CN101776591B

CN101776591B - 一种检测牛奶中青霉素残留量的方法

Info

Publication number: CN101776591B
Application number: CN2010101093753A
Authority: CN
Inventors: 杨亚玲; 耿卫东
Original assignee: YUNNAN JIANNIU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: YUNNAN JIANNIU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2030-02-11
Also published as: CN101776591A

Abstract

本发明公开了一种检测牛奶中青霉素残留量的方法。配制青霉素钠标准工作无水乙醇液，用稀HCl调至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴得到降解产物青霉胺或青霉烯酸，两种降解产物再分别与苯醌类物质发生反应，得到荷移复合物，计算不同荷移复合物的工作曲线。检测时以同样的方法计算牛奶样品的荷移复合物的吸收度，代入该类荷移复合物的工作曲线中即可求得牛奶中青霉素的残留量。本发明率先实现了直接用紫外或荧光分光光度法测定牛奶中的青霉素残留量。该方法检测速度快，检测范围宽，灵敏度高，准确率高，选择性好，无需购置昂贵的抗生素检测仪器，操作方法简单，为乳品加工企业降低生产成本、减轻运作风险提供了保证，具有良好的应用前景。

Description

一种检测牛奶中青霉素残留量的方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及牛奶中残留抗生素的检测方法，特别是涉及一种检测牛奶中青霉素残留量的方法。

背景技术

工业化奶牛养殖中，经常使用抗生素治疗牛乳腺炎和其他乳牛疾病，这些抗生素不可避免地会转移到最初几天的牛乳中。牛乳中残留的抗生素会对乳制品品质带来严重的影响。世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)的食品法对牛奶中抗生素最高残留限量都有明确规定，欧盟亦对最大残留量(MRL)作了详细的规定。我国农业部2001年颁布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，对新鲜牛乳的卫生指标明确了“抗生素不得检出”。

青霉素，因其高效、低毒是目前兽医学临床上应用最受青睐的药物之一。但青霉素对乳酸菌的抑制作用与其他抗生素相比又是最强烈的，而且青霉素的热稳定性相当好，超过任何一种其他常用抗生素，一般的加热杀菌处理不能将其完全破坏。牛奶生产中，如果使用含有青霉素残留的生鲜乳生产巴氏消毒奶和超高温灭菌奶，产品中仍会有相当量的青霉素残留；同时牛奶中青霉素残留可能会导致人体的各种不良反应，人体对青霉素类抗生素药物的敏感性下降，增加病原菌对药物的耐药性。

青霉素的检测至今都是该领域的技术难点，原因是青霉素的水溶液不稳定，会产生降解，且结构中不含活性基团氨基。现有技术中，已应用的青霉素残留技术有微生物检测法如TTC法，理化检测方法包括色谱法，以及免疫分析法等。上述方法在检测精密度等方面各有所长，有的灵敏度低、选择性差；有的操作过程步骤较为繁琐，有的需购置昂贵仪器，但大都存在检测耗时长、成本高的缺点，给乳品加工企业造成诸多不便。中国发明专利200910041985.1(CN101633948)公开的“牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法”涉及的是一种以微生物为原理的检测方法，与本发明有本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、成本低廉、检测结果准确的牛奶中青霉素残留量的检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种检测牛奶中青霉素残留量的方法，包括以下步骤：

1、青霉素的降解及荷移复合物的形成：配制青霉素钠浓度0.01～100mg/L的标准工作无水乙醇液，用稀HCl调至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴10～30min使其降解，得到降解产物青霉胺或青霉烯酸，两种降解产物再分别与浓度为1×10^-3～10×10^-3mol/L的苯醌类物质在常温下反应5～10min，得到荷移复合物，备用；

2、测定波长的选择：将步骤1得到的青霉胺荷移复合物在紫外分光光度计下测定紫外最大吸收波长，或是将得到的青霉烯酸荷移复合物在荧光分光光度计下测定荧光的激发和发射光谱；其中，所述的紫外吸收或是荧光的激发发射波长的测定选择范围为200nm～600nm；

3、针对不同的荷移复合物分别计算吸收光强度与荷移复合物的线性范围、回收率、标准偏差、检测限和工作曲线；

4、样品前处理：将牛奶样品与脱蛋白、脱脂肪沉淀剂混合均匀，在转速800～3000r/min条件下离心分离3～10min，取上清液备用；

5、样品测定：取步骤4中的上清液，按照步骤1进行降解、荷移反应，得到相应的荷移复合物，再按照步骤2的要求测定紫外最大吸收波长或荧光的激发和发射光谱，计算该荷移复合物的吸收度，代入步骤3所得的该类荷移复合物的工作曲线中即可求得牛奶中青霉素的残留量。

