CN101723890B

CN101723890B - 芳基硫脲及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101723890B
Application number: CN2009102061390A
Authority: CN
Inventors: 金毅; 姬建新; 李炎飞; 左承森
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2009-10-10
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-10-10
Also published as: CN101723890A

Abstract

本发明公开了一类芳基硫脲及其制备方法和用途，如下具体有通式I的化合物。这类具有芳基取代硫脲的新化合物展示有非常高的抑制肿瘤细胞生长的活性，尤其对于VEGFR高表达的HUVEC细胞的生长具有显著的抑制效果，半数抑制率在10μg/mL都大于70％。本发明也提供了这类化合物的制备方法。

Description

芳基硫脲及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及芳基硫脲新化合物、合成及其抑制VEGFR-2的用途，更具体地说，是含芳基硫脲化合物作为高效的靶向VEGFR的抗肿瘤药及其合成和用途，属药物领域。

背景技术

血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth FactorReceptor，VEGFR)酪氨酸激酶因其在介导肿瘤血管生成过程中的关键作用，是目前最受关注的抗肿瘤药物设计靶标[Sebolt-Leopold，J.S.；English，J.M.，Mechanisms of drug inhibition of signalling molecules.Nature2006，441，(7092)，457-62]。这个生长因子受体家族现发现了三个调控跨膜糖蛋白受体[Neufeld，G.；Cohen，T.；Gengrinovitch，S.；Poltorak，Z.，Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors.FASEB J1999，13，(1)，9-22.]：VEGFR-1(Fms-like Tyrosine Kinase，Flt-1)、VEGFR-2(Kinase Insert Domain Containing Receptor，KDR/Fsk-1)和VEGFR-3。像其它蛋白激酶一样，它们通过催化转移ATP末端磷酸，把细胞生长信号转移到靶蛋白基体的酪氨酸残基上，由此调控着许多生命过程，如细胞增殖，生长，转移和凋亡等。

VEGFR-2是单次跨膜蛋白，与所有VEGFR一样，分为膜外的配体结合域、跨膜区和膜内的酪氨酸激酶域。VEGFR-2的膜外区结构柔性大，在与VEGF结合前后其构象变化也大，因此不是小分子化合物的理想作用靶点。VEGFR-2膜内酪氨酸激酶域分为几个重要的功能区[Crystal structure of the kinasedomain of human vascular endothelial growth factor receptor 2：a keyenzyme in angiogenesis.Structure 1999，7，(3)，319-30.]：A)连接两个蛋白小叶的绞链区；B)两小叶之间扁平的三磷酸腺苷(AdenosineTri-Phosphate，ATP)结合域；C)富含甘氨酸的核苷结合环，催化环，高度柔性的活化环和激酶插入域。小分子抑制剂与ATP竞争性地与酶结合，阻止酶的活化，从而阻断VEGF的信号传导通路，达到抑制VEGF介导的血管生成的目的。因此，VEGFR-2膜内酪氨酸激酶域的ATP结合域自然地成为理想的小分子抑制剂的结合位点。

目前为止，VEGFR-2的抑制剂研究取得了比较大的进展。索拉非尼(nexavar，sorafenib)是由美国Onyx制药公司和德国拜尔公司开发的针对VEGFR-2，VEGFR-3，RAF/MEK/ERK等信号途径的多靶点抗肿瘤药物，它在临床前实验中能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和血管的生成。在转移性肾细胞癌的临床III期试验中，索拉非尼显著地提高了患者的总生存期[Preclinicaloverview of sorafenib，a multikinase inhibitor that targets both Rafand VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling.Mol Cancer Ther2008，7，(10)，3129-40.]。另一个能作用于VEGFR-2的TKI药物是辉瑞公司的舒尼替尼(sutent，sunitinib)，在随机临床III期治疗中，舒尼替尼成功地抑制了对伊马替尼产生抗性的胃肠道间质瘤患者的肿瘤发展[Efficacyand safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinalstromal tumour after failure of imatinib：a randomised controlledtrial.Lancet 2006，368，(9544)，1329-38.]。

