CN101680883A

CN101680883A - 用于多发性硬化的生物标记

Info

Publication number: CN101680883A
Application number: CN200880018874A
Authority: CN
Inventors: 维尔勒·萨默斯; 皮特·斯蒂尼森
Original assignee: Hasselt Universiteit
Current assignee: Hasselt Universiteit
Priority date: 2007-04-12
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2010-03-24
Also published as: EP2579038A2; RU2009141523A; AU2008237878A1; EP2579038A3; EP2579038B1; JP2010523629A; WO2008125651A3; MX2009011007A; WO2008125651A2; US20100297678A1; PL390236A1; EP2145182A2; CA2683865A1; ZA200907027B; NO20093327L; US8772225B2

Abstract

本发明涉及神经病症的诊断，更具体地涉及多发性硬化的诊断。提供了生物标记板，其可用于检测受试者是否患有多发性硬化。还描述了鉴定这样的生物标记的方法。

Description

用于多发性硬化的生物标记

技术领域

背景技术

多发性硬化(MS)在美国影响超过350,000人，而在全世界影响250万人。在美国，发病率估计值为5-119每100,000人，而医疗保健成本仅在美国估计每年超过100亿美元。多发性硬化是年轻成人中最常见的神经学疾病，其在10-15％的疾病持续期后具有后续的慢性功能障碍和能力丧失(disability)的风险。此疾病起初在80-90％的患者中特征为再发性神经学事件(neurologicalevent)(复发)，这可归因于CNS内的多源性损伤(multifocal lesion)。另外的疾病过程由良性变化为经典的复发-复原(relapsing-remitting)(RR)、初级(PP)和次级(SP)慢性进行性或罕见的暴发型疾病过程。认为MS是自身免疫来源的，并且在精神病理学上特征为可变程度的灶性炎症(focal inflammation)、脱髓鞘(demyelination)、轴突损伤(axonal damage)、胶质瘢痕化(gliotic scarring)和萎缩(atrophy)，还在于髓鞘再生(remyelination)和CNS中的再生。这与临床变异性一起形成了这样的看法，即MS作为相对于脱髓鞘的四种发病机制^1，2的一种异源疾病。这些发病亚型中的一种在精神病理学上特征为涉及MS损伤形成的抗体-依赖性免疫机制^1，3。

在过去的数年中，已经证明了自身反应性B细胞和自身抗体的重要作用⁴。近来的研究同样地显示患有MS的患者的CNS和脑脊液(CSF)中分泌抗体的B细胞的克隆扩张(clonal expansion)^5，6。此外，检测患有神经学疾病的患者的CSF中的寡克隆抗体已经与MS的存在相关。多项研究已报道了中枢神经系统(CNS)髓磷脂自身抗原的识别，如通过存在于MS患者(还有患有其他炎性神经学疾病(OIND)和非炎性神经学疾病(NIND)的患者以及健康对照)的CSF和血清中存在的自身抗体结合髓磷脂的糖蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质脂蛋白(proteolipid lipoprotein)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白^7-11。

在一些患者中，医师可在疾病发作不久以后诊断MS。然而，在另一些患者中，医生可能不能容易地鉴定症状的原因，导致多年的不确诊和多重诊断。大多数患者受到轻度影响，但在最坏的病例中，MS可使人不能写字、说话和走路。不幸地，还没有一个实验室测试可用于证明或排除MS。因此，本领域极其需要用于MS的改进的诊断测试。特异于不同的病理生理机制的生物标记板(panel)的开发对于进一步理解MS的发病机理以及诊断、分类、疾病活性和治疗诊断学应用将是至关重要的。

在本发明中，我们报道了对于MS患者高度特异性的自身抗体结合性肽/蛋白的鉴定。所得到的结果还与疾病持续时间、能力丧失和不同的临床疾病过程相关联。针对这些选择的肽的自身抗体谱(profile)可用作特异性检测MS的生物标记板。

附图说明

图1：正常组织中新抗原靶物的表达谱。显示UH-CSF1.4和UH-CSFP1.7的表达图形。下图面显示与肌动蛋白探针的对照杂交。1道：脑；2道：心；3道：骨骼肌；4道：结肠；5道：胸腺；6道：脾；7道：肾；8道：肝；9道：小肠；10道：胎盘；11道：肺；12道：外周血淋巴细胞。

图2：大肠杆菌中的UH-CSFP1.7和UH-CSFP1.8蛋白表达。将UH-CSFP1.7克隆为抗原(6.1kDa)并将UH-CSFP1.8蛋白克隆为部分*(13.3kDa)和全长蛋白(20.3kDa)，它们具有16.7kDa硫氧还蛋白融合体(His标签)，考马斯(Coommassie)染色后在SDS-PAGE上对于UH-CSFP1.7产生22.8kDa蛋白，而对于UH-CSFP1.8(SPAG16蛋白)产生30kDa部分和37kDa全长条带。

图3：SAS方法。a.将噬菌体-展示的MS cDNA库与MS患者CSF抗体预温育。b.显示在噬菌体上的MS-特异性抗原(黑色)结合于MS-抗原特异性患者IgG(黑色)。c.将噬菌体抗原-IgG复合物(黑色)捕获在涂覆有多克隆抗-人IgG的表面上(格子纹的).d.洗去不相关的噬菌体，并洗脱CSF-IgG特异性噬菌体。e.将选择的噬菌体用于细菌的再感染。f.将选择的噬菌体扩增并用于更多轮的选择。

图4：溶液相试验证明了CSF抗体对UH-CSFP1.1的高亲和性和特异性。将UH-CSFP1.1肽以不同稀释度(dilution)分别与MS-CSF8和MS-CSF26一起预-温育，随后通过ELISA测量剩余的免疫反应性。展示UH-CSFP1.1肽的竞争。随机的肽测量不到竞争。

图5：柱状图，其显示通过ELISA试验测定的10个随机克隆针对UH-CSFP1.1肽的反应性。克隆7得到阳性信号。

图6：UH-CSFP1.3和UH-CSFP1.6(部分)的蛋白表达。

图7：8个个体CSF样本针对UH-CSFP1.1、UH-CSFP1.2、UH-CSFP1.4、UH-CSFP1.5和负对照的反应性。

图8：在来自16个随机选择的MS患者、15个NIND/OIND患者和16个健康对照的血清中对于UH-CSFP1.6的抗体反应性。水平线表示截断值(cut-offvalue)。

本发明的目的和详述

在本发明中，我们鉴定了一组生物标记，其可用于检测患者中的多发性硬化(MS)。以血清学抗原选择(Serological Antigen Selection)(SAS)技术分离生物标记，其中鉴定与存在于患有多发性硬化的患者的脑脊液(CSF)中的抗体结合的抗原(即，生物标记)。更特别地，将包含源自MS脑斑块(plaques)的cDNA产物(其表达为与丝状噬菌体M13的小外壳蛋白(minor coat protein)pVI的融合体)的cDNA噬菌体展示文库进行淘选(pan)以鉴定在来自MS患者的CSF样品中结合自身-抗体的cDNA克隆。重新获得8种抗原性cDNA靶物的生物标记板(其显示86％特异性和45％敏感性以区别MS患者和对照)。除了在怀疑患有MS的患者的立即(早期)诊断中的作用外，可使用生物标记板(即，抗原性cDNA靶物)以有助于MS患者的分型。

因此，在第一个实施方案中，本发明提供了包含至少两种不同的多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1-8中任一个所示的序列或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段。这样的组合物在本申请中也称作生物标记或生物标记板。SEQ ID NO：1-8对应于通过在MS患者脑脊液(CSF)中选择噬菌体展示的MS cDNA表达文库而获得的抗原的经翻译的氨基酸序列。因此UH-CSFP1.1的插入序列(insert)的翻译对应于SEQ ID NO：1，...，而UH-CSFP1.8的插入序列的翻译对应于SEQ ID NO：8(参见表3)。编码SEQ ID NO：1-8的核苷酸序列示于SEQ ID NO：9-16(其中SEQ ID NO：9编码SEQ ID NO：1，...，而SEQ ID NO：16编码SEQ ID NO：8)。因此，组合物包含至少两种不同的多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的序列。这是指存在于组合物中的多肽还可以是蛋白质。作为一个实例，将SEQ ID NO：8克隆为部分13.3kDa蛋白(蛋白产物如使用SAS检测的)。由于SEQ ID NO：8(对应于UH-CSFP1.8)是SPAG16蛋白(其全长为37kDa)的片段，因此组合物还可以包含全长SPAG16蛋白。本发明的组合物还可以包含至少两种不同的多肽，其中所述多肽是源自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8的包含至少5个连续的氨基酸的片段。可设想的是源自SEQ ID NO：1-8的5个连续的氨基酸足以被识别为存在于例如血清或CSF中的自身-抗体的抗原。

