CN101679238A

CN101679238A - 用于合成选择性dpp-iv抑制剂的方法和中间体

Info

Publication number: CN101679238A
Application number: CN200880015066A
Authority: CN
Inventors: 大卫·艾伦·坎贝尔; 埃米莉娅·P·T·莱唐; 吴振平; 王朋
Original assignee: Phenomix Corp
Current assignee: Phenomix Corp
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2010-03-24
Also published as: TW200843784A; MX2009009575A; CA2680133A1; AR065666A1; EP2173709A2; WO2008109681A3; WO2008109681A2

Abstract

本发明提供了用于合成二肽基肽酶IV(DPP－IV)选择性抑制剂的方法和中间体。将羧酸盐与硼－脯氨酸衍生物偶联提供保护形式的DPP－IV抑制剂，其可被去封闭以得到药用化合物。所述羧酸盐可以是钠盐或二环己基铵盐的晶体形式。所述抑制剂可用于治疗糖尿病。

Description

用于合成选择性DPP-IV抑制剂的方法和中间体

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年3月8日提交的美国申请No.60/893,842、2008年1月25日提交的美国申请No.61/023,487、2007年7月12日提交的美国申请No.60/959,226以及2008年2月18日提交的美国申请No.61/029,506的优先权，所有这些申请的全部内容均在此通过引用并入本文。

背景技术

二肽基肽酶-IV(DPP-IV，dipeptidyl peptidase IV)是二肽基肽酶家族成员之一，其能将N-末端二肽残基从蛋白质上切割下来，尤其是当所述二肽包含位于N-末端倒数第二位的脯氨酸或丙氨酸残基时。DPP-IV被认为参与葡萄糖调控，因为其肽分解作用使促胰岛素激素肽-胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和抑胃肽(GIP，gastric inhibitory protein)失活。抑制DPP-IV(例如体内施用合成抑制剂)可起到提高GLP-1和GIP血浆浓度的作用，并因此改善血糖控制。因此，这样的合成抑制剂可用于治疗糖尿病及相关病症。

然而，该DPP酶家族还存在其它成员，包括DPP-VII、DPP-VIII、DPP-IX和FAP(成纤维细胞活化蛋白)，其对DPP-IV具有相似的底物特异性。已知在哺乳动物中抑制这些酶中的某些酶(例如DPP-VIII)可引起毒性作用。因此，为了在医学上有用，DPP-IV抑制剂还必须表现出相对于DPP酶家族其它成员的对DPP-IV的选择性。

已经开发了某些这样的选择性DPP-IV抑制剂，如以下这些文件所公开的：2006年11月16日公开的公开号WO2005/047297的PCT专利申请公开以及美国申请公开Nos.2006/0258621、2006/0264400(现在为2008年1月8日公布的美国专利No.7,317,109)以及2006/0264401。

在这些申请里的某些申请中，公开了DPP-IV被下式结构的化合物所抑制：

其中R^a和R^b是OH，从而提供了硼酸或其盐或其保护形式。所述化合物被称为吡咯烷-3-基-甘氨酰基-硼-脯氨酸及其衍生物，或者更一般而言，称为吡咯烷-3-基-甘氨酰基氨基烷基硼酸酯。2008年1月8日授权的美国专利No.7,317,109要求保护该结构的化合物，并且还要求保护所述化合物用于选择性抑制DPP-IV的用途，例如在患有可通过抑制DPP-IV而被调节或正常化的不良状况(例如糖尿病或其它葡萄糖代谢障碍)的哺乳动物中。

在本发明人的共同未决的PCT申请No.PCT/US2006/029451中，提供了一种制备上式化合物的硼酸酯保护形式的方法：

其中适当的活化(HOBt/EDAC/NMM/DCM)引起1-苄氧羰基吡咯烷-3-基-N-苄氧羰基甘氨酸的羧酸基团与受保护的硼-脯氨酸偶联产生DPP-IV抑制性化合物N-(吡咯烷-3-基甘氨酰基)硼-脯氨酸的二-苄氧羰基(Cbz)形式。硼-脯氨酸衍生物意指其中氨基酸的羧酸部分已经被硼酸部分或其受保护形式(例如硼酸酯)替代的脯氨酸类似物。R^a和R^b是被保护的羟基，其可被脱保护而形成N-(吡咯烷-3-基甘氨酰基)硼-脯氨酸或其盐。因此，1-苄氧羰基吡咯烷-3-基-N-苄氧羰基甘氨酸是制备选择性DPP-IV抑制剂N-(吡咯烷-3-基甘氨酰基)硼-脯氨酸的关键中间体。

发明内容

本发明的实施方案涉及合成吡咯烷-3-基甘氨酰基-硼-脯氨酸类的某些DPP-IV抑制性化合物的方法以及可用于实施所述合成方法的中间体。

本发明的一个实施方案提供了制备式(I)化合物的方法：

其中PG各自独立地是氮保护基，R^a和R^b各自是羟基或其盐，或者是可被转化成羟基或其盐的基团，或者R^a和R^b与它们所连接的硼原子一起形成可转化成B(OH)₂或其盐的环状结构；

所述方法包括使式(II)的羧酸盐，其中M是阳离子

与式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(I)化合物。

本发明的一个实施方案提供了制备式(IV)化合物的方法：

所述方法包括使式(V)的羧酸盐(即式(II)化合物的(R)-立体异构体)，其中M是阳离子

与式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(IV)化合物。

本发明的一个实施方案提供了制备式(VII)化合物的方法：

所述方法包括使式(V)的羧酸盐，其中M是阳离子

与式(IX)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(VII)化合物。

本发明的一个实施方案提供了式(II-Cbz-Na)的钠盐：

包括其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和水合物，其中PG均为Cbz基团，并且M⁺是钠离子。

本发明的另一个实施方案提供了式(V-Cbz-Na)的钠盐：

式(II-Cbz-Na)化合物的(R)-立体异构体，包括其互变异构体、溶剂化物和水合物。

本发明的另一个实施方案提供了上述化合物的晶体形式。所述晶体形式可通过本文所提供的X射线粉末衍射数据等来表征。

本发明的另一个实施方案提供了制备式(II-Cbz-Na)或式(V-Cbz-Na)化合物或其晶体形式的方法，所述方法包括从水性皂化反应混合物的有机萃取物中进行回收，所述水性皂化混合物之前已将pH调节至约5.5-7.5。所述水性皂化混合物可以是氢氧化钠介导的相应酯(例如甲基酯)皂化反应的产物。

本发明的另一个实施方案提供了式(II-Cbz-DCHA)的二环己基铵盐：

包括其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和水合物，其中PG均为Cbz基团，并且M⁺是二环己基铵离子。

本发明的另一个实施方案提供了式(V-Cbz-DCHA)的二环己基铵盐：

前式化合物的(R)-立体异构体，包括其互变异构体、溶剂化物和水合物。

另一个实施方案提供了上述式化合物的晶体形式，所述晶体形式可通过本文中所提供的X射线粉末衍射数据等来表征。

多个实施方案提供了制备化合物(II-Cbz-DCHA)和(V-Cbz-DCHA)的方法。在一个实施方案中，本发明提供了制备二环己基铵盐的方法，所述方法包括使下式的羧酸

与二环己基胺在有机溶剂中相接触，然后收集作为沉淀的化合物。

在另一个实施方案中，可使上述羧酸的(R)-立体异构体与二环己基胺在有机溶剂中相接触以提供二环己基铵盐的(R)-立体异构体。

在多个实施方案中，提供了利用所述外消旋体或各自的富含(R)-立体异构体形式的钠盐或二环己基铵盐与式(X)的受保护的硼-脯氨酸衍生物

进行偶联反应以分别提供具有式(XI)

或式(XII)

的DPP-IV抑制剂的保护形式的方法。

在本发明的多个实施方案中，还提供了将上述式的化合物转化成其各自相应的完全脱保护的生物活性形式的式(XV)和(XVI)的方法，

或

所述转化例如通过它们的其中Cbz基团已通过例如氢解而被除去但硼酸酯保护基保持完好的衍生物来进行，例如式(XIII)和(XIV)的化合物：

或

式(XV)和(XVI)化合物可以作为其盐而被分离。例如，所述化合物可作为其柠檬酸盐或酒石酸盐而被分离和纯化，或者更具体而言，作为其L-酒石酸盐被分离。式(XVI-T)化合物即式(XVI)化合物的L-酒石酸盐具有尤其有利的性质，因为其是可容易地被纯化、贮存、分配、配制和被需要它的患者口服摄取的稳定的盐。化合物(XVI-T)是高效和选择性的DPP-IV抑制剂。可将这些盐形式施用给患者以治疗葡萄糖代谢障碍，例如糖尿病。

