CN101674730B - 用于治疗代谢疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及采用法图他汀A和/或其衍生物和/或类似物的一种或多种代谢疾病的治疗和/或预防。在其他方面，用于治疗和/或预防一种或多种代谢疾病的化合物采取A-B-C三部分结构，其中A、B和C是相同或不同结构，如本文详述。在具体方面，代谢疾病包括例如肥胖或糖尿病。

Description

用于治疗代谢疾病的组合物和方法
本申请要求2007年2月2日提交的美国临时专利申请第60/887,994号以及2007年12月7日提交的美国临时专利申请第61/012,310号的优先权，这两份申请的内容被纳入本文作为参考。
本发明获得国立卫生机构资助号GM-63115的联邦资助以及国防部资助号DAMD17-03-1-0228的资助。美国政府对本发明拥有某些权利。并且，本发明还获得Ibrahim El-Hefni技术培训基金会的资助。
发明领域
本发明一般涉及医药、细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域。具体说，本发明的领域涉及用于治疗代谢疾病(例如肥胖)的特定组合物。在某些方面，组合物包含法图他汀A(fatostatin A)及其类似物或衍生物的组合物。
发明背景
代谢综合征涉及许多心血管危险因子，包括高血压、血脂障碍、肥胖、2型糖尿病、胰β-细胞功能障碍和动脉粥样硬化。饮食中各种含量的脂肪或碳水化合物有利于动物(包括人)的能量代谢。长链脂肪酸是主要的能量来源和构成细胞膜的重要脂质成分。它们来源于食物，也可通过复杂的反应集合由乙酰辅酶A从头合成。胆固醇也来源于食物以及通过同样复杂的反应由乙酰辅酶A合成。碳水化合物通过脂肪酸和胆固醇的从头合成转化为酰基甘油酯分别涉及至少12种和23种酶反应。编码这些酶的基因的表达水平受到三种转录因子的控制，称为甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)，SREBP-1a、-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000)。这些膜结合蛋白质属于转录因子的基本螺旋-环-螺旋亮氨基酸拉链家族的类型(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000；Tontonoz等，1993)。和转录因子的其他亮氨基酸拉链成员不同，合成的SREBP为ER-膜结合前体形式，需要由两种结合高尔基体膜的蛋白酶(位点-1和位点-2蛋白酶)通过蛋白水解释放，以激活靶基因在细胞核中的转录(Brown和Goldstein，1997；Sakai等，1996)。
SREBP的蛋白水解激活受到甾醇的紧密调控，通过与SREBP裂解激活蛋白(SCAP)，一种SREBP的ER-膜结合护卫蛋白的相互作用来实现调控(Goldstein等，2006；Hua等，1996)。当甾醇在ER膜中蓄积时，SCAP/SREBP复合物没能离开ER到达高尔基体，因而SREBP的蛋白水解加工受到抑制。SREBP是控制脂肪代谢体内稳态的关键脂肪生成转录因子。
发明概述
本发明涉及一种或多种个体代谢疾病的治疗和/或预防，所述个体尤其是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛、山羊或绵羊等。具体说，本发明涉及向个体递送一种或多种组合物用于治疗，在特定实施方式中，组合物是法图他汀A和/或其类似物或衍生物。代谢疾病可以是任何类型，只要至少一种疾病症状可以用有效量的本发明化合物进行治疗和/或预防。
在本发明的某些方面，代谢综合征涉及许多心血管危险因子，包括高血压、血脂障碍、肥胖、2型糖尿病、胰β-细胞功能障碍和动脉粥样硬化。在本发明的其他方面，提供了内脏脂肪的治疗和/或预防，包括脂肪肝。脂肪酸和胆固醇来源于食物，或者由乙酰辅酶A通过复杂的反应集合从头合成，即，涉及碳水化合物转化为酰基甘油酯的脂肪生成过程。脂肪酸和胆固醇的磁体合成分别涉及至少12种和23种酶反应。编码这些酶的基因的表达水平受到三种转录因子的控制，称为甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)，SREBP-1a、-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osborne，2000)。这些膜结合蛋白质属于转录因子的基本螺旋-环-螺旋亮氨基酸拉链家族的类型。和转录因子的其他亮氨基酸拉链成员不同，合成的SREBP为ER-膜结合前体形式，需要由两种结合高尔基体膜的蛋白酶(位点-1和位点-2蛋白酶)通过蛋白水解释放，以激活靶基因在细胞核中的转录。
SREBP的蛋白水解激活受到甾醇的紧密调控，通过与SREBP裂解激活蛋白(SCAP)，一种SREBP的ER-膜结合护卫蛋白的相互作用来实现调控。当甾醇在ER膜中蓄积时，SCAP/SREBP复合物没能离开ER到达高尔基体，因而SREBP的蛋白水解加工受到抑制。合成的药物样噻唑衍生物在培养的哺乳动物细胞中导致两种独特的表型：3T3-L1小鼠成纤维细胞细胞中胰岛素诱导的脂肪形成的抑制；和DU145人前列腺癌细胞中血清非依赖性生长的阻抑。全合成的药物样噻唑衍生物(称为法图他汀A或125B11)在培养的哺乳动物细胞中引起两种独特的表型：DU145人前列腺癌细胞中血清非依赖性生长的阻抑和3T3-L1小鼠成纤维细胞细胞中胰岛素诱导的脂肪形成的抑制。催化长链脂肪酸从头合成的胰岛素导致的脂肪酸合酶(FAS)的诱导取决于FAS基因启动子上游的SREBP结合位点。
在具体的方面，提供了一种或多种小分子，它们能阻断3T3-L1细胞中胰岛素诱导的脂肪形成和前列腺癌细胞中IGF1诱导的细胞生长。机械学研究表明，这些分子能抑制SREBP的蛋白水解激活，从而抑制其定位到细胞核中。SREBP是控制人细胞中脂肪酸和甾醇生物合成的主转录因子，功能为介入的小分子可导致治疗许多代谢疾病(包括肥胖和高脂血症)的药物的开发。DNA微阵列分析显示，分子选择性降低SREBP-靶基因的表达数量，包括LDL受体和HMB-CoA还原酶。给予小鼠该分子能降低血中甘油三酯和胆固醇的水平而不影响食物摄取。在本发明的具体方面，本发明化合物是削弱SREBP途径的非天然合成分子。
在这里证实法图他汀A和示例性的类似物能选择性阻断SREBP的活化。法图他汀A被鉴定为SREBP的抑制剂解释了其需要从头合成细胞膜构成模块脂肪酸和胆固醇的血清非依赖性癌细胞生长的阻抑作用。
还显示法图他汀A在实验小鼠中阻断SREBP-1的活化。给予小鼠法图他汀A可导致体重减轻，成熟SREBP下调，结果脂肪生成酶、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和FAS的水平和活性降低。最后，在某些实施方式中，法图他汀可用于代谢疾病的药物介入，作为工具用于脂肪酸合成的控制和作用的进一步研究。
过去通过小有机分子的化学文库的表型筛选发现了法图他汀A。合成的药物样噻唑衍生物在培养的哺乳动物细胞中引起两种独特的表型：3T3-L1小鼠成纤维细胞细胞中抑制胰岛素诱导的脂肪形成；和DU145人前列腺癌细胞中血清非依赖性生长的阻抑。本文表明，法图他汀A能够选择性阻断SREBP的活化。法图他汀A被鉴定为SREBP的抑制剂与其抗脂肪生成特性一致，解释了其需要从头合成细胞膜构成模块脂肪酸和胆固醇的血清非依赖性癌细胞生长的阻抑作用。
在本发明的一个实施方式中，化合物选自下组：4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-异丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；其药学上可接受的盐；其立体异构体；以及它们的任意组合或混合物。在一个具体的实施方式中，化合物选自N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺或N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。在另一具体的实施方式中，进一步限定化合物包含在药学上可接受的赋形剂中。
在本发明的一个实施方式中，提供了治疗个体代谢疾病的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的至少一种具有以下通式的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体：A-B-C，式中A、B和C相同或不同，各自代表5-、6-或7-元环，所述环可以是杂环或非杂环、取代的环、或非取代的环，A、B和C中的任一个、任两个或所有三个都是未取代或具有一个或多个取代基，任何取代与任何其他取代之间可相同或不同，所述取代基选自下组：a)羟基；b)C1-10烷基；c)C2-10烯基；d)C2-10炔基；e)C3-6环烷基；f)芳基；g)杂芳基；其中所述b)、c)、d)、e)、f)和/或g)中的取代基任选地被1-5个选自下组的取代基所取代：1)羟基；2)(C＝O)Ra；3)(C＝O)ORa；4)(C＝O)H；5)(C＝O)OH；6)O(CH2)nCOORa，其合作n＝1-10；7)卤素；8)氰基；9)羧基；10)氨基；11)单取代的氨基；12)二取代的氨基；13)酰氨基；14)单取代的酰氨基；15)二取代的酰氨基；和16)它们的任意组合，在2)、3)或6)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；h)-(C＝O)Ra；i)(C＝O)ORa；j)(C＝O)H；k)(C＝O)OH；l)O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，在h)、i)或1)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；m)卤素；n)氰基；o)羧基；p)氨基；q)单取代的氨基；r)二取代的氨基；s)酰氨基；t)单取代的酰氨基；和u)二取代的酰氨基；其中所述单取代的氨基、二取代的氨基、单取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一个或多个具有选自下组的取代基：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、亚砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它们的任意组合，u)中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基任选地被1-5个选自下组的取代基所取代：i)羟基；ii)(C＝O)Ra；iii)(C＝O)ORa；iv)(C＝O)H；v)(C＝O)OH；vi)O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，在ii)、iii)或vi)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；vii)卤素；viii)氰基；ix)羧基；x)氨基；xi)单取代的氨基；xii)二取代的氨基；xiii)酰氨基；xiv)单取代的酰氨基；xv)二取代的酰氨基；和xvi)它们的任意组合。在一个具体的实施方式中，A被取代，包括1-5个原子的侧链，在另一具体的实施方式中，所述1-5个原子的侧链是1-5个碳原子的侧链。
在本发明另一实施方式中，至少一种化合物选自下组：2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；2-苯基-4-对甲苯基噻唑；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-异丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶；4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑；2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4′-甲基[1，1′-联苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸；2-乙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸甲酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯；N-环己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺酰基苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-喹啉磺酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-噻吩磺酰胺；和它们的任意组合。
