CN101724696B - 双温多重pcr鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的方法及试剂盒，建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于猪早期胚胎性别鉴定的双温多重PCR反应体系，用于猪早期胚胎的性别鉴定。以双温多重PCR技术体系开发的猪早期胚胎性别鉴定试剂盒，充分发挥了双温多重PCR高效、经济简便、省时、反应特异性高的特点，实现快速鉴定猪早期胚胎从而为实现猪性别控制，提高猪养殖业经济效益，节约养殖成本提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于猪早期胚胎性别鉴定的PCR反应技术体系，进一步讲是公开了一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的方法，同时还提供了相应的试剂盒，属家畜性别控制鉴定技术领域。
背景技术
家畜的性别控制是指通过人为干预，使雌性繁殖动物按人们的愿望繁衍所需性别后代的技术，在畜牧业生产中具有重大意义。
目前，家畜性别鉴定方法主要有细胞遗传学方法、H-Y抗原法、性特异性DNA探针法、PCR法、LAMP法等，主要用于牛、羊或其它经济动物的性别鉴定，经检索未见有关于猪早期胚胎性别鉴定方法的文献报道。
发明内容
本发明一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，用于猪早期胚胎的性别鉴定。
本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于猪早期胚胎性别鉴定的双温多重PCR反应体系。
本发明双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，具体构成如下：
1)1ml细胞裂解液；
2)1ml组织裂解液；
3)550ul的2×Taq PCR MasterMix；
4)120ul的Primer mix，其中含有终浓度为1uM的引物：
Sry-1 5’-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3’
Sry-2 5’-CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3’
和4uM的引物：
Gapdh-1 5’-GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3’
Gapdh-2 5’-GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’；
5)60ul的公猪和母猪100ng/ul的基因组DNA。
本发明试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)样品处理：
A：检测样品为猪胚胎或细胞：
从待检测的猪早期胚胎中分离细胞，放入PCR管中，加入10ul细胞裂解液，置于PCR仪中56℃ 10min，94℃ 5min；12000rpm离心2min，取上清，保存于-20℃备用；
细胞裂解液：1×PCR buffer，0.45％NP-40，60ug/ml的蛋白酶K组成；
B：检测样品为猪早期胎儿或未知性别猪组织：
取待检测样品1mm×1mm大小组织块，放入PCR管中，加入组织裂解液50ul，置于PCR仪中56℃ 50min，94℃ 5min；12000rpm离心2min，取上清保存于-20℃备用；
组织裂解液：100ug/ml的蛋白酶K，20mmole/L Tris-Cl，5mmole/L EDTA，400mmole/L NaCl，1％的SDS；
2)引物设计：
根据猪SRY基因序列设计一对双温PCR扩增引物：
Sry-1 5’-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3’
Sry-2 5’-CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3’
根据猪GAPDH基因序列设计一对双温PCR扩增引物作为内部对照：
Gapdh-1 5’-GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3’
Gapdh-2 5’-GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’
3)双温多重PCR：
在20ul PCR反应体系中分别加入10ul的2×Taq PCR MasterMix、0.05uM的SryPrimer 1和Sry Primer 2、0.2uM的GAPDH Primer 1和GAPDH Primer 2及50ng～100ng的步骤1获得的基因组DNA，补水至总体积20ul；
反应条件如下：
预变性，94℃，5min；变性，98℃，10s；退火(延伸)，68℃，90s；扩增30个循环；最后72℃延伸5min 12℃保存；
4)PCR产物检测
取7ul PCR产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察照相，获得检测电泳图；
5)结果判定
根据检测电泳图中GAPDH扩增产物和SRY扩增产物的条带，检测胚胎性别。
本发明的积极效果在于：充分利用了多重PCR的高效性，即在同一PCR反应管内同时检出多个基因以及其经济简便性，即节省样本使用又提高效率，同时结合双温PCR省时、反应特异性高的特点，建立了一种适用于猪早期胚胎性别鉴定的多重双温PCR体系。以双温多重PCR技术体系开发的猪早期胚胎性别鉴定试剂盒，充分发挥了双温多重PCR高效、经济简便、省时、反应特异性高的特点，实现快速鉴定猪早期胚胎从而为实现猪性别控制，提高猪养殖业经济效益，节约养殖成本提供便利。
附图说明
图1为用提取的已知性别猪组织DNA样鉴定性别的电泳图。
其中，琼脂糖凝胶浓度为1.2％.图中编号说明如下：M，Marker 2000；1～5均为公猪组织DNA扩增结果，检出404和309bp带，6～10为母猪组织DNA扩增结果，检出404bp带。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。
实施例1
1.样品处理：
A：若待检测样品为猪胚胎或细胞：
从待检测的猪早期胚胎中分离4或者4个以上细胞，放入0.2ml PCR管中，加入10ul细胞裂解液，置于PCR仪中56℃ 10min，94℃ 5min；12000rpm离心2min，取上清，保存于-20℃备用；