本发明的一个实施方案涉及化合物(XIV)的晶体形式：

化合物(XIV)是立体化学定义的异构体2(R)-1-{2-[(3R)-吡咯烷基氨基]-乙酰基}-吡咯烷-2-硼酸(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇酯。本发明晶体形式的一个实施方案包括THF溶剂。认为晶体形式的该实施方案是式(XIV)化合物的晶体THF溶剂化物。所述晶体形式通过本发明所提供的光谱数据例如X射线粉末衍射、核磁共振(NMR)、红外吸收光谱(IR)以及差示扫描量热法(DSC)进行表征。

本发明的一个实施方案涉及以溶剂(比如四氢呋喃)结晶来制备化合物(XIV)的本发明晶体形式的方法。可将物质样品(比如氢解除去Cbz氮保护基得到的粗反应产物)溶解在温热的THF中，真空下浓缩，冷却溶液以提供所述晶体物质。可将所述物质进一步干燥。

本发明的另一个实施方案提供了一种可将所述晶体物质用于DPP-IV抑制性物质化合物(XVI)即2(R)-1-{[(3R)-吡咯烷基氨基]-乙酰基}-吡咯烷-2-硼酸的合成中的方法：

所述化合物(XVI)还可进一步与L-酒石酸反应以提供化合物(XVI-T)即相应的L-酒石酸盐，该L-酒石酸盐可用作治疗哺乳动物中糖尿病和其它葡萄糖代谢障碍的药用化合物。

附图说明

图1是本发明的(1-苄氧羰基吡咯烷-3-基)-N-苄氧羰基甘氨酸钠盐的晶体形式的差示扫描量热(DSC)图。

图2是图1的钠盐的X射线粉末衍射图。

图3是图1的钠盐的溶液质子NMR谱。

图4是本发明的(1-苄氧羰基吡咯烷-3-基)-N-苄氧羰基甘氨酸二环己基铵盐的晶体形式的差示扫描量热(DSC)图。

图5是图4的二环己基铵盐的X射线粉末衍射图。

图6是图4的二环己基铵盐的溶液质子NMR谱。

图7是图4的二环己基铵盐的溶液¹³C NMR谱。

图8显示化合物(XIV)的晶体形式的CDCl₃溶液的质子核磁共振(NMR)谱。

图9显示图8的晶体形式的红外吸收(IR)光谱。

图10显示图8的晶体形式的差示扫描量热(DSC)图。

图11显示图8的晶体形式的X射线粉末衍射图。

具体实施方式

定义

术语“治疗”定义为以对抗疾病、病况或病症为目的而对患者进行的处置和护理，包括施用本发明的化合物以阻止症状或并发症的出现，或者减轻症状或并发症，或者消除疾病、病况或病症。在本发明中，所述疾病、病况或病症是指可通过选择性地抑制酶DPP-IV或可通过本发明化合物的一个实施方案的任意其它生物化学性质调节的疾病、病状或病症。

本发明上下文中的“治疗”意为减轻与病症或疾病相关的症状，或者阻止这些症状的进一步发展或恶化，或者防止或预防所述疾病或病症。因此，治疗葡萄糖代谢病症或缺陷包括控制、减缓或预防不良状况(例如糖尿病)的症状。类似地，本文使用的本发明化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指这样的化合物量，其完全或部分缓解与病症或状况相关的症状，或者终止或减缓这些症状进一步发展或恶化，或者防止或预防病症或症状。具体来说，“治疗有效量”是指在剂量和在必要的时间方面可通过抑制DPP-IV活性而有效达到期望治疗结果的量。治疗有效量也是本发明化合物的治疗有益效果超过任何毒性或有害作用的量。例如，在治疗糖尿病的情形下，本发明DPP-IV抑制剂的治疗有效量是足以为患有与糖尿病有关的症状的患者提供有益作用的量，所述症状包括但不限于血糖水平升高、低血糖、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤和心血管疾病。

除非特别指明了特定的立体化学或特定的异构体形式，否则所有手性、非对映、外消旋形式的结构均考虑在内。显然，根据描述，本发明所用化合物包括富集或拆分的任何或所有不对称原子的旋光异构体。可以分离或合成外消旋和非对映的混合物以及单个的旋光异构体，从而基本上不含其对映体或非对映体，这些都在本发明的范围之内。或者，可将单一异构体以不同程度富集到物质样品中；化合物样品可以是外消旋的，其中两种对映体以相等的量存在；或者可以超过等量的任意程度富集特定异构体。例如，样品可以约60％富集、或者约75％富集、或约90％富集、或约99％富集特定的立体异构体。

术语“手性”或“手性中心”意指不对称中心(通常在碳原子上)，或者含有这种不对称中心的分子，这是本领域中众所周知的。术语“立体异构体”指具有手性中心的分子，其中每个手性中心上存在单一构型。当仅仅具有一个手性中心时，纯的立体异构体被称为“对映体”。一个以上的单一手性中心导致可能存在“非对映体”，其可作为dl对存在或者可以是内消旋形式，这是本领域中众所周知的。在存在单一手性中心情形下，“外消旋体”或“外消旋混合物”包含在存在单一手性中心的情形下的两种等量的立体异构体；在存在多个手性中心的情形下，给定非对映体的各对映体对以等量存在，但是不同非对映体的相对量可以不同。“立体化学纯的”和“立体化学富集的”分别指样品中存在分子的单一立体异构体的情形或者样品中一种立体异构体相对于另一种立体异构体占优势的情形。当存在单一手性中心时，一种对映体可以相对于另一种对映体在百分比上占优势，例如立体化学富集的样品可以含有80％的一种对映体和20％的另一种对映体，或者90％的一种对映体和10％的另一种对映体等等。立体化学纯度是一个相对术语，因为即便是99％立体化学纯度的样品仍然包含1％的另一种异构形式。

术语“硼-脯氨酸”意指脯氨酸的类似物，其中羧酸基被硼酸(硼酸盐)基替代。该术语包含吡咯烷硼酸结构的所有位置的异构体和立体异构体，还包括取代的衍生物。

本文所用的术语“硼酸”或“硼酸盐”分别指式RB(OH)₂化合物或其盐，其中R是通过碳原子与硼原子键合的基团。“硼酸盐”还可以指硼酸酯，其中一个或两个OH基被碳基例如甲基取代。因此，其中R’是通过碳原子与氧原子键合的基团的式RB(OR’)₂化合物也是本文意义上的硼酸盐，这些化合物也可称为“硼酸酯”。“环状硼酸二酯”是其中两个R’基团彼此共价键合的式RB(OR’)₂化合物。例如，硼酸的乙二醇二酯是本文意义上的环状硼酸二酯。

本文所用的术语“偶联反应”指羧酸盐与硼-脯氨酸衍生物之间酰胺键的形成，如本文所述。

本文使用的术语“氨基保护基”或“N保护的”是指这样的基团，其在合成步骤中保护氨基不参与不希望的反应，并且随后可以被除去以显露出胺。常用的氨基保护基公开于Protective Groups in Organic Synthesis，Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.，John Wiley&Sons，New York，NY，(3rdEdition，1999)。氨基保护基包括酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；烷氧基羰基或芳氧基羰基(与保护的胺形成尿烷)，例如苄氧羰基(Cbz)、对氯苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基、2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)、2，2，2-三氯乙氧羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基(Teoc)、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧羰基(Fmoc)、环戊基氧羰基、金刚烷基氧羰基、环己氧羰基、苯硫基羰基等；芳基烷基，例如苯甲基、三苯甲基、苄氧基甲基等；以及甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。胺保护基还包括环状氨基保护基，例如将氨基氮引入杂环中的酞酰基和二硫代琥珀酰亚胺基。通常，氨基保护基包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、苯磺酰基、Alloc、Teoc、苄基、Fmoc、Boc和Cbz。为其合成任务选择并使用合适的氨基保护基在普通技术人员的技能范围之内。

