CN101717756B

CN101717756B - 一种超氧化物歧化酶的制备方法

Info

Publication number: CN101717756B
Application number: CN2008101488996A
Authority: CN
Inventors: 李绍铭
Original assignee: HARBIN RENHUANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HARBIN RENHUANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2008-10-09
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2028-10-09
Also published as: CN101717756A

Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括：(1)将动物凝血块一边搅拌一边加入可消化杂蛋白的清除剂，过滤，收集滤液；(2)将滤液离心，取上清液，超滤，取截流液，冷冻干燥，收集冻干粉，即得。本发明方法制备工艺简捷，不需要复杂的生产设备，生产成本低，环境友好，产率高，所制备的超氧化物歧化酶活力高，可适合进行工业化生产。

Description

一种超氧化物歧化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶的制备方法，尤其涉及一种超氧化物歧化酶的制备方法，属于生物制药领域。

背景技术

超氧物歧化酶(Superoxide dismutaee简称SOD)是一种新型酶制剂，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。SOD可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。它对于治疗因超氧离子引起的各种疾病均有一定的疗效，尤其治疗类风湿关节炎、红斑痕疮，皮肌炎等均有明显效果。此外，在防辐射，防衰老，抗肿瘤等方面也已进入临床。

超氧物歧化酶原来从牛血中制取，现多从猪血中提取，商品名为Orgotdin。目前，国内外超氧化物歧化酶(SOD)的生产主要经过采血、取血球、丙酮沉淀、热处理、透析、上柱、浓缩、冷冻干燥而成，其主要步骤如下：

1、将“抗凝剂”加水配制好后按1:5的比例接屠宰猪、牛或羊的血液，并不停的搅拌(防止结块)，血液取回后，离心除去血浆，用氯化纳(0.9％)溶液洗涤后离心，去除上清液，再洗涤离心，连续三遍，得干净的红细胞；

2、将干净的红细胞加去离子水，5℃以下搅拌30分钟以上，然后加入25％倍量的乙醇和一定量的三氯甲烷，搅拌后上离心机离心去血红蛋白，收集上清液；

3、在0℃左右，将上清液加入1.2-1.5倍量的丙酮，沉淀3小时以上，离心，除去上清液，得沉淀物，再将沉淀物加去离子水后溶解，再离心，除去不溶性蛋白，上清液于55—65℃热处理10—15分钟，再用冷却水冷却至10℃以下；

4、在0℃下温度条件下，将上清液加入适量丙酮，再沉淀3小时—5小时，离心，除去上清液，沉淀再加去离子水，充分搅拌，再离心除去不溶性蛋白，清液置透析袋中动态透析6—8小时，得透析液；

5、将透析完的液体加到已用2.5mmol/L PH7.6磷酸缓冲液平衡好的EDAE-SEPHADEXA-50柱上吸附，用PH7.6、2.5-50mmol/L磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，收集SOD活力的洗脱液；

6、洗脱液用超滤器超滤、浓缩、再用冻干机冷冻干燥36小时，出成品SOD。(注：以上操作温度控制在5℃以下，一般制备时间为2-4天)。

采用上述制备工艺的生产车间要达到制药业标准，工艺非常复杂，要使用大量的机械设备、容器、和各种仪器装置，还要使用大量的乙醇，氯仿、丙酮等有害的化学试剂，此外，丙酮和乙醇还不能使用一个回收装置，所以出品率极低，每公斤血液只能生产出0.01-0.03克SOD，甚至更少，而且活力标准大多为3500u/mg左右。

所以，生产实践中急需要一种制备工艺简捷、不需要复杂的生产设备，生产成本低，环境友好、适合工业化生产的超氧化物歧化酶的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的超氧化物歧化酶的制备方法，该方法制备工艺简捷、不需要复杂的生产设备，生产成本低，环境友好，产率高，所制备的超氧化物歧化酶活力高，适合工业化生产。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括：

(1)将动物凝血块一边搅拌一边加入蛋白沉淀剂，过滤，收集滤液；

(2)将滤液离心，取上清液，超滤，取截流液，冷冻干燥，收集冻干粉，即得。

其中，所述的动物凝血块可以是屠宰后的猪、牛或羊的凝血块，优选为牛凝血块。

优选的，所述的蛋白沉淀剂由以下重量份的组分组成：5-磺基水杨酸1～1.5份，硫酸钾75～85份和15～25份蒸馏水；其中，5-磺基水杨酸和硫酸钾优选用分析纯；将上述3种组分混合在一起，搅拌均匀，即得；其中，所加入的蛋白沉淀剂的用量，按重量比计算，优选为向动物凝血块中加入1％的蛋白沉淀剂。

优选的，步骤(1)中所述的过滤为：先用60-120目(优选为80目)滤网过滤第1次，再用板框过滤器过滤第2次。

优选的，步骤(2)中所述的超滤采用板式膜超滤器进行超滤；为了达到更好的效果，更优选的，采用板式膜超滤器超滤2次，其中，第1次超滤所用板式膜超滤器的膜孔径为50000D，第2次超滤所用板式膜超滤器的膜孔径为30000D。

步骤(2)中所述的冷冻干燥优选在零下42℃的温度条件下进行冷冻干燥；更优选的，首先在零下20～17℃的温度条件下冻干6～8小时，然后在零下10～7℃的温度条件下冻干1-3小时(更优选为2小时)。

