发明内容
本发明的目的是提供一种结构新颖的且具有抑制蛋白酶体功能的新型硼酸和硼酸酯类化合物。它们作为20S蛋白酶体抑制剂,能阻断肿瘤细胞增殖,诱发肿瘤细胞凋亡,从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗和预防。
本发明的另一目的是提供一种上述肽硼酸及其酯类化合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供一种上述肽硼酸及其酯类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的目的具体可以通过以下措施来达到:
一种肽硼酸及其酯类化合物,其结构如式I所示,
其中:
R1为C1~10的烷基、C3~6的环烷基或杂环烷基、苯基、萘基或吲哚基,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素取代;R1优选为C1~10的烷基、苯基、萘基或吲哚基,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素取代;R1最优选为C1~10的烷基或苯基,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基或卤素取代。
R2为C1~10的烷基、C3~6的环烷基或杂环烷基、苄基、萘甲基或吲哚甲基,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素取代;R2优选为C1~10的烷基、苄基、萘甲基或吲哚甲基,任选地被C1~4的烷基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素取代;R2最优选为C1~10的烷基或苄基,任选地被C1~4的烷基取代。
Z1或Z2分别独立地为羟基、C1~10的烷基、C1~10的烷氧基或芳氧基,或者B、Z1和Z2一起形成含有N、S或O的杂环基团;Z1或Z2优选分别独立地为羟基、C1~10的烷基、C1~10的烷氧基或芳氧基,或者B、Z1和Z2一起形成硼酸-α-蒎烷二醇酯;Z1或Z2最优选分别独立地为羟基,或者B、Z1和Z2一起形成硼酸-α-蒎烷二醇酯。
Pg为C1~10的烷酰基、C1~10的烷氧酰基或芳香族酰基,或者含有N、S或O的杂环酰基基团,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、卤素或C1~4的卤代烷基取代;Pg优选为C1~10的烷氧酰基、苯酰基、吡啶酰基、吡嗪酰基,任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、卤素或C1~4的卤代烷基取代;Pg最优选为C1~10的烷氧甲酰基、苯甲酰基、吡啶甲酰基、吡嗪甲酰基任选地被C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、卤素或C1~4的卤代烷基即代。更进一步,Pg进一步优选为:
其中R3或R4分别独立地为氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氟、氯、溴或三氟甲基。
本发明R1、R2和Pg基团中的“任选地被…取代”是指R1、R2和Pg的基团可以被这些基团取代,也可以不被这些基团取代,即并不仅限于被所列举的这些基团取代的情况,也包括不被所列举的这些基团取代的情况。这种表达方式与“R1为取代或非取代的C1~10的烷基、C3~6的环烷基或杂环烷基、苯基、萘基或吲哚基,其中取代基为C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素”的表达方式相同,但是取代或非取代的限定并非仅狭义地指C1~10的烷基,而是扩大到所有所述的基团,即包括取代或非取代的C3~6的环烷基或杂环烷基、取代或非取代的苄基、取代或非取代的萘甲基、取代或非取代的吲哚甲基等,其中取代基为C1~4的烷基、C1~4的烷氧基、氰基、羟基、巯基、氨基或卤素。
术语“烷基”用于表示饱和烃基,C1~10的烷基是指含有1~10个碳原子的饱和烃基,C1~4的烷基是指含有1~10个碳原子的饱和烃基。
术语“环烷基”指非芳族碳环基,包括环化的烷基。环烷基可以包括二环或多环系统。环烷基的例子包括环丙基,环丁基,环戊基,环己基,环庚基,C3~6的环烷基是指含有1~10个碳原子的环烷基。
术语“苄基”是指苯甲基,取代的苄基是指在苄基的苯环上至少一个氢原子被非氢部分取代,苄基的取代基可以是卤素,-CN,-OH,-SH,-NH2,1-6个碳的直链或支链烷基,1-6个碳的取代的直链或支链烷基。
术语“杂环烷基”是指非芳族杂碳环基,包括环化的烷基,其中一个或多个成环碳原子被杂原子例如O,N或S原子取代。杂环烷基优选具有3,4,5,6或7个成环原子。
“1-萘甲基”是指
“2-萘甲基”是指
“吲哚甲基”是指
“烷氧基”是指-O-烷基基团,其碳原子数一般为1~10个。烷氧基的例子包括甲氧基,乙氧基,丙氧基(如,n-丙氧基和异丙氧基),t-丁氧基等。
“芳基”是指芳族碳环基,包括单环或多环芳烃例如苯基,萘基,蒽基,菲基等。
“芳氧基”是指-O-芳基,而芳基的概念如上所述,芳氧基最优选的例子是苯氧基。
“卤素”包括氟,氯,溴和碘。
本发明化合物中的R2基团可以为消旋体,也可以具有光学活性,本发明中的R2基团优选为R构型。
本发明化合物可以用以制备抗肿瘤药物,其总的制备路线为:
该反应式中各基团Pg,R1,R2,Z1,Z2的定义如前所述,式(II-1)在SOCl2作用下与甲醇反应得到式(II-2),式(II-2)在肽缩合剂下与Pg缩合生成式(II-3)或者式(II-2)与酰氯的Pg反应生成式(II-3),式(II-3)皂化再酸化生成(II);而另一边,(III-6)与金属试剂R2MgX反应,再在室温下被无水ZnCl2催化成式(III-7),式(III-7)与MN(SiMe3)2反应生成式(III-8),式(III-8)在酸性条件下脱保护形成式(III);最后(II)和(III)缩合成式(I)。式(I)还可脱除与B连接的基团从而得到硼酸产物。
以下详述本发明化合物的制备方法:
Pg,R1,R2,Z1,Z2的定义如上所述。
化合物(II)的制备方法包括如下的步骤:
1)式(II-1)结构的氨基酸在SOCl2作用下与甲醇反应得到式(II-2)结构的化合物;
2)式(II-3)结构的化合物可以通过以下两种途径来制备:a、式(II-2)结构的化合物在肽缩合剂存在下,与Pg发生缩合反应,生成式(II-3)的化合物;b、Pg首先与SOCl2发生反应生成酰氯,然后再与式(II-2)结构的化合物反应生成式(II-3)结构的化合物。
3)式(II-3)结构的化合物在碱性条件下发生皂化反应生成其钠盐,然后在酸性条件下生成化合物(II)。
其中,Pg和R1的定义如上所述。
上述反应中常见的肽缩合剂为N,N-二环己基-碳二亚胺(缩写为DCC),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(缩写为EDC·HCl),1-羟基苯并三氮唑(缩写为HOBt)或氯甲酸异丁酯。
