CN101703003A - 象草的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种象草的快速繁殖方法，属于植物细胞工程技术领域。以象草幼穗为材料，通过愈伤组织诱导、丛生苗诱导以及丛生苗增殖和壮根培养，进行象草细胞工程苗的快速扩繁；1个幼穗1次扩繁可产生细胞工程苗85～406株，平均细胞工程苗繁殖系数为198株/穗，细胞工程苗温室或大田苗床移栽成活率达98％，经30d以上的生长，可作为种苗用于大田种植；本方法能改进已建立的“象草体细胞培养植株再生方法”不能诱导丛生苗的不足，是现有象草种茎无性扩繁和种茎细胞工程扩繁技术的有益补充，具有繁殖系数高、取材方便和操作简便的特点，为象草产业化应用提供技术支撑。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种象草的快速繁殖方法，属于植物细胞工程技术领域。
二、背景技术
象草(Pennisetum Purpureum Schumach)又名紫狼尾草，为禾本科狼尾草属多年生草本植物，原产热带非洲，适宜在热带和亚热带地区栽培。象草不仅可作为草食畜禽和水产鱼类的优质青饲料，优质纸浆和中高档复合人造板的理想原料，还是重要的生物质能源作物，国内外种植面积正在迅速扩大。
尽管象草为多年生草本植物，但在我国长江中下游及其相同纬度地区不能自然开花结实，即使结实，也由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低的原因，国内外象草繁殖通常采用生长2个月左右的茎节为材料无性扩繁，具有繁殖系数低、操作费力费工的不足。江洪如等以矮象草幼嫩茎节为外植体，建立了矮象草的试管快繁技术体系(如江洪如，佘发新，王碧琴，刘腾云.矮象草的试管快繁技术研究，2003：472，中国重要会议全文数据库)，有效利用了幼嫩茎节，具有较高的繁殖系数；钟小仙等以象草幼穗为外植体，建立了“象草体细胞培养植株再生方法”(ZL 200610085256.2)，为利用象草幼穗进行种苗扩繁提供了可能，但存在现有幼穗离体培养不能诱导丛生苗，繁殖系数低的不足。本方法以象草幼穗为材料，通过改进培养基配方和培养条件，经幼穗愈伤组织诱导、丛生苗诱导以及增殖和壮根培养，具有繁殖率高、操作简便的特点，为象草的快速繁殖提供了又一有效方法。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种以象草幼穗为外植体进行快速繁殖的方法，弥补现有象草繁殖技术以利用茎节为主的不足；通过改进培养基配方和培养条件，改进现有象草幼穗离体培养植株再生方法，通过诱导丛生苗，提高繁殖系数。
本发明的技术方案如下：
利用象草幼穗为外植体，通过不同激素配比和改善光照条件，进行愈伤组织诱导和分化，促使愈伤组织直接分化为丛生苗，经丛生苗增殖和壮根培养，1个象草幼穗可产生85～406株细胞工程苗。
具体步骤如下：
①外植体的选择与灭菌
选用象草的幼穗为外植体，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外部的叶鞘和茎，剥出幼穗，切成2～3mm长的片段；
②幼穗愈伤组织诱导
把幼穗的切段接种于下列培养基中：改良的MS(MS中铁盐含量加倍)+4.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)+0.05mg/L激动素(KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；培养室温度为26℃～28℃，光强1500～2000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为35～40d；
③丛生苗诱导
将幼穗诱导的颗粒状愈伤组织培养于下列培养基中：改良的MS+3～4mg/L 6-BA(或3～4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；培养室温度为26℃～28℃，光强2500～3000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为30～35d；
④丛生苗增殖和壮根培养
将丛生苗中具有3张完整叶的分蘖在无菌条件切割分离后，分别接种于下列培养基中：MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；培养室温度为26℃～28℃，光强3500～45000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为25～30d。
(2)细胞工程苗的苗床移栽
将上述根系发达、生长良好的细胞工程苗，移栽至温室或大田苗床，环境温度控制在25～35℃；苗床的土壤具有较好的肥力，排灌方便，去除杂草，精细整地，做畦，畦长自定，畦宽1～1.5米为宜，行株距为20～25cm×10～15cm，移栽时浇透水，7d内保持土壤湿润，14～20d时，可施用尿素2～3kg/666.7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生长30d以后，可作为种苗向大田移栽。
有益效果
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