现有药物还是不能完全满足临床用药的需求，因此目前药物研发者还在积极地寻找新的具有VEGFR-2抑制作用的化合物。如CN101056871A、CN101052634A公开了作为VEGFR激酶抑制剂的邻氨基苯甲酰胺吡啶脲类化合物。CN1972925A公开了一类具有VEGFR激酶抑制作用的双芳基脲衍生物，但通式中取代基定义的多种基团化合物从未实施，并且与已公开的取代基化合物有较大的性质差异，因此我们无法预见通式中包含的硫脲类化合物是否具有VEGFR激酶抑制活性及其药物安全性能。

发明内容

本发明的技术方案是提供一类具有抑制血管内皮生长因子受体信号传导的芳基硫脲类新化合物。本发明的技术方案是提供一类芳基硫脲化合物的制备方法及用途。

本发明提供的一类芳基硫脲化合物，具有如下结构I

其中，R为C_6-10芳基，C₄-C₈杂芳基，取代的C_6-10芳基，取代的C₄-C₈杂芳基，所述的C_6-10芳基或C₄-C₈杂芳基被一个或多个以下基团取代：-CN、-CF₃、-NO₂、-CO₂R₁、-C(O)NR₁R₁’、-OR₁、-SR₁、卤素或至多全卤代；

R₁和R₁’独立的选自：H，C_1-10烷基，C_6-14芳基，C_3-13杂芳基，至多全卤代的C_1-10烷基。

本发明所述化合物优选自：

化合物1

化合物2

化合物3

化合物4

化合物5

化合物6

化合物7

化合物8

化合物9

化合物10

化合物11

化合物12

化合物13

化合物14

化合物15

化合物16

本发明式I化合物的合成如下反应式所示：

具体的说，以异硫腈酸酯(II)及[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]-N-甲基甲酰胺(III)为原料，在溶剂中混合直接缩合得到芳基硫脲衍生物。其中，溶剂选自：乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。反应温度为20-100℃，一般在室温下或溶剂的回流温度下进行反应。[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]-N-甲基甲酰胺(III)与异硫腈酸酯(II)的原料摩尔比为：1∶0.8-1.2。

本发明式I化合物作为VEGFR的抑制剂的用途，优选其在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤包括但不限于：结肠癌、十二指肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、导管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、非小细胞肺癌、神经恶性肿瘤和血液恶性肿瘤。

我们通过计算机分子模型设计合成了大量的新系列化合物。通过大量的体外筛选实验研究发现本发明提供的这一系列芳基硫脲化合物具有显著的抑制VEGFR-2和抗肿瘤的活性，且其作用显著优于脲类化合物sorafenib。此外，通过考察对正常肝细胞增殖的影响，我们还意外地发现本发明提供的芳基硫脲化合物对正常肝细胞增殖的影响要显著小于脲类化合物sorafenib，也就是说本发明提供的芳基硫脲化合物对人正常肝细胞具有更低毒性，表现其更加良好的抗肿瘤药物安全性能。

本发明是基于VEGFR蛋白激酶与小分子抑制相互作用的晶体结构[Harris，P.A.；Cheung，M.；Hunter，R.N.，3rd；Brown，M.L.；Veal，J.M.；Nolte，R.T.；Wang，L.；Liu，W.；Crosby，R.M.；Johnson，J.H.；Epperly，A.H.；Kumar，R.；Luttrell，D.K.；Stafford，J.A.，Discoveryand evaluation of 2-anilino-5-aryloxazoles as a novel class of VEGFR2kinase inhibitors.J Med Chem 2005，48，(5)，1610-9.]，通过聚焦型化合物库的合成方法，选定以药效团芳基硫脲为核心结构，通过在硫脲氮原子上引进不同的取代基，合成一系列不同取代芳基硫脲新化合物，在分子水平测定了各化合物对血管内皮生长因子受体蛋白激酶的抑制活性，同时在细胞水平测定了各化合物对血管内皮生长因子受体过度表达的肿瘤细胞生长的抑制活性，并通过动物实验证明了本发明化合物对肿瘤的抑制作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不构成对本发明的限制。