化合物(III)的制备方法包括如下的步骤(以B、Z1和Z2一起构成硼酸-α-蒎烷二醇酯为例):
1)式(III-1)所示的α-蒎烯在氧化剂OsO4的作用下生成手性的蒎烷二醇(III-2);
2)干燥的CH2Cl2在-110℃下与正丁基锂发生反应,生成式(III-3)所示的有机金属中间体;
3)式(III-3)结构的化合物与式(III-4)所示的硼酸酯在-110℃下反应,生成式(III-5)所示的同源硼酸酯;
4)式(III-5)结构的化合物与式(III-2)结构的手性蒎烷二醇进行酯交换,生成式(III-6)所示的硼酸酯;
5)式(III-6)结构的化合物与金属试剂R2MgX在-78℃下反应,然后在室温下被无水ZnCl2催化生成式(III-7)所示的化合物;
6)式(III-7)结构的化合物与MN(SiMe3)2反应生成双(三甲基硅)保护的胺基硼酸酯如式(III-8)所示的化合物;
7)式(III-8)所示的化合物在酸性条件下将保护基双(三甲基硅)脱除生成氨基裸露的如式(III)所示的硼酸酯类化合物。
其中,R1的定义同前所述,R5是指1到4个碳原子的直链、支链或取代烷烃,X代表卤素如F、Cl、Br、I,M代表碱金属如Li、Na、K等。
最后将化合物(II)和(III)在一定的缩合剂存在下反应生成(I)。所用缩合剂为TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲脲四氟硼酸酯),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(缩写为EDC·HCl),1-羟基苯并三氮唑(缩写为HOBt)或氯甲酸异丁酯。
式(I)所示的硼酸酯化合物可以脱去酯基生成硼酸,即脱去Z1和Z2基团生成式(IV)化合物,反应方程式如下:
脱除酯基的方法有两种:一是在高碘酸钠的作用下,二醇发生断裂,生成硼酸的钠盐,将体系pH值调为酸性,得到硼酸;二是硼酸酯与空间位阻较大的硼酸(如异丁基硼酸、苯基硼酸)发生酯交换得到目的产物硼酸,经过一些分离手段得到产物。
本发明的发明人通过实验证实,本发明化合物具有良好的抑制蛋白酶体的活性和抗肿瘤活性,部分化合物在纳摩尔水平下表现出较好的蛋白酶体抑制活性和抗肿瘤作用,具有制备蛋白酶体抑制剂或抗肿瘤药物方面的应用价值。同时,本发明所设计的化合物制备方法产率较高,工艺简单,可适合于工业化生产。
具体实施方式
第一部分 化合物的合成
本发明的化合物的制备可按照如下过程实施:
一、化合物(II)的制备
1、β-氨基酸甲酯盐酸盐II-2的制备:
将不带任何保护基的β-氨基酸II-1溶解于无水甲醇中,-5℃下向反应体系中滴加SOCl2,缓慢升至室温后反应1小时,再回流1小时。蒸除溶剂,得到的固体经重结晶(甲醇/乙醚)得到β-氨基酸甲酯的盐酸盐(式II-2)。
2、氨基保护的β-氨基酸甲酯II-3的制备:
方法a:
将氨基保护剂Pg和1中所制备的β-氨基酸甲酯II-2溶于THF中,0℃下加入N-甲基吗啉及合适的肽缩合反应试剂(DCC+HOBt)。缓慢升至室温,继续反应一定时间,直至TLC显示反应完成。过滤除去不溶性固体,蒸干滤液,向得到的粘稠液体中加入适量的乙酸乙酯溶解,有机相分别用碱洗(5%碳酸氢钠),酸洗(10%柠檬酸),碱洗(5%碳酸氢钠)及饱和食盐水洗。干燥剂干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到氨基保护的β-氨基酸甲酯II-3的粗产品。粗产品未经纯化,直接用于下步皂化反应。
方法b:
在0℃下,将氨基保护剂Pg溶解于SOCl2中,加入催化量的干燥DMF,室温下反应20分钟,升温到50℃反应一定时间,蒸除未反应的SOCl2。得到保护剂Pg的酰氯。用适量的干燥甲苯溶解,干燥放置备用。
将β-氨基酸甲酯II-2溶于有机溶剂(甲苯)中,加入过量的N-甲基吗啉,在0℃下滴加上述制备的Pg的酰氯的甲苯溶液。在0℃下反应一定时间,然后缓慢升至室温反应一定时间,直至TLC显示反应完成。减压蒸除溶剂,得到的固体用适量有机溶剂(乙酸乙酯)溶解,分别用碱洗(5%碳酸氢钠),酸洗(10%柠檬酸),碱洗(5%碳酸氢钠)及饱和食盐水洗。干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到氨基保护的β-氨基酸甲酯II-3的粗产品。粗产品未经纯化,直接用于下步皂化反应。
3、化合物II的制备:
将上述制备好的II-3的粗产品溶解于有机溶剂(丙酮或甲醇)中,在0℃下加入无机碱的水溶液(2N NaOH),使体系pH值保持在11~13之间,直至TLC显示反应完成。减压蒸除有机溶剂,在0℃下滴加无机酸的水溶液(5N HCl)直至体系pH值为1~3之间。用有机溶剂(乙酸乙酯)萃取,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到较纯产物II。
二、化合物(III)的制备
1、化合物III-a的制备:
1)III-2a的制备:
将Me3NO·2H2O溶解于水中,向反应体系中加入III-1a、叔丁醇、少量吡啶及催化量的四氧化锇。一定温度下(100℃)加热回流24小时,TLC检测反应完毕。自然降至室温,加入适量还原剂(NaHSO3)及固体食盐。分液,水层用有机溶剂(乙醚)提取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到粘稠液体。过柱得到产品III-2a。
2)化合物III-3的制备:
在-110℃下,向惰性气体(如N2或Ar气)保护的无水二氯甲烷和无水四氢呋喃体系中慢慢滴加正丁基锂溶液,滴加完毕后保持-110℃继续反应1小时。得到化合物III-3的溶液。直接用于下步反应。
3)化合物III-5的制备:
在-110℃下,向2)中制备好的化合物III-3的反应体系中慢慢滴加式III-4所示的硼酸三酯,保持-110℃搅拌1小时后加入无机酸溶液(5N HCl)淬灭反应,自然升至室温。分液,水层用有机溶剂(乙醚)萃取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂得白色粘稠状固体化合物III-5。产品未经纯化直接用于下步反应。
4)化合物III-6a的制备:
将化合物III-5用有机溶剂(无水乙醚或二氯甲烷)溶解,加入制备好的III-2a,室温搅拌反应18小时后,TLC显示反应完成。分液,水相用有机溶剂(乙酸乙酯)提取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,经柱层析分离得化合物III-6a。
5)格式试剂R2MgX的制备:
在严格干燥过的反应瓶内加入镁屑、无水有机溶剂(无水THF或无水乙醚)及一小粒碘片。室温下向反应体系中滴加卤代烃R2X和无水有机溶剂(无水THF或无水乙醚)的混合溶液。用水浴将反应体系加热至微沸状态,待大部分镁反应完后,加热回流体系30分钟,使剩余的镁全部反应完全。使反应体系慢慢冷却,备用。
6)化合物III-7a的制备:
在惰性气体(如N2或Ar气)保护下,用无水有机溶剂(无水THF或乙醚)溶解III-6a,反应体系降温至—78℃。向其中慢慢滴加5)中制备好的R2MgX格式试剂的有机溶剂(无水THF或乙醚)溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末。反应体系自然升至室温,室温下继续搅拌18h后TLC显示反应完成。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离得化合物III-7a。
7)化合物III-8a的制备:
用无水有机溶剂(无水THF)溶解6)中制备好的III-7a,反应体系用惰性气体(如N2或Ar气)保护并降温至—78℃,然后慢慢滴加MN(SiMe3)2溶液。滴加完毕后,自然升至室温,室温下继续搅拌。TLC检测显示,20h后反应完毕。减压蒸除溶剂,得到粘稠液体。加入正己烷溶解,过滤除去不溶物,得到III-8a的正己烷溶液。备用。
8)化合物III-a的制备:
将上述制备好的III-8a的正己烷溶液用惰性气体(如N2或Ar气)保护并降温至—78℃。向反应体系中加入溶解氯化氢气体的有机溶剂(如二氧六环、乙醚)溶液,然后自然升至室温,析出固体。过滤,滤饼用有机溶剂(无水乙醚)洗涤,得到化合物III-a。产品未经纯化,直接用于下步反应。
2、化合物III-b的制备:
1)III-2b的制备:
将Me3NO·2H2O溶解于水中,向反应体系中加入III-1b、叔丁醇、少量吡啶及催化量的四氧化锇。一定温度下(100℃)加热回流48小时,TLC检测反应完毕。自然降至室温,加入适量还原剂(NaHSO3)及固体食盐。减压蒸馏除去有机溶剂,向残余的液体和固体的混合物中加入有机溶剂(乙醚和乙酸乙酯),分液,水层用有机溶剂(乙醚和乙酸乙酯)提取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到粘稠液体。高真空度下减压蒸馏得产品III-2b。
2)化合物III-3的制备:
在-110℃下,向惰性气体(如N2或Ar气)保护的无水二氯甲烷和无水四氢呋喃体系中慢慢滴加正丁基锂溶液,滴加完毕后保持-110℃继续反应1小时。得到化合物III-3的溶液。直接用于下步反应。
3)化合物III-5的制备:
在-110℃下,向2)中制备好的化合物III-3的反应体系中慢慢滴加式III-4所示的硼酸三酯,保持-110℃搅拌1小时后加入无机酸溶液(5N HCl)淬灭反应,自然升至室温。分液,水层用有机溶剂(乙醚)萃取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂得白色粘稠状固体化合物III-5。产品未经纯化直接用于下步反应。
4)化合物III-6b的制备:
将化合物III-5用有机溶剂(无水乙醚或二氯甲烷)溶解,加入制备好的III-2b,室温搅拌反应24小时后,TLC显示反应完成。减压蒸除有机溶剂,向剩余粘稠液体中加入有机萃取剂(乙酸乙酯或乙醚),分液,水相用有机溶剂(乙酸乙酯或乙醚)提取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,经柱层析分离得化合物III-6b。
5)格式试剂R2MgX的制备:
在严格干燥过的反应瓶内加入镁屑、无水有机溶剂(无水THF或无水乙醚)及一小粒碘片。室温下向反应体系中滴加卤代烃R2X和无水有机溶剂(无水THF或无水乙醚)的混合溶液。用水浴将反应体系加热。使溶液呈微沸状态,待大部分镁反应完后,加热回流体系30分钟,使剩余的镁全部反应完全。使反应体系慢慢冷却,备用。
6)化合物III-7b的制备:
在惰性气体(如N2或Ar气)保护下,用无水有机溶剂(无水THF或乙醚)溶解III-6b,反应体系降温至—78℃。向其中慢慢滴加5)中制备好的R2MgX格式试剂的有机溶剂(无水THF或乙醚)溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末。反应体系自然升至室温,室温下继续搅拌24h后TLC显示反应完成。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离得化合物III-7b。
7)化合物III-8b的制备:
用无水有机溶剂(无水THF)溶解6)中制备好的III-7b,反应体系用惰性气体(如N2或Ar气)保护并降温至—78℃,然后慢慢滴加MN(SiMe3)2溶液。滴加完毕后,自然升至室温,室温下继续搅拌。TLC检测显示,24h后反应完毕。减压蒸除溶剂,得到的粘稠液体。加入大量干燥的石油醚溶解,过滤除去不溶物,得到III-8b的石油醚溶液,备用。
8)化合物III-b的制备:
将上述制备好的III-8b的石油醚溶液用惰性气体(如N2或Ar气)保护并降温至—78℃。向反应体系中加入溶解氯化氢气体的有机溶剂(如二氧六环、乙醚)溶液,然后自然升至室温,析出固体。过滤,滤饼用干燥的有机溶剂(无水乙醚)洗涤,得到化合物III-b。产品未经纯化,直接用于下步反应。
三、化合物(I)的制备
1、硼酸酯(I)的制备:
将II及III溶解在有机溶剂(如THF、CH2Cl2)中,冷却到-5℃,加入N-甲基吗啉及缩合剂(TBTU或EDC·HCl+HOBt或氯甲酸异丁酯),反应2小时后,升至室温反应1小时。过滤除去不溶性固体,减压蒸干溶剂。得到的固体用有机溶剂(乙酸乙酯)溶解,有机相分别用碱洗(5%碳酸氢钠),酸洗(0.1N盐酸),碱洗(5%碳酸氢钠)及饱和食盐水洗。有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂得玻璃状固体化合物硼酸酯I。
2、硼酸(IV)的制备:
方法a:酯交换法
用有机溶剂(如乙醚和CH2Cl2)溶解1中制备的硼酸酯I,加入水及苯基硼酸。室温搅拌反应4小时后TLC显示反应完成。有机相用水提取3遍,合并水相,减压蒸发至干。得到的粘稠固体用少量乙醚洗涤,得到胶状固体化合物硼酸IV。
方法b:氧化断裂法
用有机溶剂(丙酮或甲醇)溶解1中制备的硼酸酯I,然后加入醋酸铵水溶液及NaIO4。室温下搅拌24小时后,TLC显示反应完成。减压蒸除有机溶剂,水相用无机酸(盐酸)调节pH值为3,用有机溶剂(乙酸乙酯或CH2Cl2)萃取,合并有机相,有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠和无水硫酸镁)。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂得泡沫状固体化合物硼酸IV。
以下以具体化合物的合成来描述本发明的化合物制备过程:
一、式(II)中化合物的制备:
1、N-苯甲酰基-β-苯丙氨酸(3aA)的制备
(1)β-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(1a)的制备
在100mL反应瓶中加入25mL无水甲醇,冰盐浴冷却到-10℃以下,搅拌下缓慢滴加SOCl2(7mL,96mmol),然后于-10℃以下反应10min,再加入β-苯丙氨酸(1.65g,10mmol),低温反应40min,撤去冰盐浴,于室温反应48h,减压浓缩,再加入15mL甲醇,反复减压浓缩两次。加入50mL乙醚,放置,析出针状结晶,过滤干燥,粗产品再用甲醇—乙醚重结晶,得白色晶体β-苯丙氨酸甲酯盐酸盐2.0g,收率95%,[α]D 25=+37.2°(c=1,CH3CH2OH),m.p.:155-158℃。
