CN101759803A

CN101759803A - 水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法

Info

Publication number: CN101759803A
Application number: CN200910194323A
Authority: CN
Inventors: 方富永; 苗艳丽; 宋文东; 王宏波
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2010-06-30

Abstract

一种水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，包括了原材料菲牛蛭水解血的处理、水蛭素粗品提取及水蛭素粗品纯化等步骤，将原材料处理后，加入生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀。取水相备用，沉淀用组织捣碎机捣成浆状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀。取水相备用，沉淀再用组织捣碎机捣成浆状后，用生理盐水重复处理一次。离心，去沉淀取水相。合并3次的水相，加入硫酸钠使浓度为0.04～0.06mol·L^-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为28～30％，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀，冷冻干燥得到水蛭素。本发明工艺过程简单，生产周期短，乙醇使用量少，水蛭素提取率高。

Description

水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法

技术领域

本发明属医药制剂技术领域，涉及一种水蛭素的提取技术，特别是以菲牛蛭水解血为原材料的水蛭素提取技术。

背景技术

世界卫生组织统计数据表明，心脑血管疾病是当今危害人类健康的主要疾病。血栓是导致心脑血管疾病发生的主要原因，而凝血酶是导致血栓形成的主要因素。水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，能与凝血酶特异性结合使之丧失凝血活力。目前，水蛭素主要以菲牛蛭、欧洲医用水蛭、印度水蛭、亚马逊巨型水蛭等为原材料提取。临床试验表明，水蛭蛭素既能使血栓融化从而消除或缓解病情，也能防止血栓形成，具有极好的预防和治疗血栓性心脑血管疾病的效果。现存的水蛭素类药物剂型主要为注射剂和口服片剂。

目前，国内外提取水蛭素的方法有多种。例如1970年Markwardt采用的乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得水蛭素。中国专利<申请号>92107076<发明名称>医用天然水蛭素的提取方法，是将水蛭捣碎成浆状，加热，用冰醋酸调pH值，冷却至室温，用Na₂CO₃溶液调pH值，离心收集滤液，沉淀用生理盐水浸提2～3次，离心收集液滤。合并全部液滤，透析，透析液用95％以上的乙醇沉淀，静置，收集沉淀，低温干燥得到水蛭素。水蛭素可以用于生产口服片剂或口服液。这些工艺的不足之处是提取步骤多，过程复杂，周期长。

为了提高水蛭资源的利用率，近年已有人利用水蛭水解血为原材料提取水蛭素。水蛭水解血是让水蛭充分吸取动物血数分钟后，用物理或化学的方法使血液从水蛭体内流出的橙红色的液体。

发明内容

本发明的目的是提供一种水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，以菲牛蛭水解血为原材料，提高水蛭资源的利用率。

本发明包括原材料处理、水蛭素粗品提取及水蛭素粗品纯化等步骤，将原材料处理后，加入生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀用组织捣碎机捣成浆状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀再用组织捣碎机捣成浆状后，用生理盐水重复处理一次；离心，去沉淀取水相；合并3次的水相，得水蛭素粗品提取液；水蛭素粗品提取液加入硫酸钠使浓度为0.04～0.06mol·L^-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为28～30％，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀称重后溶解于生理盐水中；加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀，冷冻干燥得到水蛭素。

所述的原材料处理是，将菲牛蛭水解血边搅拌边加热至全部凝固后取出，迅速冷却至室温，于组织捣碎机中以10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状。

所述的水蛭素粗品提取是，将预处理过的浆状原材料加入2～2.5倍重量的生理盐水搅拌2.5～3小时，离心取水相，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1.5～2倍生理盐水，240～300r/min搅拌2～2.5小时，离心取水相，沉淀再用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1～1.5倍生理盐水搅拌2～2.5小时，离心去沉淀，取水相，合并3次的水相，此即为水蛭素粗品水溶液。

