CN101716189B - 螠蛏贝壳提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，步骤如下：选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；利用机械破碎方式对贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；用生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为：每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。具有工艺步骤简单、好操作、容易控制、成本低、原料来源广阔的优点。

Description

螠蛏贝壳提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种提取物的制备方法，特别是一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，该提取物具有抑菌活性、抗氧化活性和诱导植物抗性的作用，可作为添加剂用于制备治疗和预防清除体内过氧化物的药物、食品防腐剂、作为皮肤表浅伤口的抑菌消炎药物和诱导植物抗性的生物农药。

背景技术

贝壳含有大量的碳酰，可用来烧制石灰。贝壳灰替代石灰用于生产蒸压加气混凝土砌块，具有较好的社会效益和经济效益。贝壳也是重要的中药材，可治疗各种疾病。如鲍的贝壳用于眼疾，宝贝的贝壳明目解毒，乌贼的内壳用于治疗外伤、癫痫、心脏病和胃病，并用来止血，文蛤的壳能治疗慢性气管炎、淋巴结核、胃及十二指肠溃疡，红螺壳用于治疗胃痛；以牡蛎贝壳为原料制备碳酸钙的工艺日益引起人们的重视，该种碳酸钙具有一定的生物活性，富含多种对人体有益的微量元素，如Zn、Mg、P、Fe、K、Cu等，易于被人体吸收；利用废弃扇贝壳制备新型的吸附材料，贝壳开发利用的前景是相当广阔的，不仅可以向食用、药用方向转化，而且可向化工、饲料、农药、化妆品方向转化。

螠蛏(Sinonovacula constricta Iamarck)俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(LameUibranchia)、真瓣鳃目(Eulamellibranchia)、蛏科(Pharellidae)，为中国和日本所特有，也是中国沿海养殖的重要贝类之一。目前对螠蛏贝壳化学成分的研究并不多，对其提取物活性的研究则更少。在药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等方面还没有对其进行加工利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简单、好操作、易控制、成本低的螠蛏贝壳提取物的制备方法，以便制得具有良好抑菌、抗氧化和植物诱抗活性的产品，用于作为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添加剂，克服现有技术的不足。

本发明的螠蛏贝壳提取物的制备方法，由如下步骤组成：

a、选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；

b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；

c、用浓度为0.9％的生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与所述生理盐水的配比为：每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；

d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。

本发明的方法制备的螠蛏贝壳提取物的制备方法，工艺步骤非常简单，好操作，容易控制，成本低，原料来源广阔，为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品提供了一种较好的添加剂。

具体实施方式

本发明的工艺步骤如下：

a、选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；

b、选用机械式破碎设备对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目或60目或70目或80目或90目或100目或110目或120目，即在50目～120目之间均可；

c、用浓度为0.9％的生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与生理盐水的配比为：每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；

d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得粉末状的螠蛏贝壳生理盐水提取物。

本发明的提取物可作为药品、生物农药、食品保鲜剂、防腐剂及化妆品等产品的添加剂。

为了对本发明的提取物进行检测，将30g的螠蛏贝壳按上述方法制取提取物，并将提取物溶于100mL水中用于检测其活性。

滤纸片法检测组织提取液的抑菌活性：大肠杆菌Escherichia coli(EC)、变形杆菌Proteus vulgaris(PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(SA)、产气杆菌Enterobacter aerogenes(EA)和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(BS)用牛肉膏蛋白胨培养基，乳酸菌Lactobacterium delbruckii(LD)用MRS培养基。酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(SC)用YPD培养基。以上各种菌分别接种于相应的液体培养基，振荡培养24h作指示菌。分别用移液枪取指示菌液100μL于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后将平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取贝壳提取物样品10μL滴入滤纸片中央，置于37℃培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75％酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结果该提取物对指示菌基本都具备抑菌作用(乳酸菌除外)，尤其对酵母菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果非常显著，因此用这种螠蛏贝壳提取物开发食品添加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。由于该提取物对金黄色葡萄球菌作用明显，因此可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应用于化妆品的添加剂。

