CN101780146B

CN101780146B - 一种痹祺胶囊的检测方法

Info

Publication number: CN101780146B
Application number: CN2009100677285A
Authority: CN
Inventors: 李林海; 董铁军; 刘炎
Original assignee: Tianjin Darentang JingWanHong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jinyao Darrentang Jingwanhong Tianjin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: CN101780146A

Abstract

本发明涉及一种痹祺胶囊的质量控制方法。该中药组合物是由党参、丹参、白术、地龙、茯苓、三七、川芎、马钱子调制粉、牛膝和甘草制成。采用本发明质量控制方法可以有效的控制痹祺胶囊中马钱子碱C₂₃H₂₆N₂O₄的含量。

Description

一种痹祺胶囊的检测方法

技术领域

本发明涉及一种药品质量控制方法，具体说是涉及一种痹祺胶囊的质量控制方法。

背景技术

“痹症”一词的由来要追溯到我国最早的中医典籍《黄帝内经》，在《素问·痹论》中有“风寒湿三气杂至，合而为痹也”之说。“痹”者闭也，是阻闭不通之意。中医认为痹证是由风、寒、湿、热等外邪侵袭人体，闭阻经络，致气血运行不畅所致。本症以肌肉、筋骨、关节发生酸痛、麻木、重着、屈伸不利，或关节肿大灼热疼痛等为主要临床表现。古代对痹证的论述很多，如“风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹”等，还有骨痹、筋痹、脉痹、肌痹、五脏痹、血痹、历节、痛风、周痹等等，名目虽繁多，但其基本病理则是一致的。痹证的治疗以宣通为主，并根据具体临床表现配合祛风、散寒、祛湿、清热、活血、温经通络、益气养血等。由于痹症常缠绵日久，反复发作，难以根治，而酒有辛温宣通之性，又可助蠲痹诸药之力，酒力引药直达经络血脉关节诸筋病之所在，故药酒治痹疗效卓著，而且寓治于膳，可长期饮服，备受病家的欢迎。因此，药酒已成为痹证治疗的重要手毁。值得注意的是，一些治疗痹症的药物如大辛大热的附子、川乌、草乌、马钱子等，由于有一定毒性，过量服用易致中毒，甚至危及生命，因而使用时切要谨慎，不可过量，以免发生意外。马钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.或云南马钱Strychnos pierriana A.W.Hill的干燥成熟种子。冬季采收成熟果实，取出种子，晒干。其性状呈钮扣状圆板形，直径1.5～3cm，厚0.3～0.6cm，常一面隆起，一面稍凹下，表面密被灰棕或灰绿色绢状茸毛，自中间向四周呈辐射状排列，有丝样光泽。边缘稍隆起，较厚，有突起的珠孔，底面中心有突起的圆点状种脐。质坚硬，平行剖面可见淡黄白色胚乳，角质状，子叶心形，叶脉5～7条。无臭，味极苦。马钱子性味苦，温；有大毒，归肝、脾经。其具有通络止痛，散结消肿。主要用于风湿顽痹，麻木瘫痪，跌扑损伤，痈疽肿痛；小儿麻痹后遗症，类风湿性关节痛。安全、有效、质量可控是综合评价一个药品的基本要素，但是由于中药、天然药物成分复杂、有效成分不够清楚等特点，中药制剂的质量往往需要通过原料药(包括药材、提取物或有效成分等)、工艺、质量标准、稳定性等各方面进行控制。痹祺胶囊是由马钱子(调制粉)、地龙、党参、茯苓、白术、甘草、川芎、丹参、三七、牛膝等10味药物制成。主要用于治疗气血不足，风湿瘀阻，肌肉关节酸痛，关节肿大、僵硬变形或肌肉萎缩，气短乏力；风湿、类风湿性关节炎，腰肌劳损，软组织损伤属上述证候者。由于其中的马钱子具有剧毒，所以药典对马钱子的用量有着严格的控制。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种痹祺胶囊的质量控制方法，通过此质量控制方法，可控制该痹祺胶囊的质量。

本发明的痹祺胶囊，是由下列重量配比的原料药制成：党参7.5～30g、丹参5～20g、白术7.5～30g、地龙0.5～5g、茯苓7.5～30g、三七5～20g、川芎10～40g、马钱子调制粉5～25g、牛膝5～20g和甘草7.5～30g，其中的马钱子调制粉是由下列重量配比原料药制成：马钱子∶辅料为0.1～5∶0.1～5，所述的辅料选自糊精、淀粉、甘露醇、微晶纤维素、碳酸氢钙中的一种或几种混合。

