CN101084985B - 甘草高效抗菌、抗氧化活性部位的分离及鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种简便、快速从植物中分离高效抗菌、抗氧化活性部位的工艺及质量标准检测方法。首先将经粉碎的植物材料加入到超声提取机中，用适量的有机溶媒在10-100℃的温度下，超声提取10-30分钟，过滤、浓缩、回收溶媒，干燥成初制品，再根据极性用不同溶媒分离而得到不同的高效抗菌抗氧化活性部位。通过生物活性检测确认各活性部位的生物活性，并通过质谱指纹图确定这些活性部位所含化合物之间是否具有一致性，同时通过HPLC的指纹鉴定可确定相关化合物的相对含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种简便、快速分离植物高效抗菌、抗氧化活性部位的工艺及质量标准检测方法，属于中药制备及鉴定技术领域。
背景技术
在天然药物的制备中，快速高效地提取、分离并鉴定目标生物活性部位的工艺及方法创新最为人们关注。更为需要的是如何生产并鉴定出已知生物活性的多种化合物是否有一致性。
甘草是多年生草本植物，是一种应用极其广泛的中药材，其味甘、平，能补脾益气、止咳化痰、缓急止痛、解毒降火等。这些功能与甘草中所含的黄酮类、三萜类、多糖类等有效活性成分相关。从甘草中提取的抗氧化成分具有较强的清除自由基的作用，还具有抑菌、消炎、解毒、除臭的功能，如何针对性地分离提取甘草中具有抗氧化、抗菌生物活性部位，并对它们进行质量标准鉴定，目前还没有一种简便、快速的有效方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一种简便、快速分离甘草高效抗菌、抗氧化活性部位的方法，并对所得到的活性部位进行质量标准鉴定。
本发明分离甘草有效部位并对其进行鉴定的方法包括如下步骤：
1)以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或它们的混合物作为
溶媒，于10～100℃超声提取甘草材料10～30min；
2)过滤，浓缩滤液；
3)滤液直接干燥成粗品或者用石油醚提取后过滤、浓缩、干燥得到不同的活性部位；
4)粗品选用不同极性的有机溶剂作为溶媒进一步精化分离出不同的活性部位；
5)通过抗菌、抗氧化试验评价这些不同活性部位的功能效果；
6)通过质谱指纹鉴定，根据其功能确定这些不同活性部位所含化学基团是否具有一致性；
7)通过HPLC指纹图谱对照，结合其功能效果对比确定这些不同活性部位中相关功能化合物的相对含量。
在上述方法的步骤1)之前可先用水提取经粉碎的甘草材料，然后过滤取甘草渣进行超声提取。在步骤1)中可利用超声纳米吸附提取工艺提高分离高效抗氧化、抗菌活性部位的产率，即在超声提取过程中加入纳米材料，让超声细胞破碎提取与纳米吸附同时进行。纳米材料优选纳米级SiO2，粒度小于1000nm，或相似硬度、表面积、粒度的其他纳米材料。纳米材料用量与被提取植物原料比大于等于0.01％(重量比)，最佳用量为非水溶性目标成分的相同量。
在本发明的一个具体实施例中，上述步骤3)～4)滤液直接干燥制得粗品G007，再选用不同极性的有机溶剂作为溶媒进一步精化分离出不同的活性部位，如：制备G017选择的溶媒为乙酸乙酯，或相似极性的溶媒；制备G716选择的溶媒为石油醚-乙酸乙酯，或相似极性的溶媒；制备G717选择的溶媒为石油醚或相似极性的溶媒。
用上述工艺制备的具有高效抗氧化、抗菌生物活性的提取物G007、G017、G716及G717具有特定可测的化学特征。
在步骤5)通过抗油脂氧化试验来确定这些不同活性部位的抗氧化效果；通过不同活性部位的最低抑菌浓度评价其抑菌效果：选定检测菌如变形链球菌(Streptocacusmutans)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)，对上述活性组分的最低抑菌浓度(MIC)进行评价，按最低抑菌浓度分离高效抗菌部位如下(参见表I)：
G007MIC≤150ppm
G717，G017 MIC≤100ppm
G716MIC≤10ppm
通过质谱指纹鉴定，确定高效抗菌抗氧化提取物的主要化学基团，如根据上述抑菌的功能，确定使之功能体现的化学基团(G017的质谱指纹图如图2所示，G716的质谱指纹图如图3所示)。通过HPLC的指纹鉴定，确定相关化合物的相对含量(G007和G017的HPLC指纹图谱比较如图4所示)。
本发明提供了一种简便、高效率提取、分离植物高效抗氧化抗菌活性部位的工艺及质量标准鉴定方法，该工艺及方法可延伸到其他中药的提取与制备。其中，采用超声波提取(ultrasonic extraction)的机械效应、空化效应、热效应的优势，结合纳米材料的吸附，超声波同时增大纳米颗粒及介质分子的运动速度，增强介质的穿透力以达到从动植物种高效提取目标活性成分或部位的目的。通过质谱和HPLC指纹图谱鉴定已知生物活性的多种活性部位，可简便有效地确定其所含化合物是否有一致性及其相对含量。
附图说明
图1是从甘草中提取分离高效抗氧化、抗菌活性部位的工艺流程图。
图2是G017的质谱指纹图。
图3是G716的质谱指纹图。
图4是G007和G017在365nm下的HPLC对照图谱。
具体实施方式
下面以具体实施例来说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例 超声纳米吸附从甘草中分离提取高效抗菌抗氧化剂及其鉴定
本发明以从甘草中提取分离高效抗氧化、抗菌活性部位为例，首先采用超声波纳米SiO2吸附法成功地提取并分离了抗氧化剂G007。纳米SiO2具有硬度高、颗粒小、比表面积大、不溶于水或有机溶剂、吸附非水溶性物质能力强等优点。在超声效应中，纳米SiO2与超声波的空化效应、机械效应的协同作用使介质极大地增强了穿透力，在缩短了破碎时间的同时，增速了吸附溶解双向运动，促进了化学成分向溶剂中的溶解。