一般而言，“取代”是指本文定义的有机基团，其中其包含的一个或多个与氢原子所成的键被与非氢原子所成的键代替，所述非氢原子例如但不限于：卤素(即F、Cl、Br和I)；氧原子，例如下列基团中的：羟基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基；硫原子，例如下列基团中的：巯基、烷基和芳基硫化物基团、亚砜基、砜基、磺酰基和磺酰胺基；氮原子，例如下列基团中的：胺、羟胺、N-氧化物、酰肼、叠氮化物和烯胺；以及其他多种基团中的其他杂原子。取代的烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基基团以及其他取代的基团还包括其中与氢原子键合的一个或多个键被一个或多个与碳原子或与杂原子键合的键(包括双键或三键)所替代的基团，所述杂原子例如但不限于羰基(氧代)、羧基、酯、酰胺、酰亚胺、尿烷和脲基团中的氧原子；以及亚胺、羟亚胺、肟、腙、脒、胍和腈中的氮原子。

烷基包括直链和支链的烷基和环烷基，其具有1到约20个碳原子，通常1到12个碳，或者在一些实施方案中具有1到8个碳原子。直链烷基的实例包括具有1到8个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支链烷基的实例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2，2-二甲基丙基。代表性的取代烷基可以被以上所列的任何基团取代一次或多次，所述基团例如氨基、羟基、氰基、羧基、硝基、巯基、烷氧基和卤素基团。

芳基是不含有杂原子的环状芳香烃。因此，芳基包括但不限于苯基、薁基(azulenyl)、庚搭烯基(heptalenyl)、联苯基、吲丹烯基(indacenyl)、芴基、菲基、三亚苯基(triphenylenyl)、芘基、萘并萘基(naphthacenyl)、

基、亚联苯基、蒽基和萘基。在一些实施方案中，芳基在该基团的环部分中包含6-14个碳。芳基可以是未取代的，或者可以是如上所述取代的。代表性的取代芳基可以是单取代或者多取代的，例如但不限于2、3、4、5或6取代的苯基或2-8取代的萘基，其可被碳基或非碳基(例如以上所列的那些基团)取代。

术语“烷氧基”是指氧原子与以上定义的烷基相连接。直链烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。支链烷氧基的实例包括但不限于异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基、异己氧基等。环状烷氧基的实例包括但不限于环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

术语“芳氧基”和“芳基烷氧基”分别指与氧原子键合的芳基和在烷基上与氧原子键合的芳基烷基。实例包括但不限于苯氧基、萘氧基和苄氧基。

术语“胺”包括例如具有式-N(基团)₃的伯胺、仲胺和叔胺，其中各基团可独立地是H或非H，例如烷基、芳基等。胺包括但不限于R-NH₂、烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、R₂NH(其中R各自独立地选自例如二烷基胺、二芳基胺、芳烷基胺、杂环胺等)、R₃N(其中R各自独立地选自例如三烷基胺、二烷基芳基胺、烷基二芳基胺、三芳基胺等)。“氨基”是-NH₂-、NHR、-NR₂、-NR₃ ⁺形式的取代基，其中R各自独立地选自各自的质子化形式。术语“胺”还包括本文所用的铵离子。

“铵”离子包括未取代的铵离子NH₄ ⁺，但是除非另外指明，否则其还包括胺的任意质子化或季铵化形式。因此，盐酸三甲基铵和四甲基氯化铵均是本文意义上的铵离子。

术语“酰胺”(或“酰氨基”)包括C-和N-酰胺基，即分别为-C(O)NR₂和-NRC(O)R基团。因此，酰胺基包括但不限于氨基甲酰基(-C(O)NH₂)和甲酰胺基(-NHC(O)H)。

本文所用的术语“阳离子”是相对于本发明方法中所用的羧酸盐而言的，指带正电荷的离子型分子实体，例如金属离子或铵离子。金属阳离子包括碱金属离子，例如锂、钠、钾和铷离子，碱土金属离子例如镁、钙和锶离子，过渡金属离子例如亚铁离子或铁离子、锌离子等。铵阳离子包括如上所述的取代或未取代的铵离子，包括胺的阳离子(质子化或季铵化)形式，例如二环己基铵离子。

此外，在以马库什组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会认识到，本发明也由此就该马库什组中的任何单个成员或亚组成员进行了描述。因此，如果X被描述为选自溴、氯和碘，则完全地描述了X为溴的权利要求以及X为溴和氯的权利要求。此外，在以马库什组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会认识到，本发明也由此就该马库什组中的任何单个成员或亚组成员的组合进行了描述。因此，例如，如果X被描述为选自溴、氯和碘，而Y被描述为选自甲基、乙基和丙基，则完全地描述了X是溴且Y是甲基的权利要求。

发明详述

在本发明中，提供了用于制备某些N-乙酰化的硼-脯氨酸化合物的合成方法，已知所述化合物作为酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)的选择性抑制剂是具有生物活性的，所述酶是调节葡萄糖代谢的重要酶。而且，还提供了可用于实施本发明方法的合成中间体。

本发明的一个实施方案提供了制备式(I)化合物的方法：

其中PG各自独立地是氮保护基，R^a和R^b各自是羟基或其盐，或者是可被转化成羟基或其盐的基团，或者R^a和R^b与它们所连接的硼原子一起形成可转化成B(OH)₂或其盐的环状结构；所述方法包括使式(II)的羧酸盐

其中M是阳离子；

与式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(I)化合物。式(II)化合物是羧酸盐，所述羧酸是双N-保护形式的吡咯烷-3-基甘氨酸，又称为3-(羧甲基氨基)吡咯烷或3-N-(甘氨酰基)吡咯烷。N-保护基可以是对羧酸盐与式(III)的硼-脯氨酸衍生物或其盐偶联的反应条件稳定的任意合适基团。例如，PG可以是苄氧基羰基，又称为苄氧羰基(Cbz)，或者PG可以是叔丁氧羰基(tBoc)或者烯丙氧羰基(alloc)，或者现有技术中已知的多种合适的N-保护基中的任意一种。前提是所述保护基在偶联反应条件下是稳定的，但是可在不破坏式(I)的偶联产物

或最终的去封闭(deblocked)产物

的条件下除去。实际上，可以使用任意氮保护基或封闭基团。两个PG基团不必相同，虽然它们可以具有相同的身份。

可以利用硼酸盐保护的硼-脯氨酸衍生物进行偶联反应，其中R^a和R^b是适当封闭的羟基。例如，R^a和R^b可各自是烷氧基，例如甲氧基。或者，R^a和R^b可与它们所连接的硼原子一起形成环状基团，其最后可被水解成硼酸或其盐。例如，R^a和R^b与硼原子一起可包含环状硼酸二酯，例如乙二醇环状硼酸二酯或丙二醇环状硼酸二酯。或者，R^a和R^b与硼原子一起可包含单萜二醇环状硼酸二酯，例如蒎烷二醇环状硼酸二酯。单萜二醇可以是手性形式，也就是说，是具有至少一个手性中心的单萜，其中使用了立体异构纯的形式。这提供了通过选择性结晶所期望的非对映体二酯来纯化在连有硼原子的吡咯烷碳(α-碳)上的优选的手性形式的优点。例如，所述蒎烷二醇环状二酯可以是(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇(也称为(+)-蒎烷二醇)的环状二酯。

在本发明方法的一个实施方案中，可将立体化学富集的式(III)的硼-脯氨酸化合物用在所述偶联反应中，例如式(IX)的受保护的硼-脯氨酸或其盐：

其中所述化合物具有在手性中心(α-碳)上的(R)绝对构型，通过纯化式(IX)分子的单一非对映体可容易地制得，其中BR^aR^b是环状(+)-蒎烷二醇硼酸二酯，其中蒎烷二醇的单一立体异构体用于由外消旋吡咯烷-2-硼酸制备环状二酯，然后分离所期望的在α-碳上具有(R)构型的环状二酯的非对映体。