本发明优选的痹祺胶囊，是由下列重量配比的原料药制成：党参10～20g、丹参8～15g、白术10～20g、地龙0.8～3g、茯苓10～20g、三七8～15g、川芎15～30g、马钱子调制粉7.6～15.12g、牛膝8～15g和甘草10～20g，其中的马钱子调制粉是由下列重量配比原料药制成：马钱子∶辅料为0.5～2∶0.4～2，所述的辅料选自糊精、淀粉、甘露醇、微晶纤维素中的一种或几种混合。

本发明最佳的痹祺胶囊，是由下列重量配比的原料药制成：党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、马钱子调制粉11.36g、牛膝10g和甘草15g，其中的马钱子调制粉是由下列重量配比原料药制成：马钱子∶淀粉为1∶0.5～1.5。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法，其中该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

用高效液相色谱法测定：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；每500～1500ml乙腈-水-磷酸溶液中加戊烷磺酸钠0.8～3.0g为流动相，其中乙腈-水-磷酸之比为120∶380∶0.5；检测波长为254±2nm；理论板数按士的宁峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：取士的宁、马钱子碱对照品适量，加流动相制成每0.5～2.0ml各含士的宁12～45μg与马钱子碱8～30μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：称取本品内容物0.1～0.6g，加入三氯甲烷10～45ml，加入浓氨溶液1.0～4.5ml，称定重量，加热回流10～60分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，分取三氯甲烷层，精密量取7.5～30ml，蒸干，残渣加流动相使溶解，转移至2.5～10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明痹祺胶囊优选的质量控制方法，其中该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

用高效液相色谱法测定：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；每800～1200ml乙腈-水-磷酸溶液中加戊烷磺酸钠1.5～2.0g为流动相，其中乙腈-水-磷酸之比为120∶380∶0.5；检测波长为254±2nm；理论板数按士的宁峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：取士的宁、马钱子碱对照品适量，加流动相制成每0.8～1.2ml各含士的宁20～30μg与马钱子碱15～20μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：称取本品内容物0.2～0.4g，加入三氯甲烷20～30ml，加入浓氨溶液2.0～3.0ml，称定重量，加热回流20～40分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，分取三氯甲烷层，精密量取10～20ml，蒸干，残渣加流动相使溶解，转移至4～8ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各8～12μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明痹祺胶囊进一步优选的质量控制方法，其中该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

用高效液相色谱法测定：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；每1000ml乙腈-水-磷酸溶液中加戊烷磺酸钠1.74g为流动相，其中乙腈-水-磷酸之比为120∶380∶0.5；检测波长为254nm；理论板数按士的宁峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：取士的宁、马钱子碱对照品适量，加流动相制成每1ml各含士的宁25μg与马钱子碱17μg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备：称取本品内容物0.3g，加入三氯甲烷25ml，加入浓氨溶液2.5ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，分取三氯甲烷层，精密量取15ml，蒸干，残渣加流动相使溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法，还可以在测定该药物中马钱子碱和士的宁含量的同时增加该药物中川芎药材薄层鉴别和/或甘草药材薄层鉴别，方法如下：

痹祺胶囊中川芎药材薄层鉴别：取本品内容物0.5～2g，加乙醚10～30ml，超声处理5～15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1～4ml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材0.5～2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.5～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm±2nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

痹祺胶囊中甘草药材薄层鉴别：取本品内容物0.5～2g，加乙醚20～70ml，加热回流0.5～2小时，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇15～60ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20～80ml使溶解，用正丁醇提取2～4次，每次10～40ml，合并正丁醇液，用水洗涤2～4次，每次10～40ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1～4ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5～2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.5～4μl，分别点于同一含0.5～2％氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm±2nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

本发明痹祺胶囊的优选的质量控制方法，还可以在测定该药物中马钱子碱和士的宁含量的同时增加该药物中川芎药材薄层鉴别和/或甘草药材薄层鉴别，方法如下：

痹祺胶囊中川芎药材薄层鉴别：取本品内容物1g，加乙醚20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯之比为9∶1的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