在特定的实施方案中，组合物包含8种不同的多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1-8的序列，或8个不同的片段，所述片段包含源自SEQ ID NO：1-8的至少5个连续的氨基酸。

在另一个特定的实施方案中，组合物包含4种不同的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：4、5、6和7所示的序列，或者4个不同的片段，所述片段包含源自SEQ ID NO：4、5、6和7的至少5个连续的氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的组合物用于检测所述组合物中存在的至少一种多肽的特异性抗体的存在的用途，其中所述抗体存在于哺乳动物的体液中。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了本发明的组合物用于检测所述组合物中存在的至少一种多肽的特异性自身-抗体的存在的用途，其中所述自身-抗体存在于哺乳动物的体液中。在特定的实施方案中，组合物的所述用途是组合物的一种“体外”用途。后者暗示了一种与患者没有直接相互作用的诊断方法。

术语‘体液’包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、泪液、骨髓液、脑脊液(CSF)、滑液、淋巴液、羊水、乳头抽吸液(nipple aspiration fluid)等。优选用于分析的体液是方便地从患者获得的体液，特别优选的体液包括血清、血浆和CSF。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物中检测多发性硬化的方法，包括i)检测源自所述哺乳动物的体液中至少一种抗体的存在，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体的存在或量指示所述哺乳动物患有多发性硬化。

在又一个实施方案中，本发明的在哺乳动物中检测多发性硬化的方法与检测US20040043431中所述的MS标记，和更特别地与该申请的权利要求5、6、7、8、9和10中所述的标记组合。

在又一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中评估多发性硬化的预后/疾病严重性的方法，其包括i)在源自所述哺乳动物的体液中检测至少一种抗体的存在或量，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体浓度增加或降低指示所述患者中多发性硬化的预后(prognosis)。

在又一个实施方案中，本发明提供选择用于特异性治疗多发性硬化的哺乳动物或在哺乳动物中评估多发性硬化的治疗的方法，其包括i)在源自所述哺乳动物的体液中检测至少一种抗体的存在或量，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体浓度增加或降低导致所述哺乳动物中多发性硬化的特异性治疗的选择。

在一个优选的实施方案中，所述体液是CSF。

在又一个优选的实施方案中，所述体液是血清。

在另一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。

在又一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其特异性结合于选自包含如下的组的多肽：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的多肽，或或源自SEQ IDNO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段。用于产生抗体的方法是本领域熟知的。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。为了产生抗体，本发明的组合物的多肽形成部分可通过化学方法合成，或可以重组方式制备。在合成之后或在重组产生之后，它们还可与可溶的载体偶联。如果使用载体，所述载体的性质应为它具有大于5000的分子量且不应被抗体识别。这样的载体可为蛋白质。经常用作载体的蛋白质为钥孔戚血蓝素(keyhole limpethemocyanin)、牛γ球蛋白、牛血清白蛋白和聚-L-赖氨酸。有很多充分描述的用于将肽偶联于载体的技术。连接(键联)可发生在肽的N-末端、C-末端或在内部位点。还可将多肽衍生化用于偶联。还可在寡-赖氨酸核心上直接合成多肽，在所述核心中将赖氨酸的α以及ε-氨基用作多肽的生长点。包含核心的赖氨酸的数目优选为3或7。另外，可将半胱氨酸包括在复合物C-末端的附近或C-末端处，以促进同源-或异源二聚体的形成。

一般地说，本发明涉及用于在易于包含与MS有关的抗体的哺乳动物的生物学样本中检测所述抗体的方法，此方法包括在使所述组合物与可能存在于生物学样本中的抗体之间能够发生免疫反应且能够检测可形成的抗原/抗体复合物的条件下将生物学样本与本发明的组合物接触。可根据任何经典方法进行检测。举例来说，可使用根据ELISA技术或免疫荧光或放射免疫(RIA)或等同的技术(例如LINE印迹或LINE测定法)的免疫酶方法。因此，本发明还涉及根据发明以酶、荧光、生物素、放射类型的适当标记所标记的多肽。这样的用于检测与MS有关的抗体的方法包括例如如下步骤：将确定量的根据本发明的多肽组合物沉积在支持物上(例如在微量滴定板的孔中)，在支持物上(例如孔中)引入稀释度渐增的(increasing dilution)的待诊断的体液，温育支持物(例如微量滴定板)，反复冲洗支持物(例如微量滴定板)，在支持物上引入标记的抗体，其对于存在于体液中的免疫球蛋白是特异性的，这些抗体的标记是基于酶的活性，所述酶选自能够通过改变底物至少在给定波长的辐射吸收(absorption of the radiation)来水解底物的酶之中，通过与对照标准物进行比较来检测经水解的底物的量(detection by comparing with a control standard ofthe amount of hydrolyzed substrate)。

在又一个实施方案中，本发明还涉及用于在易于包含MS的抗原的体液中检测和鉴定MS的抗原的方法，此方法包括：在使本发明的适当抗体(即，具有对于组合物的多肽的特异性的抗体)与可能存在于生物学样本中的MS的抗原之间能够发生免疫反应且能够检测可形成的抗原/抗体复合物的条件下将生物学样本与本发明的适当抗体接触。

因此，识别本发明的多肽的抗体(特别是自身-抗体)可以多种方式检测。一种检测方法在实施例中进一步描述，且使用了以噬菌体展示的本发明多肽的酶联免疫吸附试验(ELISA)(即，噬菌体-ELISA技术)。后一种技术在SomersV.等(2005)J.of Autoimmunity 25：223-228中充分描述，其中第225页第2.6段特别地并入本文)。在ELISA检测的其他方式中，多肽或多肽的混合物结合于固体支持物。在一些情况中，此(固体支持物)可为微量滴定板，但原则上可为任何种类的不溶性固相(例如玻璃、硝酸纤维素)。在一个实施方案中，例如待测试的CSF或血清的合适稀释物与结合了多肽的固相接触。在另一个实施方案中，进行“溶液杂交”，其中发生高亲和性相互作用(例如，将组合物的生物素酰化的多肽与CSF一起预-温育)。温育进行使结合反应发生所需的时间。随后，通过洗涤固相来去除未结合的组分。使用抗体实现免疫复合物(即，例如结合于至少一种本发明的多肽的人CSF中存在的自身-抗体)的检测，所述抗体特异性地结合于人免疫球蛋白，且其已经用酶(优选但不限于辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，或β-半乳糖苷酶)标记，所述酶能够将无色或几乎无色的底物或者协同底物(co-substrate)转变为高度着色的产物或能够与生色团(chromogen)形成着色的复合物的产物。或者，检测系统可采用在适当的底物存在时发光的酶。形成的产物量可通过目测、分光光度法、电化学法、荧光法或发光法来检测，并与相似处理的对照进行比较。检测系统还可采用放射标记的抗体，在这种情况中，通过闪烁计数(scintillation counting)或γ计数(gamma counting)来确定免疫复合物的量。可使用的其它检测系统包括基于使用源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan菌株I的蛋白A，来自C组葡萄球菌属菌种(Staphylococcus sp.)(菌株26RP66)的蛋白G的那些系统，或者利用高亲和性生物素-抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合反应的系统。

本发明的多肽可以是标记的或未标记的。可采用的标记可为任何类型的，如酶的、化学的、荧光的、发光的或放射的。此外，可修饰多肽以结合于表面或固相，例如，微量滴定板、尼龙膜、玻璃或塑料珠，和色谱支持物如纤维素、二氧化硅(silica)或琼脂糖。可将多肽附接或结合于固体支持物或表面的方法是本领域的技术人员所熟知的。

