CN101708201B - 一种治疗胃溃疡的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用白檵木为主要有效成分制备的药物。本发明用白檵木粗提物进行了动物实验和体外实验，证实白檵木粗提物可明显缩小大鼠胃溃疡面积，而且安全性好，不影响动物血小板聚集功能。

Description

一种治疗胃溃疡的药物
技术领域：
本发明涉及一种治疗胃溃疡的药物，特别是涉及一种用白檵木为主要有效成分制备的药物。
背景技术：
白檵木又称白花檵木，其提取物主要成份为没食子酸、鞣质、黄酮类，中药学归属于愈合体内外伤口及收敛止血药类，临床用于外伤出血及体内脏器官出血和水火烫伤。
但未见有人用白檵木或其提取物用于治疗胃溃疡。
发明内容：
本发明的目的是开发一种用白檵木为原料制备的药物。
本发明发现了白檵木或白檵木的提取物具有治疗胃溃疡的作用，可用于制备治疗胃溃疡的药物。
所述白檵木包括白檵木植物的花、茎、叶、枝。
所述白檵木的提取物，是用药物可接受的溶剂对白檵木进行浸提所得的粗提物。
所述药物可接受的溶剂选自水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合物，所述有机溶剂选自醇、醚或酯。
提取白檵木所用的浸提方法，可采用本领域常用的浸提方法，如渗漉法、水蒸汽蒸馏法、回流法、浸渍法、超临界流体提取法、超声波提取法，也可采用柱分离、离子交换等植物有效成分分离的常规方法。在确保不破坏活性物质成分的前提下，力求采用节能减排、生态环保式的清洁生产工艺。
优选的提取方法是本发明人探索出的一套生物酶解法提取技术制备白花檵木提取物(其中含有较高含量的黄酮类物质)的工艺流程。见中国专利200710149826.4。
生物酶解法提取技术制备白花檵木提取物的具体流程为：生产线前的原料抽样分析检测→原料验收→深度清洗→组合菌酶解→灭活→动态温浸提取→低温浓缩→瞬间冷冻→高速离心沉降分离→喷雾干燥→包装检测→白花檵木粗提物。
将上述生物破壁法获得的白花檵木生物破壁产物，采用动态温浸法提取，提取浸膏先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花檵木的粗提物初步分离纯化，得到含生物活性物质的白花檵木化学部位。
进行了生物酶解法提取技术制备白花檵木提取物与常规的水提法制备白花檵木提取物的比较观察，结果显示生物酶解法有效的破壁效果使白花檵木提取物中上述三类成分的含量提高，其生化作用较强。
本发明用白檵木粗提物进行了如下动物实验和体外实验，证实：
1)白檵木粗提物以200mg/kg剂量连续灌胃给药13天可明显缩小醋酸所致大鼠胃溃疡面积。
2)白檵木粗提物单次小鼠灌胃给药量10g/kg，未见明显毒性反应，属于无毒性物质。
3)体外实验结果表明，白檵木粗提物在500μg/mL浓度下未见有促进血小板聚集的作用。
因此，白檵木提取物不仅具有治疗胃溃疡的作用，而且安全性好，不影响动物血小板聚集功能。
将上述治疗有效量的白檵木提取物和药物可接受的任何载体、赋形剂、辅剂结合，可制成治疗胃溃疡的药物。
也可以根据不同情况，将白檵木提取物与其它药物活性成分制成治疗胃溃疡的复方药物。
为了保证药物更好的疗效和更优的理化性状，还可在药物中加入制剂常用的辅剂，如防腐剂、助渗剂、增溶剂、表面活性剂、PH调节物质，本领域技术人员可根据不同剂型和使用的需要添加。
附图说明：
图1是白檵木提取物在大鼠胃溃疡药效学实验中，连续给药13天，对胃溃疡大鼠体重的影响。
图2是白檵木提取物在大鼠胃溃疡药效学实验中，连续给药13天，对胃溃疡大鼠溃疡指数的影响。
图3是白花檵木提取物紫外检测色谱图。
图4是白花檵木提取物离子色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对白檵木提取物的提取过程、药效、安全性等实验做进一步详述。但本发明并不限于此粗种方法所获得的粗提物。实际上，用其他方法所得的白檵木提取物治疗胃溃疡，也在本发明的范围之内。
实施例1 白檵木粗提物的提取
用生物酶解法提取白花檵木粗物。具体流程为：生产线前的原料抽样分析检测→原料验收→深度清洗→组合菌酶解→灭活→动态温浸提取→低温浓缩→瞬间冷冻→高速离心沉降分离→喷雾干燥→包装检测→白花檵木粗提物。
具体提取方法是，将白花檵木鲜材料破碎。采用组合菌酶解方法获得白花檵木生物破壁产物，采用动态温浸法提取(温度85℃，时间120m，PH值6.5±0.2)，温浸提取时间为16小时，得到提取浸膏。先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花檵木的粗提物初步分离纯化，得到粗提物，重量为原料重量的5.5-6％。
