser Val Leu Thr Lys

                35                  40                  45

Glu Lys Leu Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro

                50                  55                  60

Ala Gly Glu Gln Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr Leu Gln

                65                  70                  75

Thr Leu Thr Ala Val Lys Arg

                80      82

Claims (5)

1.一种基因工程融合蛋白，如SEQ ID N01的序列所示的序列，是由胸腺素a1和胸腺生成素-2通过基因工程重组技术连接组成。

2.一种多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.根据权利要求1中的基因工程融合蛋白来源是通过大肠杆菌作为表达宿主菌表达、纯化得到。

4.根据权利要求1中基因工程融合蛋白是用于制备创伤治疗药物的用途。

5.根据权利要求1中基因工程融合蛋白是用于制备消化道损伤治疗药物的用途。