本发明的多肽可根据肽合成领域的经典技术来制备。合成可在均质溶液(homogeneous solution)或在固相中进行。例如，可使用的均质溶液中的合成技术是由Houbenweyl在题目为″Methode der organischen chemie″(有机化学的方法)由E.Wunsh，vol.15-I和II.THIEME，Stuttgart 1974编辑的书中描述的技术。本发明的多肽也可以根据Atherton & Shepard在他们题目为″Solid phasepeptide synthesis″(IRL Press编，Oxford，NY，Tokyo，1989)的书中所述的方法在固相中制备。本领域的合成规程通常采用叔-丁氧羰基-(t-butyloxycarbonyl-)或9-芴甲氧-羰基-(9-fluorenylmethoxy-carbonyl-)保护的活化氨基酸。进行合成的步骤、侧-链保护的类型和切割方法在例如Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Company，1984；及Atherton和Sheppard，Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press，1989中详细描述。

在又一个实施方案中，针对本发明的多肽产生的抗体(或结合了载体的(carrier-bound)多肽)可与本发明的标记的多肽一起使用以通过竞争试验(competition assay)检测存在于血清或CSF中的(自身)-抗体。在此情况中，针对多肽产生的抗体附接于固体支持物，所述固体支持物可为例如塑料珠或塑料管。然后将标记的多肽与待测液体(例如CSF)的合适稀释物混合，随后将此混合物与结合于固体支持物的抗体接触。在合适的温育期之后，洗涤固体支持物并确定标记的多肽的量。与固体支持物结合的标记量的减少指示原样本中(自身)-抗体的存在。出于同样原因，多肽还可结合于固体支持物。然后可使标记的抗体在限制多肽量的条件下与存在于样本(例如CSF)中的(自身)-抗体竞争。如在前面的实例中，测量的信号的减少指示测试样本中(自身)-抗体的存在。

在一个特别的实施方案中，用于证明如下事实的测试是免疫印迹(或Western印迹)分析：本发明的组合物中存在的一种或多种多肽被存在于例如血清的CSF中的抗体(例如存在于多发性硬化患者的CSF中的自身-抗体)识别。在后一种情况中，多肽可通过化学方法合成或多肽(或者蛋白)可通过重组技术产生。简言之，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，在硝酸纤维素膜(例如Hybond C.(Amersham))上印迹本发明的多肽，如Towbin H.等，1979，″Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets：procedure和some applications″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：4350-4354所述。为了鉴定CSF对本发明多肽(或者蛋白)的选择性识别，将硝酸纤维素片与这些样本中的每一个(例如1∶50稀释)(在封闭(block)a-特异性蛋白-结合位点之后)一起过夜温育。通过与例如缀合有过氧化物酶的羊抗-人免疫球蛋白G抗体(例如1∶200稀释)一起温育4小时来显示硝酸纤维素片上的反应区，且在反复洗涤后，通过在过氧化氢存在下加入例如α-氯萘酚(alpha-chloronaphtol)(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif.)来显色颜色区。

不言而喻，可对存在于一些氨基酸的自由反应性官能(free reactivefunction)进行修饰而使得此修饰不改变多肽的上述性质，所述官能是本发明多肽的结构(constitution)的一部分，尤其是在一方面Glu和Asp基团或C-末端氨基酸所携带的自由羧基和/或在另一方面N-末端氨基酸或肽链内部的氨基酸(例如Lys)所携带的自由NH2基团。由此被修饰的多肽自然是本发明的一部分。上述羧基可被酰化或酯化。其他修饰也是本发明的一部分。特别地，胺或羧基官能或者两个末端氨基酸它们本身可涉及与其他氨基酸的结合(bond)。例如，N-末端氨基酸可连接于包含1至几个氨基酸的另一个肽的C-末端氨基酸。

此外，由对本发明的多肽取代和/或添加和/或缺失一个或几个氨基酸的修饰产生的任何肽序列是本发明的一部分，使得此修饰不改变所述多肽的上述性质。根据本发明的多肽可被糖基化或不被糖基化，尤其是在它们的一些Asn-X-Ser或Asn-X-Thr型的糖基化位点上，其中X表示任何氨基酸。

本发明的组合物中包括的有利的重组多肽是SEQ ID NO：6，因为此多肽在MS患者的CSF中显示最高频率的抗体反应，而在对照患者中无反应性。

这些多肽的变异也可能取决于其预期的用途。例如，如果多肽将用于产生抗血清，那么可以额外添加的半胱氨酸残基来合成多肽。此额外的半胱氨酸残基优选添加至氨基末端，并促进多肽与使小多肽成为免疫源性所需的载体蛋白偶联。如果多肽将被标记用于放射免疫试验，可为有利的是合成在氨基或羧基末端附接有酪氨酸的蛋白以促进碘化。因此，此多肽具有上述多肽的原始序列(primary sequence)，但还具有额外的氨基酸，其未出现在蛋白的原始序列中且其单独的功能是将期望的化学性质赋予多肽。

在又一个实施方案中，本发明提供用于诊断MS的试剂盒。为了进行MS的诊断方法，可使用如下必需品(necessary)或试剂盒，所述必需品或试剂盒包含：根据本发明的组合物(其包含选自SEQ ID NO：1-8的至少一种多肽)，或至少一个源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，用于制备适于免疫反应发生的介质的试剂，能够检测已通过免疫反应产生的抗原/抗体复合物的试剂，所述试剂可能具有标记，或易于被标记的试剂所识别，更特别地是在上述多肽未被标记的情况中。

本发明的其他特征和优势将出现在说明本发明的如下实施例和附图中。

实施例

1.用MS CSF富集噬菌体展示的MS cDNA文库

为了产生MS cDNA展示文库，源自活性的、慢性MS斑块(active，chronicMS plaque)的标准化的(normalized)cDNA文库克隆入M13丝状噬菌体展示载体pSPA、B和C，所述文库具有不同程度的脱髓鞘(demyelination)和炎性活性，其最初被克隆入pT7T3-Pac载体。这些载体pSPA、B和C使源自MS脑斑块的cDNA产物(肽)表达为在三个阅读框中与丝状噬菌体M13的小外壳蛋白(minor coat protein)pVI的融合体，用于蛋白产物的正确表达。获得1.1×10⁷个菌落形成单位(cfu)的总文库大小。

为了富集特异性结合于MS患者的脑脊液中存在的自身抗体的cDNA产物(展示的肽)的MS cDNA展示文库，我们对10个随机选择的RR MS患者的汇集的CSF进行了连续多轮的选择(参见图3和表7)。在每4轮选择后拯救噬菌体克隆之后，随机选择富集的噬菌体克隆用于进一步研究，所述克隆每一个携带有源自MS cDNA展示文库的单融合肽。

2.富集的噬菌体克隆的表征

在富集的克隆当中，选择总共52个克隆。对cDNA插入物进行测序并确定翻译的蛋白序列。序列分析显示8个抗原性靶物，我们将其注释为名称UH-CSFP-编号，这是Hasselt大学-脑脊液汇集物-克隆编号的简写。这些序列对应于在正确的阅读框中表达的已知蛋白，而且获得了与表达的基因的未翻译区，如蛋白脂质蛋白(proteolipid protein)的3’UTR序列的同源性，或与框外序列的同源性(参见表3)。

在初始的实验中，我们评估了用于针对8个富集的抗原性cDNA的选择步骤的个体MS CSF样品的反应性。如表4中所示，在来自RR-MS患者的10个CSF样本中，8个包含与至少2个噬菌体-肽克隆反应的抗体。将这些克隆用于后续在大板(large panel)上从其他MS患者中筛选CSF以及从患有其他炎性(OIND)和非炎性神经病症(NIND)的患者中筛选CSF。

在用于选择步骤的10个RR-MS患者中，也收集配对的(paired)血清样本并将其用于筛选抗体对于8个富集的抗原性cDNA的反应性。在具有存在于CSF中的抗原特异性抗体的8个患者中的3个中，在配对的血清中也发现了对于8个抗原性cDNA中的1个的反应性。CSF中观察到的阳性信号(positivesignal)与血清中显示的反应性之间存在良好的关联(association)。测试的个体CSF的信号高于测试的个体血清的信号，这与当抗体在鞘内产生时存在于血清中的抗原特异性抗体的稀释物是一致的。当观察到CSF内的低反应性时，在相同患者的血清中未发现阳性信号。此外，在具有抗体阴性CSF的患者中显示配对的血清样本中无反应性(数据未示出)。