所述组合菌酶解所用菌种是荷兰株芽孢，来源于景德板鸡发酵粉，由江西景德板鸡实业公司生产。
原菌种荷兰株芽孢是唯一不产生肠毒素的菌种，经培养，在二次代谢中分离出D429，过程是肉汤斜面培养。石腊封存2个月后再次分离菌体，并组扩大培养，然后再分离，最后经扩群，提取其浮生藻，冻干成活性菌体粉。菌种培养基为肉汤琼脂等。
本发明进行了生物酶解法提取技术制备白花檵木提取物与常规的水提法制备白花檵木提取物的比较观察，结果显示生物酶解法有效的破壁效果使白花檵木提取物中上述三类成分的含量提高，其生化作用较强。
实施例2 白花檵木化学成分初步分析报告
一、样品制备
精称粗提粉末1.06mg，1mL50％甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，即得。
二、色谱条件
高效液相色谱仪：Agilent 1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies公司)，包括二极管阵列检测器，四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器。
色谱柱：YMC-Pack Pro C18(150mm×3.0mm ID，5μm)；
流动相：
A(甲醇)，B(0.1％甲酸H2O)
梯度洗脱(0→35min，A：10％→98％；35min-40min，A：98％→98％；)；
流速0.3mL/min；
柱温：40℃
紫外扫描范围：200-400nm；
检测波长：200-400nm。
三、质谱条件
1、质谱仪：Q TRAPTM型四极杆-线性离子阱串联质谱仪(Applied Biosystems/MDSSCIEX，USA)，离子源：采用负离子检测模式的ESI源。
2、LC-MS测定条件：
Scan Type                      Enhanced MS(EMS)
Polarity                       Negative
Scan Mode                      Profile
Ion Source                     Turbo spray
Scan Rate：                    4000Da/s
LIT fill time                  80.00msec
Q3Entry Barrier                8.00V
Curtain Gas(CUR)               25.00
CAD                            High
Ionspray Voltage(IS)           -4.5kV
TEM                            350.00
Nebulizer Gas(GS1)             70
Source Gas 2(GS2)              60
ihe：                          ON
Declustering Potential(DP)     -80V
Entrance Potential(EP)         -10V
Collision Energy(Experiment 1) -10V
Collision Energy(Experiment 2) -40eV
表1 白花檵木主要化学成分
tR(min)   [M-H]-(m/z) Product ion 分子式   化合物名称
13.97 353.2   191.0，179.0，173.0 C16H18O9 绿原酸
  16.44   337.2   191.2   C13H22O10   奎尼酸+鼠李糖
  17.42   415.2   C21H20O9   芹菜素-O-葡萄糖苷
  18.49   477.1   313.2   C22H22O12   异鼠李素-3-O-葡萄糖苷
  19.50   479.3   316.0   C21H20O13   杨梅素-3-O-葡萄糖苷
  20.69   463.2   316.1   C21H20O12   杨梅素-3-O-鼠李糖苷
  21.36   463.2   301.0   C21H20O12   槲皮素-7(3)-O-葡萄糖苷
  22.12   599.2   447.1，313.2   C28H24O15   黄芪苷-2(6)-O-没食子酸酯