在另一具体的实施方式中，至少一种化合物选自：4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-异丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；其药学上可接受的盐；其立体异构体；和它们的任意组合。
在另一具体的实施方式中，至少一种化合物选自：2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；其药学上可接受的盐；其立体异构体；和它们的任意组合。
在本发明的具体方面，所述代谢疾病是肥胖。在其他方面，代谢疾病选自肥胖、高脂血症、糖尿病、脂肪肝、高血压、前列腺癌和心血管病。
在具体实施方式中，向个体提供额外的治疗。在具体病例中，代谢疾病是肥胖，额外治疗包括选自下组的疗法：饮食疗法、物理疗法、行为疗法、外科手术、药物疗法以及它们的组合。在其他具体病例中，代谢疾病是糖尿病，额外治疗包括选自下组的疗法：饮食疗法、物理疗法和药物疗法。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种药盒，其包括至少一种本发明的化合物，所述化合物被装在合适的容器中。在特定实施方式中，药盒还包括用于代谢疾病的额外治疗。
在本发明的另一实施方式中，提供了抑制个体SREBP途径成员的方法，该方法包括向个体提供治疗有效量的至少一种本发明的化合物的步骤。在特定实施方式中，SREBP途径的成员是SREBP-1、SREBP-2或两者。
下面相当广泛地描述了本发明的特征和技术优势，目的是更好地理解下面的发明详述。本发明的其他特征和优势将在下面描述，构成本发明权利要求的主题。本领域技术人员应理解，所述概念和具体实施方式可容易地用作改进或设计用于实现本发明相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应理解，这些等价结构并不背离所附权利要求书所提出的本发明的精神和范围。结合附图，通过以下内容将更好地理解本发明的组织结构和操作方法中本发明特征性的新特征，以及其他目的和优势。然而应清楚地理解，每幅附图仅仅是阐述和说明的目的，不应解释为构成本发明的限制。
附图简要说明
为了更全面地理解本发明，现在将结合附图进行以下描述。
图1A-1C显示了RT-PCR微阵列结果的验证。(A)法图他汀A的结构。(B)用DMSO(道1)和5mM法图他汀A(道2)处理6小时的DU145细胞。然后提取总RNA进行RT-PCR。(C)RT-PCR和微阵列数据的总结。ACL，ATP柠檬酸裂解酶；HMG CoAR，3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA还原酶；LDLR，低密度脂蛋白受体，MVD，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶；SCD，硬脂酰辅酶A去饱和酶；INSIG1，胰岛素诱导基因1；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图2A-2C显示法图他汀A抑制内源性SREBP激活报道基因的能力。用SRE-1-驱动的荧光素酶报道分子(pSRE-Luc)(A)和肌动蛋白启动子控制下的β-gal报道分子(B)共转染HEK293细胞。在不含脂质的含血清培养基中用各种浓度的法图他汀A或仅用DMSO处理转染细胞。培育20小时后，测定荧光素酶活性，数据通过β-半乳糖苷酶活性标准化。(C)用pCMV-SREBP-1c(1-436)和pSRE-Luc转染HEK293细胞，在不含脂质的含血清培养基中用或不用20mM法图他汀A处理转染细胞。所有值代表三次独立实验的平均值。
图3A-3H显示了法图他汀A对SREBP-1和-2的作用。单用DMSO或用法图他汀A(1和5μM)处理DU145细胞6小时。Western印迹检查SREBP-1(A)或SREBP-2(B)的前体和成熟形式的水平。下侧的图代表肌动蛋白的Western印迹，作为加载对照。(C-H)免疫染色检查SREBP-1的单位。单用DMSO(C-E)或用5mM法图他汀A处理细胞(F-H)，然后用DAPI(C和F)或抗-SREBP-1(D和G)染色。
图4A-4G显示了通过敲减SREBP-1的siRNA可抑制胰岛素诱导的脂肪形成。建立敲减SREBP-1的表达的3T3-L1细胞的两个稳定转染的克隆，并诱导其分化形成脂肪细胞。敲减细胞不分化(D和F)，而用空白载体(neo)转染的3T3-L1细胞几乎全部分化形成脂肪细胞(B)。A、C和E显示不进行胰岛素诱导的细胞。(G)克隆的Western印迹分析表明成功敲减SREBP-1。
图5A-5B表明，敲减SREBP-1的siRNA可阻断DU145前列腺癌细胞的血清非依赖性生长。(A)建立SREBP-1表达被敲减的DU145细胞的两个稳定转染的克隆，在无血清、含2％胎牛血清(FBS)、含2％无脂肪胎牛血清、或含1μg/mL IGF1的MEM培养基中培育3天。WST-1试验测定生长速率。敲减细胞在无血清、含2％无脂肪FB或1μg/mL IGF1的MEM培养基中不生长，但在血清存在下和对照细胞一样生长。一式三份进行试验。(B)Western印迹表明，克隆1和2中SREBP-1敲减的程度。
图6A-6G显示禁食/重新给予无脂肪饮食后法图他汀A对小鼠的作用。整个试验期间，禁食48小时，然后再给予无脂肪饮食48小时，从前一天开始每天腹膜内注射给予小鼠30mg/kg法图他汀A。48小时摄食结束时测定体重减轻(A)和食物摄取(B)。(C)处理和对照小鼠的血清成分。(D)代表性的来自对照组和法图他汀处理组的2只不同小鼠的肝脏提取物中SREBP-1的Western印迹。蛋白质的加载量标准化。(E)表明FAS表达的代表性的Western印迹(上图)和肝脏提取物中考马斯染色凝胶的加载对照(下图)。(F和G)是肝脏提取物中的FAS和ACC活性。数据表示为均值+SD(n＝5)；*P＜0.05。
图7A-7E显示法图他汀处理两周对小鼠的作用。每天注射给予5-6个月龄的小鼠30mg/kg法图他汀A或10％DMSO，持续两周。(A)用法图他汀A处理之前和之后的体重。(B)处理后体重减轻的量。(C)处理和对照小鼠中葡萄糖、胆固醇和甘油三酯(TG)的血清水平。(D)肝脏提取物中的FAS活性。(E)代表性的来自对照组和处理组的三只小鼠的肝脏提取物的Western印迹分析。蛋白质的加载量标准化。数据表示为均值+SD(n＝5)；*P＜0.05。
图8A-8C显示了法图他汀A对体重和食物消耗的影响。每天腹膜内注射给予两组ob/ob雄性小鼠(n＝5)法图他汀A或10％DMSO(对照组)的PBS溶液，持续四周。小鼠用正常饲料饲养，实验第一天以及随后的每一天，测定小鼠重量和消耗的食物量。(8A)，代表性的对照和法图他汀A处理小鼠的图；(8B)，每天测定的各组内每只小鼠的重量；显示了重量均值和方差。(8C)，每天测定食物摄取，表示为28天内每只小鼠的累积摄食。
图9A-9H显示了对照和法图他汀A处理的ob/ob小鼠的血清成分。从禁食过夜的小鼠尾静脉取血，分离细胞后收集血清。根据材料和方法部分所述测定血成分。数据表示为均值±SD，每组5只小鼠。
图10A-10D显示了法图他汀对ob/ob小鼠的肝脏和脂肪组织的影响。(10A)A表示法图他汀A处理小鼠(左)和对照(右)的肝脏。(10B)用油红O(Oil-Red O)染色以检测脂肪滴和用迈尔(Mayer)苏木精反向染色的对照和法图他汀A处理ob/ob小鼠的肝脏冷冻切片的组织学分析。用法图他汀处理的三只不同小鼠的肝脏中染成红色的脂肪滴显著减少(上图)，与处理小鼠相比对照小鼠富含红色脂肪滴(下图)。(10C)从法图他汀A处理的ob/ob小鼠(左)和对照小鼠(右)分离的附睾脂肪垫。(10D)从ob/ob对照和法图他汀A处理小鼠分离的肝脏和附睾脂肪垫的平均重量。数据表示为均值±SD，每组5只小鼠(*P＜0.05)。
图11显示对照和法图他汀A处理的ob/ob小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平。从肝脏提取脂质，根据实施例示例性材料和方法部分中所述定量甘油三酯和胆固醇。数据表示为均值±SD，每组5只小鼠(*P＝0.0004； )。
图12A-12D表明法图他汀能降低脂肪生成酶的表达水平和活性。根据实施例示例性的材料和方法部分所述测定ob/ob小鼠肝脏提取物中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(12A)和脂肪酸合酶(12B)的活性。(12C)，通过4-12％NuPAGEMES凝胶分离，用不同抗体探测，用ECL检测(材料和方法部分)的三只单独的ob/ob小鼠的肝脏粗提物的Western印迹分析。(12D)，标准化为肌动蛋白后，法图他汀A与对照小鼠的不同脂肪生成酶的特定带的强度的比率。数据表示为均值±SD，每组5只小鼠( *P＜0.05)。
图13显示了相对于对照的法图他汀A处理ob/ob小鼠中肝脂肪生成酶的转录水平。每种基因的mRNA水平标准化为肌动蛋白。从对照和法图他汀A处理小鼠(n＝5)分离RNA，通过实时定量RT-PCR测定。相对于对照，P＜0.05。
图14显示了示例性的本发明化合物。
图15显示了示例性类似物2-18的标准荧光素酶报道基因试验。
图16显示了示例性类似物19-34的标准荧光素酶报道基因试验。
图17提供了示例性类似物35-44的标准荧光素酶报道基因试验。
图18a-18g显示了法图他汀如何阻断SREBP。(a)法图他汀的结构。(b)RT-PCR证实受影响基因的下调。用DMSO(道1)或5mM法图他汀(道2)处理DU145细胞6小时。然后提取总RNA并进行RT-PCR，测定ATP柠檬酸裂解酶(ACL)，3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoAR)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)，硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)，胰岛素诱导基因1(INSIG1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。(c)用法图他汀处理引起选定基因的下降。(d)在含无脂血清的培养基中法图他汀抑制内源性SREBP激活荧光素酶报道基因的能力。用SRE-1-驱动的荧光素酶报道分子(pSRE-Luc)转染CHO-K1细胞。在含有无脂质血清的培养基中，用各种浓度的法图他汀处理转染细胞。(e)在含有无脂质血清的培养基中，法图他汀对用pCMV-SREBP-1c(1-436)和pSRE-Luc共转染的CHO-K1细胞的作用。(f)转染的CHO-K1细胞中PLAP-BP2保持膜结合，直到高尔基体中S1P使其裂解并分泌到培养基中(左)。与EtOH对照相比，用法图他汀(20μM)或甾醇(10μg/mL胆固醇和1μg/mL 25-羟基胆固醇)处理实现PLAP-BP2的裂解。(g)用法图他汀处理的CHO-K1细胞的Western印迹分析。P和N分别表示SREBP-2的未切割膜前体和切割的核形式。
图19a-19c显示法图他汀能够阻断SREBP从ER易位到高尔基体。(a)Western印迹分析表明，布雷菲德菌素A对仅用EtOH、甾醇(10μg/ml胆固醇和1μg/ml 25-羟基胆固醇)或20μM法图他汀处理的CHO-K1细胞有影响。(b)SCAP含有免遭胰蛋白酶蛋白水解且能识别抗-SCAP IgG-9D5的糖基化的腔环(luminal loop)。当SCAP滞留在ER上时，环中两种寡糖对内切糖苷酶H敏感。当SCAP转运至高尔基体，糖变得耐受内切糖苷酶H的消化。(c)在有或没有20μM法图他汀或甾醇(10μg/mL胆固醇和1μg/mL 25-羟基胆固醇)存在下生长的细胞中抗-SCAP IgG-9D5的Western印迹分析。右侧数字表示蛋白酶-保护的SCAP片段上存在的N-连接糖链。