实施例1中间体III的合成

步骤1：

250mL三口瓶中，通氮气置换空气，并于N₂保护下加入36mLSOCl₂，小心滴入1.2mL干燥的DMF，控温42℃，搅拌10min后，缓慢加入12g 2-吡啶甲酸(30min内加完)，然后升温至72℃，搅拌反应16h，冷却至室温，加入100mL甲苯，减压浓缩至40mL，再加入60mL甲苯后浓缩至40mL，重复上述过程一次，有少量红色固体出现，抽滤，用50mL甲苯洗涤固体，滤液置于250mL烧瓶中，冰水浴下缓慢加入40mL甲醇，搅拌10min，撤去冰浴，室温下搅拌45min，再置于冰水浴中5min，加入40mL乙醚，有白色沉淀析出，过滤，用30mL乙醚洗涤所得固体，干燥后得淡黄色粉末(2)14.9g，产率73.5％。

步骤2：

250mL三口瓶中，化合物(2)14.9g溶于10mL甲醇与50mL THF的混合溶剂中，N₂保护下0℃搅拌10min，缓慢滴入70mL甲胺醇溶液，保持反应温度低于5℃，滴毕，0℃下反应5h后，减压蒸干溶剂，加入150mL乙酸乙酯洗涤残余物，过滤，用50mL乙酸乙酯洗涤所得滤渣，所得滤液无水Na₂SO₄干燥后，旋蒸得黄色油状液体(3)12.4g。

步骤3：

250mL烧瓶中加入8.8g对氨基苯酚，130mL无水DMF和8.5g叔丁醇钾，室温下搅拌2h后，加入5.4g无水K₂CO₃及12.4g化合物(3)，N₂保护下升温至80℃反应6h，反应液中加入乙酸乙酯及饱和Na₂CO₃溶液分液，有机层用饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥后，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1(v/v))得6.0g棕黄色固体(III)。

¹HNMR(600MHz，CDCl3)：δ3.00(d，3H)，3.69(br s，2H)，6.71(d，2H)，6.87(d，2H)，6.90-6.91(m，1H)，7.66(d，1H)，7.99(br s，1H)，8.32(d，1H).

实施例2中间体II异硫腈酸酯的合成

方法1：

100mL单口瓶中加入1.85g对甲氧基苯胺，6.3mL三乙胺和20mL甲苯，室温搅拌下，于20min内滴加2.7mL CS₂，加完后继续室温反应直至析出大量固体。冰水浴下冷却上述反应液，缓慢滴加溶有1.48g三聚光气(BTC)的15mL甲苯溶液，加完后继续室温反应约4h，过滤，滤渣用甲苯洗2次，滤液减压蒸馏得粗品，硅胶柱层析分离(纯PE)得无色液体II-1 1.86g，产率75.1％。

¹HNMR(600MHz，CDCl3)：δ3.79(s，3H)，6.83-6.84(d，2H)，7.13-7.15(d，2H).

方法2：

100mL单口瓶中加入0.89g对三氟甲氧基苯胺，3.30g三乙烯二胺六水和10mL甲苯，室温搅拌下，于20min内滴加0.9mL CS₂(溶于15mL甲苯)，加完后继续室温反应直至析出大量固体。抽滤，并用少量甲苯洗涤所得固体，烘干得黄色固体。以上黄色固体悬浮于15mL二氯甲烷中，冰水浴冷却至5-10℃，缓慢滴加溶有0.50g三聚光气(BTC)的15mL二氯甲烷溶液，加完后室温反应1h，然后升温回流反应完全，冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液减压蒸馏得粗品，硅胶柱层析分离(纯PE或PE∶EA＝5∶1(v/v))得无色液体II-20.56g，产率50.7％。¹HNMR(600MHz，CDCl3)：δ7.18-7.20(d，2H)，7.23-7.24(d，2H).

实施例3化合物1的制备

25mL单口瓶中，73mg中间体III溶于5mL DMF中，冰水浴冷却搅拌下滴加溶于5mL DMF中的对三氟甲氧苯异硫腈酸酯71mg，滴毕室温反应，TLC板检测反应完成后，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥后，硅胶柱层析分离(PE∶EA＝2∶1(v/v))得76mg浅灰色粉末，产率52.8％。

¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.96-2.97(d，3H)，7.01-7.02(m，1H)，7.05-7.06(d，2H)，7.18-7.19(d，2H)，7.42-7.45(t，4H)，7.62(d，1H)，8.11-8.12(br d，1H)，8.39-8.40(d，1H)，8.64(s，1H)，8.70(s，1H).