B：若待检测样品为猪早期胎儿或未知性别猪组织：
取待检测样品1mm×1mm大小组织块，放入0.2mlPCR管中，加入组织裂解液50ul，置于PCR仪中56℃ 50min，94℃ 5min；12000rpm离心2min，取上清保存于-20℃备用；
2.引物设计：
根据猪SRY基因序列(Genbank登录号：U49860.2)设计一对双温PCR扩增引物。此外，根据猪GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因序列(Genbank登录号：AF017079.1)设计一对双温PCR扩增引物作为内部对照，以确定PCR扩增的有效性，防止假阴性结果的出现。
设计引物序列如下：
Sry-1 5’-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3’
Sry-2 5’-CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3’
Gapdh-1 5’-GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3’
Gapdh-2 5’-GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’
3.双温多重PCR：
在20ul反应体系中分别加入：10ul的2×Taq PCR MasterMix、0.05uM的SryPrimer 1和Sry Primer 2、0.2uM的GAPDH Primer 1和GAPDH Primer 2、50ng～100ng的步骤1获得的基因组DNA，补水至总体积20ul。
反应条件如下：
预变性，94℃，5min；变性，98℃，10s；退火(延伸)，68℃，90s；扩增30个循环；最后72℃延伸5min 12℃保存。
4.PCR产物检测
取7ulPCR产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察照相，电泳图参见附图1。
5.结果判定
检测电泳图中是否同时出现404bp的GAPDH扩增产物(见序列表SEQ ID2)和309bp的SRY扩增产物(见序列表SEQ ID1)两条带，如果电泳图中两条带同时出现说明待检测胚胎为雄性胚胎或待检测组织来源为雄性个体，如果只出现404bp(GAPDH扩增产物带)，说明待检测胚胎为雌性胚胎或待检测组织来源为雌性个体。
实用例
随机选取5头公猪、5头母猪，采取肝组织，按实施例所述1处理，用本发明试剂盒检测，获得附图1；从图中可见，1～5公猪样品均出现404bp的GAPDH扩增产物和309bp的SRY扩增产物条带，6～10母猪样品只出现404bp的GAPDH扩增产物条带，能够准确反映猪的性别。
序列表
SEQ ID1
GCTTTCATTGTGTGGTCTCGTGATCAAAGGAGAAAAGTGGCTCTAGAGAACCCTCAAATGCAAAACTCAGAGATCAGCAAGTGGCTGGGATGCAAGTGGAAAATGCTTACAGAAGCCGAAAAGCGCCCATTCTTCGAGGAGGCACAGAGGCTACAGGCGGTGCACCGAGATAAATACCCGGGCTATAAATACCGACCTCGTCGCAAGGGAGAGAGGGCACAGAATTTGCTTCCGGCAGAGGCGGCAGTACTATGCAGCCAAGTGCGCGTAGAGGAGAGGATGTATCCCTTCACATACACAGTCGCCAAG
SEQ ID2
GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGAGGGGCTGCCCAGAACATCATCCCTGCTTCTACCGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGGTGAGGCTCTTTGCTGCTCTCCTGCCCTGGGTGTCTGGGGCACCAGCAGGGGTGGTGCTGACTCTGCTTGCTTCCTCGTGTCCCCAGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACCCCCAACGTGTCGGTTGTGGATCTGACCTGCCGCCTGGAGAAACCTGTAGGTTTGGGTTGGAACAGCTTTGGGGGGCTGAGGGGTTGTAGGATTGGTACTTGAATAACCATCGGTTTTTACCTCATCAGGCAAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCC
Claims (1)
1.一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，具体构成如下：
1)1ml细胞裂解液；
2)1ml组织裂解液；
3)550ul的2×Taq PCR MasterMix；
4)120ul的Primer mix，其中含有终浓度为1uM的
Sry-1 5′-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3′
Sry-2 5′-CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3′
和4uM的
Gapdh-1 5′-GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3′
Gapdh-2 5′-GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′；
5)60ul的公猪和母猪100ng/ul的基因组DNA。
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| CN 200910217772 CN101724696B (zh) | 2009-10-28 | 2009-10-28 | 双温多重pcr鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒 |
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| 陈颖等.体外培养枫径猪胚胎成纤维细胞系方法的建立.《吉林农业大学学报》.2007,第29卷(第3期),310－313. * |
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