图20a-20d显示了(a)丹酰法图他汀和法图他汀-聚脯氨酸接头-生物素偶联物的结构。插入聚脯氨酸接头以使法图他汀分子更好延伸(Sato等，2007)。(b)用丹酰法图他汀和ER-追踪红处理的CHO-K1细胞，显示丹酰法图他汀在ER中的定位。比例尺＝10μm。(c)在CHO-K1膜提取物中，用结合于用生物素化法图他汀饱和的中性链亲和素(Neutravidine)-琼脂糖珠的蛋白质的抗-SCAP，抗-SREBP-1，抗-SREBP-2和抗-ATF6抗体，通过Western印迹分析测定，法图他汀与SCAP的相互作用。(d)对于竞争试验，将膜提取物与单独的EtOH、胆固醇或法图他汀进行预孵育。
图21a-21c显示了法图他汀对雄性ob/ob小鼠的体重、食物消耗和血成分的影响。表示为均值±SD(n＝5)。(a)表示对照和法图他汀处理小鼠。(b)28天处理后每只小鼠的重量和累积食物摄取。(c)对照和法图他汀处理小鼠的血成分。
图22a-22d显示了法图他汀对ob/ob小鼠的肝脏和脂肪组织的影响。(a)表示法图他汀处理和对照小鼠的肝脏。(b)法图他汀处理和对照小鼠的肝脏和附睾脂肪垫的重量(均值±SD，n＝5，*P＜0.05)。(c)法图他汀处理和对照小鼠的肝脏切片，显示了红色脂质滴。(d)法图他汀处理和对照小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平(均值±SD，n＝5，*p＝0.0004；)。
图23显示了法图他汀导致SREBP-效应基因表达减少的微阵列结果。用法图他汀或仅用DMSO处理DU145细胞，通过Affymetrix DNA微阵列分析提取的mRNA样品。在下调超过35％的63种基因中，34种与脂肪或甾醇合成直接相关。粉红色标记表示已报道受SREBP控制的18种基因，橘红色表示与脂肪或甾醇合成有关。
图24显示了用法图他汀处理的CHO-K1细胞的Western印迹分析。P和N分别表示SREBP-1的未切割膜前体和切割的核形式。
图25提供了法图他汀、丹酰法图他汀和法图他汀-聚脯氨酸接头-生物素的示例性合成方案。
图26显示了在含有无脂质血清的培养基中，法图他汀类似物抑制内源性SREBP激活荧光素酶报道基因的能力。用pSRE-Luc转染CHO-K1细胞。在含有无脂质血清的培养基中用各种浓度的法图他汀、丹酰法图他汀或异丙胺衍生物处理转染细胞。
图27提供了丹酰法图他汀或丹酰酰胺在ER中的定位。用5μM丹酰法图他汀或丹酰酰胺处理CHO-K1细胞，在共聚焦显微镜下观察。比例尺10μm。
图28a-28c显示法图他汀能降低脂肪生成酶的表达水平和活性。(a)测定ob/ob小鼠肝脏提取物中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶(FAS)的活性。(b)肝脏粗提物的Western印迹分析。(c)标准化为肌动蛋白后法图他汀和对照小鼠中不同脂肪生成酶的特定带的强度的比率。数据表示为均值±SD，每组5只小鼠( *P＜0.05)。
发明详述
如本说明书所用，“一”或“一个”可表示一个或多个。如权利要求书中所述，与术语“包含”联用时，“一”或“一个”可表示一个或不止一个。如本文所用，“另一”可表示至少第二或更多个。在特定实施方式中，本发明的各个方面可“基本上由本发明的一个或多个序列构成”或“由本发明的一个或多个序列构成”。本发明的一些实施方式可以由或基本上由本发明的一个或多个元素、方法步骤和/或方法构成。考虑本文所述的任何方法或组合物可以相对于本文所述的任何其他方法或组合物实现。
I.本发明的通用实施方式
用本发明化合物治疗和/或预防代谢疾病。例如，脂肪酸和胆固醇生物合成的失调以及饮食脂肪的过度摄取与许多医疗并发症有关，至少包括肥胖、糖尿病、高血压和心血管病，在某些方面这些疾病可用本发明的化合物治疗和/或预防。流行病学证据表明，包括肥胖在内的代谢疾病还能促进侵袭性形式前列腺癌的发展。
脂肪消耗时，甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)从膜蛋白水解释放并易位到细胞核内，它们在核内激活参与胆固醇和脂肪酸生物合成的基因的转录。本发明鉴定了过去已知能阻断脂肪形成和癌细胞生长的合成小分子作为SREBP激活的选择性抑制剂，也提供了该分子的类似物和衍生物。药物样分子法图他汀A削弱SREBP的蛋白水解激活，从而降低其效应基因在细胞内的转录。在小鼠中，法图他汀A阻断肝中SREBP-1的激活，减轻体重，降低血胆固醇和葡萄糖的水平，并下调脂肪生成酶。经过处理的小鼠的肝中脂肪酸合酶和乙酰辅酶A羧化酶活性及其表达水平降低。法图他汀A用作理解细胞途径的工具，在某些方面提供了一种通用分子至少作为代谢疾病药物介入的起点。
在特定实施方式中，调控代谢相关表型的小分子可用作剖析复杂相关因素的工具。法图他汀A在培养的哺乳动物细胞中导致两种独特的表型：3T3-L1小鼠成纤维细胞细胞中胰岛素诱导的脂肪形成完全被抑制；和DU145人前列腺癌细胞中不医疗血清的胰岛素样生长因子1(IGF1)-依赖性生长的选择性阻抑。
在本发明的某些方面，法图他汀A选择性阻断甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)的活化，SREBP是激活参与胆固醇和脂肪酸合成的特定基因的关键脂肪生成转录因子。法图他汀A被鉴定为SREBP的抑制剂与其抗脂肪形成性质一致，指明SREBP在前列腺癌的IGF1-依赖性生长中的作用。
本发明考虑法图他汀A用作阻断至少SREBP-1的活化的化合物，例如如实验小鼠中所示。给予肥胖ob/ob小鼠法图他汀A可导致体重减轻和内脏脂肪的显著减少。
II.代谢疾病
本发明考虑代谢疾病的至少一种症状的治疗和/或预防。代谢疾病可以是任何类型，只要用本发明的化合物能够改善或防止其症状之一。具体说，代谢疾病源自一种或多种先天性代谢缺陷(可称为遗传性障碍)，例如不完全代谢酶(例如具有一个或多个突变或无序的酶，包括调控蛋白和转运机制中的突变)引起的遗传性状。
通常，代谢疾病可定义为影响细胞能量产生的病症。虽然大多数代谢疾病是遗传性的，一些病症可能是一种或多种因素导致的获得性疾病，这些因素包括饮食、毒素、感染等。遗传性代谢疾病可能是遗传缺陷引起的，导致细胞代谢过程中的某一步骤所必需的酶的缺失或不当构建。最大类别的代谢疾病包括：1)糖原贮积病(也称为糖原病或糊精聚积病)，包括影响糖代谢的病症；2)脂肪氧化病症，影响脂肪代谢和脂肪组分的代谢；和3)线粒体病症，影响线粒体。糖原贮积病(GSD)至少包括I型GSD(葡萄糖-6-磷酸酶缺乏；冯吉尔克氏病(von Gierke′s disease))；II型GSD(酸性麦芽糖酶缺乏；蓬珀氏病)；III型GSD(糖原脱支酶缺乏；柯里氏病或弗碧氏病(Forbe′s disease))；IV型GSD(糖原分支酶缺乏；安德森病)；V型GSD(肌糖原磷酸化酶缺乏；麦卡德尔病)；VI型GSD(肝磷酸化酶缺乏，赫斯氏病)；VII型GSD(肌磷酸果糖激酶缺乏；塔里氏病)；IX型GSD(磷酸化酶激酶缺乏)；和XI型GSD(葡萄糖转运体缺乏；法-碧病(Fanconi-Bickel disease))。
在某些实施方式中，脂肪酸代谢缺乏可描述为脂肪氧化病或脂质贮积病。它们可涉及影响身体氧化脂肪酸以在肌肉、肝脏和其他细胞细胞内产生能量的酶缺乏所导致的一种或多种先天性代谢缺陷。脂肪酸代谢缺乏的例子至少包括：辅酶A脱氢酶缺乏；其他辅酶A酶缺乏；肉毒碱相关疾病；或脂质贮积病。辅酶A脱氢酶缺乏的例子至少包括：极长链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏(VLCAD)；长链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶缺乏(LCHAD)；中链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏(MCAD)；短链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏(SCAD)；和短链L-3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶缺乏(SCHAD)。其他辅酶A酶缺乏的例子至少包括：2，4-二烯酰辅酶A还原酶缺乏；3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA裂合酶缺乏；和丙二酸单酰辅酶A脱羧酶缺乏。肉毒碱相关缺乏的例子至少包括：原发性肉毒碱缺乏；肉毒碱-酰基肉毒碱转位酶缺乏；肉毒碱棕榈酰转移酶I缺乏(CPT)；和肉毒碱棕榈酰转移酶II缺乏(CPT)。脂质贮积病的例子包括酸性脂酶疾病；沃尔曼病；胆固醇酯沉积病；戈谢病；尼曼-皮克病；法布里病；法伯氏病(Farber’s disease)；神经节苷脂贮积病；克拉碧氏病(Krabbédisease)；和异染性脑白质营养不良。其他脂肪酸代谢疾病至少包括线粒体三功能性蛋白质缺乏；电子转移黄素蛋白(ETF)脱氢酶缺乏(GAII和MADD)；丹吉尔病；和妊娠急性脂肪肝。线粒体病的例子至少包括进行性外眼肌麻痹(PEO)；糖尿病和耳聋(DAD)；雷伯(Leber)遗传性视神经病(LHON)，线粒体脑肌病，乳酸性酸中毒和中风样综合征(MELAS)；肌阵挛性癫痫症和蓬毛样红纤维(MERRF)；雷氏综合征(Leigh syndrome)；亚急性硬化性脑病；神经病，共济失调，视网膜色素变性和下垂(NARP)；卡恩斯-塞尔综合征(KSS)；肌神经源性胃肠脑病(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy，MNGIE)。
在本发明的具体方面，代谢疾病是或者患有以下病症作为其并发症之一：肥胖、高脂血症、糖尿病、脂肪肝、高血压和心血管病。
III.本发明的示例性组合物
在一个实施方式中，提供了代谢疾病的治疗方法，该治疗方法包括给予具有以下通式的至少一种化合物，或其药学上可接受的盐和立体异构体：
A-B-C
其中A，B和C可相同或不同，各自可以是5-、6-或7-元环，所述环是杂环或非杂环，取代的环或非取代的环。
优选地，A环是具有一个杂原子的6元杂环。A环可被取代。在优选实施方式中，该环是吡啶环；更优选地，吡啶环的氮原子相对于B环位置在4位。最优选地，吡啶环的氮杂原子α位的碳上被正丙基取代。在其他优选的实施方式中，A环上存在1-5个原子的侧链，更优选地1-5个碳的侧链。在其他示例性且非限制性的实施方式中，A环可以是苯基、吡咯、噻吩、呋喃、嘧啶、异喹啉、喹啉、苯并呋喃、吲哚、噁唑或萘基。
优选地，B环是具有至少两个杂原子的5-元环。B环可被取代。在优选实施方式中，B环是噻唑环。在其他示例性且非限制性的实施方式中，B环可以是噁唑、咪唑、异噁唑、咪唑、噻吩、呋喃、嘧啶、吡唑或异噻唑。
优选地，C环是6-元环，最优选苯环。C环可被取代。在优选实施方式中，C环被甲基取代。在其他示例性且非限制性的实施方式中，C环可以是苯基、吡啶、吡咯、噻吩、呋喃、嘧啶、异喹啉、喹啉、苯并呋喃、吲哚、噁唑或萘基。
示例性的化合物如图14所示。参考图14的化合物1，正丙基取代的吡啶环对应于通式的A环，2，4-取代的噻唑环对应于通式的B环，甲基取代的苯环对应于通式的C环。
应理解，取代可以是A、B和C环中任何一个的任意位置，任何取代基可以与任何其他取代基相同或者不同。除了图14所示之外，取代基的非限制性例子包括下组：H(即，未取代)；羟基；C1-10烷基；C2-10烯基；C2-10炔基；C3-6环烷基；芳基；杂芳基；其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂芳基任选地被1-5个选自下组的基团所取代：羟基；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；O(CH2)nCOORa其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6环烷基；芳基；杂芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；单取代的氨基和二取代的氨基；单取代的酰氨基和二取代的酰氨基以及它们的任意组合；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；-O(CH2)nCOORa其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6环烷基，芳基或杂芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；酰氨基；单取代或二取代的氨基，具有选自下组的取代基：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、亚砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它们的任意组合；其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂芳基任选地被1-5个选自下组的取代基所取代：羟基，-(C＝O)Ra，-(C＝O)ORa，-(C＝O)H，-(C＝O)OH，-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6环烷基，芳基和杂芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；单取代或二取代的氨基，具有一个或多个C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基和它们的任意组合；以及单取代和二取代的酰氨基，具有选自下组的取代基：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、亚砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它们的任意组合；其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂芳基任选地被1-5个选自下组的取代基所取代：羟基；-(C＝O)Ra；-(C＝O)ORa；-(C＝O)H；-(C＝O)OH；-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基或C3-6环烷基、芳基或杂芳基；氟；氯；溴；碘；氰基；羧基；氨基；单取代和二取代的氨基，具有一个或多个C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基和它们的任意组合。