本发明中所用到的其它β氨基酸甲酯的盐酸盐可以采用上述步骤制备,化合物1b:按合成化合物1a的方法采用β-4-甲基苯基丙氨酸合成;化合物1c:按合成化合物1a的方法采用β-4-氯苯基丙氨酸合成;化合物1d:按合成化合物1a的方法采用β-4-甲氧基苯基丙氨酸合成。合成的具体化合物及其性质如下表。
(2)N-苯甲酰基-β-苯丙氨酸甲酯(2aA)的制备
方法a:DCC缩合法
将化合物1a(1.12g,5.2mmol)溶于20mL THF中,用N-甲基吗啉(NMM)(0.7mL,6.2mmol)中和,于冰浴下冷却备用。在另一反应瓶中加入苯甲酸(0.64g,5.2mmol),用THF 20mL溶解,冰水浴冷却,于0℃加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.07g,5.2mmol),HOBt(0.84g,6.2mmol),于0℃反应40min,然后加入已制备并冷却好的中和完毕的1a的THF溶液。TLC检测反应,4h后反应完毕,过滤除去不溶物N,N’-二环己基脲(DCU),滤液加入乙酸乙酯150mL,分别用5%NaHCO3溶液(30mL)、10%的柠檬酸溶液(30mL)、5%NaHCO3溶液(30mL)和饱和食盐水溶液洗涤(2×20mL)。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,减压蒸除溶剂,得化合物1.44g,产物为白色固体,收率98%。产品未经纯化,直接用于下步反应。
方法b:酰氯法
在室温下,向苯甲酸(0.64g,5.2mmol)中加入SOCl2(3.8ml,52mmol),然后加入催化量的干燥DMF。反应20分钟,再升温回流反应1小时,停止反应。蒸除未反应的SOCl2。得到苯甲酰氯。将之溶解于10ml干燥的THF中,备用。
将化合物1a(1.12g,5.2mmol)溶于20mL THF中,加入N-甲基吗啉(NMM)(0.7mL,6.2mmol),在0℃下滴加上述制备好的苯甲酰氯的THF溶液。在0℃下反应2小时,然后缓慢升至室温反应1小时,TLC显示反应完成。减压蒸除溶剂,得到的固体用30ml乙酸乙酯溶解,分别用5%碳酸氢钠(30mL)、10%柠檬酸(30mL)、5%碳酸氢钠(30mL)及饱和食盐水洗(2×20mL)。有机相用无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂,减压蒸干溶剂,得到粘稠的白色固体1.42g,收率96.9%。产品未经纯化,直接用于下步皂化反应。
鉴于DCC缩合法得到的产品不但产率高,而且色泽较好,所以本发明中所用到的其它氨基保护的氨基酸甲酯可以采用实施例(2)中所述的DCC缩合法制备,所有甲酯均未纯化,直接用于下步反应。
化合物2bA:按DCC缩合法利用苯甲酸和1b合成;2cA:按DCC缩合法利用苯甲酸和1c合成;2dA:按DCC缩合法利用苯甲酸和1d合成;2aB:按DCC缩合法利用烟酸(吡啶-3-甲酸)和1a合成;2bB:按DCC缩合法利用烟酸和1b合成;2cB:按DCC缩合法利用烟酸和1c合成;2dB:按DCC缩合法利用烟酸和1d合成;2aC:按DCC缩合法利用吡嗪甲酸和1a合成;2bC:按DCC缩合法利用吡嗪甲酸和1b合成;2cC:按DCC缩合法利用吡嗪甲酸和1c合成;2dC:按DCC缩合法利用吡嗪甲酸和1d合成。
合成的具体化合物及其性质如下表。
(3)N-苯甲酰基-β-苯丙氨酸(3aA)的制备
将化合物2aA(1.0g,3.53mmol)用10mL丙酮溶解,冰水浴下慢慢滴加2N NaOH至pH值为12~13,继续保持冰水浴中反应,TLC检测,2h后反应完毕。冰水浴下滴加盐酸至pH值为2~3,产生大量白色固体,过滤产生的沉淀,用水、乙醚洗涤后真空干燥,得白色产品0.89g,收率93.7%,m.p.:198.6-199.8℃。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ2.78(-CH2,q,J1=6.15,J2=9.53,1H),2.90(-CH2,q,J1=6.73,J2=8.95,1H),5.42~5.45(-CH,m,1H),7.23~7.25(-Ph,m,1H),7.32(-Ph,t,J1=7.84,2H),7.40~7.42(-Ph,m,2H),7.45~7.48(-Ph,m,2H),7.51~7.62(-Ph,m,1H),7.84~7.86(-Ph,m,2H),8.86(-CONH,d,J=8.25,1H),12.15(-COOH,br,1H)。MS(ESI):observed:m/z 268.0[M-H]-,calcd:269.1。
本发明中所用到的其它氨基保护的氨基酸可以采用实施例(3)中所述的方法制备。
3bA:将2bA采用实施例(3)的方法合成;3cA:将2cA采用实施例(3)的方法合成;3dA:将2dA采用实施例(3)的方法合成;3aB:将2aB采用实施例(3)的方法合成;3bB:将2bB采用实施例(3)的方法合成;3cB:将2cB采用实施例(3)的方法合成;3dB:将2dB采用实施例(3)的方法合成;3aC:将2aC采用实施例(3)的方法合成;3bC:将2bC采用实施例(3)的方法合成;3cC:将2cC采用实施例(3)的方法合成;3dC:将2dC采用实施例(3)的方法合成;
合成的具体化合物及其性质如下表。
二、式(III)中化合物的制备:
1、化合物III-a的制备:
(1)(+)-α-蒎烷二醇(化合物III-2a)的制备
将Me3NO·2H2O(165.6g,1.49mol)用216mL水溶解,搅拌下依次加入(+)α-蒎烯1b(191.4g,1.4mol)、1L叔丁醇、108mL吡啶和四氧化锇(1g,3.9mmol)。然后通入氮气,10分钟后,加热至100℃回流。TLC检测显示,72小时反应完毕。自然降至室温,加入NaHSO3(20g,0.19mol)搅拌60分钟,待溶液颜色变为淡黄色时,再加入60g的NaCl,再搅拌10分钟后,减压蒸除有机溶剂。釜底残液用3×200mL乙醚提取,合并有机相,并用无水硫酸钠干燥。减压蒸除有机溶剂,得到的红棕色液体高真空度下减压得白色固体230.1g,收率96.5%,[α]D 20=+8.3°(c=6.5,甲苯),m.p.:53-56℃。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.94(3H,s),1.27(3H,s),1.31(3H,s),1.37(1H,d,J=5.4),1.62~1.66(1H,m),1.91~1.93(1H,m),2.01(1H,t,J=5.8),2.18~2.21(1H,m),2.44~2.48(1H,m),2.81~2.95(2H,m),3.97~4.00(2H,q,J=5.0)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ 24.15,27.89,28.08,29.64,38.18,39.00,40.60,54.10,69.27,73.88.