偶联反应可以使用式(II)的羧酸盐：

其中M是阳离子，其可包含任意和所有的立体化学形式和混合物。或者，偶联反应可使用立体化学纯形式的羧酸盐，例如式(V)化合物：

其中M是阳离子，所述化合物在所指出的手性中心(即带有受保护的取代氨基的吡咯烷-3-碳)处主要是(R)绝对构型。

可在式(II)的未确定立体化学的化合物或式(V)的已确定立体化学的化合物与式(III)的未确定立体化学的硼-脯氨酸衍生物或其盐或式(IX)的已确定立体化学的硼-脯氨酸衍生物或其盐之间进行偶联反应。因此，反应产物可以是式(I)的未确定立体化学的产物：

式(IV)的在吡咯烷-3-碳上确定立体化学的产物：

式(IVA)的在硼-脯氨酸α-碳上确定立体化学的产物：

或者式(VII)的立体化学在吡咯烷-3-碳和硼-脯氨酸α-碳上确定立体化学的产物：

式(VII)化合物尤其可用作立体化学确定的已知的DPP-IV抑制剂即

式(XVI)化合物

或其药学上可接受的盐的直接前体，这公开于在2008年6月8日授权的美国专利No.7,317,109中。所述药学上可接受的盐可以是柠檬酸盐，或者可以是酒石酸盐，例如L-酒石酸盐，这公开于本发明人的未决PCT申请No.PCT/US2007/018629中。

式(III)的硼-脯氨酸反应物或其式(IX)的(R)-对映体可作为游离碱存在于偶联反应中，或者可以盐形式引入，例如作为式(X)化合物，其中R^a、R^b以及它们所键合的硼原子是环状(+)-蒎烷二醇硼酸二酯，并且Y是合适的反离子：

合适的反离子是阴离子，其在反应条件下是稳定和无反应活性的，并且不导致偶联反应中所用试剂的分解。卤化物(例如氯化物)是已知用于偶联反应的所示硼-脯氨酸铵离子的合适反离子的一个非限定性实例。

在适合形成酰胺键的条件下进行偶联反应。例如，可在羧基活化剂(例如可与羧基形成活化酯的羟基化合物)存在下进行偶联反应。更具体地，所述羧基活化剂可以是N-羟基化合物。一个具体实例是N-羟基苯并三唑。另一个实例是N-羟基琥珀酰亚胺。

可在脱水剂的存在下进行偶联反应。羧基和氨基的偶联得到作为副产物的水，因此脱水剂的存在可用于驱动反应完成。脱水剂还可起到导致形成活化酯的作用，所述活化酯由上文所述的活化酯中所用的羧基和羟基化合物形成。脱水剂的一个实例是碳二亚胺。具体实例是EDAC、N-乙基-N’-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐。碳二亚胺也可通过形成O-酰基异脲化合物来起到羧基活化剂的作用。

可在碱(例如有机碱)存在下进行偶联反应。一个实例是N-甲基吗啉。碱可起到清除硼-脯氨酸盐中质子的作用。

用于偶联反应的合适溶剂包括非羟基和非氨基有机溶剂，例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。

所述反应可以在任意合适的温度下进行，例如在约0℃-约5℃，例如在二氯甲烷中；或者在约15℃-约25℃，例如在二甲基甲酰胺中。在这些温度下可反应几个小时以完成反应。可利用本领域中众所周知的技术(例如高效液相色谱(HPLC))来监测反应进程。

式(II)或(V)的羧酸盐包括反离子M⁺。阳离子M⁺可以是金属离子或者取代或未取代的铵离子。例如，M⁺可以是钠离子。或者，M⁺可以是烷基取代的铵离子，例如二环己基铵离子。

在多个实施方案中，所述化合物或所述化合物组(例如用在本发明方法的那些)可以是上文所列举实施方案的任意组合和/或亚组合中的任意一种。

因此，本发明提供了式(II-Cbz-Na)化合物，其中M⁺是钠离子，两个BP基团均是Cbz：

其可用作制备DPP-IV抑制剂的合成中间体。本发明的该化合物包括具有所示结构的化合物的立体异构体、互变异构体、水合物和溶剂化物。本发明人所确定的化合物的结构得到分析数据包括元素分析和NMR谱的支持。对于分子式，计算值为C₂₂H₂₃N₂O₆Na.H₂O，理论值为C(58.40％)、H(5.53％)、N(6.19％)、Na(5.09％)。实测的元素组成百分率为C(58.17％)、H(4.91％)、N(6.00％)、Na(5.92％)。钠含量支持所述结构是钠盐而不是游离羧酸，虽然在某些实例中当通过本发明方法制备钠盐时可存在少量的最高达约20％的游离羧酸。残留的钠盐(例如氯化钠)可存在于本发明方法制备的晶体物质中，如下文所述，这解释了在上文分析中所检测到的稍高的钠含量。NMR谱也与所提出的结构一致。发现所分离的晶体形式是高度可溶于水的，符合钠盐结构。

式(II-Cbz-Na)化合物可在手性碳原子上具有(R)-构型，其中3-氨基与吡咯烷环键合。因此，本发明还提供了(R)-立体异构体，即式(V-Cbz-Na)化合物(其中两个PG基团均是Cbz，M⁺是钠离子)

以及制备该钠盐的(R)-立体异构体的方法。

本发明还提供了式(V-Cbz-Na)化合物的晶体形式，其中所述晶体形式可容易地在pH约5.5-6.5下利用有机溶剂从相应酯(其可以是甲酯)的碱水解反应混合物中萃取而回收。所述晶体形式已通过DSC(见图1)和X射线粉末衍射(XPD)(见图2)以及溶液质子NMR谱(见图3)进行了表征，其通常可以至少约70％的收率以及至少约90％的纯度而回收。DSC图显示在约178℃(所述物质的熔点)具有尖的吸热峰。XPD图包括选自具有以下近似值的极大2θ值：9.57、11.25、14.37、16.34、16.72、16.96、17.34、18.38、18.61、18.97、19.29、19.51、20.34、21.07、21.24、21.81、22.54、23.11、23.45、24.41、25.33、25.82、27.10、28.02以及29.97度。

晶体形式可包含少量的游离羧酸，例如约5-10％、或高达约20％的游离羧酸。所述晶体形式是以盐形式从皂化反应水相(其已经调节到pH约5.5-7.5)中萃取出来以后再以有机溶剂结晶而出乎意料地得到的。在所述pH下将所述盐形式萃取到有机溶剂中是意料不到的，因为羧酸盐是离子型化合物，通常被分配到水相中。从所述过程中回收晶体形式也是意料不到的，因为在其它实验中发现钾盐、铯盐和四甲基胍盐以及游离酸形式都是非晶体腊状固体或油，其不适于通过重结晶纯化并且难于大规模处理。就合成中间体而言，钠盐的晶体形式具有特别有利的性质，因为其可容易地纯化，例如通过结晶，并且晶体形式作为相对稳定、易于流动的粉末存在，而不是腊或油。当进行大规模合成DPP-IV抑制剂时这是有利的。

不希望受到理论的约束，认为将钠盐形式萃取到有机溶剂(例如二氯甲烷)中的发生至少部分归因于所述亲脂性羧酸钠盐的表面活性剂性质，使得二-Cbz-吡咯烷-3-基-甘氨酸钠盐可以胶束形式被萃取到有机溶剂中，除了有机羧酸盐以外，所述胶束还可包含水和氯化钠。浓缩萃取物，然后将残留物溶解在可溶解大量水的醚(例如MTBE、THF或乙醚)、醇(例如异丙醇)中，这导致二-Cbz-吡咯烷-3-基-甘氨酸钠盐从醚或醇溶液中结晶出来。

式(II)化合物的晶体形式可在手性碳原子上具有(R)-构型，其中3-氨基与吡咯烷环键合。当使用合适的手性原料时，通过本发明方法回收的晶体形式是式(V-Cbz-Na)的(R)-立体异构体。

式(V-Cbz-Na)化合物的晶体形式是以高收率得到的，并且容易纯化。因此，其适合用作用于医疗用途的DPP-IV抑制剂制备中的中间体并且是有利的，因为晶体形式容易纯化，因此得到纯度较高的最终药物物质，而且因为固体晶体物质与粘性油或腊状固体相比更容易大规模处理。