MS(ESI)：461.06(M-H)

实施例4化合物2的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为对氟苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶0.8。所用溶剂为DMF，温度50℃，产率为86％。

1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(d，3H)，6.90(d，2H)，6.98(d，2H)，7.02(m，1H)，7.07(m，1H)，7.31(d，2H)，7.55(d，2H)，8.05(br，3H)，8.51(m，1H).

MS(ESI)：395.02(M-H)

实施例5化合物3的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为对溴苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.2所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为67％。

1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.99-3.00(d，3H)，7.02-7.03(m，1H)，7.10-7.12(t，4H)，7.36-7.38(m，2H)，7.44-7.45(d，2H)，7.67(d，1H)，7.85(s，1H)，7.87(s，1H)，8.01(br d，1H)，8.41-8.42(d，1H).

MS(ESI)：456.34(M-H)

实施例6化合物4的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为间苯甲酸乙酯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为75％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ1.36(t，3H)，2.98(s，3H)，4.36(q，2H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.01(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.45(m，1H)，7.74(m，1H)，7.95(d，1H)，8.16(d，1H)，8.39(br，3H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：450.51(M)⁺

实施例7化合物5的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为1-萘异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.2，所用溶剂为DMSO，温度100℃，产率为86％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.75-2.76(d，3H)，7.10-7.12(m，1H)，7.14-7.16(d，2H)，7.38(d，1H)，7.50-7.55(m，4H)，7.59-7.60(d，2H)，7.83-7.85(t，1H)，7.93-7.97(m，2H)，8.48(d，1H)，8.71(br，1H)，9.78(s，1H)，9.89(s，1H).

MS(ESI)：429.22(M+H)⁺

实施例8化合物6的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为6-吲哚异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶0.8，所用溶剂为乙酸乙酯，温度70℃，产率为54％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.76-2.77(d，3H)，6.45(s，1H)，7.04-7.07(t，1H)，7.11-7.12(m，1H)，7.13-7.14(d，2H)，7.22-7.25(t，2H)，7.32-7.33(t，1H)，7.39(d，1H)，7.60-7.62(d，2H)，8.49-8.50(d，1H)，8.72(br d，1H)，9.61(s，1H)，9.84(s，1H)，11.16(br s，1H).

MS(ESI)：416.20(M-H)⁺

实施例9化合物7的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为1-吡咯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶0.8，所用溶剂为乙醇，温度20℃，产率为48％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.98(s，3H)，5.97(d，1H)，6.23(m，1H)，6.90(d，2H)，6.96(d，1H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.35(dd，2H)，8.51(d，1H)，9.52(br，4H).

MS(ESI)：367.41(M)⁺

实施例10化合物8的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为3-苯甲酰甲胺异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为84％。

1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.82(s，3H)，2.98(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.68(m，1H)，7.76(m，1H)，7.82(m，1H)，8.01(br，4H)，8.13(d，1H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：436.49(M+H)⁺

实施例11化合物9的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为4-苯甲酰苯胺异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.2，所用溶剂为DMF，温度100℃，产率为78％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，1H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.14(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，2H)，7.86(m，2H)，7.89(dd，2H)，8.16(dd，2H)，8.38(br，4H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：498.56(M+H)⁺

实施例12化合物10的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为4-苯甲硫醚异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.2，所用溶剂为DMF，温度50℃，产率为79％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.60(s，3H)，2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.30(dd，2H)，7.31(dd，2H)，7.51(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：424.53(M)⁺

实施例13化合物11的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为4-吡啶异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为62％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.80(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.45(dd，2H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：397.75(M)⁺

实施例14化合物12的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为3-硝基苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.1，所用溶剂为乙腈，温度50℃，产率为87％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.67(m，1H)，7.86(m，1H)，8.05(br，3H)，8.20(m，1H)，8.51(d，1H)，8.87(d，1H).