(2)二氯亚甲基锂(化合物III-3)的制备
在250mL三口瓶中加入无水二氯甲烷(4.26mL,66mmol)和120mL无水四氢呋喃,通入氮气,降温至—110℃,然后慢慢滴加正丁基锂的正己烷溶液(25.2mL,60mmol),滴加完毕后低温继续搅拌1小时。溶液直接用于下步反应。
(3)二氯亚甲基硼酸二甲酯(化合物III-5-1)的制备
在—110℃下,向上述制备好的化合物III-3a的溶液中加入硼酸三甲酯(7.5mL,66mmol),继续低温搅拌1小时后加入5N HCl溶液12mL,自然升至室温。反应液转入分液漏斗,分出有机相,水层用乙醚提取(2×10mL),合并有机相,无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂得白色粘稠状固体9.3g,收率99.4%。产品未经纯化直接用于下步反应。
(4)二氯亚甲基硼酸二异丙酯(化合物III-5-2)的制备
在—110℃下,向已制备好的化合物III-3a的溶液中加入硼酸三异丙酯(9.3mL,40mmol),继续低温搅拌2小时后加入5N HCl溶液10mL,自然升至室温。反应液转入分液漏斗,分出有机相,水层用乙醚提取(2×15mL),合并有机相,无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂得白色粘稠状固体8.73g,收率>100%。产品未经纯化直接用于下步反应。
(5)二氯亚甲基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-6a)的制备
方法a:从化合物III-5-1出发
在25mL瓶中加入化合物II-2a(32.2g,0.19mol)和化合物III-5-1(51.6g,0.33mol)。再加入30mL THF溶解,室温下搅拌。TLC检测,20h后反应完毕。柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:18)得无色液体49.4g,收率98.9%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.85(3H,s),1.21(1H,d,J=11.2),1.31(3H,s),1.46(3H,s),1.93~1.97(2H,m),2.13(1H,t,J=5.2),2.27~2.30(1H,m),2.38~2.39(1H,m),4.47(2H,dd,J=8.8),5.40(IH,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ23.90,26.19,26.95,28.19,35.00,38.32,39.23,51.17,79.43,88.03。
方法b:从化合物III-5-2出发
在60mL瓶中加入化合物II-2a(2g,0.012mol)和化合物III-5-2(6.36g,0.03mmol)。再加入20mL THF溶解,室温下搅拌。TLC检测,48h后反应完毕。柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:15)得无色液体2.92g,收率92.7%。
(6)2-甲基-4-氯-丁基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-7a)
于250mL三口瓶中加入剪碎的镁条(1.45g,60mmol)、70mL无水四氢呋喃,再加入一小粒碘,室温下滴加叔丁基溴(8.22g,60mmol)的四氢呋喃溶液30ml,滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得叔丁基格式试剂的四氢呋喃溶液。干燥放置备用。
将二氯甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6a(15.78g,60mmol)用100mL无水四氢呋喃溶解。通入干燥的氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加上述制备好的叔丁基格式试剂的四氢呋喃溶液,滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(4.09g,30mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,18h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:200)得无色液体15.26g,收率89.5%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.85(-CH3,s,3H),0.92(-CH3,q,J=6.6,6H),1.19(-CH2,d,J=11.0,1H),1.30(-CH3,s,3H),1.42(-CH3,s,3H),1.60~1.66(-CH2,m,1H),1.78~1.80(-CH2,m,IH),1.88~1.94(-CH2,-CH,m,3H),2.09(-CH,t,J=5.1,1H),2.24~2.26(-CH,m,1H),2.34~2.37(-CH2,m,1H),3.51~3.55(-CH,m,1H),4.35~4.37(-CH,m,1H)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ21.22,21.27,22.85,23.94,25.58,25.64,26.30,27.02,28.41,35.28,38.25,39.40,42.81,51.26,78.50,86.63。
(7)5-氯-戊基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-8a)
于100mL三口瓶中加入剪碎的镁条(0.14g,6mmol)、20mL无水乙醚,再加入一小粒碘,室温下滴加正丁基溴(0.82g,6mmol)的乙醚溶液10ml,滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得正丁基格式试剂的乙醚溶液。干燥处放置备用。
将二氯亚甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6a(1.58g,6mmol)用20mL乙醚溶解,室温下搅拌。通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加制好的正丁基格式试剂的乙醚溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(0.41g,3mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,18h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:250)得无色液体1.44g,收率84.5%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.85(3H,s),0.91(3H,t,J=7.2),1.18(1H,dd,J=11.0),1.30(3H,s),1.31~1.41(3H,m),1.42(3H,s),1.48~1.51(1H,m),1.82~1.95(4H,m),2.09(1H,t,J=5.2),2.23~2.28(1H,m),2.33~2.39(1H,m),3.44~3.48(1H,m),4.36(1H,dd,J=8.8)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ 13.91,22.19,23.94,26.34,27.02,28.45,29.50,33.91,35.29,38.22,39.41,51.24,78.51,86.65。
(8)1-苯基-2-氯-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-9a)
于100mL三口瓶中加入剪碎的镁条(0.12g,5mmol)、20mL无水乙醚,再加入一小粒碘,室温下滴加苄氯(0.63g,5mmol)的乙醚溶液10ml,滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得苄氯的格式试剂的乙醚溶液。干燥处放置备用。
将二氯亚甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6a(1.31g,5mmol)用20mL乙醚溶解,室温下搅拌。通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加制好的苄氯的格式试剂的乙醚溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(0.41g,3mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:15)得无色液体1.24g,收率77.8%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.83(3H,s),1.07(1H,d,J=11.0),1.28(3H,s),1.37(3H,s),1.84~1.90(2H,m),2.05(1H,t,J=4.8),2.15~2.17(1H,m),2.30~2.34(1H,m),3.08~3.23(2H,m),3.64(1H,q,J=8.6),4.32(1H,q,J=8.8),7.21~7.30(5H,m)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ23.92,26.18,26.99,28.33,29.68,35.14,38.21,39.34,40.42,51.19,78.54,86.77,126.71,126.76,128.34,129.17,129.23,138.40。
(9)1-对甲苯基-2-氯-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-10a)
于100mL三口瓶中加入剪碎的镁条(0.48g,20mmol)、30mL无水乙醚,再加入一小粒碘,室温下滴加对甲基苄氯(2.81g,20mmol)的乙醚溶液15ml,滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得对甲基苄氯的格式试剂的乙醚溶液。干燥处放置备用。