  22.83   447.2   285.1   C21H20O11   山奈酚(木犀草素)-3(7)-O-葡萄糖苷
  23.14   447.2   301.1   C21H20O11   槲皮素-O-鼠李糖苷
  25.07   431.2   285.1   C27H30O15   山奈酚(木犀草素)-O-鼠李糖苷
  25.95   301.2   C15H10O7   槲皮素
26.38 593.0 285.1   C27H30O15C30H26O13   木犀草素(山奈酚)-7-O-芸香糖苷山奈酚-3-(6”-对羟基桂皮酰)-葡萄糖苷
  28.42   285.1   C15H10O6   山奈酚(木犀草素)
图3是紫外检测色谱图，其中：红色254nm，蓝色285nm，绿色360nm。
图4是离子色谱图，其中：黑色m/z 191(奎尼酸母核)，蓝色m/z 285(山奈酚/木犀草素母核)，红色m/z 301(槲皮素母核)，绿色m/z 316(杨梅素母核)。
实施例3 白檵木粗提物对醋酸所致大鼠慢性胃溃疡的影响
1、实验材料
受试品：白檵木粗提物，褐色粉末状固体，由江西德宇集团提供①称取10g+蒸馏水混悬后定容至250ml，②取①80ml加蒸馏水至160ml。
阳性对照药：泮托拉唑钠肠溶片，沈阳东宇药业有限公司，批号：080903，取4片(160mg)加蒸馏水溶解后定容至160ml。
动物：Wistar大鼠，雄性，体重180-220g，中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号，SCXK(京)2008-0004。
2、实验方法：Wistar大鼠24只，试验前禁食24h。在乙醚麻醉下打开腹腔，暴露全胃，将内径5mm长30mm的塑料管垂直放置于胃体部浆膜面上，向管腔内加入原浓度冰醋酸0.1ml，1.5分钟后用棉签蘸出冰醋酸，缝合手术切口。术后正常饮食，第二天将动物随机分为4组，分别为：
药高组：白花檵木粗提物给药400mg/kg；
药低组：白花檵木粗提物给药200mg/kg；
阳性对照组：泮托拉唑给药10mg/kg；
空白对照组，不给药。
各组连续灌胃给药13天，上述药物按10ml/kg体积灌胃给药，空白对照组给予同体积(10ml/kg)蒸馏水。末次给药后30min，解剖取出胃，用10％甲醛固定10min后沿胃大弯剖开胃，平展在玻璃上，测量溃疡部位最长直径，和最短直径，以最长直径和最短直径平均值作为溃疡指数，
3、实验结果
体重、溃疡指数结果见表2和图1、图2。数据分析方法为：数据以平均值±标准差表示，数据分析采取组间t检验。
表2 白花檵木粗提物连续给药13天对醋酸所致大鼠胃溃疡指数的影响
Figure G2009102420209D00061
注：溃疡指数为溃疡面的最长径与最短径的均值，各组同空白组比较。
4、实验结论
白檵木粗提物以200mg/kg剂量连续灌胃给药13天可明显缩小醋酸所致大鼠胃溃疡面积，但作用强度弱于10mg/kg泮托拉唑。
实施例4 白檵木粗提物对大鼠血小板聚集功能的影响体外研究
一、材料
1、受试品：白檵木粗提物，褐色粉末状固体，由江西德宇集团提供。
2、试剂：戊巴比妥钠，购自鼎国生物技术有限公司，规格：258，批号：76I10203；枸橼酸钠，北京化工厂产品，批号：20000809，蒸馏水配制成3.8％的溶液；牛凝血酶，规格：1000U，Sigma公司产品进口分装产品，固体粉末状，用生理盐水配制100U/ml，分装后-20℃保存；医用生理盐水，购自石家庄四药有限公司产品，批号：080904110。
3、仪器：飞鸽牌TDL-40B型低速台式大容量离心机，北京科学器材有限公司出品；LBY-NJ4型血小板聚集仪，北京利普生公司出品；秒表等。
二、方法
1、麻醉：取雄性SD大鼠，280-300g，1.5％戊巴比妥钠麻醉(剂量为0.4ml/100g)。2、取血：腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠按体积比9∶1抗凝。
2、血小板的制备：全血1200r/min离心10min后取上层米黄色混悬液，为富血小板血浆(PRP)，剩余血浆3000r/min离心10min后取上层清夜，为贫血小板血浆(PPP)。用PPP将PRP中血小板数量调整至仪器显示吸光度值300-400之间。
3、血小板最大聚集率的测定：
(1)白檵木粗提物对血小板的直接促聚作用：在比色杯中加入300μl PPP调整仪器零点，另取比色杯依次加入搅拌子和300μl PRP，预温5min，分别加入受试品(体系终浓度为500μg/mL)、凝血酶(体系终浓度为6.4U/mL)或生理盐水20μl后，立即记录5min内血小板最大聚集率。