痹祺胶囊中甘草药材薄层鉴别：取本品内容物1g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一含1％氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水之比为15∶1∶1∶2的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法中，流动相溶液的配制比例是按体积比配制。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法中，展开剂的配制比例是按体积比配制。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法中，该中药组合物为胶囊剂，其中每粒胶囊剂内容物为0.3g。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法中，每粒胶囊含马钱子调制粉以士的宁C₂₁H₂₂N₂O₂计，为0.21～0.36mg。

本发明痹祺胶囊的质量控制方法中，每粒胶囊含马钱子碱C₂₃H₂₆N₂O₄不得少于0.09mg。

本发明优选的痹祺胶囊的质量控制方法中，每0.3g胶囊内容物含马钱子调制粉以士的宁C₂₁H₂₂N₂O₂计，为0.21～0.28mg；含马钱子碱C₂₃H₂₆N₂O₄ 0.09～0.12mg。

本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

对于本领域技术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进。例如，使用不同的检测仪器所获得的测定结果可能有所不同，但只要使用本发明所述的质量控制方法，均在本发明保护范围之内。

对于本发明而言，按照本发明提供的质量控制方法来控痹祺胶囊中士的宁和马钱子碱的含量以控制本发明痹祺胶囊的质量。

下面通过本发明药物(按照实施例18制备方法获得)下述药效学和药理学试验说明本发明药物的有益效果。

试验例1本发明药物对类风湿性关节炎(RA)患者外周血T细胞亚群的影响

1.资料与方法

1.1样本来源

在临床研究的两组病例中，随机选取20对患者，正常组20例从健康志愿者中选取。

1.2试剂与仪器

美国贝克曼库尔特公司(COULTER)EPICS XI型流式细胞仪，IgG-FITC/IgG-PE-Cy5(catN01672)和CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-Cy5(cat N01650)均由Immunotech Acoulter公司提供。

1.3实验方法

1)所有受检者均于清晨空腹时无菌采外周静脉血1ml，肝素抗凝。

2)取两支上样管，分别标识A、B，并同时标上标本号。

3)取10μl IgG-FITC/IgG-PE-Cy5加至A管，10μl CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-Cy5加至B管。

4)分别取100μl抗凝血加至A、B两管，立即短暂漩涡混匀，室温暗处孵育15min(小心避免血样加至试管壁，导致血样与试剂不能充分混匀)。

5)加500μl溶血素OptiIyse C至A、B两管，立即短暂漩涡混匀，室温暗处孵育10min。

6)加500μl PBS溶液，立即短暂漩涡混匀，终止溶血，4℃保存，24h内上机检测。

1.4统计学处理

所有数据采用SPSS13.0软件处理，以X±s表示，采用ANOVA检验。

2结果

治疗前治疗组和对照组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值与正常组相比有显著性差异，P＜0.05，治疗组和对照组CD4+、CD4+/CD8+比值较正常组显著升高，CD8+较正常组显著降低。两组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+治疗后与治疗前比较均有显著性差异P＜0.05，两组治疗后CD4+较治疗前显著降低，P＜0.05，CD8+、CD4+/CD8+比值较治疗前显著降低，P＜0.05；治疗后治疗组和对照组比较无显著性差异，P＞0.05，见表II-1。

表II-1 两组外周血淋巴细胞不同亚群的比较(X±s)

注：^★与治疗前比较有显著性差异(P＜0.05)。^△与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。

3.结论

T细胞亚群对机体免疫功能的稳定起着重要的调节作用。本研究结果显示，RA患者与正常人比较，外周血CD3+细胞无明显变化，CD4+细胞较正常人明显升高，CD8+细胞明显降低，CD4+/CD8+比值明显升高，存在着T细胞亚群失衡。经本发明药物治疗后，CD4+细胞明显降低，CD8+细胞明显升高，CD4+/CD8+比值降低。临床观察结果显示这些病例经治疗后从活动期进入缓解期，RA病情趋于稳定，提示细胞免疫参与了RA的发病过程，疾病的发展变化与RA患者外周血T细胞亚群的变化密切相关，随着病情的控制、症状的缓解，CD4+、CD8+细胞及CD4+/CD8+比值趋于正常。

试验例2 本发明药物抗胶原诱导性关节炎(CIA)作用研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

清洁级Lewis大鼠60只，雄性，体重(180±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：2002-0003；饲养环境：天津中医药大学第一附属医院清洁级动物房。适应性饲养1周后用于实验。