3.MS板的详细血清学分析

下面，在不用于选择步骤的个体CSF样品的大板上测试样品克隆(对于MS患者n＝63(54个RR-MS、3个SP-MS患者和6个PP-MS)，对于OIND患者n＝30，和对于NIND患者n＝64)。对167个不同的CSF进行个体噬菌体-cDNA克隆的噬菌体ELISA筛选的结果在表5显示。与对照组相比，所有测试的抗原在MS组中显示独有的或优选的反应性。克隆UH-CSFP1.4-UH-CSFP1.7在73(23％)MS CSF中的17个中显示反应性，而没有观察到对OIND和NIND CSF样品的反应性。如与对照组13/94(14％)相比，剩余的克隆(UH-CSFP1.1-UH-CSFP1.3和UH-CSFP1.8)在MS组中显示更高的反应性25/73(34％)，而因此，将这些克隆定义为具有MS-相关的血清学谱(serological profile)的克隆。

总的来说，73个MS患者中的33个(45％)显示与8个抗原性靶物的至少一个板有反应性的CSF IgG抗体。对于UH-CSFP1.6发现在MS CSF中有最高频率的抗体反应，而对照组中没有反应性。所有测试的CSF样本显示等同的总CSF IgG水平。将具有高IgG浓度的CSF样本标准化至正常的CSF浓度范围。

4.新MS标记的表达图样

对多种正常人组织进行对照组中无反应性的抗原性靶物的Northern印迹分析。UH-CSFP1.4给出1.9kb的转录物，且在脑、心和胎盘中高表达(washighly expressed brain，heart和placenta)，并在骨骼肌、肾和肝中较低程度表达。UH-CSFP1.7给出5.1kb的转录物，且在脑、心和骨骼肌中显示高表达。对于UH-CSFP1.5和UH-CSFP1.6未能检测到转录物。

我们进一步选择了4种抗原性靶物(UH-CSFP1.3、UH-CSFP1.6、UH-CSFP1.7和UH-CSFP1.8)，用于在大肠杆菌(E.coli)中进行蛋白表达。将UH-CSFP1.7克隆为抗原(6.1kDa)并将UH-CSFP1.8(SPAG16)蛋白克隆为部分(13.3kDa，如使用SAS检测到的蛋白产物)和全长蛋白(20.3kDa)，它们具有16.7kDa硫氧还蛋白融合体(His标签)，考马斯染色后在SDS-PAGE上对于UH-CSFP1.7产生22.8kDa蛋白，而对于SPAG16蛋白产生30kDa部分和37kDa全长条带(参见图2)。

由于克隆UH-CSFP1.3和UH-CSFP1.6的序列中琥珀终止密码子的存在，进行定位诱变以产生谷氨酰胺密码子用于在非抑制性(non-suppressing)LMG194菌株中进行细菌蛋白表达。在定位诱变后，将UH-CSFP1.3克隆为抗原(6.11kDa)，产生包括硫氧还蛋白的22.8kDa蛋白(参见图6)。由于毒性，不能表达完整UH-CSFP1.6。因此，制备由抗原的氨基酸1-52编码的蛋白的第一部分(如使用SAS检测到的)，产生包括硫氧还蛋白的22.5kDa蛋白产物(参见图6)。

5.自身抗体反应性和临床数据

其后我们确定了与我们的抗原性板的反应性是否与特定的疾病表型相关联。与8个抗原性靶物中至少一个的自身抗体反应性在30/64(47％)RR-MS患者、3/6(50％)PP-MS患者和0/3 SP-MS患者中显示。抗体-阳性和抗体-阴性MS患者的人口统计学的变量(demographic variables)和EDSS分数示于表6。在抗体-阳性和抗体-阴性患者之间在年龄上未观察到差别。抗体反应性可在诊断时在一些患者中观察到，并在具有短的疾病持续时间(short diseaseduration)(＜1年)的患者中存在，而且在具有超过10年的疾病持续时间的患者中存在。然而，在抗体反应性和疾病持续时间之间未发现关联。

为了评估抗体反应性对于疾病严重性的影响，我们检查了抗体反应性和EDSS分数之间的关系。在21/50(42％)的EDSS＜3的患者、6/11(54％)的EDSS＝3或3.5的患者和3/5(60％)的EDSS＝4的MS患者中发现了抗体反应性。尽管较高百分数的患者显示对于具有渐增的EDSS分数的8个抗原性cDNA的板的反应性，但是此差别并不显著。

6.溶液相试验/竞争ELISA

为了确定观察到的MS CSF的自身抗体标记(signature)是否是由于MS脑斑块来源的肽，将用于UH-CSFP1.1的2个MS CSF样品(一个阳性(MS-CSF8)和一个阴性(MS-CSF26)与代表克隆UH-CSFP1.1的cDNA插入物的合成肽UH-CSFP1.1(NH2-ASSRGYEDLRTF-COOH)一起，并与非-特异性(随机)肽一起预-温育。如图4所示，与UH-CSFP1.1肽一起预温育显然抑制对于MS-CSF8有特异性的IgG抗体/噬菌体UH-CSFP1.1复合物的形成，而对于MS-CSF26没有发现抑制。与此相反，针对克隆UH-CSFP1.1的CSF反应性不受到添加随机肽的抑制。

7.单克隆抗体产生

基于Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(Kohler，G和Milstein，C，1973，Nature 256，495-497)产生用于UH-CSFP1.1的鼠类单克隆抗体。图5表示杂交瘤选择后针对UH-CSFP1.1肽的抗体反应性。在首先筛选用于抗体生成时指示来自10个随机测试的杂交瘤克隆的上清液的OD。克隆7获得阳性ELISA信号。此克隆的进一步亚克隆产生单克隆杂交瘤细胞系，所述单克隆杂交瘤细胞系产生定向针对UH-CSFP1.1肽的抗体。产生的单克隆抗体显示的表位特异性与先前对于MS血清或CSF样本鉴定的相同。这允许进一步分析UH--CSFP1.1抗原。在可替换的方法中，我们使用了噬菌体颗粒，其表达用于免疫Balb/c雌性小鼠的UH-CSFP抗原性靶物。使用噬菌体-展示的肽的优势在于它们廉价、易于获得，并且在于将抗原展示于鼠类免疫系统，如同它在MS患者的血清或CSF中被识别(as it is recognized in serum or CSF from MS patients)。

8.对于肽的ELISA

为了研究是否还观察到针对线性肽的抗体反应性，我们对于合成的肽(UH-CSFP1.1，UH-CSFP1.2，UH-CSFP1.4和UH-CSFP1.5)使用了ELISA。如图7所示，4号MS患者显示了针对克隆UH-CSFP1.1的CSF反应性，而对于其他肽，没有发现反应性。对于其他MS患者，没有显示针对任何测试的肽的反应性。这些结果与UH-CSFP1.1、UH-CSFP1.2、UH-CSFP1.4和UH-CSFP1.5的噬菌体ELISA结果一致。

9.对于纯化的重组蛋白的ELISA

在UH-CSFP1.3，UH-CSFP1.6，UH-CSFP1.7和UH-CSFP1.8的蛋白表达(如实施例4第2段所述)之后，在血清中测量每个纯化的重组蛋白的免疫反应性。图8描述了在来自16个随机选择的MS患者、15个NIND/OIND患者和16个健康对照的血清中对于UH-CSFP1.6的抗体反应性。在3/16MS患者和1/15NIND/OIND患者中显示反应性，而健康对照中未发现反应性。

10.免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining)

在单克隆抗体产生(实施例7)之后，使用针对UH-CSFP1.1的鼠类单克隆抗体用于实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis)(EAE)大鼠脑组织的免疫组织化学染色。观察到针对UH-CSFP1.1的鼠类单克隆抗体使血管的内皮内层(endothelial lining)染色并显示大神经元的细胞质染色。

材料和方法

1.患者和对照

脑脊液样本获得自73个MS患者、30个患有其他炎性神经病症(脑膜炎(meningitis)、多神经病(polyneuropathy))的患者和64个患有非炎性神经病症的患者(疝气(hernia)、癫痫(epilepsy)、痴呆(dementia)、头痛(headache)、阿尔茨海默症(Alzheimer)患者，...)，其经受用于诊断目的的腰椎穿刺(lumbarpuncture)。根据McDonald和Poser标准14诊断MS患者。研究群体的特征示于表1。从73个MS患者中的28个中收集双份(paired)血清样本。收集后将CSF和血清样本保存在-80℃。此研究由机构伦理委员会(the institutionalethics committee)批准。