将二氯亚甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6a(4.52g,20mmol)用30mL乙醚溶解,室温下搅拌。通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加制好的对甲基苄氯的格式试剂的乙醚溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(0.55g,4mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:15)得无色液体5.33g,收率80.3%。1H-NMR(CDCl3,300MHz):δ0.83(3H,s),1.09(1H,d,J=11.1),1.28(3H,s),1.38(3H,s),1.83~1.92(2H,m),2.06(1H,t,J=5.0),2.14~2.21(1H,m),2.29~2.37(4H,m),3.01~3.21(2H,m),3.58~3.66(1H,m),4.29~4.36(1H,m),7.08~7.16(4H,m)。13C-NMR(CDCl3,75MHz):δ21.02,23.91,26.10,26.23,27.00,28.33,35.15,38.21,39.35,40.01,51.21,78.52,86.71,128.26,128.96,129.02,129.08,135.30,136.21。
(10)1-对氟苯基-2-氯-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-11a)
于100mL三口瓶中加入剪碎的镁条(0.24g,10mmol)、15mL无水乙醚,再加入一小粒碘,室温下滴加对氟苄溴(3.36g,10mmol)的乙醚溶液10ml,滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得对氟苄溴的格式试剂的乙醚溶液。干燥处放置备用。
将二氯亚甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6a(2.26g,10mmol)用20mL乙醚溶解,室温下搅拌。通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加制好的对氟苄溴的格式试剂的乙醚溶液。滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(0.27g,2mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:10)得无色液体2.04g,收率60.7%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.82(3H,s),1.00(1H,dd,J=11.1),1.28(3H,s),1.36(3H,s),1.83~1.90(2H,m),2.06(1H,t,J=5.3),2.31~2.35(1H,m),3.04~3.19(2H,m),3.58~3.63(1H,m),4.30~4.35(IH,m),6.95~6.99(2H,m),7.22~7.26(2H,m)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ23.95,26.16,26.99,28.40,35.19,39.35,39.65,51.23,71.49,78.68,86.92,115.21,130.79,134.22,162.90。
(11)2-甲基-4-氨基-丁基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-12a)
于150mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(10mL,10mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后用注射器慢慢加入含有2-甲基-4-氯-丁基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-7a(2.85g,10mmol)的THF溶液10mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,20h后反应完毕。减压蒸除溶剂,加入30mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入23mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量乳白色固体。冷冻使固体完全析出,过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体2.11g,收率70.1%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.82(3H,s),0.85~0.88(6H,m),1.12~1.16(1H,m),1.26(3H,s),1.37(3H,s),145~1.55(2H,m),1.72~1.78(2H,m),1.87~1.89(1H,m),2.00(1H,t,J=5.4),2.17~2.20(1H,m),2.70~2.76(1H,m),4.42~4.45(1H,m),7.42(3H,t,J=50.7),7.98(3H,s,)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ22.07,22.43,23.53,24.41,25.82,26.75,28.07,34.59,37.76,38.33,38.79,50.69,75.49,77.52,86.55。MS(ESI):observed:m/z266.3[M+H]+,calcd:265.2。
(12)5-氨基-戊基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-13a)
于150mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(15mL,15mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后用注射器慢慢加入含有5-氯-戊基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-8a(4.28g,15mmol)的THF溶液15mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,18h后反应完毕。减压蒸除溶剂,加入30mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入34.5mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量乳白色固体。冷冻使固体完全析出。过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体3.86g,收率76.7%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.83(3H,s),0.86(3H,J=6.6),1.12~1.16(1H,m),1.24~1.32(5H,m),1.38(3H,s),161~1.63(2H,m),1.76(2H,d,J=14.5),1.88~1.90(1H,m),2.01(1H,t,J=5.6),2.19~2.21(1H,m),2.32~2.36(1H,m),2.72~2.74(1H,m),4.45(1H,d,J=8.9),7.30(3H,t,J=50.7),7.90(3H,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ 13.60,21.79,23.51,24.41,25.87,26.74,28.00,28.85,34.63,37.76,38.79,50.67,75.45,77.53,86.58。MS(ESI):observed:m/z266.3[M+H]+,calcd:265.2。
(13)1-苯基-2-氨基-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-14a)
于100mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(10mL,10mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后用注射器慢慢加入含有1-苯基-2-氯-乙基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-9a(3.19g,10mmol)的THF溶液10mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。减压蒸除溶剂,加入30mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入23mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量乳白色固体。冷冻使固体完全析出。过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体2.31g,收率68.8%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.78(3H,s),1.06(1H,d,J=10.9),1.23(3H,s),1.26(3H,s),1.62~1.66(2H,m),1.80~1.83(1H,m),2.00(1H,t,J=5.4),2.07~2.11(1H,m),2.23~2.27(1H,m),2.88~2.93(1H,m),3.03~3.10(2H,m),4.35(1H,dd,J=8.8),7.22~7.32(5H,m),7.42(3H,t,J=50.7),8.14(3H,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ23.50,25.76,26.73,27.97,34.38,35.14,37.72,38.72,50.57,77.50,86.55,126.65,128.28,128.33,129.04,129.08,136.92。MS(ESI):observed:m/z300.3[M+H]+,calcd:299.2。。