在具体实施方式中，提供了具有以下通式的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体：
A-B-C
其中A、B和C相同或不同，各自包括5-、6-或7-元环，所述环是杂环或非杂环，取代的环，或非取代的环，
所述A、B和C中的任一个、任六个或全部三个都未取代或具有一个或多个取代基，任何取代基可与任何其他取代基相同或不同，所述取代基选自下组：
a)羟基；
b)C1-10烷基；
c)C2-10烯基；
d)C2-10炔基；
e)C3-6环烷基；
f)芳基；
g)杂芳基；
所述b)、c)、d)、e)、f)、和/或g)中的取代基任选地被1-5个选自下组的取代基进一步取代：
1)羟基；
2)-(C＝O)Ra；
3)-(C＝O)ORa；
4)-(C＝O)H；
5)-(C＝O)OH；
6)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10；
7)卤素；
8)氰基；
9)羧基；
10)氨基；
11)单取代的氨基；
12)二取代的氨基；
13)酰氨基；
14)单取代的酰氨基；
15)二取代的酰氨基；和
16)它们的任意组合，
2)、3)或6)中Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；
h)-(C＝O)Ra；
i)-(C＝O)ORa；
j)-(C＝O)H；
k)-(C＝O)OH；
l)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
h)、i)或l)中，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；
m)卤素；
n)氰基；
o)羧基；
p)氨基；
q)单取代的氨基；
r)二取代的氨基，
s)酰氨基；
t)单取代的酰氨基；和
u)二取代的酰氨基；
其中所述单取代的氨基、二取代的氨基、单取代的酰氨基和二取代的酰氨基中的一个或多个具有选自下组的取代基：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、亚砜、砜、磺酸酯、烷基磺酸酯、磺酸和它们的任意组合，
u)中，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基任选地被1-5个选自下组的取代基进一步取代：
i)羟基；
ii)-(C＝O)Ra；
iii)-(C＝O)ORa；
iv)-(C＝O)H；
v)-(C＝O)OH；
vi)-O(CH2)nCOORa，其中n＝1-10，
ii)、iii)或vi)中，Ra是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-6环烷基、芳基或杂芳基；
vii)卤素；
viii)氰基；
ix)羧基；
x)氨基；
xi)单取代的氨基；
xii)二取代的氨基；
xiii)酰氨基；
xiv)单取代的酰氨基；
xv)二取代的酰氨基；和
xvi)它们的任意组合。
具体化合物的例子包括：2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸甲酯；2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙酸；4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑；4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸甲酯；4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶；2-苯基-4-对甲苯基噻唑；3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；2-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚；4-(4-溴苯基)-N-异丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酰胺；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶；4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑；2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶；4-(4′-甲基[1，1′-联苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸；2-乙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸；2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸甲酯；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯；N-环己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺酰基苯胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-喹啉磺酰胺；N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-噻吩磺酰胺。
优选的化合物是2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶；4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶，N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。
本文所用术语“烷基”表示从直链或支链无环饱和烃概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团(即-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-C(CH3)3等)。
本文所用术语“烯基”表示从含有至少一个碳-碳双键的直链或支链无环不饱和烃概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团(即-CH＝CH2、-CH＝CHCH3、-C＝C(CH3)2、-CH2CH＝CH2等)。
本文所用术语“炔基”表示从含有至少一个碳-碳三键的直链或支链无环不饱和烃概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团(即-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CCH(CH3)2、-CH2C≡CH等)。
本文所用术语“芳氧基”表示具有桥接氧原子的芳基，如苯氧基(-OC6H5)或苯甲酰氧基(-OCH2C6H5)。“芳基氨基”表示具有桥接胺官能团的芳基，例如-NHCH2C6H5。“芳基酰氨基”表示具有桥接酰胺基团的芳基，例如-(C＝O)NHCH2C6H5。
本文所用术语“亚烷基”表示从直链或直链无环饱和烃的同一碳原子概念性去除两个氢原子所得到的取代的二价基团(即＝CH2，＝CHCH3，＝C(CH3)2等)。
本文所用术语“环烷基”表示从饱和单环烃概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团(即，环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基)。
本文所用术语“芳基”表示从单环或双环芳族烃概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团。芳基的例子有苯基、茚基和萘基。
本文所用术语“杂芳基”表示从含有1、2、3或4个选自N、O或S的杂原子的单环或双环芳族环系统概念性去除一个氢原子所得到的取代的单价基团。杂芳基的例子包括但不限于：吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基，异噁唑基，噻唑基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，苯并咪唑基，吲哚基和嘌呤基。杂芳基取代基可连接于碳原子或通过杂原子连接。单环杂芳基的例子包括：吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、异噁噁唑基、噻唑基和吡啶基。双环杂芳基的例子包括：嘧啶基、吡嗪基、苯并咪唑基、吲哚基和嘌呤基。单个环可具有5或6个原子。因此，这包括4元单环杂芳基和5-元单环杂芳基。也包括具有一个5-元环和一个6-元环的双环杂芳基和具有2个6-元环的双环杂芳基。
术语“卤素”包括碘、溴、氯和氟。
术语“取代的”应理解为包括取代基的多重取代度。化学基团或部分上的原子价被除氢之外的原子或官能团满足时可发生取代。如果是多重取代，取代的化合物可被一个或多个所述或声称的取代基部分以单数或复数形式独立地取代。独立取代表示所述(两个或更多个)取代基可以相同或不同。
术语“药学上可接受的盐”表示具有母体化合物所需的药理学活性的药学上可接受的盐。这种盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代；或是与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等配位。
术语“立体异构体”表示原子连接性与一种或多种其他分子相同但原子空间排列不同的异构分子。该定义包括对映异构体、非对映异构体、顺式异构体、反式异构体、构象异构体。
术语“未取代”表示化学基团或部分上的所有原子价被氢饱和。
本发明还包括本文所述化合物受保护的衍生物。例如，当本发明的化合物包含诸如羟基或羰基的基团时，这基团可用适当的保护基进行保护。合适的保护基的综合列表参见T.W.Greene，《有机合成中的保护基》(ProtectiveGroups in Organic Synthesi)，约翰威利父子公司(John Wiley&Son，Inc.)1981，其内容被纳入本文作为参考。本发明化合物受保护的衍生物可通过本领域所熟知的方法进行制备。
本发明化合物可具有不对称中心，手性轴和手性平面，形成外消旋物、外消旋混合物和单独的非对映异构体，及其所有可能的异构体和混合物，包括光学异构体，都包括在本发明范围内。此外，本文所述的化合物可以互变异构体形式存在，两种互变异构体形式都涵盖在本发明的范围内，即时只描述了一致互变异构体的结构。
IV.SREBP