2.用于pVI展示的MS cDNA文库的克隆和噬菌体pVI展示的cDNA库 (repertoire)的血清学抗原选择(SAS)

标准化的(normalized)cDNA文库(1.0×10⁶原始(primary)重组体)源自3个活性的慢性MS斑块，具有变化的脱髓鞘程度和炎性活性(来自Soares博士的赠予)，将该文库用于通过将其与丝状噬菌体小蛋白pVI克隆为融合蛋白来构建MS cDNA展示文库。因此，将文库转移至我们的噬菌体展示载体，其名称为pSPVIA、pSPVIB和pSPVIC，各自编码三个阅读框之一。克隆步骤的详情描述于¹⁵。

如先前所述(Somers，JI)¹⁵进行SAS步骤。简言之，汇集10个随机选择的未处理的复发-复原(RR)-MS患者的CSF样本，并将其用于亲和性选择(affinity selection)。用于亲和性选择的患者的特征示于表2。在选择步骤开始之前，如¹⁵所述针对大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)和噬菌体抗体吸收CSF样本。吸收之后，将汇集的CSF保存在-20℃。随后，将汇集的预吸收的CSF用于选择步骤。如¹⁵所述进行亲和性选择。简言之，在涂覆缓冲液(0.1M碳酸氢钠pH9.6)中在37℃用兔抗-人IgG(Dako，Glostrup，Denmark)将免疫管(immunotube)(Nunc，Roskilde，Denmark)涂覆2小时。将免疫管用含0.1％吐温20的磷酸盐-缓冲的盐水洗涤两次并用PBS洗涤两次后，用2％MPBS(PBS中的2％乳粉)将管封闭2小时。对于第一轮选择步骤，由克隆于3个噬菌体展示载体pSP6A、B和C中的MS cDNA文库制备噬菌体。如先前¹⁶所述制备噬菌体。将约10¹³个噬菌体加入汇集的预吸收的CSF(1∶5稀释于4％MPBS)并在旋转平台上在室温(RT)温育1.5小时。将涂覆的免疫管用PBST洗涤两次并用PBS洗涤两次后，将预温育的CSF和噬菌体混合物转移至涂覆的免疫管，在旋转平台上温育30分钟并在室温静置120分钟。然后将管用PBST和PBS充分洗涤以去除非-结合的噬菌体。结合的噬菌体用100mM三乙胺洗脱并用1M Tris HCl中和，如之前¹⁷所述。用输入和输出(input and output)噬菌体感染大肠杆菌TG1细胞，并在每轮选择时涂布于含氨苄青霉素和葡萄糖的2x TY琼脂板(16g/l细菌用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，10g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g细菌用琼脂/l，氨苄青霉素为100μg/ml和葡萄糖为2％)。刮取得到的菌落并挽救噬菌体用于更多轮次的亲和性选择。为了监测特异性克隆的富集，滴定(titrate)来自每轮选择的输入和输出噬菌体并确定输出/输入噬菌体的比。几轮选择之后，选择个体菌落并确定插入物大小和序列，如¹⁵中所述。将序列提交至GenBank用于BLAST同源性搜索。

3.噬菌体ELISA

如¹⁵中所述进行配体展示的噬菌体的ELISA。相对于由针对空噬菌体的抗体反应性检测到的内部对照信号测量每个噬菌体肽的免疫反应性。对于竞争ELISA，将CSF在0-50pmol/50μl合成肽UH-CSFP1.1(NH2-ASSRGYEDLRTF-COOH)或随机肽存在下进行预温育。随后，根据标准噬菌体ELISA步骤确定对于噬菌体UH-CSFP1.1的免疫反应性。

4.Northern印迹分析

使用Qiagen Plasmid Midi Kit根据制造商的说明分离质粒。将分离的质粒进行EcoRI/NotI消化并将切割的DNA进行凝胶纯化(GFXTM PCR DNA和Gel Band Purification Kit，GE Healthcare，Brussel，Belgium)。

将切割的DNA片段用作Northern印迹中的探针。使用High Prime DNALabeling Kit(Roche，Vilvoorde，Belgium)用[α³²P]标记探针。简单地，将50ng切割的DNA首先在沸水中在10分钟的过程中变性，并立即在冰上冷却。将标记化合物加入DNA，并在37℃温育45分钟之后，通过加入0.2M EDTA来终止反应。用Sephadex G75柱纯化标记的DNA并用闪烁计数器测量放射性。

使用Multiple Tissue Northern(MTNTM)Blot(BD Biosciences，Erembodegem，Belgium)进行Northern印迹。简单地，在97℃在5分钟的过程中将标记的DNA或人β-肌动蛋白cDNA对照探针变性，并立即在冰上冷却数分钟。在将印迹膜与ExpressHyb溶液预杂交之后，加入放射性标记的探针(2-10ng/ml或1-2×10⁶cpm/ml)并在68℃过夜进行杂交。洗涤3次后，将印迹膜在-70℃暴露于X-射线片，并使用Gevamatic 60(Agfa Gevaert，Mortsel，Belgium)显色。

5.在pBAD/Thio-TOPO载体中克隆抗原性cDNA和表达重组蛋白

根据制造商的指导，将数个抗原性cDNA克隆入pBAD/Thio-TOPO载体(Invitrogen Life Technologies，Merelbeke，Belgium)并转化入LMG 194细胞。在补充有氨苄青霉素的LB Broth Base培养基(Invitrogen Life Technologies，Merelbeke，Belgium)中培养克隆。通过添加0.2％阿拉伯糖诱导在大肠杆菌中由araBAD启动子(pBAD)驱动的表达。重组蛋白表达为与His-Patch硫氧还蛋白的融合体，并根据制造商的说明通过Ni-NTA珠(Qiagen，Venlo，theNetherlands)纯化。通过SDS-PAGE确认了正确大小的蛋白质的表达。通过质谱确认了蛋白质同一性(identity)。

由于在克隆UH-CSFP1.3和UH-CSFP1.6的核苷酸序列中存在琥珀终止密码子，因此根据制造商的指导进行定位诱变(Quikchange Site-DirectedMutagenesis Kit，Stratagene)以产生谷氨酰胺密码子，用于非抑制性LMG194菌株中的细菌蛋白质表达。对于UH-CSFP1.6，产生由抗原的氨基酸1-52编码的蛋白质的第一部分(如使用SAS检测的)。

6.统计分析

使用GraphPad Prism 4.0版进行统计分析。使用t-检验比较了抗体-阳性和抗体-阴性个体的定量的人口统计变量(Quantitative demographic variable)，并使用chi-平方检验(chi-square test)比较了分类变量(categorical variable)。p值＜0.05被认为是统计学上显著的。通过线性回归分析确定多个标记之间的关联。

7.单克隆抗体产生

根据由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(Kohler，G和Milstein，C，1973，Nature 256，495-497)产生了用于UH-CSFP1.1的鼠类单克隆抗体。由于其尺度小，将UH-CSFP1.1肽偶联于钥孔戚血蓝素(KLH)作为载体(UH-CSFP1.1)(Eurogentec)用于免疫Balb/c雌性小鼠。在用150μg UH-CSFP1.1-KLH的三个腹膜内免疫之后，将脾细胞分离并与小鼠骨髓瘤细胞系(Sp2/0)融合。通过在HAT培养基中进行培养来选择融合的杂交瘤之后，使用涂覆的UH-CSFP1.1肽(Eurogentec)和细胞系上清液通过肽ELISA来进行所得杂交瘤细胞系的筛选。亚克隆后，得到单克隆杂交瘤细胞系，其产生定向针对UH-CSFP1.1肽的抗体。