1.1.2试剂

牛II型胶原(Collagen Type II，C II)和弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)均购自美国Sigma公司；

锇酸：JOHNSON MATTHEY CHEMICALS LTD.产品，ENGLAND；

尼美舒利：广东健力宝药业有限公司生产(批号：050402)

本发明药物，天津达仁堂达二药业有限公司生产(批号：301414)。

1.1.3主要仪器

切片机，Leica Jung Biocut 2035，德国；

振荡器，江苏省泰县医疗器械厂；

台式高速冷冻离心机，北京四环科学仪器厂；

光学显微镜，OIYMPUS BX51，日本。

电镜，(OTONEMIOC，德国)

1.2方法

1.2.1乳剂配制

将C II溶于0.1M冰醋酸中，浓度为2mg/ml，在4℃下搅拌使之充分溶解，置于4℃冰箱中过夜。

1.2.2模型制备

60只Lewis大鼠中随机挑选10只，做为正常组，其余50只以备CIA造模。造模具体步骤如下：溶解于冰醋酸的C II加入等体积的CFA，在冰浴条件下混匀，使二者充分乳化(以乳化液滴入水中不扩散为度)，CII最终浓度为1mg/ml。于大鼠右足皮下注射CII胶原乳剂，每只大鼠0.2ml。初次免疫21d后加强免疫，在鼠尾根部皮下注射0.2ml乳剂。定期观察大鼠的一般状况，四肢关节肿胀、颜色、关节活动情况等变化。

1.2.3足踝肿胀度测定

致炎前及初次免疫后第1d起，每2d测1次后足前后径、左右径及足垫厚度，以此作为观察指标。

1.2.4关节炎症评分

从初次免疫后21d起，采用关节分数评分法记录多发性关节炎病变的发生及严重程度，关节炎指数(Arthritis index，AI)分为5级(0-4分)，0分：无红肿；1分：足小趾节红肿；2分：趾关节、足跖部均红肿；3分：踝关节以下均红肿；4分：包括踝关节，全部红肿；最高为16分，隔2天记录评分1次。

1.2.5分组与给药

50只CII致炎大鼠中的45只相继在免疫出现继发性关节炎症状，四肢(尤为双后肢)出现发红肿胀，关节炎指数≥6分为造模成功。将CIA造模成功的36只Lewis大鼠随机分为本发明药物高剂量组、本发明药物低剂量组、尼美舒利组、模型组，每组9只大鼠。并将造模前随机挑选的10只大鼠作正常组。

Lewis大鼠CII致炎后第21天，开始灌胃。

本发明药物高剂量组，本发明药物水溶灌胃，1.8g/kg.d(相当于正常成人用量的35倍)；

本发明药物低剂量组，本发明药物水溶灌胃，0.36g/kg.d(相当于正常成人用量的7倍)；

尼美舒利组：水溶灌胃6mg/kg.d；

模型组，生理盐水灌胃，10ml/kg.d；

给药持续6W。

1.2.6病理学观察

给药6W，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死大鼠，剥离切取各组左足踝关节组织，立即放入10％中性福尔马林溶液中，固定2d后，8％甲酸脱钙14d，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，显微镜下观察关节及滑膜病理变化。

1.2.7滑膜细胞超微结构的观察

取大鼠膝关节滑膜组织，以4％戊二醛Milloning’s缓冲液预固定，1％锇酸固定液固定，不同浓度乙醇逐级脱水，环氧丙烷过渡，Epon 812浸泡、包埋，定位后行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色后，透射电镜观察滑膜细胞超微结构并摄片。

1.3统计学处理

以上实验数据应用SPSS13.0统计软件处理，数据统计结果以X±s表示，进行ANOVA检验。

2结果

2.1 CIA大鼠模型制备情况

2.1.1 CIA的发病情况

初次免疫次日，大鼠免疫侧踝关节皮肤开始发红，肿胀。致炎后10-19d，大鼠四肢关节红肿加重，以双侧后足踝关节明显，足垫增厚，大鼠活动量减少，食欲下降，毛发失去光泽，皮内注射部位出现多处小溃疡，随后结痂愈合。5W左右大鼠关节炎病变最为严重，活动困难，体重增长缓慢，甚至下降。其后关节肿胀逐渐减退，部分大鼠出现关节强直，活动明显受限。

