CN101464434A

CN101464434A - 残留的青霉素类抗生素酶解产物的检测方法

Info

Publication number: CN101464434A
Application number: CNA2007103037101A
Authority: CN
Inventors: 安颖; 林楠
Original assignee: Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: CN101464434B

Abstract

本发明提供了一种残留的青霉素类抗生素酶解产物的检测方法，包括：样品的预处理；取空白样品预处理后，作为空白样，取青霉噻唑酸钾作为酶解产物标样，将待检样品、空白样和酶解产物标样用高效液相的方法进行检测；高效液相的条件包括反相色谱柱，流动相为甲醇:磷酸二氢钠，紫外检测器，检测波长为220－245nm，以3.7±0.1分钟区间内酶解产物标样的出峰作为对照来定性判定待检样品中是否存在青霉素类抗生素酶解产物。该发明可以检测出的酶解产物的最低浓度是40ppb，可以检测乳和乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物。

Description

残留的青霉素类抗生素酶解产物的检测方法

技术领域

本发明提供了一种检测方法，其为一种青霉素类(属于β-内酰胺类)抗生素的酶解残留物的检测，尤其是指乳和乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物的检测。

背景技术

由于国标中规定原料奶收购时必须“无抗”，一些不法奶站便人为使用抗生素酶水解乳中残留的抗生素，这类水解酶制剂及酶水解产物没有做过相关的安全性评价，对于消费者存在直接或间接的安全隐患。现有的抗生素酶的主要成分是青霉素类酶，该酶主要针对β-内酰胺类的抗生素，如青霉素钾、钠、氨苄青霉素等。一般来说，青霉胺、青霉醛、青霉噻唑酸、青霉烯酸是常用的抗生素青霉素水解后的主要产物，其中青霉噻唑酸含量相对最高。一般的检测方法有高效液相色谱法，分光光度法，但是，这些方法都是针对高浓度的药品，残留级的抗生素水解残留物的检测至今未有相关报道。上述的高效液相色谱法和分光光度法的缺点主要有两点，一、都不能用来检测残留级的青霉噻唑酸；二、都不是针对牛奶里残留的青霉噻唑酸；而且，现有方法均缺乏必要的前处理过程，因此不能用来检测乳和乳制品中的残留青霉素类抗生素的酶解残留物青霉噻唑酸的残留量。

由于乳和乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物的检测方法未见报道，为了确保原奶及其产品的质量和安全，本领域急需一种可以检测乳和乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物的方法，尤其是检测残留青霉素类抗生素的酶解残留物青霉噻唑酸的方法。

发明内容

为了确保乳品的安全质量和消费者的健康，本发明人开发了一种青霉素类抗生素酶解残留物的检测方法，尤其是指乳和乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物的检测方法，该方法能够有效地检测乳和乳制品中残留的抗生素酶解产物青霉噻唑酸。

本发明的目的在于提供一种残留的抗生素酶解产物的检测方法，该方法采用与标样对比出峰时间的方法确认酶解物，可以有效地检测乳和乳制品中残留的青霉素类抗生素酶解残留物青霉噻唑酸钾，并可根据特定峰的峰面积经过测绘出标准曲线来定量其浓度范围。

本发明所述的酶解残留物也可称为酶解产物，在本发明的检测方法中一般指青霉噻唑酸类物质。

本发明提供了一种残留的青霉素类抗生素酶解产物的检测方法，包括：

1.样品的预处理，该预处理的步骤包括：

(1)取待检乳样离心；

(2)去掉上层的脂肪层，得到脱脂乳；

(3)在脱脂乳中加入无水乙醇，离心；

(4)抽取上清液，过滤，得到清液作为待检样品；

2.检测，该检测的步骤包括：

(1)取空白样品按上述1中的预处理的步骤处理后，作为空白样(对照样)；

(2)取10μl浓度至少为40μg/l的青霉素类的酶解产物作标样(酶解产物标样)；

(3)液相条件：色谱柱为反相色谱柱；流动相为体积比1；3～3：1的甲醇：磷酸盐，该磷酸盐包括磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；检测器为紫外检测器；检测波长为220—245nm；

(4)将待检样品、空白样和青霉素类的酶解产物标样用高效液相色谱仪按照(3)中的液相条件进行检测；

3.以酶解产物标样的出峰时间为定性依据，确定待检样品中酶解产物是否存在以及存在的浓度。

本发明的上述检测方法通过将含有(或者未含有)抗生素酶解物的乳品(包括原料乳或乳制品)，经过包括去除乳脂肪、乳蛋白质等大分子成份的前处理，在设定的检测条件下用HPLC进行测定，从而能够有效地检测乳品中残留的青霉素类抗生素的酶解产物，能够检测到的酶解产物的最低限为40μg/l，准确率高。