根据纳米SiO2与植物化学成分的非永久性吸附的特点，选用不同极性的有机溶媒进一步精化分离出G717，G017，及G716。
提取的具体工艺流程参见图1。超声提取后过滤浓缩，浓缩液直接干燥得到粗品G007，而将滤液进一步用石油醚室温提取5～20min，过滤、浓缩、干燥后得到G717。将粗品G007溶解于≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或它们的混合物中，上硅胶柱进行柱层析，室温下用乙酸乙酯洗脱并干燥得到G017，用石油醚-乙酸乙酯(体积比1∶1)洗脱并干燥则得到G716。
本发明通过所提取的活性部位对食用油的抗氧化添加剂试验来评价抗氧化功能(见表I)。用对口腔厌氧菌的最低抑菌浓度(MIC)来评价抗菌效果(见表II)。
表I.甘草抗氧化剂添加试验*
*测试条件：G007，G717 100ppm，茶多酚(固体)100ppm，大豆色拉油PV：0，测试温度110℃，空气流量15L/h。
结论：采用(Metrohm)公司679Rancimat测定不同种类的抗氧化剂对大豆色拉油的抗氧化效果，从甘草细胞中提炼而成的天然抗氧化剂G007、G717的抗氧化效果明显优越。
表II.甘草抗氧化剂最低抑菌浓度试验
结果：G007、G717、G017、G716、G178分别为不同方法从甘草细胞提取的样品，其中G178为常规大孔树脂法提取的甘草黄酮。G716在其它独立试验中最低抑菌浓度为：～3μg/ml。
通过对提取的活性部位进行生物活性检测(见表I、表II)发现，G007、G717具有高效抗氧化功能及抗菌活性，而G017，G716则具有比一般甘草提取物高出500倍以上的高效抗菌功能。
通过对提取的活性部位进行质谱鉴定，发现这些具有相同活性的部位有共同相似的化学基团(见图2、图3)。其高效抑菌效果的化学基团应有如图1、图2所示的化学性质。图中化学物质的含量差异可能决定生物活性的效果高低。从基团分子量推断，这些特定提取物中包含有甘草黄酮、异黄酮、查耳酮类物质、甘草定甙、苷类等物质。
根据表II，G017的抗菌效果比G007高出约2-8倍，换言之，G017的MIC小于G007的MIC 2-8倍，这种生物活性的差异可通过HPLC指纹图谱鉴别出来。
将甘草产品G007和G017用乙腈分别配制成20mg/ml的溶液，0.45μm过滤器过滤备用。进样体积：30μl；流速：1.0ml/min；检测波长：365nm；用乙腈和1％冰醋酸水溶液梯度洗脱。得到的HPLC指纹对照图谱如图4所示，G017的峰1与G007的峰1含量相当，而峰2-6均比G007提高约1.28-5.17倍，因此图4中的峰1-6为G017的特征峰，可作为G017高效抗菌、抗氧化活性部位的鉴别方法及参考质量标准。该方法也可延伸到其他产品及活性部位的鉴别及质量标准控制中。
从图4可得，与G007相比，G017的峰1-6的含量变化如下表所示：
| 产品 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 |
| G017 | 0.95 | 2.15 | 5.17 | 2.51 | 1.5 | 1.28 |
| G007 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
Claims (8)
1.一种分离甘草抗菌、抗氧化活性部位的方法，包括如下步骤：
1)以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或它们的混合物作为溶媒，于10～100℃超声提取甘草材料10～30min；
2)过滤，浓缩滤液；
3)滤液直接干燥成粗品得到活性部位，或者将滤液用石油醚提取后过滤、浓缩、干燥得到活性部位。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1)之前先用水提取甘草材料，然后过滤取甘草渣进行超声提取。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤1)加入纳米材料进行超声纳米吸附提取。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述纳米材料为纳米级SiO2，粒度小于1000nm，或者是具有相似硬度、表面积、粒度的其他纳米材料。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：按重量计纳米材料用量与被提取的植物原料比大于等于0.01％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所得粗品进一步选用不同极性的有机溶剂作为溶媒分别精化分离出不同的活性部位。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)所得粗品用≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或它们的混合物溶解后上层析柱，用乙酸乙酯或者体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱得到活性部位。
8.一种分离自甘草的抗菌、抗氧化活性部位，由如下方法制备：以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或它们的混合物作为溶媒，于10～100℃超声提取甘草材料10～30min，然后过滤，滤液浓缩后干燥制得。
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