8.肽的ELISA

对于ELISA实验，在PBS中用100μl的1μg/ml肽(UH-CSFP1.1、UH-CSFP1.2、UH-CSFP1.4和UH-CSFP1.5)涂覆96-孔ELISA板(Greiner)并在室温(RT)保持过夜。然后用PBS 0.05％吐温20将孔洗涤3次，并在室温用封闭缓冲液(PBS中2％脱脂乳)封闭。在用PBS 0.05％吐温20洗涤3次后，将板与100μl稀释的样本(CSF 1∶5稀释和血清1∶100稀释于封闭缓冲液)一起在室温温育2小时。用PBS-T洗涤数次之后，将孔与100μl的HRP-缀合的抗-人IgG的1∶2000稀释物一起在封闭缓冲液中温育1小时。洗涤后，向每个孔添加100ul TMB-显色溶液，然后将其在室温温育。通过添加1M H₂SO₄来终止反应，并在450nm读数。对于阴性对照，一些孔不与样本一起温育，而另一些孔不用抗原涂覆但与样本一起温育。对于阴性对照值，显示了两种阴性对照值的均值。

9.纯化的重组蛋白的ELISA

如对于肽所述进行ELISA实验，只是在涂覆缓冲液中用100μl的1μg/ml纯化的蛋白(UH-CSFP1.3、UH-CSFP1.6、UH-CSFP1.7和UH-CSFP1.8)涂覆96-孔ELISA板(Greiner)，并在4℃保持过夜。当OD₄₅₀高于健康对照的均值+3倍标准偏差时，认为血清样本对于针对纯化蛋白的抗体是阳性的。图8中的水平线表示截断值(cut-off value)。

表1.研究群体的特征

表2.用于亲和性选择的患者的特征

表4.8个噬菌体克隆的板对于用于选择步骤的个体MS CSF的反应性

+阳性ELISA信号处于OD450nm(＞1.5x背景)

-阴性ELISA信号处于OD450nm(＜1.5x背景)

表5.对于167个不同的CSF的个体噬菌体-cDNA克隆的ELISA筛选

^a来自MS患者用于选择步骤的个体抗原反应性CSF

^b来自MS患者不用于选择步骤的个体CSF

^cNIND：疝气(hernia)，癫痫(epilepsy)，痴呆(dementia)，头痛(headache)，偏头痛(migraine)，阿尔茨海默症(Alzheimer)，脑积水(hydrocephalus)

^dOIND：脑膜炎(meningitis)，多神经病(polyneuropathy)

表6.患有确定的(established)MS的抗体-阳性和抗体-阴性患者的比较

抗体抗体

阳性阴性

特性 (n＝33) (n＝40) P

年龄，均值±SD年 37,7±8.9 39,4±10,0 NS

疾病持续时间，均值±SD年 3,6±3.3 4,3±5,2 NS

性别

男性 11 11

女性 22 29

EDSS，gem±SD 2±1 2±1 NS

通过t-检验(t-test)比较了年龄和疾病持续时间，并通过chi-平方检验以及适当的自由度(degrees of freedom)来比较分类变量。NS＝不显著

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28.Ota，T.，Suzuki，Y.，Nishikawa，T.，Otsuki，T.，Sugiyama，T.，Irie，R.，Wakamatsu，A.，Hayashi，K.，Sato，H.，Nagai，K.，Kimura，K.，Makita，H.，Sekine，M.，Obayashi，M.，Nishi，T.，Shibahara，T.，Tanaka，T.，Ishii，S.，Yamamoto，J.，Saito，K.，Kawai，Y.，Isono，Y.，Nakamura，Y.，Nagahari，K.，Murakami，K.，Yasuda，T.，Iwayanagi，T.，Wagatsuma，M.，Shiratori，A.，Sudo，H.，Hosoiri，T.，Kaku，Y.，Kodaira，H.，Kondo，H.，Sugawara，M.，Takahashi，M.，Kanda，K.，Yokoi，T.，Furuya，T.，Kikkawa，E.，Omura，Y.，Abe，K.，Kamihara，K.，Katsuta，N.，Sato，K.，Tanikawa，M.，Yamazaki，M.，Ninomiya，K.，Ishibashi，T.，Yamashita，H.，Murakawa，K.，Fujimori，K.，Tanai，H.，Kimata，M.，Watanabe，M.，Hiraoka，S.，Chiba，Y.，Ishida，S.，Ono，Y.，Takiguchi，S.，Watanabe，S.，Yosida，M.，Hotuta，T.，Kusano，J.，Kanehori，K.，Takahashi-Fujii，A.，Hara，H.，Tanase，T.O.，Nomura，Y.，Togiya，S.，Komai，F.，Hara，R.，Takeuchi，K.，Arita，M.，Imose，N.，Musashino，K.，Yuuki，H.，Oshima，A.，Sasaki，N.，Aotsuka，S.，Yoshikawa，Y.，Matsunawa，H.，Ichihara，T.，Shiohata，N.，Sano，S.，Moriya，S.，Momiyama，H.，Satoh，N.，Takami，S.，Terashima，Y.，Suzuki，O.，Nakagawa，S.，Senoh，A.，Mizoguchi，H.，Goto，Y.，Shimizu，F.，Wakebe，H.，Hishigaki，H.，Watanabe，T.，Sugiyama，A.，Takemoto，M.，Kawakami，B.，Yamazaki，M.，Watanabe，K.，Kumagai，A.，Itakura，S.，Fukuzumi，Y.，Fujimori，Y.，Komiyama，M.，Tashiro，H.，Tanigami，A.，Fujiwara，T.，Ono，T.，Yamada，K.，Fujii，Y.，Ozaki，K.，Hirao，M.，Ohmori，Y.，Kawabata，A.，Hikiji，T.，Kobatake，N.，Inagaki，H.，Ikema，Y.，Okamoto，S.，Okitani，R.，Kawakami，T.，Noguchi，S.，Itoh，T.，Shigeta，K.，Senba，T.，Matsumura，K.，Nakajima，Y.，Mizuno，T.，Morinaga，M.，Sasaki，M.，Togashi，T.，Oyama，M.，Hata，H.，Watanabe，M.，Komatsu，T.，Mizushima-Sugano，J.，Satoh，T.，Shirai，Y.，Takahashi，Y.，Nakagawa，K.，Okumura，K.，Nagase，T.，Nomura，N.，Kikuchi，H.，Masuho，Y.，Yamashita，R.，Nakai，K.，Yada，T.，Nakamura，Y.，Ohara，O.，Isogai，T.，和Sugano，S.Complete sequencing and characterization of 21，243 full-lengthhuman cDNAs.Nat.Genet.，36：40-45，2004.

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序列表

<110>艾匹托普国际股份有限公司(Apitope International NV)

<120>用于多发性硬化的生物标记

<130>P036196CN

<140>PCT/EP2008/054479

<141>2008-04-14

<150>EP 07106081.8

<151>2007-04-12

<160>24

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Ala Ser Ser Arg Gly Tyr Glu Asp Leu Arg Thr Phe

1 5 10

<210>2

<211>23

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Leu Asp Asn Ser Tyr His Asp Asn Pro Val Val Ser Lys Glu Leu Arg

1 5 10 15

Ile Glu Gly Asn Gln Leu Thr

20

<210>3

<211>53

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Leu Arg Ala Pro Ala Gly Leu Gly Ala Ala Cys Asp Asn Trp Cys Ile

1 5 10 15

Trp Gln Glu Gln Gln Leu Pro Leu Gly Ala Thr Ala Gly Ala Ala Asn

20 25 30

Gln Arg Asn Thr Asp Thr Pro His Arg Ala Thr Ala Ser Leu Gly Ala

35 40 45

Trp Ser Pro Pro Arg

50

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Gly Ala Arg Cys Ile Asn Ala Glu Gln Pro Cys Gln Ser Pro

1 5 10

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

Tyr Ser Cys Leu Lys Leu Tyr Ser Phe Ala Asn

1 5 10

<210>6

<211>104

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Glu His Ala Thr Gln Asn Gln Val Ser Val Ser Asp Lys Gln Val Lys