其中，上述检测方法优选在配好流动相之后，予以放置，目的是使流动相的PH值更加稳定。

在本发明的检测方法中，作为青霉素类抗生素酶解产物的标样青霉噻唑酸钾等标样的浓度可以至少是40μg/l，优选为40-200μg/l，最优选100μg/ml。

在用高效液相方法进行检测的时候，流动相可以是醇和磷酸盐的混合液，例如，甲醇和磷酸二氢钠的混合液，或甲醇和磷酸氢二钾的混合液，优选甲醇和磷酸二氢钠的混合液；该混合液中甲醇和磷酸二氢钠/磷酸二氢钾的体积比优选为1：3～3：1，更优选1：2～2：1，最优选1：1。

利用高效液相进行检测所采用的仪器包括波长检测器，为了得到更好的干扰最少的HPLC图谱，经过筛选，所述的检测波长一般可以选择在210—255nm，优选为220—245nm，更优选230—240nm，最优选大约为235nm；当流动相为1：1(体积比)的甲醇和磷酸盐(例如甲醇和磷酸二氢钠)时，最优选的检测波长为235nm。

本发明的检测方法中，所述的HPLC采用色谱柱优选为反相色谱柱，更优选C18反相色谱柱，例如ODS C18柱，在本发明的优选实施例中，色谱柱为ZORBOXODS C18柱，柱的规格一般是常用的该类商品的规格，没有特殊限制，在本发明的优选实施例中，柱子的规格为4.6×250mm；所述的柱温一般为30—50℃，优选大约40℃；所述的流动相的流速大约为0.1—10ml/min，本发明在很多实施方式中选择1：1(体积比)的甲醇和磷酸二氢钠作为流动相时，流速约1ml/min。

经过多次实验证明，本发明的检测方法中所制备的待测样品，优选是先进行脱脂之后再醇沉、离心、取上清液、过滤得到的，其中，脱脂的步骤可以是任何常规方法，本发明的优选实施例中采用将待检乳样通过在0—15℃，优选在大约4℃下，经过离心分离除去上层的脂肪层的方法得到脱脂乳；而该脱脂乳加入乙醇(优选无水乙醇)离心后抽取的上清液再经过用0.45μm的滤膜过滤的步骤，过滤后的清液为待检样品。

在本发明的优选实施例中，通过以下技术方案来实现本发明的目的：

一种乳和乳制品中残留的青霉素类抗生素酶解产物——青霉噻唑酸钾等残留物的高效液相色谱检测方法，包括：

1.样品的预处理，其为：

1).取30ml待检乳样于30ml离心管中，在4℃，4000转/分钟的条件下离心10min；

2).去掉最上面的脂肪层，得到脱脂乳；

3).取脱脂乳10ml于50ml离心管中，加入20ml的无水乙醇(化学纯)，在4℃，20000转/min的条件下，离心10min；

4).抽取上清液5ml，再用0.45μm的滤膜过滤，过滤后的清液为待检样品；

2.用高效液相进行操作，包括：

2.1.取空白样品30ml(进口乳粉做的还原奶，例如新西兰进口的恒天然奶粉)，按上述预处理的操作步骤处理后，作为空白样，待用；

2.2.取一定量的浓度大于40μg/l的青霉素类的酶解产物青霉噻唑酸钾等作为标样，待用；

2.3.液相条件：色谱柱：ZORBOX ODS C18，4.6×250mm；流动相：甲醇∶磷酸二氢钠(0.018g/ml)(V:V＝50:50)；检测器：紫外检测器；检测波长：235nm；柱温：40℃；流速：1ml/min；每次进样10μl，每个样品需要8min；其中，流动相必须在配好之后，放置一段时间，使PH值较稳定；

2.4.将处理好的待检样品和空白样和青霉噻唑酸钾等标样用高效液相色谱仪检测；

2.5.结果判定：以青霉噻唑酸钾等标样的出峰时间为定性判定依据，出峰时间为3.7±0.1分钟，即可检测出待检样品中是否含有青霉素类的酶解产物青霉噻唑酸钾以及该青霉噻唑酸钾的浓度。