本发明的晶体形式可由氢氧化钠介导的羧酸甲酯(II-Cbz-E)或其立体化学纯的(R)形式(V-Cbz-E)皂化的反应混合物得到：

在碱条件下(例如在pH约13)之后，所述甲酯发生皂化形成式(II-Cbz-Na)的钠盐。出乎意料地，将反应混合物的pH调节到约5.5-7.5之后，可溶于水的式(II-Cbz-Na)化合物或立体化学纯的式(V-Cbz-Na)的(R)形式也可被萃取到二氯甲烷中。可利用约1-2N的盐酸调节pH。在对调节pH后的混合物进行首次萃取之后，可在随后进行有机萃取时调节pH以维持在约5.5-7.5的值。优选地，利用有机溶剂萃取pH为5.5-7.5的水溶液至少两次。

可通过蒸发而浓缩式(II-Cbz-Na)钠盐的有机(例如二氯甲烷)溶液。然后，将残留物加到醚中，例如可将残留物加到甲基叔丁基醚中。或者，可使用乙醚。可添加其它溶剂，例如THF或异丙醇。在加入醚或乙醇后的任意情形下，将混合物静置，由此发生结晶。可通过过滤或其它合适的技术回收晶体形式，然后干燥。按摩尔计，可得到收率为至少约70％的式(II-Cbz-Na)或式(V-Cbz-Na)的物质，其纯度适于进一步精制成DPP-IV抑制剂，如方案1所示。当通过本发明方法制备时，所分离的钠盐可含有最高约20wt％的游离羧酸，例如约5wt％或约10wt％的游离羧酸。该物质可不需要进一步纯化而直接用在本文所述的本发明偶联反应中。

因此，本发明提供了式(II-Cbz-Na)化合物的R-立体异构体，即式(V-Cbz-Na)化合物(其中M⁺是钠离子，两个PG基团均是Cbz)以及制备所述(R)-立体异构体的方法：

可如下进行化合物的全合成：将3-氨基吡咯烷的N(1)-Cbz衍生物的合适的立体异构体与羧甲基化试剂(例如溴乙酸甲酯)偶联，然后，例如利用氯甲酸苄酯将Cbz基团与环外氮偶联；然后进行酯皂化和结晶，如上文所述。

本发明的另一个实施方案提供了式(II-Cbz-DCHA)化合物，其中两个PG基团均是Cbz，M⁺是二环己基铵(DCHA)离子：

其可容易地以稳定的晶体形式被分离出来。在另一个实施方案中，提供了相应的(R)-对映体，即式(V-Cbz-DCHA)化合物：

其可容易地以稳定的晶体形式被分离出来。参照图4和5，分别显示了本发明晶体形式的式(V-Cbz-DCHA)化合物的差示扫描量热(DSC)图和X射线粉末衍射(XPD)图。DSC图显示在约156℃(所述物质的熔点)具有尖的吸热峰。XPD图包括具有选自以下近似极大值的极大2θ值：6.16、7.47、8.52、10.51、14.24、16.79、17.13、17.81、18.30、19.03、20.51、20.78、22.43、23.69、25.18、27.07和28.11度。

参照图6和7，提供了溶解在CDCl₃中的式(V-Cbz-DCHA)化合物的溶液NMR谱(分别是质子NMR和碳13NMR)，其中M⁺是二环己基铵离子。

在本发明的一个实施方案中，提供了制备式(V-Cbz-DCHA)化合物的方法。可利用游离酸与二环己基胺的有机溶液结晶来制备所述二环己基胺盐。例如，所述有机溶液可包含乙酸异丙酯。所述有机溶液还可包含四氢呋喃(THF)。通过本发明制备的DCHA盐可含有少量的游离羧酸，分离时通常存在约5％-约10％的游离酸。该物质可不需要进一步纯化而直接用于实施本发明的合成方法。

出乎意料地发现式(V-Cbz-DCHA)化合物的晶体形式高度稳定、易于处理且容易纯化。例如，未发现羧酸(V-Cbz-A)与其它胺(例如三乙胺或吗啉)形成的盐具有相当的稳定性或易于处理和纯化。

稳定的、晶体形式的化合物(V-Cbz-DCHA)在大规模制备此类的DPP-IV抑制剂(例如制备化合物(XIV-T))时尤其有利，因为化合物(V-Cbz-DCHA)的纯化、处理和分散相对容易。

在多个实施方案中，可将式(II)或(V)的盐用在合成式(XVI)的DPP-IV抑制剂的方法中，所述式(II)或(V)的盐例如式(II-Cbz-Na)的钠盐、其式(V-Cbz-Na)的(R)立体异构体或其晶体形式，或者式(II-Cbz-DCHA)的DCHA盐，其式(V-Cbz-DCHA)的(R)立体异构体或其晶体形式。盐或者盐的晶体形式可用在方案1所示的偶联反应中，其中保护的硼脯氨酸衍生物(X)或其盐的氨基可与羧酸盐在适于形成酰胺键的条件下偶联以提供式(XII)化合物，或其立体化学不完全确定形式的式(XI)化合物，其在吡咯烷的3-位具有两种手性形式。本发明方法的多个实施方案可利用多种保护基和反离子。产生化合物(XII)(或(XI))的偶联反应的条件可包括利用羧基活化剂，即可与羧基或羧酸根基团反应以提供活化形式(例如N-羟基化合物的酯)的试剂。例如，羧基活化剂可以是N-羟基苯并三唑。这些偶联条件还可包括利用脱水剂，即以能量有利的方式与水反应并且可起到驱动完成产生水作为副产物之反应(例如酰胺形成反应)的作用的试剂。例如，所述脱水剂可以是碳二亚胺，其可与水反应形成脲产物。更具体地，所述碳二亚胺可以是EDAC。所述偶联条件还可包括在反应混合物中存在碱。碱可起到清除偶联反应所产生的酸的作用，或将胺游离碱从其相应的盐形式中释放出来。所述偶联条件可包括存在合适的有机溶剂，例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺。合适的溶剂不与任意试剂在任何程度上以干扰所期望的酰胺产物形成的方式进行反应。

更具体地，偶联反应可在适于形成酰胺键的条件下利用式(X)的(+)-蒎烷二醇保护的硼-脯氨酸环状二酯的盐进行：

然后可将偶联产物(XI)或其3-(R)-立体化学纯形式的(XII)部分地去封闭，通过氢解除去两个N-Cbz基团，在立体化学纯的3-(R)-对映体的情形下，可通过结晶(例如用四氢呋喃)来任选地纯化氢解产物(XIV)。如下文所述，可通过在合成上将硼酸根部分去封闭，而将在吡咯烷3-位上具有两种手性构型的式(XIV)化合物或式(XIII)化合物进行部分去封闭，分别产生立体化学上确定的化合物(XVI)或化合物(XV)。

方案1

本发明的一些实施方案涉及式(XIV)化合物的晶体形式和纯化方法：

本发明的晶体形式(XIV)(称为2(R)-1-{2-[(3R)-吡咯烷基氨基]乙酰基}-吡咯烷-2-硼酸(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇酯)可通过利用四氢呋喃(THF)溶液的重结晶步骤进行纯化。由THF重结晶得到的产物可包含残留溶剂，甚至在真空干燥之后也是如此，并被认为是化合物(XIV)的晶体溶剂化物。认为晶体形式的纯度为至少约99％(残留溶剂除外)。晶体溶剂化物意指晶体形式，其中溶剂分子占据晶体晶胞中空间上确定的位置。

本发明的一个实施方案提供了晶体形式，其具有本文所述的光谱特征和物理性质。如图8所示，(XIV)晶体形式的CDCl₃溶液的质子核磁共振(NMR)谱显示所预期的共振，以及由残留THF的存在而造成的共振。图9显示通过由THF重结晶得到的(XIV)晶体形式的红外(IR)吸收光谱。在1620cm^-1附近观察到酰胺键的强的羰基带。图10显示所述晶体形式的差示扫描量热(DSC)图。在约157℃观察到强的单一吸热峰。图11显示由晶体形式得到的X射线粉末衍射图。在2θ值为约7、12、14、16、18和21°观察到强的散射峰。

本发明的一个实施方案提供了制备本发明晶体形式的方法。所述方法包括由四氢呋喃结晶产物的步骤。在所述实施例中，给出以下示例性方法用于粗物质的合成及其纯化：用THF进行结晶；提供本发明的晶体形式的化合物。