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的组合物靶向甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)途径的一种或多种成员。该途径涉及膜结合转录因子的蛋白水解释放，在具体方面，促进SREBP从胞浆向细胞核的转运。在细胞核中，SREBP与编码脂质制备相关酶的基因的调控区域中存在的甾醇调控元件(SRE)结合。SREBP与DNA结合后，调节靶基因的转录，例如上调。
内质网(ER)的膜和核被膜通过蛋白中间的两个跨膜螺旋容纳SREBP前体蛋白。膜中前体蛋白的发夹取向使得氨基端转录因子区和羧基端调控区都面向胞浆。蛋白裂解释放起效并释放转录的活性氨基端区域，前体蛋白的裂解在位点-1蛋白酶(S1P)和位点-2蛋白酶(S2P)进行。裂解蛋白的激活通过SREBP裂解激活蛋白(SCAP)进行，通过其各自的羧基端区域之间的相互作用与SREBP形成复合物。
SREBP三种不同的亚型(SREBP-1a、-1c和-2)在哺乳动物基因组的两个单独的SREBP基因中存在。SREBP-1a和-1c的区别在于其第一外显子，利用SREBP-1的不同转录起始位点。认为SREBP-1与脂肪酸合成的基因调节有关，而SREBP-2调节胆固醇代谢的基因。
一般，认为SREBP是含有甾醇调控元件(SRE)的靶基因的激活剂(Shimano 2001)。这些基因至少包括：1)脂肪酸代谢途径，例如乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合酶、硬酯酰辅酶A脱羧酶-1和2苹果酸酶、PPARγ、乙酰辅酶A合酶、ATP柠檬酸裂解酶、酰基-辅酶A结合蛋白；2)胆固醇合成，例如HMG-CoA还原酶、LDL受体、HMG-CoA合酶、法呢基-二磷酸合酶、角鲨烷合酶；3)甘油三酯合成，例如甘油-3磷酸酰基转移酶；和4)血浆脂蛋白代谢，例如脂蛋白脂肪酶和HDL受体。已报道，SREBP通过置换这些基因的特异性正调节剂可用作其他含SRE的基因的阻抑物(Shimano 2001)。这些基因，例如微粒体转移蛋白和小窝蛋白参与细胞胆固醇含量的调节。
V.药物制剂
本发明药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的有效量的一种或多种本发明组合物(适当时也包含其他试剂)。术语“药学上可接受的”表示适当给予动物(例如人)不会产生副作用、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本发明的内容，含有至少一种法图他汀A类似物或衍生物或其他活性成分的药物组合物的制剂是本领域技术人员已知的，参见雷明登药物科学(Remington′s Pharmaceutical Science)，第18版，马克印刷公司(MackPrinting Company)，1990，其内容被纳入本文作为参考。而且，对于动物(例如人)给药，应理解制剂应符合无菌性、致热原性、广泛安全性和纯度标准，如FDA生物标准所要求的那样。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员所知(参见例如，雷明登药物科学，第18版，马克印刷公司，1990，第1289-1329页，纳入本文作为参考)。只要排除任何与活性成分不相容的常规载体，其在药物组合物中的应用有待考虑。
根据是以固体、液体或是气溶胶形式给药，以及对于该给药途径(例如注射)是否需要灭菌，法图他汀A类似物或衍生物可包含不同类型的载体。本发明可以静脉内给药、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、肌内、皮下、粘膜、口服、外用、局部、吸入(如气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浴靶细胞、经导管、经灌洗、乳霜、液体组合物(如脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或上述方法的任意组合进行给药(参见例如，雷明登药物科学，第18版，马克印刷公司，1990，纳入本文作为参考)。
可将法图他汀A类似物或衍生物配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质性组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸，例如盐酸或磷酸，或有机酸，例如醋酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的盐。与游离羧基形成的盐可源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因。配制后，将溶液以与剂型相容的方式和治疗有效量进行给予。制剂可容易地以各种剂型进行给药，例如配制用于胃肠外给药，例如可注射溶液，或递送至肺的气溶胶，或配制用于消化给药，例如释药胶囊等。
进一步根据本发明，适用于给药的本发明组合物是以含或不含惰性稀释剂的药学上可接受的载体的形式提供。载体应可同化，包括液体、半固体(即糊剂)或固体载体。虽然任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者有害或者对本文所包含的组合物的治疗有效性有害，其用于实施本发明方法的给药组合物形式的应用是合适的。载体或稀释剂的离子包括：脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或它们的组合。组合物还可包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。此外，微生物的预防作用可通过防腐剂，例如各种抗菌剂和抗真菌剂实现，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合。
根据本发明，以任何常规和实施方式将组合物与载体组合，例如通过溶液、混悬液、乳化、混合、包封、吸收等方式。这些方法可本领域技术人员已知的。
在本发明的一个具体实施方式中，将组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以任何常规方式进行，例如研磨。混合过程中也可加入稳定剂以保护组合物避免治疗活性损失，即在胃中变性。组合物中可使用的稳定剂的例子包括：缓冲液、氨基酸如甘氨酸和赖氨酸、糖如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等。
在其他实施方式中，本发明考虑使用包含法图他汀A类似物或衍生物、一种或多种脂质和水性溶剂的药物脂质运载体组合物。如本文所用，术语“脂质”定义为包括在水中特征性不溶并且可用有机溶剂提取的广泛物质中的任一种。该广泛类型的化合物是本领域技术人员所熟知的，如术语“脂质”在这里所用，并不限于任何具体的结构。例子包括含有长链脂肪烃的化合物及其衍生物。脂质可以是天然产生的或合成的(即人为设计或制备)。然而，脂质通常是一种生物物质。生物脂质是本领域所熟知的，包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫脂(sulphatide)、含有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和聚合脂质、以及它们的组合。当然，本发明的组合物和方法也包括本领域技术人员所理解的除本文具体描述之外的化合物。
本领域普通技术人员熟悉用于将组合物分散到脂质运载体中的技术范围。例如，法图他汀A类似物或衍生物可分散到含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，共价结合于脂质，作为助悬剂包含在脂质中，用胶束或脂质体包封或复合，或者通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构结合。分散体可能导致或不导致脂质体的形成。
给予动物对象的本发明组合物的实际剂量可通过物理和生理学因素确定，例如体重、疾病严重性、治疗疾病的类型，过去或并行的治疗干预手段，对象特发性以及给药途径。根据给药剂量和途径，优选的剂量和/或有效量的给药次数可根据对象的响应而变化。在任何事件中，负责给药的人员将确定组合物中活性成分的浓度以及个体对象的适当剂量。
在某些实施方式中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方式中，活性化合物的含量可约为2-75重量％，或者约25-60重量％，以及其中的任意范围。当然，每个治疗有效组合物中活性化合物的量可制备成在化合物的任何给定单位剂量中可获得适当剂量。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品储存期等因素以及其他药理学考虑因素是制备这种药物制剂的领域中技术人员所考虑的，这样，需要各种剂量和治疗方案。
在其他非限制性的例子中，剂量也可以是每次给药约1微克/千克/体重、约5微克/千克/体重、约10微克/千克/体重、约50微克/千克/体重、约100微克/千克/体重、约200微克/千克/体重、约350微克/千克/体重、约500微克/千克/体重、约1毫克/千克/体重、约5毫克/千克/体重、约10毫克/千克/体重、约50毫克/千克/体重、约100毫克/千克/体重、约200毫克/千克/体重、约350毫克/千克/体重、约500毫克/千克/体重、到约1000毫克/千克/体重或更高，以及可推导出的任何范围。在从上述数字推导出的范围的非限制性例子中，基于上述数字，可给予约5毫克/千克/体重到约100毫克/千克/体重，约5微克/千克/体重到约500毫克/千克/体重等。
A.消化组合物和制剂
在本发明的优选实施方式中，可将法图他汀A类似物或衍生物配置成经消化途径给药。消化途径包括组合物与消化道直接接触的所有可能的给药途径。具体说，本文所述的药物组合物可口服、含服、经直肠或舌下给药。这样，这些组合物可用惰性稀释剂或用可同化的食用载体配制，或者它们可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可压制成片，或者它们可直接掺入饮食食物中。
在某些实施方式中，活性化合物可掺入赋形剂中，以可摄取片剂、口颊片、含片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、纸囊剂等形式使用(Mathiowitz等，1997；Hwang等，1998；美国专利5,641,515；5,580,579；和5,792,451，其内容各自被具体纳入本文作为参考)。片剂、含片、丸剂、胶囊等也可包含以下物质：粘合剂，例如黄芪树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃香料、橘子香料等。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，还可包含液体载体。各种其他材料可以包衣形式存在或改变剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶、糖或两者对片剂、丸剂或胶囊进行包衣。当剂量形式是胶囊时，除上述类型的材料外，还可包含载体如液体载体。可对明胶胶囊、片剂或丸剂进行肠包衣。肠包衣可防止组合物在pH为酸性的胃或肠道上部的变性。参见例如，美国专利5,629,001。到达小肠后，其中的碱性pH溶解包衣，使组合物释放并被特定细胞吸收，例如上皮肠细胞和派伊尔氏淋巴集结M细胞。酏剂糖浆剂可包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和丙酯作为防腐剂，染料和调味剂，例如樱桃或橘子香料。当然，制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应药学纯并且在所用剂量下基本上无毒。此外，活性化合物可掺入缓释制剂或配方中。
对于口服给药，本发明的组合物可任选地结合一种或多种赋形剂，形成漱口剂、牙膏、口颊片、口服喷雾剂、或舌下口服给药制剂。例如，将所需量的活性成分掺入合适的溶剂如硼酸钠溶液(多贝耳氏液)中制备漱口剂。或者，活性成分可掺入口服溶液如含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液中，或分散到牙膏中，或以治疗有效量加入包含水、粘合剂、磨料、调味剂、发泡剂和致湿剂的组合物中。或者，可将组合物配制成置于舌下或在口腔中溶解的片剂或溶液形式。
适用于其他消化给药模式的其他制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常含药，用于插入直肠。插入后，栓剂在腔液中软化、熔化或溶解。通常，对栓剂而言，传统的载体可包括例如，聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方式中，栓剂可由包含例如约0.5-10％，优选约1-2％活性成分的混合物形成。