2.1.2 CIA大鼠关节病理改变

病理切片HE染色显示：正常组的关节滑膜组织由1-2层滑膜细胞及滑膜下层组成，滑膜细胞排列整齐呈扁平状，关节面光滑，关节腔内无渗出，无炎细胞浸润。模型组的滑膜组织明显增厚，严重者达10多层，排列疏散、紊乱，滑膜绒毛形成突向关节腔；滑膜下层可见多处灶性淋巴细胞浸润，散在的浆细胞和巨噬细胞，形成“淋巴样滤泡”，滑膜下新生小血管数量增多，血管内皮增生，管腔狭窄甚至闭塞，血管翳形成，出现滑膜组织贴附软骨生长现象，软骨侵蚀、破坏。

2.2药物对CIA大鼠表现的影响

2.2.1对CIA大鼠一般发病情况的影响

正常组大鼠皮毛光泽色白，精神佳、活泼，饮食正常；模型组大鼠皮毛暗淡无光泽、部分大鼠爬行困难、纳食减少、体形瘦弱；本发明药物低剂量组大鼠皮毛枯糙发黄，倦怠懒动，体重增长缓慢；本发明药物高剂量组和尼美舒利组大鼠皮毛光泽、较活跃、进食状况较好。

2.2.2对CIA大鼠继发性病变的影响

2.2.2.1初次免疫后11d，观察到少数大鼠(6/40)开始出现继发性的足踝红肿，至第19d，大部分(36/40)的造模大鼠均发生不同程度的继发性关节炎。

2.2.2.2药物治疗后的足踝肿胀改变情况

灌胃6W后本发明药物低剂量组后足踝肿胀程度与模型组比较差异有显著性，P＜0.05，其它各组与模型组比较差异有显著性，P＜0.01。本发明药物低剂量组与本发明药物高剂量组比较差异有显著性，P＜0.05；本发明药物低剂量组与尼美舒利组比较差异有显著性，P＜0.01。本发明药物高剂量组与尼美舒利组比较，差异有显著性，P＜0.05。各组炎症指数比较结果：本发明药物低剂量组与模型组比较差异有显著性，P＜0.05，其它各组与模型组比较差异有显著性，P＜0.01。痹祺高剂量组与尼美舒利组比较，差异无显著性，P＞0.05。

2.2.2.3对CIA大鼠组织病理改变的影响

踝关节病理显示：光镜下观察模型组大鼠与正常组大鼠比较，病变踝关节出现滑膜高度增生，呈乳头状突起，细胞排列不规则，可见大量的炎性细胞浸润、“淋巴样滤泡”结构、软骨面破坏，严重的甚至可见炎性细胞侵蚀到软骨、骨组织，并有血管翳形成。

尼美舒利组踝关节滑膜正常，滑膜细胞1～2层规则排列，未见炎细胞浸润及血管翳形成。本发明药物高剂量组滑膜可见局部轻微增生(滑膜细胞3～5层)，部分可见轻度炎细胞浸润，亦未观察到血管翳。本发明药物低剂量组可见滑膜增生，滑膜衬里下层可见新生血管生成，炎细胞浸润明显。本发明药物高剂量组及尼美舒利组的踝关节病理显示关节软骨表面光滑，未见软骨侵蚀及软骨下骨破坏，病理表现基本与正常大鼠一致。本发明药物低剂量组与CIA模型组大鼠踝关节病理改变相似。

2.2.2.4对CIA大鼠滑膜细胞超微结构的影响

透射电镜观察显示：正常组：滑膜细胞以B型细胞为多，其中粗面内质网较多，高尔基体和小泡少见；而A型细胞则具有显著的高尔基复合体和小泡，高尔基体可见轻微的卷屈，粗面内质网很少见.模型组：滑膜细胞中A型细胞显著增多，滑膜细胞内可见较多的致密体，滑膜细胞内高尔基体显著增多，可见严重的卷屈，有大量的空泡，线粒体显著增多，可见肿胀，粗面内质网显著增多，且多有扩张.本发明药物高剂量组与尼美舒利组：滑膜细胞均以B型细胞为主，滑膜细胞内高尔基体较模型组明显减少，可见轻微卷屈，线粒体和小泡减少，粗面内质网显著减少；A型滑膜细胞高尔基体减少，结构较为清晰、完整，可见轻度卷曲，线粒体较少，肿胀不明显.本发明药物低剂量组：滑膜细胞以B型细胞为主，滑膜细胞内高尔基体较模型减少，可见卷屈；线粒体和小泡稍有减少，粗面内质网减少；A型滑膜细胞高尔基体减少，结构较为清晰、完整，线粒体较模型组有所减少，可见肿胀.