1 5 10 15

Gly Leu Leu Ile Leu Lys Thr Glu Lys Gln Lys Arg Lys Gly Lys Lys

20 25 30

Ser Ala Ser Arg Ile Ala Ile Gly Gly Ser Phe Ala Gly Ala Asp Cys

35 40 45

Gln Leu Arg Leu Phe Lys Pro Gln Ser Lys His Ser Ala Pro Ala Pro

50 55 60

Leu Glu Leu Pro Ser His Arg Ser Val Leu Pro Pro Ala Arg Gly Gly

65 70 75 80

Leu Ala Ala Ala Asp Thr Ser Glu Pro Phe Phe His Ser Arg Ser Pro

85 90 95

Ser Gly Pro Thr Leu Ile Tyr Gln

100

<210>7

<211>55

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

Gly Thr Gly Ser Gly Gln Gly Glu Glu Ala Ala Tyr Leu Thr Asn Gln

1 5 10 15

Pro Leu Cys Gly Pro Pro Ala Ser Trp Leu Gly Gly Arg Ala Leu Asn

20 25 30

Gln Gln Gly Pro Arg Arg Glu Glu Glu Val Gly Gln Ser Leu Ala Ser

35 40 45

Pro Leu Gly Ser Phe Ala Ile

50 55

<210>8

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Ala Asp Asp Asn Phe Ser Ile Pro Glu Gly Glu Glu Asp Leu Ala Lys

1 5 10 15

Ala Ile Gln Met Ala Gln Glu Gln Ala Thr Asp Thr Glu Ile Leu Glu

20 25 30

Arg Lys Thr Val Leu Pro Ser Lys His Ala Val Pro Glu Val Ile Glu

35 40 45

Asp Phe Leu Cys Asn Phe Leu Ile Lys Met Gly Met Thr Arg Thr Leu

50 55 60

Asp Cys Phe Gln Ser Glu Trp Tyr Glu Leu Ile Gln Lys Gly Val Thr

65 70 75 80

Glu Leu Arg Thr Val Gly Asn Val Pro Asp Val Tyr Thr Gln Ile Met

85 90 95

Leu Leu Glu Asn Glu Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asp Leu Lys His Tyr

100 105 110

Lys Gln Ala Ala Glu Tyr Val Ile Phe

115 120

<210>9

<211>603

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

ggcaagttca agaggatatg aagatttgag aactttttaa ctattcattg actaaaaatg 60

aacattaatg ttaaagactt aagactttaa cctgctggca gtcccaaatg aaattatgca 120

actttgatat catattcctt gatttaaatt ggcttttgtg attgagtgaa actttataaa 180

gcatatggtc agttatttaa ttaaaaaggc aaaacctgaa ccaccttctg cacttaaaga 240

agtctaacag tacaaataca ctatctatct tagatagata tatttttttt tatttttaaa 300

tattgtacta tttatggtgg tggggctttc ttactaatac acaaataaat ttaatcattt 360

caaaggcatt ctatttggtt tagaagttga ttcccaggag tgccatattt cagctactgt 420

atttcctttt tcttgtaatg taagcagctc agataccatg tgctatcatt tttgtatcaa 480

gttttttgca caggatgtga ccactgtcag atcactgttc ttttctttct ttttgtgatt 540

gaaaagccta tactacaatt tgaagtaaat ttttgttttt cttaaaaaaa aaaaaaaaaa 600

aaa 603

<210>10

<211>783

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

ccttgataac agctaccatg acaaccctgt ggtttccaag gagctgagaa tagaaggaaa 60

ctagcttaca tgagaacaga ctggcctgag gagcagcagt tgctggtggc taatggtgta 120

acctgagatg gccctctggt agacacagga tagataactc tttggatagc atgtcttttt 180

ttctgttaat tagttgtgta ctctggcctc tgtcatatct tcacaatggt gctcatttca 240

tgggggtatt atccattcag tcatcgtagg tgatttgaag gtcttgattt gttttagaat 300

gatgcacatt tcatgtattc cagtttgttt attacttatt tggggttgca tcagaaatgt 360

ctggagaata attctttgat tatgactgtt ttttaaacta ggaaaattgg acattaagca 420

tcacaaatga tattaaaaat tggctagttg aatctattgg gattttctac aagtattctg 480

cctttgcaga aacagatttg gtgaatttga atctcaattt gagtaatctg atcgttcttt 540

ctagctaatg gaaaatgatt ttacttagca atgttatctt ggtgtgttaa gagttaggtt 600

taacataaag gttattttct cctgatatag atcacataac agaatgcacc agtcatcagc 660

tattcagttg gtaagcttcc aggaaaaagg acaggcagaa agagtttgag acctgaatag 720

ctcccagatt tcagtctttt cctgtttttg ttaactttgg gttaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaa 783