MS(ESI)：422.44(M-H)⁺

实施例15化合物13的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为2-腈基苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.2，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为79％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.22(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.54(m，1H)，7.66(m，1H)，7.75(m，1H)，8.07(br，3H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：402.45(M-H)⁺

实施例16化合物14的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为4-氯-3-三氟甲基苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为乙腈，温度30℃，产率为85％。

1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.97-2.98(d，3H)，7.05-7.06(m，1H)，7.07-7.08(d，2H)，7.41-7.44(t，3H)，7.60(d，1H)，7.66-7.68(dd，1H)，7.71(d，1H)，8.14-8.15(br d，1H)，8.41-8.42(d，1H)，8.61(s，1H)，8.81(s，1H).

MS(ESI)：479.04(M-H)⁺，480.10(M⁺)

实施例17化合物15的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为5-氯萘异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为65％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，1H)，7.44(m，1H)，7.71(m，1H)，7.78(m，1H)，8.05(m，1H)，8.05(br，3H)，8.09(m，1H)，8.51(d，1H).

MS(ESI)：462.95(M)⁺

实施例18化合物16的制备

操作方法同实施例3，所用中间体II为苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1∶1.0，所用溶剂为DMF，温度20℃，产率为91％。

1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ2.91(s，3H)，6.91(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.06(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.34(m，2H)，7.58(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1).

MS(ESI)：378.45(M)⁺

以下通过具体药效试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物对血管内皮生长因子受体[VEGFR]蛋白激酶抑制活性测试：

将VEGFR-2蛋白激酶的胞质区序列Val 805-Val 1356在Sf9细胞中大量表达，接种于6孔板(5′105/孔)，无血清培养液同步化24小时后，在4℃下用细胞裂解液作用20分钟，刮下细胞，超声破碎细胞，离心后收集上清，通过连续色谱发分离得到纯度＞90％的激酶蛋白。

在96孔板中，用poly(Glu4-Tyr)在Tris缓冲溶液(25mM Tris，pH7.2，150mM NaCl)中配比成0.5mg/mL的悬液，1小时候用TBS溶液洗涤两次。VEGFR-2激酶稀释到激酶反应缓冲溶液中，加入用DMSO配制的化合物溶液孵化10分钟。在各孔中加入ATP/MgCl₂激发反应，最后的溶液浓度组成是：1M的ATP，10mM的MgCl₂，1mM的MnCl₂，4mM的HEPES，pH为7.4，20mM的Na₃VO₄，20mg/mL的BSA，和2％的DMSO。室温下40分钟后，除去清液，并用TBST溶液(TBS with 0.05％ Tween 20)洗涤3次。加入浓度约0.1mg/mL的铕共轭抗磷酸酪氨酸抗体75ml孵化1小时，然后用TBST溶液洗涤3次，加入100ml增强液在暗箱中孵化15分钟。然后将96孔板置于维克多电压多标签柜台使用默认的铕检测协议进行读数。与空白样数据进行比较计算出化合物的抑制百分率。

表1化合物1-16对VEGFR蛋白激酶的抑制效果

分子水平的酶活性测试显示，本发明提供的芳基硫脲化合物对血管内皮生长因子受体蛋白激酶有很强的抑制效果，其抑制率显著高于sorafenib，特别是化合物2，4，5，6，9，10，14和16。

试验例2本发明化合物对血管内皮生长因子受体[VEGFR]蛋白激酶高表达的肿瘤细胞生长抑制活性测试：

人脐静脉内皮细胞[HUVEC]高表达血管内皮生长因子受体，用来测试化合物对肿瘤细胞生长的抑制效果。

用四氮唑盐(MTT)法观察化合物对于细胞的增殖作用：将对数生长期的HUVEC，用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎小牛血清的1640培养基培养液配成单个细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96孔板，每孔100mL，在培养箱中孵化24h。在无菌条件下，以无药培养液和各种浓度的含药培养液处理96孔培养板(每种化合物设3个平行)24-72小时。培养结束前4小时加入MTT显色，在活细胞内可形成有色结晶，悬浮细胞离心后吸弃上清液。用DMSO溶解结晶后，测定570nm处的吸光度。按以下方法求得抑制率(％)。

增殖抑制率＝1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)

表2化合物1-16对人脐静脉内皮细胞[HUVEC]生长的抑制效果

细胞水平的药理结果显示，本发明提供的芳基硫脲化合物是一类高活性的肿瘤生长抑制剂，对血管内皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞显示很高的抑制活性，显著优于sorafenib，尤其是化合物6，9，11，12和14。