B.胃肠外组合物和制剂
在其他实施方式中，法图他汀A类似物或衍生物可通过胃肠外途径给予。如本文所用，术语“胃肠外”包括绕过消化道的途径。具体说，本文所述药物组合物的给药途径包括但不限于：静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内。美国专利6,537,514，6,613,308，5,466,468，5,543,158；5,641,515；和5,399,363(各自的内容被纳入本文作为参考)。
可以在适当混入表面活性剂如羟丙基纤维素的水中制备游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在普通的存储和使用调节性，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适用于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体以及用无菌注射用溶液或分散体临用配制的无菌粉末(美国专利5,466,468，其内容被特别纳入本文作为参考)。在所用情况下，制剂必须无菌，并且必须是在一定程度上可流动以便于注射。它必须在制造和储存条件下稳定，必须能够对抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(即，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们合适的化合物、和/或植物油。例如，使用涂层如卵磷脂，对于分散体则通过维持所需的粒度，以及使用表面活性剂，可维持适当的流动性。防止微生物的作用可通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过使用延迟吸收试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于水性溶液的胃肠外给药，必要时溶液必须适当缓冲并用足够的盐水或葡萄糖先使液体稀释剂等渗。这些具体的水性溶液尤其施用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。在这方面，可使用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本发明的内容已知的。例如，可将一个剂量溶解在1毫升NaCl等渗溶液中，加入1000毫升皮下输液中，或者在所建议的适当输注部位进行注射(参见例如，″雷明登药物科学″，第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所需治疗的对象的状态，需要对剂量进行一些改变。在任何事件中，负责给药的人将绝决定个体对象的适当剂量。而且，对于人体给药，制剂应符合无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物标准所要求的那样。
无菌注射用溶液的制备包括：将所需量的活性化合物结合到适当溶剂中，需要时结合有上述各种其他成分，然后过滤除菌。通常，分散体的制备包括：将各种无菌活性成分结合到含有基本分散介质和上述所需的其他成分的无菌运载体中。对于制备无菌注射用溶液的无菌粉末，优选的制备方法是采用真空干燥和冻干技术形成活性剂加选自上述无菌过滤溶液的任何其他所需添加剂的粉末。粉末组合物与含有或不含稳定剂的液体载体，例如水或盐水溶液组合。
C.各种药物组合物和制剂
在本发明其他优选的实施方式中，可将活性化合物法图他汀A类似物或衍生物配制成经各种各样的途径给药，例如外用(即透皮)给药、粘膜给药(鼻内、阴道等)和/或吸入给药。
外用给予的药物组合物可包括配制成含药应用的活性化合物，例如软膏、糊剂、乳膏或粉末。软膏包括所有外用施加的油脂、吸附、乳剂和水溶性基质的组合物，而乳膏和洗剂是仅包含乳剂基质的组合物。外用给予的药物可包含渗透促进剂以利于活性成分经皮肤的吸收。合适地渗透促进剂包括：甘油，醇，烷基甲基亚砜，吡咯烷酮和月桂氮酮。外用施加的组合物的可能的基质包括：聚乙二醇，羊毛脂，冷霜和矿脂以及任何其他合适的吸收、乳剂或水溶性软膏基质。需要时，外用制剂可还包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂以保存活性成分并提供均一的混合物。本发明透皮给药也可包括采用“贴片”。例如，贴片可以在固定的时间范围内以预定的速率和连续方式提供一种或多种活性物质。
在某些实施方式中，药物组合物可通过滴眼剂、鼻腔喷雾剂、吸入剂和/或其他气溶胶递送运载体的形式递送。通过鼻腔气雾剂使组合物直接递送至肺的方法已在美国专利5,756,353和5,804,212中描述(各自的内容被纳入本文作为参考)。类似地，用鼻内微粒树胶(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利5,725,871，其内容被纳入本文作为参考)递送药物也是药学领域众所周知的。类似地，以聚四氟乙烯载体基质的形式经粘膜药物递送在美国专利5,780,045中描述(其内容被纳入本文作为参考)。
术语气溶胶指分散在液化或加压空气推进剂中的液体颗粒的细分固体的胶体系统。本发明用于吸入的典型的气溶胶包括活性成分在液体推进剂中或在液体推进剂和适当溶剂的混合物中的混悬剂。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器取决于推进剂的压力要求。气溶胶的给予将根据对象年龄、体重以及症状的严重性和反应而变化。
IV.组合疗法
为了提高本发明组合物的有效性，向患有代谢疾病的个体输送其他疗法。例如，可给予肥胖个体本发明组合物以及治疗肥胖的其他疗法。其他肥胖疗法包括：饮食疗法、物理疗法(运动)、药物疗法、手术、行为学疗法等。示例性的药物疗法包括例如：赛尼可(Xenical)、奥利司他(Orlistat))、苯丁胺和西布曲明(Meridia)。示例性的手术包括：吸脂和胃旁路术。
对于糖尿病患者，例如，示例性的其他治疗化合物包括以下一种或多种：奥克拓(Actos)(吡格列酮)；ACTOSPlus Met；阿美里尔(Amaryl)(格列美脲)；阿凡达里(Avandaryl)(文迪雅+格列美脲)；文迪雅(Avandia)(罗格列酮)；阿凡达美(Avandamet)(马来酸罗格列酮和盐酸二甲双胍)；拜他普(Byettap)；度他克(Duetact)(盐酸吡格列酮和格列美脲)；盖尔弗(Galvus)(维他里迪(Vildagliptin))；格列吡嗪(磺酰脲(Sulfonlyurea))；格华止(二甲双胍)；格列美脲；格鲁凡丝(Glucovance)(格列本脲/二甲双胍)；瑞易宁(Glucotrol XL)(格列吡嗪延迟释放)；格列本脲；格里塞(Glyset)(米格列醇)糖苷酶抑制剂；佳纽维亚(Januvia)(磷酸西塔里迪(sitagliptin phosphate))；麦塔里普(Metaglip)(格列吡嗪+二甲双胍)；二甲双胍-双胍；普拉迪(Prandin)(瑞格列奈)；普里考(Precose)(阿卡波糖)；瑞祖林(Rezulin)(曲格列酮)；斯塔里克(Starlix)(那格列奈)。其他糖尿病疗法包括改善饮食和运动。
V.示例性的代谢疾病治疗的测量
在本发明的具体方面，给予个体一种或多种本发明组合物，并评价个体至少一种代谢疾病症状的改善。例如，在代谢疾病是肥胖的具体实施方式中，确定用本发明一种或多种组合物治疗期间和/或治疗后肥胖的改善。肥胖的改善可通过任何标准方式进行测量，但在具体方面，通过体重测量、体重指数(BMI)测量、和/或身体局部尺寸测量(如腰围测量)等确定肥胖的改善。计算BMI的示例性方法包括：体重(千克)除以高度(米)的平方(体重[kg]高度[m]2)。认为BMI等于或大于30是肥胖，BMI在25到29.9之间为超重。
在本发明的其他方面，测定糖尿病患者在给予本发明疗法后的改善。在一个具体实施方式中，通过血试验来监测糖尿病。例如，血试验可测定化学物质A1C。血糖越高，A1C水平越高。美国糖尿病协会推荐糖尿病患者的A1C维持在7.0％以下以减少糖尿病相关并发症。(美国临床内分泌学协会推荐等于或小于6.5％)。
在一些情况下，例如通过本领域的标准方法，测定胆固醇(包括HDL和/或LDL胆固醇)和/或甘油三酯。在具体情况下，例如通过本领域的标准方法绘制禁食脂蛋白分布图。
VI.本发明的药盒
任何本文所述的组合物可包含在药盒中。在非限制性例子中，药盒包括适用于治疗和/或防止一种或多种代谢疾病的组合物。
在本发明的其它实施方式中，药盒包括一种或多种用于从对象取样的器械。该器械可以是拭子，例如棉花拭子、牙签、解剖刀、刮勺、注射器等器械中的一种或多种。
在另一实施方式中，药盒中包含其他化合物，例如用于治疗和/或防止代谢疾病的其他化合物。药盒中提供的任何组合物可以在水性介质中或以冻干形式包装。药盒的容器通常包括至少一种管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，可将组分置于其中，优选经适当等分。药盒中存在一种以上的组分时，通常药盒还包括第二、第三或其他容器，这些额外的组分可分别置于其中。
实施例
下面的实施例是为了阐述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，下面的实施例中描述的技术逮捕了本发明者发现的在本发明的实施中运行良好的技术，因而被认为构成其实施的优选模式。然而，根据本发明的内容，本领域技术人员应理解，可对所述具体实施方式进行许多改变，仍然获得类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
法图他汀A降低血清效应基因的表达
药物处理和未处理细胞的基因表达分布比较可揭示受法图他汀A影响的特定分子途径。用法图他汀A或仅DMSO处理DU145细胞，提取的mRNA
样品通过Affimetrix DNA微阵列进行分析，得到33,000种基因的图谱(表1)。
结果表明，被法图他汀A下调(＜0.7倍)的基因中55％是已知或很可能是由甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)控制的，包括LDL受体、HMG-CoA还原酶和脂肪酸合酶(Horton等，2003)。RT-PCR实验了证实代表性的SREBP-效应基因的下调(图1B和1C)。这些结果表明，法图他汀A是SREBP途径的选择性抑制剂。
为了说明法图他汀A削弱SREBP的功能，在存在或不存在法图他汀A时测定HEK293细胞中内源性SREBP激活SREBP-效应性报道基因的转录的能力(图2AB)。法图他汀A以浓度依赖性方式降低报道基因的激活，其中荧光素酶的表达受三个甾醇调控元件的重复单元的控制。相反，法图他汀A不能削弱SREBP-1的外源性表达成熟形式(氨基酸1-500)激活报道基因活性的能力(图2C)。这些结果表明，法图他汀A能选择性阻断细胞中SREBP的激活过程。
实施例2
法图他汀A阻断SREBP的蛋白水解激活
SREBP经蛋白水解加工而易位到核内，在核中激活脂肪生成基因的转录(Brown和Goldstein，1997)。为了鉴定法图他汀A是否影响SREBP的蛋白水解激活，用针对SREBP-1 NH2末端的抗体，通过Western印迹分析用法图他汀A处理的DU145细胞的全细胞裂解物(图3A)。法图他汀A能够以剂量依赖性方式降低SREBP-1的68KDa成熟形式的量，而125KDa前体形式的量增加。用针对COOH末端的抗体分析SREBP-2得到类似结果(图3B)。这些结果表明，法图他汀A能够直接或间接削弱两种SREBP同种型的蛋白水解激活。
抑制SREBP的蛋白水解激活作用可能损害SREBP的核易位。用针对SREBP-1 NH2末端的抗体，通过免疫荧光显微镜分析法图他汀A对SREBP-1亚细胞定位的影响。仅用DMSO处理细胞时，在无血清(无脂肪)培养基中，SREBP-1几乎排他性地定位在核中(图3C-3E)。相反，用法图他汀A处理细胞时，核中SREBP-1的免疫荧光降低而核外相应增加(图3F-3H)，表明法图他汀A能够抑制SREBP-1的核定位。
实施例3
通过敲减SREBP-1确认法图他汀表型