(14)1-对甲苯基-2-氨基-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-15a)
于100mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(3mL,3mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢加入含有1-对甲苯基-2-氯-乙基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-10a(1g,3mmol)的THF溶液5mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。减压蒸除溶剂,加入40mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入6.9mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量乳白色固体。冷冻使固体完全析出。过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体0.76g,收率72.5%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.78(3H,s),1.08(1H,d,J=10.9),1.23(3H,s),1.27(3H,s),1.63~1.67(2H,m),1.81~1.84(1H,m),1.94(1H,t,J=5.4),2.09~2.11(1H,m),2.23~2.28(4H,m),2.85~2.89(1H,m),2.97~3.03(2H,m),4.35(1H,dd,J=8.9),7.11(5H,q,J=8.1),7.45(3H,t,J=50.7),8.12(3H,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ20.50,23.44,25.72,26.70,27.93,34.33,34.65,37.67,38.72,50.59,77.50,86.49,128.77,128.82,128.90,128.95,133.80,135,56。MS(ESI):observed:m/z314.3[M+H]+,calcd:313.2。
(15)1-对氟苯基-2-氨基-乙基硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-16a)
于100mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(10mL,10mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢加入含有1-对氟苯基-2-氯-乙基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-11a(3.36g,10mmol)的THF溶液10mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,24h后反应完毕。减压蒸除溶剂,加入60mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入23mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量淡黄色固体。冷冻使固体完全析出。过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体1.93g,收率54.6%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.77(3H,s),0.95(1H,d,J=10.9),1.22(3H,s),1.26(3H,s),1.63~1.66(1H,m),1.81(1H,d,J=5.1),1.92(1H,t,J=11.0),2.06~2.11(1H,m),2.22~2.27(1H,m),2.88~2.93(1H,m),3.01~3.09(2H,m),4.34~4.36(1H,m),7.11(2H,t,J=8.9),7.28~7.31(2H,q,J=5.7),7.38(3H,t,J=50.3),8.18(3H,s)。13C-NMR(DMSO-d6,125MHz):δ23.53,25.78,26.75,28.00,34.41,37.73,38.75,50.59,77.54,86.59,114.93,115.09,131.10,133.24,160.19,162.12。MS(ESI):observed:m/z 318.3[M+H]+,calcd:317.2。
2、化合物III-b的制备:
(1)(-)-α-蒎烷二醇(化合物III-2b)的制备
将Me3NO·2H2O(11.3g,102mmol)用16mL水溶解,搅拌下依次加入(-)α-蒎烯1b(13.2g,96.9mmol)、74mL叔丁醇、7.4mL吡啶和四氧化锇(60mg,0.24mmol)。然后通入氮气,10分钟后,加热至回流。TLC检测,18小时反应完毕。自然降至室温,加入NaHSO3(1.2g,11.5mmol)搅拌10分钟,待溶液颜色变为黄色时,再加入20g的NaCl。分出有机相,水层用乙醚提取(3×20mL),合并有机相,并用无水硫酸钠干燥。浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:30),得白色固体15.33g,收率92.9%,[α]D 20=-10.79°(c=5.5,甲苯),m.p.:52-54℃。1H-NMR(CDCl3,300MHz):δ0.94(3H,s),1.28(3H,s),1.32(3H,s),1.37(1H,d),1.66(1H,m),1.93(1H,m),2.01(1H,t),2.20(IH,m),2.33(2H,s),2.49(1H,m),4.00(1H,q);13C-NMR(CDCl3,75MHz):δ 24.11,27.80,28.00,29.54,38.21,38.99,40.51,53.98,69.26,73.88;Anal.Calcd.for C10H18O2:C,70.55;H,10.66。Found:C,70.55:H,10.67。
(2)二氯亚甲基锂(化合物III-3b)的制备
将无水二氯甲烷(7.1mL,110mmol)和200mL无水四氢呋喃在氮气保护下,降温至—110℃,然后慢慢滴加正丁基锂的正己烷溶液(44mL,110mmol),滴加完毕后低温继续搅拌1小时。溶液直接用于下步反应。
(3)二氯亚甲基硼酸二甲酯(化合物III-4b)的制备
在—110℃下,向上述制备好的化合物III-3b的溶液中加入硼酸三甲酯(12.5mL,110mmol),继续低温搅拌1小时后加入5N HCl溶液20mL,自然升至室温。反应液转入分液漏斗,分出有机相,水层用乙醚提取(2×20mL),合并有机相,无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂得白色粘稠状固体17.6g,收率102.1%。产品未经纯化直接用于下步反应。
(4)二氯亚甲基硼酸二异丙酯(化合物III-5b)的制备
在—110℃下,向已制备好的化合物III-3b的溶液中加入硼酸三异丙酯(10.2mL,44mmol),继续低温搅拌2小时后加入5N HCl溶液15mL,自然升至室温。反应液转入分液漏斗,分出有机相,水层用乙醚提取(2×20mL),合并有机相,无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂得白色粘稠状固体10.32g,收率>110.2%。产品未经纯化直接用于下步反应。
(5)二氯亚甲基硼酸-(-)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-6b)的制备
方法a:从化合物III-4b出发
在25mL瓶中加入化合物II-2b(3.23g,0.019mol)和化合物III-4b(5.38g,0.035mol)。再加入10mLTHF溶解,室温下搅拌。TLC检测,18h后反应完毕。柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:20)得无色液体4.92g,收率98.5%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.85(3H,s),1.22(1H,d,J=11.2),1.31(3H,s),1.46(3H,s),1.94~1.96(2H,m),2.13(1H,t,J=5.1),2.27~2.30(1H,m),2.36~2.41(1H,m),4.47(2H,dd,J=8.9),5.40(IH,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ23.87,26.15,26.92,28.17,34.97,38.29,39.20,51.14,79.40,88.00。。
方法b:从化合物III-5b出发
在50mL瓶中加入化合物II-2b(1.70g,0.01mol)和化合物III-5b(5.30g,0.025mmol)。再加入15mLTHF溶解,室温下搅拌。TLC检测,48h后反应完毕。柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:15)得无色液体2,38g,收率90.8%。
(6)2-甲基-4-氯-丁基硼酸-(-)-α-蒎烷二醇酯(化合物III-7b)
于100mL三口瓶中加入剪碎的镁条(1.1g,45.8mmol)、30mL无水乙醚,再加入一小粒碘,室温下滴加叔丁基溴的乙醚溶液(6.0mL,45mmol),滴完后加热微沸至镁条溶解完毕,自然冷却得叔丁基格式试剂的乙醚溶液。干燥放置备用。