试验例3本发明化合物对肝癌的作用：

将对数期生长的肝癌SMMC-7721细胞用磷酸缓冲液(PBS)制成密度为5×10⁷个/ml的细胞悬液，取0.2ml接种于70只BALB/C裸鼠右腋部皮下。于8d后随机分为模型组、对照组和化合物2、6、9、11、14组。口服给药，实验组分别给予0.1g/kg体重的化合物2、6、9、11、14，每天1次，同样给予模型组等量的生理盐水，对照组0.1g/kg体重的sorafenib。4周后处死动物，无菌状态下取出瘤块，测量移植瘤的长径、短径，并称瘤重。肿瘤体积(V)＝(长径×短径)²/2，体积抑瘤率＝(对照组体积-实验组体积)/对照组体积×100％；重量抑瘤率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％。肿瘤微血管密度(MVD)按Wendner法(张必翔等，环氧合酶-2和血管内皮生长因子共表达与肝细胞癌血管形成的关系，中华实验外科杂质，2004，21：671-675)进行检测。

表3化合物对肝癌作用的实验结果

组别	体积抑瘤率(％)	重量抑瘤率(％)	MVD
				模型组	0	0	20.94±5.63
对照组	61.32	59.28	9.64±1.91*
				化合物2	74.39	72.94	7.88±1.79*△
化合物6	79.54	76.52	7.54±1.97*△
				化合物9	78.63	76.98	7.42±2.10*△
化合物11	76.58	73.43	7.73±1.86*△
				化合物14	83.56	81.64	6.81±2.10*△

注*：与模型组比较P＜0.01

△：与对照组比较P＜0.05

动物实验的结果显示，本发明提供的芳基硫脲化合物和sorafenib均可以显著抑制肿瘤的生长，显著降低MVD，证实了二者均有抑制肿瘤血管形成的作用。与sorafenib比较，化合物2、6、9、11、14的抑瘤率显著提高，降低模型动物MVD的作用也显著增强(P＜0.05)。

实施例4：药物对人体正常肝细胞LO-2增殖的影响：

将处于对数生长期的人正常肝细胞LO-2用1mI 0.5％的胰蛋白酶消化后，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面。在室温下孵育约8min，将培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化。倒掉培养瓶内消化液，加入含牛血清的培养液，用弯头吸管反复吹打瓶内壁细胞，制成细胞悬液。用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞悬液浓度为1.0×10⁵个/L。取190uL细胞悬液接种于96孔培养板，37℃、5％CO2培养箱中培养12h。待细胞贴壁后，在样品孔中分别加入10ul索拉非尼、化合物2、化合物6、化合物9、化合物11和化合物14，每组均设6个平行孔。空白对照组加入等体积培养液。在药物作用24、48、72h后，每孔加入10ul浓度为5mg/mL的四噻唑蓝溶液，37℃、5％CO₂培养箱中继续孵育4h后，每孔加DMSO150ul，中速振荡15s，以空白对照孔调零，用酶标仪在570nm处检测各样品孔吸光度(D)，每孔重复测定两次。增殖抑制率(％)＝(D对照-D测定)/D对照×100％。

表4化合物对人正常肝细胞LO-2增殖抑制率的影响

注*：与sorafenib组比较P＜0.05；

**：与sorafenib组比较P＜0.01

结果表明：各组对人正常肝细胞LO-2均表现出不同程度的抑制细胞生长作用，并随着作用时间的延长，抑制作用呈现增强的趋势。在药物作用24小时后，化合物6、9、11及化合物14的增殖抑制率明显低于sorafenib对照药物(P＜0.05或P＜0.01)。作用48、72小时后，所有化合物的细胞抑制作用均显著低于sorafenib(P＜0.05或P＜0.01)。

因此，通过体内外实验证明本发明提供的芳基硫脲化合物是一类高活性的新的血管内皮生长因子受体蛋白激酶生长抑制剂和肿瘤生长抑制剂，并且对人体正常肝细胞(人正常肝细胞LO-2)具有显著的低细胞毒性，表现其更加良好的抗肿瘤药物安全性能。