当将硼酸根保护成化合物(XII)或其手性形式即化合物(XI)的二酯或环状二酯时，然后可将所述分子完全去封闭，例如通过酸催化水解或酯交换作用。例如，当硼酸根封闭基团是环状蒎烷二醇二酯时，其可在苯基硼酸存在下除去，如方案2所示。最终产物可以L-酒石酸盐(XIV-T)形式分离和纯化。

方案2

根据本发明方法制备的完全去封闭的吡咯烷-3-基甘氨酰基-硼-脯氨酸(XVI)可用于治疗不良状况，或可被转化成稳定的盐例如柠檬酸盐或酒石酸盐(例如化合物(XVI-T))，然后用于治疗不良状况。

本发明的一个实施方案提供了治疗患者的不良状况的方法，其中所述不良状况可以是糖尿病或葡萄糖代谢障碍，或其中对DPP-IV的抑制是有医学上指征的，包括以足以向患者提供有益作用的剂量、频率以及时间来向患者施用式(XV)或(XVI)的化合物或其盐，其中式(XV)或(XVI)化合物或其盐是分别由式(II)或式(V)化合物或晶体形式制得的，或者根据本发明的方法制备的。

虽然为了本领域技术人员制备和使用已经足够详细地描述和举例说明了本发明，但是在不背离权利要求的精神和范围的情形下，多种替代、变动和改进对本领域技术人员而言是显而易见的。

实施例

缩写：

Cbz 苄氧羰基

EDAC N-乙基-N’-(3-(二甲基氨基)-丙基)碳二亚胺盐酸盐

HOBt N-羟基苯并三唑

MTBE 甲基叔丁醚，甲基叔丁基醚

NMM N-甲基吗啉

THF 四氢呋喃

h 小时

min 分钟

实施例1

将(R)-(+)-3-氨基-1-Cbz-吡咯烷盐酸盐(1.0kg)置于反应器中。将甲基叔丁基醚()置于所述反应器中，利用一部分甲基叔丁基醚冲洗(R)-(+)-3-氨基-1-Cbz-吡咯烷盐酸盐的加料系统，将冲洗液加入到反应器中。将预先通过将碳酸钾(2.6kg±1％)溶解在工业用水(5.0l±5％)中而制得的溶液加到所述反应混合物中，同时将温度维持在15-25℃。将混合物的温度冷却至10-0℃。将溴乙酸甲酯(

)加到反应器中，同时将温度维持在0-10℃。利用甲基叔丁基醚()冲洗溴乙酸甲酯的加料系统，将冲洗液加入到反应器中，同时将温度维持在0-10℃。在20-25℃的温度下加热混合物。在20-25℃的温度下搅拌混合物至少4小时，直到(R)-(+)-3-氨基-1-Cbz-吡咯烷盐酸盐的含量小于或等于通过HPLC检测的5％面积。直接将所述溶液用在下一反应中。

实施例2

将上述反应的混合物冷却至10-0℃。将氯甲酸苄酯(

)加到反应器中，同时将温度维持在0-14℃。利用甲基叔丁基醚(

)冲洗氯甲酸苄酯的加料系统，将冲洗液加入到反应器中，同时将温度维持在0-14℃。在20-25℃的温度下加热混合物。在20-25℃的温度下搅拌混合物至少1小时，直到原料含量小于或等于通过HPLC检测的1％面积。将工业用水(3.0l±5％)加到反应混合物中，将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少30分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。倒出水相(下面的相)弃掉。将工业用水(2.0l±5％)加到有机相中，将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少30分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。倒出水相(下面的相)弃掉。将预先用工业用水(1.5l±5％)稀释盐酸(

)而制得的溶液加到有机相中，同时将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少30分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。倒出水相(下面的相)弃掉。将预先用工业用水(1.5l±5％)稀释盐酸(

)而制得的溶液加到有机相中，同时将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少30分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。倒出水相(下面的相)弃掉。

实施例3

将之前通过利用工业用水(2.5l±5％)稀释氢氧化钠(20％w/w)(

)而得到的溶液加到有机相中，同时将温度维持在15-45℃。将混合物加热至回流温度并维持回流，直到原料的含量小于或等于通过HPLC检测的1％面积。将混合物冷却至25℃至15℃的温度。停止搅拌，分层至少30分钟。将下面的两相转移到接收器中。注：在此阶段有三相，产物在下面的两相中。倒出有机相(上面的相)弃掉。将甲基叔丁基醚()加到下面的两相中，同时将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少20分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。将下面的两相转移到接收器中。注：在此阶段有三相，产物在下面的两相中。倒出有机相(上面的相)弃掉。将甲基叔丁基醚()加到下面的两相中，同时将温度维持在15-25℃。在15-25℃的温度下搅拌至少20分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。将下面的两相转移到接收器中。注：在此阶段有三相，产物在下面的两相中。倒出有机相(上面的相)弃掉。将工业用水(4±5％l)加到有机相中，同时将温度维持在15-25℃。将工业用水(5±5％l)加到混合物中，同时将温度维持在15-25℃。将温度稳定在在20-25℃。利用2N的HCl调节pH至5.7-5.9之间。在20-25℃的温度下搅拌混合物至少15分钟。将二氯甲烷()加到水相中，同时将温度维持在20-25℃。在20-25℃的温度下搅拌混合物至少20分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。将有机相(下面的相)转移到接收器中。产物在有机相中。水相(上面的相)保留在反应器中。再次利用2N的HCl调节水相的pH至5.7-5.9。将二氯甲烷(

)加到水相中，同时将温度维持在20-25℃。在20-25℃的温度下搅拌至少20分钟。停止搅拌，分层至少30分钟。取水相样品用于HPLC分析。将有机相(下面的相)转移到接收器中，并与之前的有机相合并。注：产物在有机相中。倒出水相(上面的相)弃掉。在低于或等于25℃的温度下于真空下浓缩合并的有机相，直到残留物为11±5％(约2.3kg±5％)。将甲基叔丁基醚(

)加到混合物中。在60-70℃的温度下回流混合物以除去所有水。注：优选在65℃的温度下回流混合物，通常除去约1.2倍体积的水。

将THF(

)加到混合物中，同时将温度维持在低于或等于25℃。在60-70℃的温度下回流混合物1小时。在15-25℃的温度下冷却混悬液至少2小时。在15-20℃的温度下搅拌所述混悬液至少1小时。过滤混悬液。利用THF(

)清洗湿滤饼。在低于40℃的温度下于真空中干燥固体，直到得到5％(w/w)的卡尔费休(Karl Fischer)试验结果。

实施例4

式(II)化合物的分离-方法A

在利用NaOH水解相应的甲酯并用MTBE清洗有机层后将产物分离。浓缩混合物以除去残留的溶剂(T≤40℃)，利用2N的HCl调节pH至5.9。溶液用CH₂Cl₂萃取两次，在第一次萃取后将pH调节至相同的值。浓缩有机相得到残留物，加入MTBE。将混合物回流几小时以除去水，加入THF，将混合物在65℃回流1小时，冷却至室温，搅拌1小时，过滤沉淀。产物高度溶于水，用去离子水以1∶1的重量比溶解。其也溶于甲醇和乙醇，但是不溶于乙酸乙酯或甲苯。其在二氯甲烷中有一定的溶解。产率70％。DSC图和X射线粉末图分别显示在图1和2中。溶液质子NMR谱显示在图3中。

实测值：C(58.17％)，H(4.91％)，N(6.00％)，Na(5.92％)。

一水合物的理论值：C(58.40％)，H(5.53％)，N(6.19％)，Na(5.09％)。

实施例5

式(II)化合物的分离-方法B

在利用氢氧化钠水解甲酯并用MTBE清洗碱相(pH约13)后，利用1N的HCl溶液调节pH至约6。水相用CH₂Cl₂萃取，有机相用磷酸钠干燥。浓缩有机相得到残留物，用乙醚和异丙醇稀释所述残留物。5分钟后，加入THF，搅拌混合物约5分钟。停止搅拌，混合物放置过夜。第二天早晨观察到大的晶体，通过过滤将其回收。