法图他汀A在培养细胞中导致两种表型：(i)3T3-L1细胞中胰岛素诱导的脂肪形成的抑制和(ii)DU145前列腺癌细胞血清非依赖性生长的阻抑(Choi等，2003)。第一种表型与我们得出的结论完全一致，即因为SREBP-1在脂肪形成中的已知作用，法图他汀A是SREBP-1的阻断剂(Tontonoz等，1993；Kim和Spiegelman，1996)。为了证实在细胞培养条件下，转染SREBP-1特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体导致3T3-L1细胞中SREBP-1表达的沉默(图4G)，检测对胰岛素诱导的脂肪形成的沉默作用。正如预期，敲减SREBP-1表达完全阻断了3T3-L1细胞中油滴的形成(图4D和4F，克隆1和2)，而用空白载体(neo)转染的对照细胞表现出与亲代3T3-L1细胞一样多的脂肪累积(图4B)。这些结果表明，3T3-L1细胞中法图他汀A-诱导表型是通过抑制SREBP-1介导的。
为了测试法图他汀A对SREBP-1的抑制是否介导DU145细胞中血清非依赖性生长的阻抑作用，类似地通过转染SREBP-1-特异性siRNA的表达载体使DU145细胞中SREBP-1表达沉默(图5B)。用空白载体(neo)转染的对照细胞在血清或IGF1的存在下生长，正如亲代DU145细胞那样。相反，SREBP-1表达沉默的敲减细胞(克隆1和2)表现为血清非依赖性IGF1-驱动的生长降低，而对其依赖血清的生长影响极少(图5A)。
血清非依赖性生长中对SREBP-1的需求可能是因为无血清培养基中外源性脂肪源的缺乏。当血清中不存在外源性脂肪酸时，细胞需要合成膜构建模块脂肪酸和胆固醇以维持细胞生长。为了测试脂肪酸在细胞生长中的重要性，监测无脂肪血清培养基中SREBP-1敲减细胞的生长(图5A)。SREBP-1沉默降低细胞在无脂肪培养基中的生长和无血清含IGF1-培养基中一样多。这些结果表明，法图他汀A通过抑制SREBP-1阻断癌细胞血清非依赖性生长。
实施例4
法图他汀A减轻小鼠体重、降低其胆固醇和葡萄糖水平并下调脂肪生成酶
法图他汀A类似药物的化学结构促使发明者探索其抑制完整动物肝脏中的SREBP-1的能力。检测了在长时间禁食(48小时)，然后再给予无脂肪高糖饮食48小时的脂肪生成条件下，法图他汀A对肝SREBP-1的作用。以30毫克/千克/天的剂量小鼠腹膜内注射法图他汀持续5天，从48小时禁食阶段的前一天开始。禁食48小时后，相对于对照组，处理组体重减轻更多(6.12±0.6克/小鼠，而对照组为4.9±0.3克/小鼠；p＝0.01)(图6A)。处理期间未观察到食物摄取减少或明显毒性(图6B)。有趣的是，重新给予无脂肪高糖饮食48小时后，法图他汀A-处理小鼠的血清中出现葡萄糖水平降低趋势(110±23mg/dl，而对照是137±14mg/dl；P＝0.06)和胆固醇(93±20mg/dl，而对照是120±19mg/dl；P＝0.12)(图6C)。处理组小鼠中HDL和LDL均降低。然而，LDL水平的降低似乎更显著(16±5，相对于30±6mg/dl)(图6C)。
通过Western印迹检测肝脏提取物中SREBP-1的表达水平。与细胞培养物的结果一致，用法图他汀A处理的小鼠肝脏提取物中SREBP-1的68KDa成熟形式的量降低，而125KDa前体形式的量增加(图6D)。处理后还测定脂肪酸合酶(FAS)的肝表达，其中脂肪酸合酶(FAS)是一种代表性的SREBP-1-响应性脂肪生成酶(Boizard等，1998)。肝脏提取物的Western印迹分析表明，法图他汀A处理导致FAS的表达水平降低最高达30％(图6E)。与表达减少相一致，提取物中的酶活性也相应地降低(图6F)。和FAS观察到的结果相同，肝脏提取物中也受到SREBP-1调控的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的活性降低(图6G)。这些结果表明，和培养细胞中一样，法图他汀A阻断了小鼠肝脏中SREBP-1的激活。
另一组正常饮食的小鼠较长时间的处理(2周)导致体重减轻10％，而对照组的体重无变化(图7AB)。两组间食物摄取类似(处理组和对照组分别为3.8和3.5g/小鼠/天)。与禁食/重新给予无脂肪饮食的小鼠中观察到的结果一致，正常饮食的小鼠的血中表现为显著较低的葡萄糖水平和较低甘油三酯(TG)和胆固醇水平的趋势(图7C)。FAS活性及其蛋白质水平也降低约30％(图7D和7E)。
实施例5
本发明的意义
已证明生物活性小分子是探索复杂细胞过程(包括代谢途径)的有价值工具。脂肪稳态和胰岛素作用的关键调控子是SREBP转录因子家族(Brown和Goldstein，1997)。发现调节SREBP功能的小分子可用于治疗代谢疾病，可用作进一步理解疾病分子机制的工具。我们基于细胞和动物的研究数据提示，法图他汀A通过下调核中成熟SREBP-1形式的量能够降低脂肪生成基因的表达。据本发明者所知，法图他汀A是能够在培养细胞和小鼠肝脏中抑制SREBP蛋白水解激活的第一种非甾醇样合成分子。
葛兰素史克(GlaxoSmithKline)的一个小组报道了能够激活SREBP-1和-2的小分子(Grand-Perret等，2001)。这些降低LDL的分子通过刺激SREBP的蛋白水解激活而上调LDL受体的表达。虽然作用的分子机制尚未完全明了，但数据提示SCAP是该分子的主要靶点。与这些分子不同，法图他汀A抑制SREBP的激活并下调SREBP-效应基因，包括LDL受体基因的表达(表1)。
似乎SREBP-1和-2的激活在体内受到不同的调控(Rader，2001；Sheng等，1995)。因此，在体内条件下，有可能开发选择性抑制SREBP-1或-2的小分子。不幸的是，因为目前没有适合免疫染色的针对人SREBP-2的NH2-末端片段的抗体，法图他汀A对SREBP-2核定位的影响的研究有限。虽然法图他汀A确定能阻断培养细胞和小鼠肝脏中SREBP-1的激活，关于对SREBP-2的影响的结论仍需进一步探索。
法图他汀A动物试验的数据与细胞培养结果一致。已报道，响应禁食后重新给予低脂高糖饮食，催化脂肪生成关键步骤的ACC和FA的mRNA增加(Liang等，2002)。ACC和FAS表达的增加取决于核SREBP，尤其是SREBP-1，而由单独基因编码的SREBP-2参与激活胆固醇生物合成中的基因。在重新给予无脂饮食的条件下，用法图他汀A处理的小鼠的肝脏提取物中，成熟SREBP-1形式的水平显著较低而其前体形式的水平较高(图6)。另一方面，正如预期，对照组的肝脏提取物中，成熟形式的水平高于前体形式(Horton等，1998)。有趣的是，两种形式的总量似乎无变化，唯一的差异在与核(成熟)和胞浆(前体)间的分布(图6)。这些数据表明，法图他汀A可能不改变SREBP-1的表达水平，而是提高前体切割过程，导致其量的降低以及成熟活性形式的增加。使用缺乏SCAP的小鼠进行实验已证明脂肪合成中SREBP-1切割的重要性：在重新饮食条件下，小鼠肝脏不能诱导ACC和FAS的表达(Liang等，2002)。
为了评价核SREBP-1水平降低的生理学意义，测定ACC和FAS的水平和活性。法图他汀A处理导致肝脏提取物中它们的活性发生下调(图6和7)。该结果与SREBP-1作为脂肪酸合成途径调节子的作用相一致(Shimano，2000)。Shimano等揭示，用高糖饮食饲养SREBP-1-/-小鼠时不能诱导FAS和ACC的水平(Shimano等，1997)，证实SREBP-1在调节脂肪生成酶的表达中的作用。
法图他汀A处理小鼠中的一种有趣发现是体重和血糖水平的降低(图6和7)。体重降低的一种可能性是因为脂肪生成酶如ACC和FAS下调导致的较低的脂肪生成速率。此外，作为ACC产物和肉毒碱棕榈酰转移酶的强效抑制剂，丙二酸单酰辅酶A的减少可导致脂肪酸氧化提高和脂肪燃烧。过去已揭示，Acc2-/-突变小鼠瘦小，并且肌肉、肝脏和脂肪中的脂肪酸氧化速率较高，血中葡萄糖水平较低(Abu-Elheiga等，2001；Abu-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。在本发明一个具体的实施方式中，法图他汀A抑制SREBP-1切割可下调脂肪生成酶，提高脂肪酸氧化，减轻体重和增加胰岛素敏感性而降低葡萄糖。
实施例6
实施例1-5中的示例性材料和方法
在本发明的实施例中，提供了以下示例性材料和方法。
材料：根据文献所述制备脂肪缺失的血清(Goldstein等，1983)。不含脂肪的FBS购自费氏公司(Fisher)。兔抗-SREBP-1(sc-8984)和羊抗-肌动蛋白(sc-1616)多克隆抗体购自桑塔克鲁茨生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。小鼠抗-SREBP-2多克隆抗体和小鼠抗-FAS抗体购自BD生物科学公司(BDBiosciences)。抗-羊IgG HRP和抗-兔IgG HRP购自普美加公司(Promega)。含DAPI的ProLong Gold抗退色反应试剂购自分子探针英吉检测技术公司(Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies)。抗-兔IgG FITC购自凯米康国际公司(Chemicon International)。地塞米松(DEX)和1-甲基-3-异丁基花黄素(MIX)购自西格玛公司(Sigma)。
法图他汀A的制备：搅拌的同时，将2-溴-4’-甲基苯乙酮(1.22g，5.70mmol)和丙硫异烟胺(1.03g，5.70mmol)在乙醇(20ml)中的混合物在70℃加热0.5小时，然后冷却至0℃。将形成的黄色沉淀过滤，用冷乙醇洗涤，干燥后得到黄色针状法图他汀A氢溴酸盐(1.78g，83％)：1H NMR(DMSO-d6，600MHz)δH 8.88(d，J＝6.2Hz，1H)，8.54(，1H)，8.46(d，J＝1.4Hz，1H)，8.36(dd，J＝1.4，6.2Hz，1H)，7.99(d，J＝7.6Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，2H)，3.03(t，J＝7.6Hz，2H)，2.35(s，3H)，1.80(m，2H)，0.96(t，J＝7.6，3H)；HRMS(FAB)精确质量C18H18N2S+H计算值m/z 295.1269，实测值m/z 295.1269。
细胞培养：DU145人雄激素非依赖性前列腺癌细胞(ATCC)在含有2mML-谷胺酰胺、1.0mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和1.5g/L碳酸氢钠、10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的伊格尔最少必需培养基中，37℃、5％CO2下进行培养。3T3-L1成纤维细胞(ATCC)在含有5.5mM葡萄糖、10％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素，0.5mM谷胺酰胺和0.5μg/mL两性霉素B的Dulbecco改进的Eagle培养基中，37℃进行培养。人胚肾293细胞(ATCC)在含有10％胎牛血清，100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中，37℃、5％CO2下进行培养。
寡核苷酸微阵列分析：在1μg/mL IGF1的存在下，在无血清培养基中，用5μM法图他汀A或仅用DMSO处理DU145前列腺癌细胞6小时，将总RNA提取到TRI反应试剂中(分子研究中心(Molecular Research Center))并通过RNeasy微量试剂盒(Mini Kit)(恰根公司(Qiagen))进一步分离。在医学微阵列核心实验室的拜尔学院(Baylor College of Medicine Microarray Core Facility)通过Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0分析纯化的mRNA。代表超过39,000种转录物的由大约45,000种探针组构成的阵列来源于大约33,000种已证实的人类基因(阿弗麦特有限公司(Affymetrix，Inc.))。