步骤(2)中在冷冻干燥完成之后，将温度升至20℃，再收集冻干粉。

本发明方法与国内外目前制备超氧化物歧化酶的生产工艺相比，主要具有以下几方面的优点：

1、本发明方法可以用凝血块作为制备超氧化物歧化酶的原料：现有的制备工艺多以动物血液为制备原料，本发明的方法可以将所取回的动物凝血块直接使用，这样对原料的要求就大大降低，从而更有利于产业化生产。

2、工艺简单，所制备的超氧化物歧化酶活力高：本发明方法，由于其工艺非常简单(凝血块破碎成浆，加入“清除剂”机械处理清除所有不要的蛋白质，超滤或析出去小分子SOD提取即完成)，所制备的SOD很少流失或变性失活，而现有的制备工艺需要十几道工序，多种方法处理，大部分SOD在处理过程中流失或变性失活。本发明方法所制备的SOD活力能达到8000u/mg以上，甚至能达到9221u/mg个活力单位。而现有方法所制备SOD的活力大多在2500u/mg—4000u/mg之间。

3、用时短：本发明方法从开始生产到出成品SOD只需几个小时，而现有的工艺需要耗时100个小时左右，与现有方法相比，本发明方法显著的节省了人力、物力和时间。

4、产率高：采用本发明方法制备SOD，每公斤血块可生产50万个活力单位的SOD，采用同样的原料，现有的方法只能生产出1万—10万个活力单位SOD。

5、成本低：本发明方法生产SOD的工艺过程简单、原料要求低、设备要求低，故生产成本也得以大幅度的降低。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.取100kg牛凝血块放入搅拌罐中室温搅拌，搅拌时加入蛋白沉淀剂(由以下三种组分混合在一起而得：5-磺基水杨酸0.1kg，硫酸钾7.5kg和蒸馏水1.5kg)1L，持续搅拌20分钟；先用80目滤网过滤，然后用板框过滤器过滤，收集滤液；

2.取滤液用高速管式离心机离心(转速16000rpm)，取上清液，备用；

3.将上清液用板式膜超滤器进行第一次超滤，膜孔径为50000D，取滤出液，备用；

4.将步骤3所得到的滤出液经板式膜超滤器进行第二次超滤，膜孔径为30000D，取截流液，备用。

5.取截流液进行冷冻干燥，首先在零下20～17℃的温度条件下冻干6～8h；然后在零下10～7℃温度条件下持续冻干2h；冻干结束后，升温至20℃，收集冻干粉，装入无菌袋中，密封，得SOD成品，零下4℃保存。经检测，本发明方法的收率为50万个活力单位的SOD/kg血块，酶活性为4000～12000u/mg。

实施例2

1.取100kg猪凝血块放入搅拌罐中室温搅拌，搅拌时加入蛋白沉淀剂(由以下三种组分混合在一起而得：5-磺基水杨酸0.15kg，硫酸钾8.5kg和蒸馏水2.5kg)1L，持续搅拌15分钟；先用60目滤网过滤，然后用板框过滤器过滤，收集滤液；

2.取滤液用高速管式离心机离心，取上清液，备用；

5.取截流液进行冷冻干燥，将冻干温度零下42℃，首先在零下20～17℃的温度条件下冻干6～8h；然后在零下10～7℃温度条件下持续冻干2h；冻干结束后，升温至20℃，收集冻干粉，装入无菌袋中，密封，得SOD成品，零下4℃保存；经检测，本发明方法的收率为50万个活力单位的SOD/kg血块，酶活性为4000～12000u/mg。

实施例3

1.取100kg羊凝血块放入搅拌罐中室温搅拌，搅拌时加入蛋白沉淀剂(由以下三种组分混合在一起而得：5-磺基水杨酸0.12kg，硫酸钾8kg和蒸馏水2kg)1L，持续搅拌25分钟；先用120目滤网过滤，然后用板框过滤器过滤，收集滤液；

2.取滤液用高速管式离心机离心，取上清液，备用。

5.取截流液进行冷冻干燥，将冻干温度零下42℃，首先在零下20～17℃的温度条件下冻干6～8h；然后在零下10～7℃温度条件下持续冻干2h；冻干结束后，升温至20℃，收集冻干粉，装入无菌袋中，密封，得SOD成品，零下4℃保存。

Claims

1.一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括：

(1)将动物凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，过滤，收集滤液；

(2)将滤液离心，取上清液，超滤，取截流液，冷冻干燥，收集冻干粉，即得；所述的蛋白质沉淀剂由以下重量份的组分组成：5-磺基水杨酸1～1.5份，硫酸钾75～85份和15～25份蒸馏水。

2.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：所述的动物凝血块是猪、牛或羊的凝血块。

3.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤(1)中按重量百分比计算，向动物凝血块中加入1％的蛋白质沉淀剂。

4.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的过滤是先用60-120目滤网过滤第1次，再用板框过滤器过滤第2次。

5.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的超滤采用板式膜超滤器进行超滤。

6.按照权利要求5的制备方法，其特征在于：所述的超滤是采用板式膜超滤器超滤2次，其中，第1次超滤所用板式膜超滤器的膜孔径为50000D，第2次超滤所用板式膜超滤器的膜孔径为30000D。

7.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：所述的冷冻干燥是首先在零下20～17℃的温度条件下冻干6～8小时，然后在零下10～7℃的温度条件下冻干1-3小时。

8.按照权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤(2)中在冷冻干燥完成之后，将温度升至20℃，再收集冻干粉。