检测的下限是青霉素类的酶解产物青霉噻唑酸钾的浓度为40μg/l。

上述本发明的检测方法可以定性乳和乳制品中是否含有残留的青霉素类抗生素酶解残留物，对原料乳和乳制品的品质安全检测提供可靠的依据，对于乳品企业控制原奶质量提供强有力的检测手段和方法，使当前不法奶站对原奶做手脚等现象得到完全控制，对于出口奶粉的安全性检测提供有力的方法支持。该方法具有样品前处理简单、快速、定性准确、重复性好的特点，方法简便，对操作无特殊要求，易于推广。

附图说明

图1：本发明的以青霉噻唑酸钾标样的出峰时间为依据的HPLC检测图谱。

图2：本发明的检测方法可以测定的青霉噻唑酸钾浓度下限的HPLC图谱。

图3：流动相为30:70的甲醇：磷酸二氢钠的HPLC图谱。

图4：流动相为60:40的甲醇：磷酸二氢钠的HPLC图谱。

图5：检测波长220nm时青霉噻唑酸钾标样的HPLC检测图谱。

图6：检测波长245nm时青霉噻唑酸钾标样的HPLC检测图谱。

图7：原料乳中酶解残留物的HPLC检测图谱。

图8：奶粉中酶解残留物的HPLC检测图谱。

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。

本发明用于检测青霉素类的酶解产物，所述的青霉素类包括青霉素盐，例如青霉素钾盐、青霉素钠盐等，在本发明的实施例中，均以业内普遍实施的青霉素钾为例。

实施例1：

实验目的：最佳检测条件下的出峰时间

实验采用100ppb(μg/l)浓度青霉素钾的酶解产物(青霉噻唑酸钾)为测试样，以进口无抗乳粉做的还原奶为空白样品。

实验步骤：

1.将浓度为100ppb(μg/l)的青霉噻唑酸钾标样加到空白牛乳中；

2.将样品取30ml，放于30ml离心管中，在4℃，4000转的条件下离心10min；

3.小心去掉样品最上面的脂肪层；

4.吸取上述脱脂乳样10ml于50ml离心管中，加入20ml无水乙醇(化学纯)，于4℃、20000转离心10min；

5.用5ml玻璃注射器分别抽取上清液5ml，再用0.45μm的滤膜(有机相)过滤，过滤后的清液待用；

其中：过滤膜只用一次，即一个样品对应一个过滤膜；

6.取空白样品30ml，不加青霉噻唑酸钾，按上述操作步骤处理后，作为空白样待用；

7.取1ml100ppb上述处理后的青霉噻唑酸钾标样，待用；

8.液相条件的选择：色谱柱：ZORBOX ODS C18，4.6×250mm；流动相：甲醇∶磷酸二氢钠(0.018g/ml)(V:V＝50:50)；检测器：紫外检测器；检测波长：235nm；柱温：40℃；流速：1ml/min。

其中：流动相必须在配好之后，放置3个小时，使PH值较稳定。

9.将处理好的待检样品和对照样及青霉噻唑酸钾标样用HPLC进行检测。

10.结果判定：结果以青霉噻唑酸钾标样的出峰时间为定性依据。

见图1，图1是样7所对应的图谱，本发明以青霉噻唑酸钾标样的出峰时间为依据的HPLC图谱。

由图可以看出，100ppb(μg/l)青霉噻唑酸标样的出峰时间为3.731min，空白样品在3.731min处没有出峰，由此判断样品含有青霉噻唑酸钾。

实施例2：

目的：检测限(40μg/l)的验证实验。

方法：

1)将浓度为40μg/l酶解产物标样，即青霉噻唑酸钾，添加到空白牛乳(进口无抗乳粉做的还原奶)中；

2)取样品30ml，放于30ml离心管中，4℃以及4000转离心10min；

3)去掉离心后的离心管样品中最上面的脂肪层；

4)吸取脱脂乳10ml于50ml离心管中，加入20ml无水乙醇(化学纯)，于4℃、20000转离心10min；

5)用5ml玻璃注射器分别抽取上清液5ml，再用0.45μm的滤膜(有机相)过滤，过滤后的清液待用；

6)取空白样品30ml(进口无抗乳粉做的还原奶)，不加青霉噻唑酸钾，按上述操作步骤处理后，作为空白样待用；

7)取1ml40ppb(μg/l)的上述处理后的青霉噻唑酸钾标样，待用；

8)液相条件的选择：色谱柱：ZORBOX ODS C18，4.6×250mm；流动相：甲醇∶磷酸二氢钠(0.018g/ml)(V:V＝50:50)；检测器：紫外检测器；检测波长：235nm；柱温：40℃；流速：1ml/min；