试验例3 本发明药物对CIA大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响

1.材料与方法

1.1试剂

IL-1β ELISA试剂盒(批号：20050705)、TNF-α ELISA试剂盒(批号：20050705)，均为深圳晶美公司。

1.2动物造模及分组给药：同实验2

1.3细胞因子的测定

IL-1β、TNF-α的测定采用ELISA试剂盒，并按试剂盒说明进行检测。

1.4统计学分析

数据应用SPSS13.0统计软件处理，数据统计结果以X±s表示，进行ANOVA检验。

2.结果

模型组以及各治疗组与正常组比较，IL-1β表达水平均升高，差异均有显著性，P＜0.01；各治疗组与模型组比较，IL-1β表达水平均下降，其中尼美舒利组和中药高剂量组下降更为明显，差异有显著性，P＜0.01。模型组以及各治疗组与正常组比较，TNF-α表达水平均升高，差异均有显著性，P＜0.01；各治疗组与模型组比较，均呈下降变化，其中尼美舒利组和中药高剂量组下降更为明显，差异有显著性，P＜0.01。见表III-1

表III-1 本发明药物对大鼠血清IL-1β、TNF-α的影响(x±s)

注：与正常组比较有显著性差异，^★P＜0.05，^★★P＜0.01；

与模型组比较有显著性差异，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

3.结论

RA患者的外周血单核细胞及关节滑膜细胞大量分泌IL-1β与TNF-α，这两种细胞因子在RA的急性滑膜炎症、滑膜纤维化、骨和软骨破坏等病情进展中起主导作用。本研究结果表明本发明药物能明显下调血清IL-1β、TNF-α水平，减轻关节炎症，并可能抑制滑膜增生，但须进一步的研究证实。

试验例4 本发明药物镇痛作用的实验研究

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：健康ICR小鼠，体重(20±2)g。健康SD大鼠，雄性，体重(200±20)g。以上动物均为II级清洁级，由北京军事医学科学院实验室中心提供。

1.2.实验方法

1.2.1对小鼠热板性疼痛的影响

预试验中将ICR小鼠置预热至(55±0.5)℃的金属热板上，以舔后足作为痛反应指标，记录小鼠出现舔后足的时间，作为痛反应的潜伏期(痛阈值)。选取痛阈值在5-30s之间的小鼠随机分为3组：1.对照组(生理盐水，2ml/d)；2.尼美舒利组(尼美舒利胶囊，50mg/kg/d)；3.本发明药物组(本发明药物，0.6g/kg/d)，每组10只，每天灌胃给药一次，连续3d.于第3天给药后的30、60、90min各测量一次小鼠的痛阈值。为防小鼠足部烫伤，实验截止时间设为60s。

1.2.2对醋酸诱导的小鼠扭体反应的影响

ICR小鼠随机分为3组：1.对照组(生理盐水，10ml/kg)；2.尼美舒利组(尼美舒利胶囊，40mg/kg/d)；3.本发明药物组(本发明药物，0.48g/kg/d)，每组10只，每天灌胃给药一次，连续3d.。于末次灌胃30min后，小鼠腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.2ml，记录20min内小鼠的扭体次数，并计算扭体反应的抑制率。

1.3统计学分析

数据应用SPSS13.0统计软件处理，数据统计结果以X±s表示，进行t检验。

2.结果

2.1本发明药物对小鼠热板疼痛的影响

结果显示本发明药物给药后0.5h即可提高热板所致小鼠疼痛的阈值，一个小时后达到最大效应，而后逐渐减弱，尼美舒利显效时间早于本发明药物组；本发明药物组和尼美舒利组的痛阈值与生理盐水组比较均有显著性差异，P＜0.05；本发明药物组与尼美舒利组比较无显著性差异，P＞0.05。见表III-2

表III-2本发明药物对小鼠热板法痛阈值的影响(X+s)

注：*与生理盐水组比较，P＜0.05。

2.2本发明药物对醋酸诱导的小鼠扭体反应的影响

结果表明，本发明药物给药后能明显减少酷酸所致的小鼠扭体反应的次数，与生理盐水组比较差异有显著性(P＜0.01)，与阿斯匹林组比较差异无显著性(P＞0.05)，见表III-3。