步骤(1)中以水、甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种作为反应介质；所述的苯醌类物质为苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基对二次甲基苯醌中的一种。

步骤(4)中所述的脱蛋白、脱脂肪沉淀剂选自酸性乙腈(pH2)、三氯乙酸、钨酸钠、醋酸钠或醋酸铅中的一种。其中，使用酸性乙腈或三氯乙酸时将其与牛奶等体积混合；使用钨酸钠、醋酸钠或醋酸铅时按牛奶重量的2～10％重量百分数混合。

同现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明解决了青霉素检测的难点。由于青霉素本身紫外吸收很弱，无荧光，且水溶液易降解，现有技术一直无法直接用紫外或荧光分光光度法测定牛奶中的青霉素残留量。本发明首创将青霉素降解后再与苯醌类物质发生荷移反应，反应生成的青霉胺荷移复合物具有强的紫外吸收能力，而青霉烯酸荷移复合物具有强的荧光吸收能力，从而一举攻克了这一技术难题，为乳品加工企业降低生产成本、减轻运作风险提供了保证；

2、检测速度快，检测范围宽，灵敏度高，准确率高，选择性好，全部操作过程可在40min内完成；

3、无需购置昂贵的抗生素检测仪器，只需配备低速离心机与紫外或荧光分光光度计即可完成检测；

4、操作方法简单，对操作人员无特殊技术要求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

以下实施例中牛奶样品均为牛奶生产企业收购的生鲜乳。

1、取100mL、0.50mg/L青霉素钠标准工作无水乙醇液于小烧杯中。用稀HCl调至pH4，沸水浴10min，降解得到青霉烯酸。

2、取上述青霉素钠降解物青霉烯酸3mL置于10mL比色管中，加入3.00mL5×10^-3mol/L四氯苯醌无水乙醇溶液，用乙醇稀释至刻度，摇匀，室温下放置10min，得到荷移复合物。

3、将上述荷移复合物溶液以323nm为激发波长，475nm为发射波长测定荷移反应产物的荧光强度，同时做空白试验。

4、取步骤1的降解青霉素溶液1mL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步骤分别进行荷移荧光测定，其线性回归方程为A＝0.04568C+0.058，线性范围0.05mg/L-100mg/L，相关系数r＝0.9990，回收率95％-103％，相对标准偏差2.6％(n＝6)，检测限0.05mg/L。

5、加标准回收试验，分别将100mL牛奶样品、5g醋酸钠与5mL、10mL、20mL 0.50mg/L青霉素钠混合，在3000r/min条件下离心3min，取上清液5mL按步骤1、2、3进行，进行加标回收测定，平均回收率(n＝3)为91.4％。

6、取含青霉素钠抗生素的牛奶样品100mL与5g醋酸钠在3000r/min条件下离心3min，取上清液5mL按步骤1、2、3进行，测定荧光吸收强度，带入步骤4的回归方程，求出青霉素浓度为12.3mg/L。

该法检测结果与用GB-19301-2003检测结果一致。

实施例2：

1、取100mL、0.50mg/L青霉素钠标准工作无水乙醇液于小烧杯中。用稀HCl调至pH2，沸水浴20min，降解得到青霉胺。

2、取上述青霉素钠降解物青霉胺3mL置于10mL比色管中，加入5.00mL 1×10^-3mol/L四氯苯醌无水乙醇溶液，用乙醇稀释至刻度，摇匀，室温下放置5min，得到荷移复合物。

3、将上述荷移复合物溶液以400nm为紫外吸收波长测定荷移反应产物的紫外强度，同时做空白试验。

4、取步骤1的降解青霉素溶液1mL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步骤进行荷移紫外测定，其线性回归方程为A＝0.03901C+0.04821，线性范围0.5mg/L-50mg/L，相关系数r＝0.9991，回收率97％-101％，相对标准偏差2.3％(n＝6)，检测限0.5mg/L。

5、取含青霉素钠抗生素的牛奶样品100mL与5g醋酸钠在3000r/min条件下离心3min，取上清液5mL按步骤1、2、3进行，测定紫外吸收强度，带入步骤4的回归方程，求出青霉素浓度为3.5mg/L。该法检测结果与用GB-19301-2003检测结果一致。