其中：流动相必须在配好之后，放置至少3小时，使PH值较稳定；

9)将处理好的待检样品和对照样以及标样用高效液相色谱仪检测；

10)结果判定：结果以青霉噻唑酸钾标样的出峰时间为定性依据。见图2。图2是本发明的检测方法可以测定的青霉噻唑酸钾浓度下限的HPLC图谱。

由图可以看出，青霉噻唑酸标样的出峰时间为3.743min，空白样品在3.743min处没有出峰，由此验证了本方法的检测限为40ppb，高于此浓度的青霉素酶解残留物用此方法都可以进行检测。

实施例3：

目的：流动相的筛选实验。

方法：流动相为甲醇：磷酸二氢钠30:70，其他条件与实施例1相同。

结果见图3。图3是流动相为30:70的甲醇：磷酸二氢钠的HPLC图谱。青霉噻唑酸钾的出峰时间是2.764—2.766。

当甲醇和磷酸二氢钠为60:40，其他方法同上。

结果见和图4。

图4是流动相为60:40的甲醇：磷酸二氢钠的HPLC图谱。青霉噻唑酸钾的出峰时间是12.651。

经过实验证明，流动相(体积比)为1：3～3：1的甲醇∶磷酸盐，该磷酸盐包括磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，均可以测出酶解产物，优选流动相为1：2.5～3：2的甲醇：磷酸盐。

实施例4：

目的：检测波长的变化范围实验

方法：实验1中的检测波长改变为220nm，其他条件同实施例1，结果见图5。图5是检测波长220nm时青霉噻唑酸钾标样的HPLC检测图谱。出峰时间是3.718。

当检测波长为245nm时，其他条件同上，结果见图6。

图6是检测波长245nm时青霉噻唑酸钾标样的HPLC检测图谱。tR是3.718。

结果证明，检测波长在220—245nm范围内均可以测出酶解产物。但是其他条件均相同的情况下，峰形状最好的是检测波长约为230—235nm的色谱峰。

实施例5：

本实施例为原料乳中酶解残留物(酶解产物)青霉噻唑酸钾的检测实例

方法：样品为奶站送样。其他条件同实施例1。

结果见图7。

图7为原料乳中酶解残留物青霉噻唑酸钾的HPLC检测图谱。

实施例6：

本实施例是奶粉中酶解残留物青霉噻唑酸钾的检测实例。

方法：样品为市场购买工业奶粉，其他条件同实施例1。

结果见图8。

图8是奶粉中酶解残留物青霉噻唑酸钾的HPLC检测图谱。

实验证明，无论是液态奶还是固态奶(例如奶粉、奶酪或者奶片)，只要曾经加入过抗生素并且试图用酶解的方式掩盖抗生素的存在，即使酶解产物的量很小(痕量)，采用本发明的方法也完全可以检测出乳和乳制品中是否添加过抗生素，从源头上确保了乳和乳制品及其进一步的加工产品的质量安全。

Claims

1.一种残留的青霉素类抗生素酶解产物的检测方法，其特征在于，该方法包括：

(1)样品的预处理，该预处理的步骤包括，取待检乳样离心；去掉上层的脂肪层，得到脱脂乳；在脱脂乳中加入无水乙醇，离心；抽取上清液，过滤，得到清液作为待检样品；

(2)检测，该检测的步骤包括，取空白样品按上述(1)中的预处理的步骤处理后，作为空白样；取浓度至少为40μg/l的青霉噻唑酸钾作为酶解产物标样；将待检样品、空白样和酶解产物标样用高效液相的方法进行检测；

(3)高效液相的液相条件包括，色谱柱为反相色谱柱；流动相为体积比1：3～3：1的甲醇：磷酸盐，该磷酸盐包括磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；检测器为紫外检测器；检测波长为220—245nm；

(4)以酶解产物标样的出峰时间为定性依据，检测待测样品中残留的青霉素类抗生素酶解产物。

2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(2)所述的青霉噻唑酸钾的浓度为40—500μg/l。

3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(3)所述的甲醇和磷酸盐的体积比为1:1。

4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(3)所述的检测波长为230—240nm。

5.权利要求4所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(4)所述的出峰时间为3.5—3.9分钟。

6.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(3)所述的色谱柱为C18反相色谱柱。

7.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(3)还包括柱温为30—50℃。

8.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(3)还包括流速为0.5—2ml/min。

9.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(1)所述的待检乳样通过在0—15℃下经过离心分离除去上层的脂肪层来得到脱脂乳。

10.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法中步骤(1)所述的脱脂乳加入无水乙醇离心后抽取的上清液经过用0.45μm的滤膜过滤的步骤，过滤后的清液为待检样品。