表III-3 本发明药物对醋酸诱导的小鼠扭体反应的影响(X+s)

注：*与生理盐水组比较，P＜0.05，**与生理盐水组比较，P＜0.01。

3.结论

上实验结果表明，本发明药物可提高热板所致小鼠疼痛的阈值，并在一个小时后达到最大效应。另外，本发明药物还可明显减少醋酸所致的小鼠扭体反应的次数，具有良好的镇痛作用。

试验例5本发明药物组合物(按照实施例18制备获得)的质量控制方法

1、试验条件

采用高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(120∶380∶0.5，含0.01mol/L戊烷磺酸钠)为流动相；检测波长为254nm；柱温：30℃；

2、仪器

LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津)。

3、试验方法

采用以十八烷基键合硅胶为填充剂的反相色谱方法对痹祺胶囊中士的宁和马钱子碱进行含量测定。分别进行了线性关系考察试验、精密度试验、重现性试验、稳定性试验、加样回收试验。

样品批号	士的宁含量(mg/粒)	马钱子碱含量(mg/粒)
			301434	0.2262	0.1184
301432	0.2236	0.1189
			301431	0.2245	0.1192
301430	0.2263	0.1164

4、试验获得的结果

线性关系试验中士的宁线性考察相关系数r为0.9998，线性回归方程为Y＝1392057X+49685.84、马钱子碱线性考察相关系数r为0.9999，线性回归方程为Y＝651011.3X+24894.53；精密度试验中士的宁和马钱子碱的RSD分别为0.32％和0.21％；重现性试验中士的宁和马钱子碱的RSD分别为0.32％和0.21％；稳定性试验中士的宁和马钱子碱的RSD分别为1.96％和0.72％；加样回收试验中士的宁和马钱子碱的平均回收率为99.49％和99.71％，RSD皆为1.25％。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐述本发明药物的制备方法。

实施例1

a.取马钱子0.1kg、糊精0.1kg；采用单罐研兑法，把马钱子和糊精混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合30分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

b、取重量配比的党参7.5g、丹参5g、白术7.5g、地龙0.5g、茯苓7.5g、三七5g、川芎10g、牛膝5g和甘草7.5g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉5～25g混合均匀，制成片剂。

实施例2

a.取马钱子5kg、糊精5kg；采用单罐研兑法，把马钱子和糊精混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合90分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合4小时，制备成马钱子调制粉备用；

b、取重量配比的党参30g、丹参20g、白术30g、地龙5g、茯苓30g、三七20g、川芎40g、牛膝20g和甘草30g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉25g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例3

a.取马钱子1.5kg、糊精2.5kg；采用单罐研兑法，把马钱子和糊精混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合60分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3小时，制备成马钱子调制粉备用；

b、取重量配比的党参30g、丹参10g、白术15g、地龙2g、茯苓20g、三七15g、川芎30g、牛膝15g和甘草20g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11g混合均匀，制成丸剂。

实施例4

a.取马钱子0.1kg、淀粉5kg；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合30分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合4小时，制备成马钱子调制粉备用；

b、取重量配比的党参15g、丹参8g、白术25g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎15g、牛膝12g和甘草25g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉8g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例5

a.取马钱子0.2kg、淀粉0.1kg；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合40分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合4小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参10g、丹参8g、白术10g、地龙0.8g、茯苓10g、三七8g、川芎15g、牛膝8g和甘草10g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉7.6g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例6

a.取马钱子0.5kg、淀粉5kg；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合40分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参20g、丹参15g、白术20g、地龙3g、茯苓20g、三七15g、川芎30g、牛膝15g和甘草20g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉15.12g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例7

a.取马钱子5kg、淀粉4kg；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合35分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2.5小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参12g、丹参15g、白术10g、地龙3g、茯苓10g、三七15g、川芎30g、牛膝8g和甘草20g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉10g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例8

a.取马钱子1kg；糊精、淀粉、甘露醇、微晶纤维素和碳酸氢钙各0.25kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合60分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参12g、丹参10g、白术12g、地龙2.5g、茯苓12.5g、三七10g、川芎20g、牛膝9g和甘草10g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉8g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例9

a.取马钱子0.6kg、淀粉、甘露醇和微晶纤维素各0.45kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合50分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3.5小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙2g、茯苓12g、三七10g、川芎30g、牛膝15g和甘草10g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉9g混合均匀，制成胶片剂。