实施例6

式(II)化合物钠盐与硼-脯氨酸酯(IV)的偶联

向盛有100mL二氯甲烷的500mL圆底烧瓶中加入13.8g硼-脯氨酸蒎烷二醇酯和7.8g 1-羟基苯并三唑。将溶液的温度维持在15-25℃，同时加入18.6mL N-甲基吗啉。然后，加入20g式(II)化合物在38mL二氯甲烷中的溶液，同时将反应温度维持在0-5℃，然后加入10.2g N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐在50mL二氯甲烷中的溶液。在0-5℃搅拌反应混合物4小时。然后在旋转蒸发仪上浓缩溶液，将残留物在262mL乙酸乙酯和111.4g 7％碳酸氢钠水溶液之间进行分配。在20-25℃搅拌20分钟后，使相分离10分钟，利用另外的53.6g 7％碳酸氢钠水溶液清洗有机相，然后利用7g柠檬酸在80mL水中的溶液进行清洗。分离有机相，在低于约35℃的温度和真空下在旋转蒸发仪上除去溶剂。然后将残留物溶解在140mL甲醇中，并转移到氢化瓶中，向其中加入1.6g 5％的钯碳。利用氢气吹洗6次后，将瓶在氢气下于28-30℃下振摇过夜。然后通过60g纤维素和34g硫酸钠过滤所述溶液，然后利用甲醇清洗。在约20-35℃的温度下于真空下将滤液浓缩至约40mL的体积。然后，加入158mL乙酸乙酯，再次在约20-35℃的温度下于真空下浓缩溶液，重复所述步骤得到18.28g(100％)产物，其中R^a和R^b与硼原子一起是环状蒎烷二醇硼酸二酯。

实施例7

向(R)-(+)-3-氨基-1-Cbz-吡咯烷盐酸盐(1.0kg)在MTBE(3.0kg)中的溶液中加入之前制备的碳酸钾(2.6kg)水溶液(5.0L)，同时将温度维持在15-25℃。然后将混合物冷却至10-0℃，然后将溴乙酸甲酯加到混合物中。然后将混合物温热至20-25℃，然后在此温度下搅拌约4小时。将反应混合物直接用于下一步中。

将氯甲酸苄酯(0.63kg)加到上述步骤的反应混合物中，同时将反应温度维持在0-14℃。然后将反应混合物温热至20-25℃，并搅拌至少1小时。然后，加水(3.0L)，将温度维持在15-25℃。然后在此温度下搅拌混合物至少30分钟。停止搅拌，使混合物静置至少30分钟。然后，弃掉水层(下层)，另外加入2.0L水。再次搅拌混合物至少30分钟，静置30分钟，弃掉水层(下层)。然后，加入盐酸(0.59kg＝0.51L)在水(1.5L)中的溶液，搅拌混合物30分钟，停止搅拌，使相分离，弃掉水层(下层)。重复此盐酸萃取1次。将反应混合物直接用于下一步中。

将之前制备的20％氢氧化钠(2.5kg＝2.1L)在水(9.5L)中的溶液加入到之前反应得到的反应混合物中，同时将温度维持在15-45℃。将混合物加热至回流30分钟，然后冷却至15-25℃。将反应混合物静置30分钟，发生相分离。分离出下面的相(水相)并保留，弃掉有机相(上面的相)。可存在明显的第三层，应将其与下面的相(水相)一起取出。利用MTBE清洗水相3次，每次2.0L，每次保留水层(下层)与任何明显的第三相(或乳液层)，同时弃掉有机层(上层)。将保留的溶液或混悬液直接用于下一步中。

将浓盐酸(1.2kg＝1.0L)加入到之前步骤得到的水相中，同时将温度维持在15-34℃。然后将温度稳定在15-25℃，加入乙酸异丙酯(7.0L)。然后利用浓盐酸(约0.3L)将水相的pH调节至约0.7-1.3，同时将温度维持在15-25℃。搅拌混合物30分钟，然后在15-25℃静置30分钟。分离出有机相(上面的相)并保留，必要时利用浓盐酸(约0.3L)将水相(下面的相)的pH调节至约0.7-1.3，再次利用乙酸异丙酯(7.0L)萃取，将混合物在15-25℃搅拌30分钟，并静置30分钟。再次分离出有机相(上面的相)，并与之前的有机相合并。通过HPLC检测乙酸异丙酯溶液中游离羧酸的浓度(C)，测定溶液的总重量(W)。利用另外的乙酸异丙酯将合并的有机相的体积调至18L，然后在搅拌下加入四氢呋喃(1.0L)和二环己基胺(0.615×C×W kg)。将混合物在25-35℃搅拌6小时，然后冷却至15-25℃，静置至少2小时。然后，过滤沉淀，利用预冷却的(15-25℃)乙酸异丙酯(0.8L)和四氢呋喃(0.2L)的混合物清洗滤饼，然后在低于35℃的温度下于真空下干燥，以提供基本上纯的1-Cbz-吡咯烷基-N-Cbz-甘氨酸二环己基铵盐。该DCHA盐的DSC扫描显示在图4中，X射线粉末衍射图显示在图5中，溶液质子NMR谱显示在图6中，溶液¹³C NMR谱显示在图7中。

实施例8

将1-Cbz-吡咯烷基-N-Cbz-甘氨酸二环己基铵盐(1.0kg，以游离酸计)、1-羟基苯并三唑(0.454kg)、蒎烷二醇保护的硼-脯氨酸(0.765kg)和N，N-二甲基甲酰胺(3.0L)于15-25℃下混合至少30分钟至均匀，然后加入EDAC(0.519kg)，然后加入N-甲基吗啉(0.912kg＝0.209L)，将反应温度始终维持在15-25℃。在相同温度下再搅拌4小时。然后，向反应混合物中加乙酸乙酯(7.0L)和去离子水(10.0L)，同时将反应温度维持在15-25℃。搅拌混合物20分钟，使相分离，排出水层(下层)并弃掉。再加入10.0L去离子水，重复萃取。然后，加入之前制备的碳酸氢钠(0.37kg)在去离子水(5.2L)中的溶液，在15-25℃搅拌混合物，使相分离，排出水相(下层)并弃掉。加入另一份在去离子水(2.5L)中的碳酸氢钠(0.18kg)溶液，搅拌混合物，使相分离，排出水相(下层)并弃掉。然后，加入之前制备的在去离子水(4.0L)中的柠檬酸(0.05kg)溶液，搅拌混合物10分钟，使相分离，排出水相(下层)并弃掉。利用去离子水(5.0L)清洗有机溶液。在35℃或更低的温度下于真空下浓缩有机相至最终体积为约1.7L。

在15-25℃的温度下利用甲醇(7.0L)稀释前述反应得到的浓缩溶液，然后加入钯碳(5％Pd，0.04kg)，搅拌混合物。然后在约3至约9巴(约45至约135psi)的压力下引入氢气，搅拌混合物直到起始原料的含量小于0.4％(GC分析)。通过置于0.45微米滤器上的纤维素(10.0kg)和无水硫酸钠(0.4-1.7kg)的床层过滤反应混合物，然后用甲醇(1.3L)清洗过滤床层。在不超过35℃的温度下于真空下浓缩甲醇溶液至最终体积为约2.0L。然后加入四氢呋喃(7.9L)，在不超过35℃的温度下于真空下浓缩溶液至最终体积为约2.0L。如果甲醇含量超过0.5％，则加入THF并反复蒸馏。然后，将溶液冷却至约-5℃至约-10℃，搅拌至少30分钟。通过过滤收集所沉淀的产物，利用冷THF(0.3L)清洗滤饼，然后在约40℃真空干燥约8小时。

在低于30℃的温度下将上述反应得到的产物(1.0kg，以干重计)和L-酒石酸(0.4kg)的水溶液(2.0L)混合30分钟，然后加入苯基硼酸(0.33kg)和MTBE(5.0L)。在15-25℃搅拌混合物2小时，然后停止搅拌，使相分离。排出有机层(上层)并弃掉。向水层中加入另外5.0LMTBE，搅拌混合物10分钟，然后使相分离15分钟。排出有机层，再重复MTBE萃取3次，每次用5.0L MTBE。然后，在约35-50℃的温度下于约0.1-0.2巴压力的真空下除去残留的溶剂。然后通过孔隙不大于0.22微米的绝对滤器(absolute filter)将水溶液加到喷雾干燥器中以提供吡咯烷-3-基甘氨酰基硼脯氨酸产物的酒石酸盐。