<210>11

<211>539

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

aattctcagg gcccccgcag gcctgggagc ggcctgtgat aactggtgta tctggcagga 60

gtagcagctg ccccttggcg cgactgctgg agccgcgaac tagagaaaca cagacacgcc 120

tcatagagca acggcgtctc tcggagcgtg gagcccgcca aggtaactcc gggaattgag 180

tggagtggag gctgcactga ggcccccttc tggctcctct ctggtcgaaa aggctccccc 240

gctagagaga gccctgctgc ttttggaagc cttcaggtgt tagttgcttt gcaccgaagc 300

tgctgactgc tggggttctg cgccgattgc caggctcaag tttattttgg gggctgctga 360

gcagactttg cccttctgtg ctgttatcag cttctgtcgc tgtccgtcca cgcccgctat 420

atccatccac tctccgttct gtctccagca ggcaactccc cctaccctgc cccattttct 480

gggtcatagg ggtatttgaa ataaaccttt aagggaaaag caaaaaaaaa aaaaaaaaa 539

<210>12

<211>1119

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

ggtgcaagat gcataaacgc agaatagcca tgctagagcc cctaactgta gacctgaatc 60

cacagtatta tctgttggtc aacagacaga tccagtttga aattgcacat gcttactatg 120

atatgatgga tttgaaggtt gccattgctg acaggctaag ggatcctgat tcacacattg 180

taaaaaaaat aaataatctt aataagtcag cactgaagta ctaccagctc ttcttagact 240

ccctgagaga cccaaataaa gtattccctg agcatatagg ggaagatgtt cttcgccctg 300

ccatgttagc taagtttcga gttgcccgtc tctatggcaa aatcattact gcagatccca 360

agaaagagct ggaaaatttg gcaacatcat tggaacatta caaatttatt gttgattact 420

gtgaaaagca tcctgaggcc gcccaggaaa tagaagttga gctagaactt agtaaagaga 480

tggttagtct tctcccaaca aaaatggaga gattcagaac caagatggcc ctgacttaat 540

ccttgttttt aaagaaagga aatgtgcaat attgaagtga tctttttccc tagtcagaca 600

ggcccaattc cattgtgatg tttaccttta tagccaggtg agtgcagttt gaacttgaga 660

tacagtcaac tgagtgtttg ctaggatcct aaggaacata aagttaatta aaaacttaca 720

cctaattatg taaattgcct tgttaaagac atgtgatttg tattttagat gcttgtttcc 780

tattaaaata cagacatttc taccctcagt ttctaaatgt agactatttg ttggctagta 840

cttgatagat tccttgtaag aaaaaatgct gggtaatgta cctggtaaca agcctgttaa 900

tatattaaga ttgaaaaagt aacttctata gttactcctt ctaaaatatt tgacttccta 960

aattcccccc acccaaaatc tttccctttt gaaaatacta aaaactaagt tatgttatta 1020

taaagtgtaa aatggtttgt cttaattata ggagaaaaag gccttgttag aaataaaata 1080

aactgactta tttcactaat gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1119

<210>13

<211>864

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>13

ctattcttgc ttaaaactgt actcttttgc aaattaacaa ttttatcact gattcagagt 60

taaaaagaag actaactttt caagcaaatg catctgtaaa gatgctttag attagactgt 120

catgtctcag tgtctatctg tatatattat ttgatattca gagaatctaa agcactcgtc 180

tactgtttta atgagattta acagctttta acagtgagtt tcgtttgtaa actgcttgaa 240

gtctgtggca ttcaggcaca cgtctggctg gccggctggg tctcctcccg ggctcagtgg 300

gcctggggcc tctctgacgt ggtgcctgct ggagggaggc tcgtcgtcac cagctgactg 360

ctggtccggc ttctgaccgg cctttgtcct ggctccgtag cagaacactg taaaagtgcc 420

cgcgtctttg cagtagttgc agatttcagt cgtcgtgtta cttgtgcaca aacagaagct 480

gggtcttacc cgcagcacga gtgtctcggg ctgcccggag tcgcccggga gcaggtgctg 540

cagccagagt tacgcggggg ccacgcgggc cggcgggggt ggggggaacg tgggggaacc 600

tgtgtttcac gtgactcagc agtgcccgcc gccgtcacca gctatgcatt cactccgttt 660

ccagtgagca gatgtcttgc ttggaaagtg gacctgtgtc tgtgtctgtc ctgagaactt 720

accagcagaa atcctcattt ctgtgctacg gatttaccaa aaattgtcaa gtctttttca 780

gtttaacagt tcctttacat gtgtagtatt tgaggaaaaa aatcaataaa cagttgatct 840

cgtgcataaa aaaaaaaaaa aaaa 864

<210>14

<211>790

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

aacatgctac acaaaaccag gtttctgttt cagataaata ggtgaaggga ctcttaatcc 60

taaagactga aaagtagaaa agaaagggga agaagagtgc ctcaaggatt gccattggag 120

gttcttttgc tggggctgat tgccagctga gattattcaa gccccagagc aaacattctg 180

ctcctgctcc cttagagctg ccctcccacc gctcagtatt gcctcctgcg aggggcgggc 240

tggctgccgc agacaccagt gaaccctttt tccattccag aagtcccagt ggacctactt 300

taatatacca ataacactcc tattttaaac tagctgtatc cattttcgtt ttaatagtcc 360

cagtgctaaa gtttttcaaa gcagttattt tgtaagtagg tcaaacaggt actttgggat 420

cctgttctgt ctgtttgctt gccaggtaac ctctttgtta tctaattcaa agtctggtac 480

agtttgaacc aaaacaaaaa aggaatgatg tttcactttg gagtcaagat tcattcattt 540

tctaacatta atcattttcg ttatacagta agtctatatt catgataaaa aatagaaaat 600

atgaataagc aaaactaaat tgaaaggaaa accatctgtg atctgccaat tagaaaatct 660

ctattctaaa cattttggta aatatgctac cagattttta tctatgcaaa tgtgtatctg 720

tatttttcct cacttgtata gtggacatct tttcatatta ataaataagt tagcatcaaa 780

aaaaaaaaaa 790

<210>15

<211>681

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

ggacagggag tgggcaaggg gaagaagcag cttatttgac taaccagccc ctctgtggtc 60

caccagcgtc ttggcttggt gggagggctc tcaatcagca gggccccagg agggaagaag 120

aagtggggca aagcctggcc tcgccgctcg ggagctttgc catctgagcc acgcctcctc 180

caggccatgc tccttgaact tggaaatgtc aaccggagcc cttacaccag ccctccagca 240

tctaatagac ttgaatctac tctaaacgaa tatttaatcc aacctcacta cattgtagct 300

cagtccaacg actaaccctg aaatgggggt gttccagcct tcagcgagat ggccaagcgg 360

tcccctgggg gctgtggcag cgggcttatc cttctctgtt gccaaccttg ccgtccgacc 420

tcctccgccc ccatgcggtg accccgtccg tgtctgtgtc tgtccatacg tgtgagtcca 480

gctaaaaaga caaaacagaa cccgtgggcc cagctcggaa ggtgcgtgga gaaggctccg 540

acgtctccga agtgcagccc ttgggatggc attccgttgt gtgccttatt cctggagaat 600

ctgtatacgg ctcgcctata gaaatatagc ctcttcatgc tgtattaaaa ggacttttaa 660

aagcaaaaaa aaaaaaaaaa a 681

<210>16

<211>970

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

cagatgacaa ttttagcatc ccagaaggtg aagaagatct ggcaaaagca attcagatgg 60

cccaagaaca ggctacagat actgaaattt tggaacggaa aacagttctt ccttcaaagc 120

atgcagtacc tgaagtaata gaagactttc tctgcaattt cttgatcaaa atgggaatga 180

ccagaactct tgattgcttt cagtctgaat ggtatgagtt aatacagaaa ggagtgactg 240

aacttagaac tgttgggaat gttccagatg tctacaccca gattatgctg ttggaaaatg 300

agaacaaaaa tttaaagaaa gatttgaagc actacaaaca agcagctgag tatgttattt 360

tttaaatgac attttcttct ttttcttttg gactaaataa aagagttgag tgaagctgat 420

atatgtaata taccagagcc ttaatttttg aaaactgaat ttttctagtt gtaaagaatg 480

tgagaggctt cattagcaaa ttaattaaac agatgatcag aactatcaca attataactt 540

accaacaaga agggaatgca ggtagttgtt taggagatgg tacatttttt atataacatt 600

cacttccttg tgtatttgat agtcttttca tggtttataa cattttctcc tgtaaagata 660

ggctaatttc tgaaataata attaaattta tagaaagccg agaggaaatt gctagtttat 720

tcctggtaga ggaatttctg tatttgaaaa ttctccagaa ggaataatat aaactgtgga 780

ctttgggtga taatgatatg taggttcgtc agttgttaac aaatgtatcc ctctgttggg 840

ggctattgat aatggggaag gctgtgcatg tgtgggagta ggaggtgtat gggacatctc 900

tgtaccttct aatcaatttt gctatgaact taaaactgct ctaaaaataa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa 970

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Ala Ser Ser Arg Gly Tyr Glu Asp Leu Arg

1 5 10

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Leu Asp Asn Ser Tyr His Asp Asn Pro Val

1 5 10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

Leu Arg Ala Pro Ala Gly Leu Gly Ala Ala

1 5 10

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>20

Gly Ala Arg Cys Ile Asn Ala Glu Gln Pro

1 5 10

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>21

Tyr Ser Cys Leu Lys Leu Tyr Ser Phe Ala

1 5 10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>22

Glu His Ala Thr Gln Asn Gln Val Ser Val

1 5 10

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>23

Gly Thr Gly Ser Gly Gln Gly Glu Glu Ala

1 5 10

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>24

Ala Asp Asp Asn Phe Ser Ile Pro Glu Gly

1 5 10

Claims

1.包含至少两种不同的多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：1-8中任一个所示的序列或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段。

2.根据权利要求1的组合物用于检测哺乳动物的体液中对所述组合物的至少一种多肽的特异性抗体的存在和/或量的体外用途。

3.根据权利要求2的用途，其中所述哺乳动物是人。

4.根据权利要求2和3的用途，其中所述体液是脑脊液。

5.根据权利要求2-3的用途，其中所述检测是通过免疫-酶法进行的，所述免疫-酶法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术、放射免疫试验(RIA)、免疫印迹和LINE印迹(LINE blot)。

6.根据权利要求2-5的用途，其中所述至少一种特异性抗体的检测和/或量指示多发性硬化。

7.在哺乳动物中特异性检测多发性硬化的方法，其包括i)在源自所述哺乳动物的体液中检测至少一种抗体的存在或量，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体的存在或量指示所述哺乳动物患有多发性硬化。

8.根据权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是人。

9.根据权利要求7和8的方法，其中所述体液是脑脊液。

10.根据权利要求7-9的方法，其中所述检测是通过免疫-酶法进行的，所述免疫-酶法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术、放射免疫试验(RIA)、免疫印迹和LINE印迹(LINE blot)。

11.根据权利要求7-10的方法，其中所述至少一种特异性抗体的检测和/或量指示多发性硬化。

12.在患者中评估多发性硬化的预后和/或疾病严重性的方法，其包括i)在源自所述患者的体液中检测至少一种抗体的存在或量，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体浓度降低或增加指示所述患者中多发性硬化的预后。

13.选择用于特异性治疗多发性硬化的患者或在患者中评估多发性硬化的治疗的方法，其包括i)在源自所述患者的体液中检测至少一种抗体的存在或量，其中所述抗体对于包含如下序列的多肽具有特异性：选自由SEQ ID NO：1-8组成的组的序列，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段，而且其中ii)所述抗体的存在或量导致所述患者中多发性硬化的特异性治疗的选择。

14.用于检测多发性硬化的诊断试剂盒，其包含权利要求1的组合物、用于制备适于免疫反应发生的介质的试剂和能够检测已通过所述免疫反应产生的抗原/抗体复合物的试剂。

15.与选自下组的多肽特异性结合的抗体，所述的组包括选自由SEQ IDNO：1-8组成的组的多肽，或源自SEQ ID NO：1-8的包含至少5个连续的氨基酸的片段。