超氧阴离子自由基(O^2-)清除作用的测定：取邻苯三酚0.1mL于试管中，加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入螠蛏贝壳提取物的溶液0.25mL，迅速混匀。在25℃反应15min。使用1cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度A_i，并测定本底扣除水解液自身的干扰。提取物溶液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：清除率S(％)＝Ao-(A_i-A_j)/Ao×100％。式中，Ao为试剂空白的吸光度值；A_i为样液的吸光度值；A_j为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(O^2-)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的·OH，因此常用样品对超氧阴离子自由基(O^2-)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao为0.862，经清除率公式S(％)＝Ao-(A_i-A_j)/Ao×100计算超氧阴离子自由基清除率。结果螠蛏贝壳提取物溶液的超氧阴离子自由基清除率56.30％。因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。

羟自由基(·OH)清除作用的测定：取9mmol/L的FeSO₄1mL、9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1mL、样品酶解液1mL，最后加入8.8mmol/L的H₂O₂1mL启动反应。在37℃反应30分钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510nm下测各个提取液吸光度值。提取物对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算：

S_A＝[(Ac-As)/(Ac-Ao)]×100％

式中，Ac为对照组OD值；As为样品组OD值；A₀为空白组OD值。

羟基自由基(·OH)是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。

对照组OD值Ac 1.053，空白组OD值Ao0.018。经公式S_A＝[(Ac-As)/(Ac-Ao)]×100％算出羟自由基清除率S％，该样品清除羟自由基(·OH)的清除率为60％，因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。

大豆子叶法测定植物诱抗活性：将发芽大豆，放入洗净的解剖盘当中浇水浸没，放入光照培养箱培养，每天浇水培养4-5天待大豆长出两片真叶后即可进行活性测定。在无菌条件下，将刚刚长出真叶的大豆子叶剪下，用8％次氯酸钠溶液灭菌5分钟，再用无菌水冲洗。用刀片削去子叶外表皮厚约1mm，直径约6mm的伤口，用无菌水浸泡清洗，约30秒后取出，滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿10片子叶作为一个处理。每组样液一个处理，每个处理做一次重复，对照组用无菌水。使用微量移液器取配置好的螠蛏贝壳提取液每10μL加在一个伤口上。处理后的子叶在28℃黑暗的温箱中培养24小时后，将每皿中的子叶转移到一个盛有10mL双蒸水的试管中，充分振荡，用紫外分光光度计在286nm处测定OD值。结果该螠蛏贝壳提取物的溶液处理的样品OD值明显高于阳性对照(壳寡糖)，因此植物诱抗活性显著，可应用于生物农药的开发。

根据上述的检测可知，本发明的提取物具有抗氧化、抑菌和植物诱抗等多种显著生物活性；原料来源丰富，价格低廉，制备方法简便；螠蛏是中国沿海养殖的重要贝类良种之一，而螠蛏的组织加工后，其壳往往被废弃，因此来源丰富且可增强废物利用，减少环境污染。

Claims (1)

1.一种螠蛏贝壳提取物的制备方法，其特征在于：由如下步骤组成：

a、选取新鲜的螠蛏贝壳去肉；

b、利用机械破碎方式对a步骤所述的贝壳进行破碎，形成贝壳粉末，其贝壳粉末的目数控制在50目～120目之间；

c、用浓度为0.9％的生理盐水提取贝壳粉末，贝壳粉末与所述生理盐水的配比为：每千克贝壳粉末加入2升生理盐水；分三次提取，第一次提取时间为一天，然后利用抽滤装置过滤收集滤液；第二次提取时间为两天，利用抽滤装置过滤收集滤液；第三次提取时间为三天，利用抽滤装置过滤收集滤液；

d、把c步骤中三次提取的滤液混合得生理盐水提取液，再对生理盐水提取液进行冷冻干燥，得螠蛏贝壳的生理盐水提取物。