实施例3：

1、同实例1。

2、取上述3mL的青霉素钠降解物于10mL比色管中，加入3.00mL 5×10^-3mol/L对苯醌丙酮溶液，用丙酮稀释至刻度，摇匀，室温下放置10min。

3、将上述溶液以335nm为激发波长，460nm为发射波长测定荷移反应产物的荧光强度，同时做空白试验。

4、取步骤1的降解青霉素溶液1mL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步骤进行荷移荧光测定，，其线性回归方程为A＝0.06412C+0.07634，线性范围0.1mg/L-50mg/L，相关系数r＝0.9992，回收率97％-103％，相对标准偏差2.8％(n＝6)，检测限0.1mg/L。

5、取含青霉素钠抗生素的牛奶样品100mL与5g醋酸钠在3000r/min条件下离心3min，取上清液5mL按步骤1、2、3进行，测定荧光吸收强度，带入步骤3的回归方程，求出青霉素浓度为4.1mg/L。该法检测结果与用GB-19301-2003检测结果一致。

实施例4：

1、同实例1。

2、将实例2中的四氯苯醌无水乙醇溶液换成对苯醌丙酮溶液，其余相同。

3、将实例2中的紫外吸收波长换成320nm。

4、取步骤1的降解青霉素溶液1mL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步骤进行荷移紫外测定，其线性回归方程为A＝0.08124C+0.0126，线性范围0.5mg/L-50mg/L，相关系数r＝0.9990，回收率95％-103％，相对标准偏差2.5％(n＝6)，检测限0.1mg/L。

5、取含青霉素抗生素的牛奶样品20mL与三氯乙酸20mL在2500r/min条件下离心5min，取上清液5mL按步骤1、2、3进行，测定紫外吸收强度，带入步骤4的回归方程，求出青霉素浓度为1.4mg/L。该法检测结果与用GB-19301-2003检测结果一致。

Claims

1.一种检测牛奶中青霉素残留量的方法，包括以下步骤：

(1)青霉素的降解及荷移复合物的形成：配制青霉素钠浓度0.01～100mg/L的标准工作无水乙醇液，用稀HCl调至pH 2±0.5，沸水浴10～30min使其降解，得到降解产物青霉胺，降解产物再与浓度为1×10^-3～10×10^-3mol/L的苯醌类物质在常温下反应5～10min，得到青霉胺荷移复合物，备用；或是将标准工作无水乙醇液用稀HCl调至pH 4±0.5，沸水浴10～30min使其降解，得到降解产物青霉烯酸，降解产物再与浓度为1×10^-3～10×10^-3mol/L的苯醌类物质在常温下反应5～10min，得到青霉烯酸荷移复合物，备用；

(2)测定波长的选择：将步骤1得到的青霉胺荷移复合物在紫外分光光度计下测定紫外最大吸收波长，或是将得到的青霉烯酸荷移复合物在荧光分光光度计下测定荧光的激发和发射光谱；其中，所述的紫外吸收或是荧光的激发发射波长的测定选择范围为200nm～600nm；

(3)针对不同的荷移复合物分别计算吸收光强度与荷移复合物的线性范围、回收率、标准偏差、检测限和工作曲线；

(4)样品前处理：将牛奶样品与脱蛋白、脱脂肪沉淀剂混合均匀，在转速800～3000r/min条件下离心分离3～10min，取上清液备用；

(5)样品测定：取步骤4中的上清液，按照步骤1进行降解、荷移反应，得到相应的荷移复合物，再按照步骤2的要求测定紫外最大吸收波长或荧光的激发和发射光谱，计算该荷移复合物的吸收度，代入步骤3所得的该类荷移复合物的工作曲线中即可求得牛奶中青霉素的残留量。

2.根据权利要求1所述的检测牛奶中青霉素残留量的方法，其特征在于：步骤(1)中，以水、甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种作为反应介质；所述的苯醌类物质为苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基对二次甲基苯醌中的一种。

3.根据权利要求1所述的检测牛奶中青霉素残留量的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的脱蛋白、脱脂肪沉淀剂选自pH2的酸性乙腈、三氯乙酸、钨酸钠、醋酸钠或醋酸铅中的一种。

4.根据权利要求3所述的检测牛奶中青霉素残留量的方法，其特征在于：当使用酸性乙腈或三氯乙酸时将其与牛奶等体积混合；使用钨酸钠、醋酸钠或醋酸铅时按牛奶重量的2～10％重量百分数混合。