将二氯甲基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-6b(1.18g,4.49mmol)用12mL乙醚溶解,室温下搅拌。通入氮气,并降温至—78℃,然后慢慢滴加制好的叔丁基格式试剂的乙醚溶液(6mL,4.50mmol),滴加完毕后,加入干燥好的ZnCl2粉末(0.44g,3.25mmol)。自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,18h后反应完毕。过滤除去固体,浓缩后柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚=1:200)得无色液体1.13g,收率88.5%。1H-NMR(CDCl3,500MHz):δ0.85(3H,s),0.90~0.94(6H,m),1.19(1H,dd,J=11.0),1.30(3H,s),1.42(3H,s),1.63~1.66(1H,m),1.78~1.80(1H,m),1.88~1.93(3H,m),2.09(1H,t,J=5.2),2.24~2.26(1H,m),2.33~2.38(1H,m),3.51~3.55(1H,m),4.36(1H,dd,J=8.9)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ21.29,21.34,22.88,23.97,25.68,26.36,27.07,28.46,35.34,38.30,39.47,42.90,51.35,78.56,86.66。
(11)2-甲基-4-氨基-丁基硼酸-(-)-α-蒎烷二醇酯盐酸盐(化合物III-8b)
于100mL单口瓶中加入LiN(SiMe3)2(5mL,5mmol),通入氮气,并降温至—78℃,然后用注射器慢慢加入含有2-甲基-4-氯-丁基硼酸-α-蒎烷二醇酯III-7b(1.42g,5mmol)的THF溶液10mL,滴加完毕后,自然升至室温,继续室温下搅拌。TLC检测,20h后反应完毕。减压蒸馏除去溶剂,加入20mL正己烷溶解,过滤除去不溶物。将滤液降温至—78℃,加入12mL浓度为1.3M氯化氢的乙醚溶液,然后自然升至室温,出现大量乳白色固体。冷冻使固体完全析出,过滤,乙醚洗涤产品得乳白色固体1.12g,收率74.6%。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):δ0.82(3H,s),0.86~0.89(6H,m),1.11~1.16(1H,m),1.25(3H,s),1.37(3H,s),144~1.55(2H,m,),1.71~1.79(2H,m),1.86~1.88(1H,m),1.99(1H,t,J=5.3),2.17~2.20(1H,m),2.30~2.34(1H,m),2.70~2.75(1H,m),4.41~4.44(1H,m),7.45(3H,t,J=50.7),8.01(3H,s)。13C-NMR(CDCl3,125MHz):δ22.04,22.45,23.54,24.42,25.83,26.76,28.06,34.60,37.77,38.33,38.80,50.68,75.48,77.52,86.55。MS(ESI):observed:m/z266.3[M+H]+,calcd:265.2。。
三、式(I)的制备:
1、硼酸酯化合物(I)的制备:
(1)N-苯甲酰基-β-苯丙酰胺-D-亮氨酸硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯的制备(I-1)
在氮气保护下,将实施例一中N-苯甲酰基-β-苯丙氨酸(3aA)(0.10g,0.37mmol)溶解在10ml干燥的THF中,将体系冷却到-5℃,加入HOBt(0.06g,0.44mmol),反应20分钟后,将体系降温到-15℃,加入EDC·HCl(0.37mmol)。最后加入实施例二中的2-甲基-4-氨基-丁基硼酸-α-蒎烷二醇酯盐酸盐III-12a(0.11g,0.37mmol)和DIPEA(0.064mL,0.37mmol)。继续保持在-15℃反应2小时,升至室温反应3小时,TLC显示反应结束。过滤除去不溶物,减压蒸除溶剂,用20mL乙酸乙酯溶解,分别用5%NaHCO3溶液(20mL)、10%的柠檬酸溶液(20mL)、5%NaHCO3溶液(20mL1)、饱和食盐水溶液(2×20mL)洗涤。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤,浓缩后得玻璃状固体0.166g,收率87%。所有硼酸酯化合物均未纯化,直接用于下步反应。
本发明的其它类似化合物的合成方法可以采用上述的方法。I-2:将3bA与III-12a反应制备;I-3:将3cA与III-12a反应制备;I-4:将3dA与III-12a反应制备;I-5:将3aB与III-12a反应制备;I-6:将3bB与III-12a反应制备;I-7:将3cB与III-12a反应制备;I-8:将3dB与III-12a反应制备;I-9:将3aC与III-12a反应制备;I-10:将3bC与III-12a反应制备;I-11:将3cC与III-12a反应制备;I-12:将3dC与III-12a反应制备;I-13:将3aC与III-14a反应制备;I-14:将3aC与III-15a反应制备;中间体羧酸部分采用实施例一中制备的化合物(II),中间体硼酸-α-蒎烷二醇酯氨基的盐酸盐采用实施例二中制备的化合物(III)。
2、硼酸的制备:
N-苯甲酰基-β-苯丙酰胺-D-亮氨酸硼酸的制备(IV-1)
将N-苯甲酰基-β-苯丙酰胺-D-亮氨酸硼酸-(+)-α-蒎烷二醇酯(0.21g,0.407mmol)用6mL的甲醇溶解,加入2-甲基丙基硼酸(0.207g,2.04mmol)及6mL正己烷,最后加入HCl溶液(1M,1mL),室温搅拌反应。5小时后TLC显示反应完成。分层,下层用10mL己烷洗涤1遍,无水硫酸钠干燥下层。减压蒸干溶剂,过柱得到无色固体116mg,收率74.6%。1H-NMR(CD3OD,500MHz):δ0.84~0.89(-CH3,m,6H),1.14~1.32(-CH2,m,2H),1.50~1.62(-CH,m,1H),2.62(-CH,t,J=7.1,1H),3.04~3.18(-CH2,m,2H),5.62~5.67(-CH,m,1H),7.26~7.41(-Ph,m,3H),7.42~7.53(-Ph,m,5H),7.82~7.85(-Ph,m,2H)。13C-NMR(CD3OD,75MHz):δ22.12,23.82,27.01,37.76,40.93,45.18,52.09,127.74,128.44,129.52,129.78,132.81,135.44,141.85,169.62,177.12。MS(ESI):observed:m/z409.3[M+27]-,m/z419.2[M+37]+,calcd:382.3.
本发明的其它类似的硼酸类化合物的合成可以采用上述相类似的方法。具体的化合物如下表所示。
第二部分 抑制蛋白酶体活性测定
蛋白酶体抑制活性
本方法利用荧光底物多肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(简写Suc-LLVY-AMC,Suc表示琥珀酰基,AMC表示7-酰胺-4-甲基香豆素)在蛋白酶体作用下会发生水解,释放出具有荧光的AMC(Ex:380nm,Em:460nm)的原理,通过改变待测化合物浓度,测得不同浓度药物作用后的蛋白酶体催化底物得到的产物荧光值判断药物对酶的抑制程度,从而计算药物对蛋白酶体抑制的IC50值。
本实验所用的蛋白酶体为人红细胞20S蛋白酶体,酶、荧光底物及测试缓冲液均购自biomol公司。实验体系为100ul,其中含有蛋白酶体90μl(0.2μg),底物10μl,其终浓度为50μM,药物(抑制剂)0.1μl,其终浓度为10-7M~10-11M,实际配置浓度为10-4M~10-8M。具体实验过程如下:
1、药物配置:
准确称量药物,加入DMSO溶解至10-2M。用移液器吸取10μl加至90μl DMSO得到10-3M,然后从10-3M浓度药物中吸取10μl加90μl DMSO得到10-4M,同样方法得到10-5M、10-6M、10-7M、10-8M浓度的药物。
2、底物制备:
将5mg底物Suc-LLVY-AMC(mw:763.9)粉末溶解于654μlDMSO中,得到10mM储备液,-20℃保存,使用时用缓冲液稀释20倍,每份样品中加入10μl,使得反应体系中的底物浓度为50μM。
3、反应体系制备:
将20S蛋白酶体(1μg/μl)以缓冲溶液稀释成浓度为0.0022μg/μl的溶液,96孔荧光酶标板中每孔加入90μl,然后每孔中加入0.1μl待测样品,使用已上市药物万珂为阳性对照药,同时空白对照组及本底对照组中加入0.1μl DMSO,37℃反应20min。反应完毕后,每孔加入10μl荧光底物,避光37℃反应1小时,380nm/460nm荧光酶标仪(Tecan,InfiniteM200)检测荧光值。
4、数据处理
计算扣除本底后不同浓度药物作用下所得产物的荧光值,运用SPSS软件,计算药物对蛋白酶体抑制的IC50浓度。
部分化合物的结果如下表:
化合物编号 | IC50(nM) | 化合物编号 | IC50(nM) |
Velcade | 2.89 | IV-9 | 69.8 |
IV-1 | 40 | IV-10 | 121 |
IV-2 | 12.5 | IV-11 | 134 |
IV-3 | 30 | IV-12 | 664 |
IV-4 | 3.4 | IV-13 | 497 |
IV-5 | 16500 | IV-14 | ND |
IV-6 | ND | IV-15 | 981 |
IV-7 | 35 | IV-16 | ND |
IV-8 | 13.6 | | |
备注:ND表示没有抑制蛋白酶体的活性。
Velcade(万珂)的化学结构式为
本发明化合物的治疗剂量可以根据例如该治疗的具体用途,化合物的给药方式,病人的健康状况,以及处方医生的判断而改变。药物组合物中本发明化合物的比例或浓度将随多种因素而改变,包括剂量,化学特性(如疏水性),以及给药途径。例如,本发明化合物可以提供于含有大约0.1到大约10%w/v化合物的水性生理缓冲液中用于非肠道给药。一些通常的剂量范围为每天大约1μg/kg到大约1g/kg体重。在一些实施方案中,剂量范围从每天大约0.01mg/kg体重到大约100mg/kg体重。剂量极可能取决于这样的变量,如疾病或失调的类型和进展程度,特定病人的总体健康状态,选定的化合物的相对生物学功效,赋形剂的配方,及其给药途径。有效剂量可以从来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推出。