以象草幼穗为外植体，1个幼穗产生的愈伤组织可分成2～3mm左右的愈伤组织团60～96块，愈伤组织块30～40d分化培养，再生植株的频率80％以上，丛生苗诱导率75％以上，每个丛生苗具有3张完整叶片的分蘖有2～8个，增殖和壮根培养后，1个幼穗1次扩繁可产生细胞工程苗85～406株细胞工程苗，平均细胞工程苗繁殖系数为198株/穗；细胞工程苗温室或大田苗床移栽成活率达98％，生长30d以后，可作为种苗用于大田种植，以1株大田生长的象草有效分蘖穗30个计，1株象草幼穗通过本方法可繁殖5811株种苗，象草按株行距40cm×40cm大田种植计，可满足约1.4亩大田象草种植的需要。
四、附图说明
图1幼穗诱导的愈伤组织
图2愈伤组织分化的丛生苗
五、具体实施方式
(1)外植体的选择与灭菌
10月下旬至11月上旬，选用自然分化孕穗的象草N51(公知公用，白淑娟，张运昌，陈德新.杂交狼尾草亲本花期及主要植物学性状[J].中国草地，1996，(3)：49-52)的幼穗为外植体，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外部的叶鞘和茎，剥出幼穗。幼穗长度小于2cm，直接接种；幼穗长度2～5cm，切成2～3mm长的穗段；幼穗长度超过5cm，则取幼穗基部5cm以内部分，同样切成2～3mm长的穗段。
(2)幼穗愈伤组织诱导
把幼穗的切段接种于愈伤组织诱导培养基，诱导时间为30～35d，培养室温度为26℃～28℃，光强1500～2000Lx，光照时间为16小时/天.培养基配方为：改良的MS(MS中铁盐含量加倍)+4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)+0.05mg/L激动素(KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8，统计了60个幼穗，愈伤组织诱导率为100％；
(3)丛生苗诱导
将幼穗诱导的颗粒状愈伤组织分成2～3mm大小的愈伤组织团，接种于丛生苗诱导培养基，培养时间为30～35d，培养室温度为26℃～28℃，光强2500～3000Lx，光照时间为16小时；培养基配方为：改良的MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；统计了48个幼穗诱导的愈伤组织，可分成2～3mm大小的愈伤组织团64-96块，植株再生率(再生植株数/愈伤组织团数)平均为81％，2～8个分蘖的丛生苗率(丛生苗数/再生植株数)为75.2％；
(4)丛生苗增殖和壮根培养
将丛生苗中具有3张完整叶的分蘖在无菌条件切割分离后，分别接种于下列培养基中：MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；培养室温度为26℃～28℃，光强3500～45000Lx，光照时间为16小时，培养时间为25～30d；1个幼穗产生茎和叶绿色、根系发育正常的细胞工程苗数为85～406株，30个幼穗产生的细胞工程苗数总数为5930株，平均每个幼穗可生产细胞工程苗198株；
(5)细胞工程苗的苗床移栽
将细胞工程苗移栽至温室，苗床环境温度控制在25～35℃；苗床畦长6米，畦宽1.5米，行株距为25×10cm，移栽时浇透水，7d内保持土壤湿润，15d时，施用尿素2kg/666.7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生长30d以后，可提供5811株生长健壮的种苗供大田种植，细胞工程苗苗床移栽成活率达98％。
Claims (1)
1.象草的快速繁殖方法，其特征在于，
(1)外植体的选择与灭菌
选用象草的幼穗为外植体，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外部的叶鞘和茎，剥出幼穗，切成2～3mm长的片段；
(2)幼穗愈伤组织诱导
把幼穗的切段接种于下列培养基中：改良的MS+4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D+0.05mg/L激动素KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；培养室温度为26℃～28℃，光强1500～2000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为35～40d；其中改良的MS指的是MS中铁盐含量加倍；
(3)丛生苗诱导
将幼穗诱导的颗粒状愈伤组织培养于下列培养基中：改良的MS+3～4mg/L 6-苄基腺嘌呤6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；
培养室温度为26℃～28℃，光强2500～3000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为30～35d；
(4)丛生苗增殖和壮根培养
将丛生苗中具有3张完整叶的分蘖在无菌条件切割分离后，分别接种于下列培养基中：
MS+3～4mg/L 6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂条+0.5g/L活性碳，pH值为5.8；
培养室温度为26℃～28℃，光强3500～45000Lx，光照时间为16小时/天，培养时间为25～30d；
(5)细胞工程苗的苗床移栽
将培养苗移栽至温室或大田苗床，环境温度控制在25～35℃；做畦，畦长自定，畦宽1～1.5米，行株距为20～25cm×10～15cm，移栽时浇透水，7d内保持土壤湿润，14～20d时，可施用尿素2～3kg/666.7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生长超过30d，可作为种苗进行大田移栽。
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