实施例10

a.取马钱子1kg、甘露醇0.8kg、微晶纤维素0.6kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合45分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参12g、丹参12g、白术12g、地龙1.5g、茯苓12g、三七12g、川芎12g、牛膝12g和甘草12g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉7g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例11

a.取马钱子0.2kg、糊精0.2kg；采用单罐研兑法，把马钱子和糊精混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合45分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参20g、丹参15g、白术10g、地龙0.8g、茯苓20g、三七15g、川芎15g、牛膝8g和甘草20g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉7.6g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例12

a.取马钱子0.4kg、糊精0.1kg、碳酸氢钙0.5kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合70分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3.5小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11.36g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例13

a.取马钱子2kg、淀粉3kg、碳酸氢钙2kg备用采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合80分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11.36g混合均匀，制成片剂。

实施例14

a.取马钱子3kg，糊精和淀粉各2kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合55分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合4小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11.36g混合均匀，制成丸剂。

实施例15

a.取马钱子0.5kg、糊精、淀粉、微晶纤维素各0.4kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合75分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11.36g混合均匀，制成颗粒剂。

实施例16

a.取马钱子0.2kg、糊精、淀粉各0.8kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合85分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2.5小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉11.36g混合均匀，制成颗粒。

实施例17

a.取马钱子0.5kg、淀粉、微晶纤维素各0.3kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和上述辅料混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合60分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

实施例18

a.取马钱子1kg、淀粉0.5kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合60分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合2小时，制备成马钱子调制粉备用；

实施例19

a.取马钱子1kg、淀粉1.5kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合90分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合4小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉10.56g混合均匀，制成胶囊剂。

实施例20

a.取马钱子1kg、淀粉1kg备用；采用单罐研兑法，把马钱子和淀粉混合均匀，然后一次性加入球磨灌中，混合75分钟，收集所得研兑粉投入总混灌中混合3小时，制备成马钱子调制粉备用；

b.党参15g、丹参10g、白术15g、地龙1g、茯苓15g、三七10g、川芎20g、牛膝10g和甘草15g等9味粉碎，与上述方法制备的马钱子调制粉15.12g混合均匀，制成胶囊剂。

Claims

1.一种痹祺胶囊的检测方法，其特征在于，该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

该胶囊是由下列重量配比的原料药制成：党参7.5～30g、丹参5～20g、白术7.5～30g、地龙0.5～5g、茯苓7.5～30g、三七5～20g、川芎10～40g、马钱子调制粉5～25g、牛膝5～20g和甘草7.5～30g，其中的马钱子调制粉是由下列重量配比原料药制成：马钱子∶辅料为0.1～5∶0.1～5，所述的辅料选自糊精、淀粉、甘露醇、微晶纤维素、碳酸氢钙中的一种或几种混合。

2.权利要求1所述痹祺胶囊的检测方法，其特征在于，该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

3.权利要求2所述痹祺胶囊的检测方法，其特征在于，该药物中马钱子碱和士的宁含量测定方法如下：

4.权利要求1-～3任一所述痹祺胶囊的检测方法，其特征在于，该方法还包括如下川芎药材薄层鉴别和/或甘草药材薄层鉴别：

痹祺胶囊中川芎药材薄层鉴别：取本品内容物0.5～2g，加乙醚10～30ml，超声处理5～15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1～4ml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材0.5～2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2005版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各0.5～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm±2nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

痹祺胶囊中甘草药材薄层鉴别：取本品内容物0.5～2g，加乙醚20～70ml，加热回流0.5～2小时，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇15～60ml，加热回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20～80ml使溶解，用正丁醇提取2～4次，每次10～40ml，合并正丁醇液，用水洗涤2～4次，每次10～40ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1～4ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材0.5～2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2005版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各0.5～4μl，分别点于同一含0.5～2％氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～20％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm±2nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

5.权利要求4所述痹祺胶囊的检测方法，其特征在于，该方法还包括如下川芎药材薄层鉴别和/或甘草药材薄层鉴别：

痹祺胶囊中川芎药材薄层鉴别：取本品内容物1g，加乙醚20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2005版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯之比为9∶1的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

痹祺胶囊中甘草药材薄层鉴别：取本品内容物1g，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2005版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一含1％氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水之比为15∶1∶1∶2的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。