(2)白檵木粗提物与凝血酶联合应用对血小板促聚作用：在比色杯中加入300μl PPP调整仪器零点，另取比色杯依次加入搅拌子、300μl PRP、以及生理盐水或受试品15μl(体系终浓度为500μg/mL)，温育5min后加入10μl凝血酶(体系终浓度为3.2U/ml)，记录5min内血小板最大聚集率。
4、数据分析
数据以平均值±标准差表示，数据分析采取组间t检验。
三、结果
1、受试品对血小板的直接促聚作用研究
表3 白檵木粗提物单用对大鼠体外血小板聚集的影响
  组别   n   浓度   最大聚集率(％)
  生理盐水   3   -   25.45±8.43*
  白檵木粗提物   3   500μg/mL   8.23±9.71*
  凝血酶   3   6.4U/mL   86.93±12.64
*与凝血酶组比较，P＜0.001。
与生理盐水组比较，白檵木粗提物组对血小板最大聚集率无统计学差异。此外，白檵木与生理盐水组的血小板最大聚集率均显著低于凝血酶组。说明500μg/mL白檵木和生理盐水都不能直接引起显著的血小板聚集，不具有促血小板聚集的作用。
2、受试品与凝血酶对血小板联合促聚作用研究
表4 白檵木粗提物与凝血酶联合应用对大鼠体外血小板聚集的影响
 组别   n   浓度(μg/mL)   最大聚集率(％)
 生理盐水+凝血酶   3   -   65.94±6.6
 白檵木粗提物+凝血酶   3   500   66.26±4.4
与生理盐水组比较，白檵木粗提物组与凝血酶联合应用用对血小板的最大聚集率无统计学差异。说明500μg/mL白檵木粗提物与凝血酶联合作用不能显著促进血小板聚集。
四、结论
本实验证明白檵木粗提物在1，10，100μg/mL浓度下均具有显著收缩血管作用。本实验研究了白檵木粗提物对血小板聚集的影响，实验结果表明，白檵木粗提物在500μg/mL浓度下未见有促进血小板聚集的作用。据此推测，白檵木收敛止血的功效可能不通过促进血小板聚集发挥作用。
实施例5 白檵木粗提物小鼠单次给药急性毒性初步试验
目的：此次试验采用最大给药剂量法，通过小鼠单次灌胃白檵木，观察小鼠出现的中毒症状、中毒程度、性质、恢复情况及死亡等。
材料与方法
受试品：白檵木粗提物，棕色粉末，易溶于水；由江西德宇集团提供。临用前用双蒸水配制成所需浓度的溶液备用。
动物：昆明种小鼠，体重18 20g，雌雄各半，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK(京)-2007-0001。
方法：根据最大给药量法，使用40只小鼠，雌雄各半，空白对照组与给药组各20只。给药组以最大给药体积(0.4ml/10g体重)给予合适的给药浓度(浓度为0.25g/ml)，给药剂量为10g/kg，对照组给予同体积的蒸馏水。详细记录给药当日动物表现，对死亡动物剖检，存活药后观察14天，第15天进行剖检。
结果：
白檵木给药后无小鼠死亡；给药后未见小鼠有异常表现，小鼠均活动正常、毛色光滑、摄食量正常、粪便正常、体重增加、肉眼尸检未见异常。给药后每日记录小鼠体重，结果见表5。
表5 白檵木单次给药毒性试验动物体重记录(g)(n＝10)
Figure G2009102420209D00091
结论
在本次试验条件下，单次灌胃给药白檵木的LD50大于10g/kg，未见死亡及异常变化，属于无毒性物质。

Claims (2)

1.白檵木提取物作为唯一活性成分在制备治疗胃溃疡的药物中的用途，所述白檵木提取物以如下方法得到：将白檵木鲜材料破碎，采用组合菌酶解方法获得白檵木生物破壁产物，采用动态温浸法提取，温度85℃下时间为120m，pH值6.5±0.2；温浸提取时间为16小时，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，得到粗提物，重量为原料重量的5.5-6％；所述组合菌酶解所用菌种是荷兰株芽孢。
2.权利要求1所述的用途，所述白檵木选自白檵木的花、茎、叶或枝。
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Denomination of invention: Xiangbei notoginseng powder for treating gastric ulcer

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