所述的水蛭素纯化是在水蛭素粗品水溶液中加入硫酸钠使浓度为0.04～0.06mol·L^-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为28～30％，240～300r/min搅拌30分钟，离心分离形成上、下相，取上相水溶液，加入2.8～3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心，取沉淀，冷冻干燥得到水蛭素。

关键试剂优选的使用浓度为：硫酸钠0.05mol·L^-1、聚乙二醇6000质量浓度为29％。

与现有的技术相比，本发明的突出的优点和显著的进步是：

1、本发明由于没有层析的操作步骤，所以过程简单，生产周期明显缩短。

2、本发明由于没有透析的操作步骤，具有提取液体积小，水蛭素浓度高，可以提高水蛭素的收率并使乙醇的使用量明显减少。

具体实施方式

实施例1：

1)将菲牛蛭水解血240～300r/min边搅拌边加热，至菲牛蛭水解血全部变凝胶状后取出，迅速冷却至室温。

2)取一定量凝胶状的菲牛蛭水解血于组织捣碎机中以10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状。

3)取一定量浆状物按重量加入2～2.5倍的生理盐水240～300r/min搅拌2.5～3小时。

4)4000～4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状。

5)按步骤2)的重量加入1.5～2倍生理盐水240～300r/min搅拌2～2.5小时。

6)4000～4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状。

7)按步骤2)的重量加入1～1.5倍生理盐水240～300r/min搅拌2～2.5小时，4000～4500r/min离心10分钟去沉淀，取水相备用。

8)合并3次的水相，量体积。加入硫酸钠使浓度为0.05mol·L^-1，加聚乙二醇6000使质量浓度为29％，240～300r/min搅拌30分钟。

9)4000～4500r/min离心20分钟，分离上、下相。

10)取上相水溶液加入2.8～3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，4000～4500r/min离心10分钟取沉淀。

11)沉淀冷冻干燥得水蛭素。

实施例2：

根据实施例1，加入硫酸钠使浓度为0.04mol·L^-1，加聚乙二醇6000使质量浓度为30％，其余同实施例1。

实施例3：

根据实施例1，加入硫酸钠使浓度为0.06mol·L^-1，加聚乙二醇6000使质量浓度为28％，其余同实施例1。

Claims

1.一种水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，其特征是包括原材料处理、水蛭素粗品提取及水蛭素粗品纯化步骤，将原材料处理后，加入生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀用组织捣碎机捣成浆状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀再用组织捣碎机捣成浆状后，用生理盐水重复处理一次；离心，去沉淀取水相；合并3次的水相，得水蛭素粗品提取液；水蛭素粗品提取液加入硫酸钠使浓度为0.04～0.06mol·L^-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为28～30％，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀称重后溶解于生理盐水中；加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀，冷冻干燥得到水蛭素。

2.据权利要求1所述的水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，其特征是所述的原材料处理是将菲牛蛭水解血边搅拌边加热至全部凝固后取出，迅速冷却至室温，于组织捣碎机中以10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状。

3.据权利要求1所述的水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，其特征是所述的水蛭素粗品提取是将预处理过的浆状原材料加入2～2.5倍重量的生理盐水搅拌2.5～3小时，离心取水相，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1.5～2倍生理盐水，240～300r/min搅拌2～2.5小时，离心取水相，沉淀再用组织捣碎机10000～12000r/min处理1.5～2分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1～1.5倍生理盐水搅拌2～2.5小时，离心去沉淀，取水相，合并3次的水相，此即为水蛭素粗品水溶液。

4.据权利要求1所述的水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，其特征是所述的水蛭素纯化是在水蛭素粗品水溶液中加入硫酸钠使浓度为0.04～0.06mol·L^-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为28～30％，240～300r/min搅拌30分钟，离心分离形成上、下相，取上相水溶液，加入2.8～3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心，取沉淀，冷冻干燥得到水蛭素。

5.权利要求4所述的水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法，其特征是关键试剂优选的使用浓度为：硫酸钠0.05mol·L^-1、聚乙二醇6000质量浓度为29％。