实施例9

化合物(XIV)的结晶

将化合物(XIV)(1.0kg)置于反应器中，然后加入21.4至24L的THF。在40-45℃加热混合物至少2小时以溶解固体。然后，在不超过45℃的温度下于真空下浓缩混合物直到化合物(XIV)的量达到4.2-4.5体积，然后将混合物冷却至18-20℃，搅拌至少2小时。过滤出沉淀的固体，利用预先冷却至18-22℃的THF(0.89kg)清洗滤饼。在不超过40℃的温度下于真空下干燥所述滤饼直到干燥失重小于2％(w/w)。认为产物的纯度为至少99％(所包含的THF除外)。

实施例10

化合物(XIV)向化合物(XVI)的转化

将纯度为至少99％的晶体形式的化合物(XIV)置于反应器中，然后加入酒石酸(0.4kg)和纯化水(2.0L)。在不超过30℃的温度下搅拌所得混合物至少1小时。然后，加入苯基硼酸(0.33kg)和MTBE(3.7kg)，在15-25℃下搅拌混合物至少2小时。通过HPLC分析所述混合物直到原料剩余量小于0.5％。然后，停止搅拌，使所述层分离至少15分钟，弃掉有机层(上层)。然后加入MTBE(3.7kg)，搅拌混合物10分钟，使相分离至少15分钟。弃掉有机层(上层)，利用MTBE反复萃取两次，在每个步骤中保留水层(下层)。过滤水溶液并于35-50℃下在-0.8至-0.9巴的真空下保持2小时以除去痕量溶剂。将溶液转移到冷冻干燥机的托盘或喷雾干燥机中，通过冷冻干燥或喷雾干燥除去水。得到酒石酸盐形式的化合物(XVI)。通过HPLC测定的纯度超过99％。

Claims

1.一种制备式(I)化合物的方法：

其中PG各自独立地是氮保护基，以及

R^a和R^b各自是羟基或其盐，或者是可转化成羟基或其盐的基团，或者R^a和R^b与它们所连接的硼原子一起形成可转化成B(OH)₂或其盐的环状结构；

所述方法包括：

使式(II)的羧酸盐

其中M是阳离子，

与式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(I)化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述式(I)化合物是式(IV)化合物：

所述方法包括：

使包含式(V)化合物的式(II)羧酸盐

与式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(IV)化合物。

3.权利要求1的方法，其中所述式(I)化合物是式(VII)化合物：

所述方法包括：

使包含式(V)化合物的式(II)羧酸盐

与包含式(IX)化合物的式(III)的受保护的硼-脯氨酸或其盐

在适于形成酰胺键的条件下相接触，以提供式(VII)化合物。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中PG是苄氧基羰基(Cbz)。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中M⁺是金属离子或者取代或未取代的铵离子。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中M⁺是钠离子或二环己基铵离子。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中R^a和R^b与它们所连接的硼原子一起形成可转化成B(OH)₂或其盐的环状结构。

8.权利要求7的方法，其中所述环状结构包括单萜二醇的环状硼酸二酯。

9.权利要求8的方法，其中所述环状结构包括蒎烷二醇的环状硼酸二酯。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述适于形成酰胺键的条件包括在有机溶剂中存在羧基活化剂和脱水剂。

11.权利要求10的方法，其中所述羧基活化剂包括N-羟基化合物。

12.权利要求11的方法，其中所述N-羟基化合物包括N-羟基苯并三唑。

13.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述脱水剂包括碳二亚胺。

14.权利要求13的方法，其中所述碳二亚胺包括N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)。

15.权利要求10-14中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括二氯甲烷或二甲基甲酰胺。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述适于形成酰胺键的条件包括存在有机碱。

17.权利要求16的方法，其中所述有机碱包括N-甲基吗啉。

18.权利要求1-3中任一项的方法，其中PG在每种情形下是苄氧基羰基(Cbz)，M⁺是钠离子，R^a和R^b以及它们所连接的硼原子一起形成蒎烷二醇硼酸二酯，所述适于形成酰胺键的条件包括在二氯甲烷中存在1-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉以及N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐。

19.权利要求18的方法，其中所述条件包括约0℃至约5℃的温度。

20.权利要求1-3中任一项的方法，其中PG在每情形下是苄氧基羰基(Cbz)，M⁺是二环己基铵离子，R^a和R^b以及它们所连接的硼原子一起形成蒎烷二醇硼酸二酯，所述适于形成酰胺键的条件包括在二甲基甲酰胺中存在1-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉以及N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐。

21.权利要求20的方法，其中所述条件包括约15℃至约25℃的温度。

22.包含式(II-Cbz-Na)化合物

的权利要求1的式(II)化合物，包括其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和水合物。

23.包含式(V-Cbz-Na)化合物

的权利要求2或3的式(V)化合物，包括其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和水合物。

24.权利要求22或23的化合物的晶体形式，包括其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和水合物，其特征在于基本上如图1所示的DSC，基本上如图2所示的X射线粉末衍射图以及基本上如图3所示的溶液质子NMR谱。

25.权利要求24的晶体形式，其(R)-构型的立体化学纯度为至少约80wt％，或至少约90wt％，或至少约95wt％，或至少约98wt％，或至少约99wt％。

26.权利要求22或23的化合物或者权利要求24或25的晶体形式，其是通过包括在pH约5.5-7.5的水性介质中利用不与水混溶的溶剂进行萃取的方法制备的。

27.权利要求22或23的化合物或者权利要求24或25的晶体形式，其差示扫描量热的吸热峰在约178℃，或者X射线粉末衍射的2θ极大值为约9.57、11.25、14.37、16.34、16.72、16.96、17.34、18.38、18.61、18.97、19.29、19.51、20.34、21.07、21.24、21.81、22.54、23.11、23.45、24.41、25.33、25.82、27.10、28.02以及29.97度，或者二者皆满足。

28.一种制备权利要求22或23的化合物或者权利要求24或25的晶体形式的方法，所述方法包括从水性皂化反应的不与水混溶有机溶剂的萃取物中回收所述化合物或所述晶体形式，所述水性皂化反应预先已将高pH调节至约5.5-7.5。

29.权利要求28的方法，其中所述约5.5-7.5的pH是约5.7至约5.9。

30.权利要求28的方法，其中所述水性皂化反应是下式酯的氢氧化钠皂化反应：

其中R包括低级烷基或芳基。

31.权利要求30的方法，其中R是甲基或乙基。

32.权利要求28的方法，其中所述萃取物是利用二氯甲烷得到的。

33.权利要求32的方法，其还包括除去二氯甲烷以提供残留物以及将醚加到所述残留物中。

34.权利要求33的方法，其中所述醚包括MTBE、THF或乙醚。

35.权利要求33或34的方法，其中式(II)的晶体形式是通过结晶从醚中回收的。

36.权利要求22或23的化合物或者权利要求24或25的晶体形式，或者通过权利要求28-35中任一项的方法制备的化合物，其还包含最高约20％的式(II-Cbz-A)的游离羧酸：

37.包含式(II-Cbz-DCHA)化合物

38.包含式(V-Cbz-DCHA)化合物

的权利要求2或3的式(V)化合物，包括其立体异构体，互变异构体、溶剂化物和水合物。

39.权利要求37或38的化合物的晶体形式，其特征在于基本上如图4所示的DSC曲线和基本上如图5所示的X射线粉末衍射图。

40.权利要求39的晶体形式，其(R)-构型的立体化学纯度为至少约80wt％，或至少约90wt％，或至少约95wt％，或至少约98wt％，或至少约99wt％。

41.权利要求37或38的化合物或者权利要求39或40的晶体形式，其特征在于基本上如图6所示的溶液质子NMR谱和基本上如图7所示的溶液碳-13NMR谱。

42.权利要求37或38的化合物或者权利要求39或40的晶体形式，其差示扫描量热的吸热峰在约156℃，或者X射线粉末衍射的2θ极大值为约6.16、7.47、8.52、10.51、14.24、16.79、17.13、17.81、18.30、19.03、20.51、20.78、22.43、23.69、25.18、27.07和28.11度，或者二者皆满足。

43.权利要求37或38的化合物或者权利要求39或40的晶体形式，其通过下述方法制备，所述方法包括使式(II-Cbz-A)的羧酸