荧光素酶报道分子分析：第0天，将HEK293细胞以5x 103/孔的密度一式三份接种到96-孔板中，在含有10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中进行培养。第2天，采用脂转染试剂(Lipofectamine reagent)(英吉公司(Invitrogen))用以下质粒瞬时共转染细胞：0.4μg/孔 pSRE-Luc(一种SRE-1-驱动的荧光素酶报道分子构建物；Hua，X.，Sakai，J.，Ho，Y.K.，Goldstein，J.L.&Brown，M.S.1995 J Biol Chem 270，29422-7)和0.1μg/孔β-gal报道分子，其中β-gal的表达受到肌动蛋白启动子的控制，最终体积150μL。在37℃培养5小时后，用磷酸缓冲盐水洗涤细胞，然后在有或没有法图他汀A存在下，在含有10％无脂质血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的100μlDulbecco改进的Eagle培养基中进行培养。培养20小时后，用20μL of 1 x Reporter Lysis缓冲液(普美加)裂解各个孔中的细胞，用等分试样测定荧光素酶(10μL)和β-半乳糖苷酶(10μL)活性。对于荧光素酶的分析，在Wallac 1420 ARVOsx多标记计数器(PerkinElmer)中检测光子产生，以每秒计数表示。对于β-半乳糖苷酶的分析，37℃培养0.5小时后，通过微板读数仪(Tecan)在405nm波长处测定O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶的水平。由β-半乳糖苷酶的活性(OD单位)对荧光素酶活性(每秒计数)进行标准化处理。对于SREBP-1c的N-末端成熟形式的过度表达，用pSRE-Luc共转染pCMV-SREBP-1c(1-436)。pSRE-Luc和pCMV-SREBP-1c(1-436)由J.L.Goldstein和M.S.Brown提供(得克萨斯西南医学中心(University ofTexas Southwestern Medical Center)(Hua，X.，Sakai，J.，Ho，Y.K.，Goldstein，J.L.和Brown，M.S.1995 J BiolChem 270，29422-7)。
RT-PCR实验：从DU145细胞将总RNA提取到TRI反应试剂(分子研究中心)中并用RNeasy微量试剂盒(恰根公司)进行分离。采用Access RT-PCR系统(普美加)对RNA样品进行RT-PCR分析。RT-PCR反应液包含总RNA，1μM的各种引物，0.2mM dNTP，1mM MgSO4，AMV逆转录酶(2单位)和TflDNA聚合酶(2单位)，终体积25μL。所用引物对如下：对于低密度脂蛋白受体(LDLR)是5′-TCA GAC CGG GAC TGC TTG GAC GGC TCA GTC-3′(SEQ ID NO：1)和5′-CCA CTT AGG CAG TGG AAC TCG AAG GCC G-3′(SEQ ID NO：2)；对于硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是5′-GCC TGC TTGATA ATA TAT AAA C-3′(SEQ ID NO：3)和5′-CAC TTG AAT TGA GCT TTAG-3′(SEQ ID NO：4)；对于ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是5′-AAG AAA AAGTGT CAG ACA GCT GG-3′(SEQ ID NO：5)和5′-TGG ACT GAA GGG GTGTTA GC-3′(SEQ ID NO：6)；对于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCoA R)是5′-GCC CGA CAG TTC TGA ACT GGA ACA-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GAA CCT GAG ACC TCT CTG AAA GAG-3′(SEQ ID NO：8)；对于甲羟戊酸激酶(MVD)是5′-CTG CCT GAC TGC CTC AGC-3′(SEQ IDNO：9)和5′-ACC TCT CCT GAC ACC TGG G-3′(SEQ ID NO：10)；对于胰岛素诱导基因1(INSIG1)是5′-AAG ACT TCA GGG TAA GTC ATC A-3′(SEQ ID NO：11)和5′-CGT GTA TAA TGG TGT CTA TCA G-3′(SEQ IDNO：12)。扩增条件如下：在94℃1次循环持续4分钟，然后在94℃变性40秒，在50℃退火40秒，在68℃延长2分钟，对于SCD和HMG CoA R是22次循环，对于LDLR和INSIG1是在58℃退火并进行24次循环，或者对于ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是在60℃退火并进行24次循环，对于MVD是在55℃退火并进行30次循环。通过琼脂糖凝胶分析扩增的DNA并用Scion-image软件(版本4.02)进行定量。
Western印迹：将DU145前列腺癌细胞以2x 105个细胞/孔的密度接种到6-孔板中，在37℃无血清MEM中培养过夜。然后在IGF1(1μg/mL)的存在下，用DMSO或法图他汀A(1或5mM)处理细胞。培育6小时后，将细胞收集到PBS中并在SDS缓冲液中裂解。样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离并用兔抗-SREBP-1和抗-SREBP-2抗体印迹。用增强的化学发光(ECL)检测试剂(安玛西亚(Amersham))可观察到特定的带。
免疫荧光实验：将DU145前列腺癌细胞接种到盖玻片上，在无血清MEM中培养过夜，然后用含有IGF1(1μg/mL)的5μM法图他汀A或仅DMSO的无血清MEM处理细胞。培养6小时后，细胞在-20℃的甲醇中固定20分钟，在含有5％牛奶和0.1％吐温20的PBS中封闭1小时。样品与兔多克隆抗-SREBP-1(桑塔克鲁茨(Santa Cruz)：sc-8984)培育，然后与荧光素异硫氰酸酯-偶联的抗-兔IgG抗体(开米肯公司(Chemicon Inc))一起培育。采用适用于荧光检测的滤波片，以×400的放大倍数在尼康(Nikon)TE200荧光显微镜下观察盖玻片。
SREBP的siRNA敲减：将源自SREBP-1基因序列(512-531)的互补寡核苷酸，5′-GAT CCC CGC CAC ATT GAG CTC CTC TCT TCA AGA GAGAGA GGA GCT CAA TGT GGC TTT TTG GAAA-3′(SEQ ID NO：13)和5′-AGCTTT TCC AAA AAG CCA CAT TGA GCT CCT CTC TCT CTT GAA GGAGGA GCT CAA TGT GGC GGG-3′(SEQ ID NO：14)插入pSUPER载体(OligoEngine)中。用Fugene 6(罗氏(Roche))将所得质粒转染到3T3-L1或DU145细胞中。为构建稳定转染的克隆，使用浓度500μg/mL的新霉素-衍生物G418(基博科公司(Gibco))，构建稳定转化株。通过Western印迹评价SREBP-1的表达水平。对于脂肪形成实验，将3T3-L1细胞接种到96-孔板中，在含有10％胎牛血清的DMEM中再培养2天以实现完全汇合。第0天，将培养基转换成诱导培养基：含10％胎牛血清、5μg/mL胰岛素、0.5mM 1-甲基-3-异丁基花黄素(MIX)和1μM地塞米松(DEX)的DMEM。第2天，去除诱导培养，转换成含有10％胎牛血清和5μg/mL胰岛素的DMEM培养基。第10天，用油红O对脂肪油滴进行染色。对于细胞生长实验，将DU145细胞以2,000个细胞/孔的密度接种到96-孔板中，无血清、或含1μg/mL IGF1、2％无脂胎牛血清、或2％胎牛血清的MEM中进行培养。3天后通过WST-1试验评价细胞生长。该实验一式三份进行。
法图他汀A的动物实验：将雄性小鼠(129Sv背景)在拜尔医学院动物研究中心的受控条件下(12小时白天/晚上循环；25℃)进行饲养，小鼠可随意食用标准实验饲料(PM公司(Purina Mills))和水。根据美国国立卫生机构出版的实验动物的护理和使用指导(NIH出版编号85-23，1996年修订)进行动物实验。采用两种不同的方案对5-6个月的雄性小鼠(129Sv背景)腹膜内给予(30mg/kg；150mL)法图他汀A。第一终方案包括：小鼠禁食48小时，然后重新给予无脂饮食48小时。除SREBP外，该处理还能诱导脂肪生成酶如ACC和FAS的活性和水平。禁食前给予对照组(n＝5)法图他汀A或10％DMSO的PBS溶液并继续每天给予直到实验结束。
在第二种方案中，用30mg/kg法图他汀A或10％DMSO的PBS溶液每天处理两组雄性小鼠(n＝5)，持续2周。每天测定食物摄取和体重。在实验结束时，小时暂时禁食4-5小时，取血检测血清成分。然后处死小鼠，快速取其干燥并在液氮中研磨成粉末。将粉末化组织重新悬浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/mL蛋白酶抑制剂混合物(罗氏)的10ml PBS中，用Polytron(3x 30秒，高速)匀浆化，短时超声以降解DNA。在16,000xg离心20分钟分离提取物。然后用市售抗FAS和SREBP-1的抗体对样品进行Western印迹分析。如过去所述测定FAS和ACC活性。
实施例7
在肥胖OB/OB小鼠中法图他汀A防止脂肪肝、减轻高血糖症并诱导体重减轻
文献中已很好地记载了遗传修饰的小鼠模型的药物开发中的重要性和作用(Zambrowicz和Sand，2003)。在这些小鼠模型中，认为缺乏瘦激素的小鼠Lepob/Lepob是研究肥胖及其相关综合征如胰岛素耐性和脂肪肝疾病尤其有价值的模型(Ktorza等，1997)。纯合的ob/ob肥胖小鼠中体脂沉积增加、血糖过高、高胰岛素血症且生育力受损(Ingalis等，1950)。肥胖导致的结果之一代谢综合征涉及许多心血管风险因子，包括高血压、血脂障碍、2型糖尿病、胰β-细胞功能障碍和动脉粥样硬化(Moller和Kaufman，2005)。
虽然努力探索调节食物摄取和能量平衡的网络，肥胖如何导致这些疾病仍未完全了解。研究法图他汀A对雄性ob小鼠的作用，尤其是其通过减少白色脂肪粒以防止体重增加、防止糖尿病和脂肪肝的作用。如过去所述，法图他汀A通过抑制SREBP-1的作用，是转录主控制的抑制剂。用法图他汀A处理的正常小鼠体重减轻，并且葡萄糖和胆固醇水平较低。还发现，与对照相比，法图他汀A能减少处理小鼠肝脏中SREBP-1的活性成熟形式。
SREBP-1和-2在脂肪酸和胆固醇的生物合成中发挥相关但独特的作用。SREBP-1优先激活脂肪酸合成所需的基因，而SREBP-2有利于胆固醇产生。由于法图他汀A能阻断SREBP-1的激活并且可能阻断SREBP-2，在本发明的具体实施方式中，给予肥胖ob/ob小鼠法图他汀A能暂时调制脂肪酸和胆固醇的生物合成，揭示肥胖小鼠中感兴趣的表型。
法图他汀A对体重和食物摄取的影响
研究采用4-5周龄的雄性ob/ob小鼠，小鼠平均体重约23克。每天腹膜内给予法图他汀A(30毫克/千克/天)，测定体重和食物摄取。如图8A和8B所示，处理小鼠体重的增加显著低于对照组。在第一周处理结束时，给予DMSO的ob对照小鼠体重增加平均4.82克(从23.58±0.62到28.40±1.45)，而法图他汀处理组的体重增加约为3.37克(从23.08±1.53到26.45±1.2g/小鼠)，(p＝0.03)。用法图他汀A处理28天后，处理组体重比对照组低约12％(32.1±1.4相对于36.2±2.2g/小鼠)(P＝0.02)。两组间总的食物摄取类似(图8C)。平均来说，处理组和对照组的食物摄取没有显著性差异，分别为5.4±1.5和5.9±1.4g/小鼠。
法图他汀A对血中葡萄糖和脂质分布的影响
ob/ob小鼠中一种最独特的表型是胰岛素耐性病症所导致的高血糖症。为了测定法图他汀A对血中葡萄糖和脂质的影响，测定标准饮食饲养的ob/ob小鼠中的葡萄糖、甘油三酯和胆固醇的血清水平。
如图9所示，禁食过夜后，处理动物血清中的培养基水平比对照低约70％；分别为153.2±30.5和429.4±87mg/dl(P＝0.003)。处理动物血清中的葡萄糖水平与具有功能性ob基因的wt小鼠相当，而给予DMSO的对照小鼠正如预期血糖过高。有趣的是，与对照相比，处理动物中酮体(ketond bodies)(β-羟基丁酸酯)增加约7倍；分别为3.62±1.41和0.5±0.37mg/dl(P＝0.004)(图9)。法图他汀A动物中酮体的高水平说明肝脏中脂肪酸氧化显著增加，其中主要产物是分泌入血的酮体。并且，处理小鼠中增加的血成分是血清中测定的非酯化的游离脂肪酸(NEFA)，比对照高约70％；分别为1.93±0.26和0.7±0.2mEq/l(P＝0.028)(图9)。NEFA水平的增加可能是因为脂肪酸氧化需求提高导致的脂肪组织脂解作用增加。已知动物和人体中FFA与胰岛素耐性有关(Chalkley等，1998；Boden等，1994)。然而，虽然法图他汀A处理的ob/ob小鼠血清中FFA水平提高，但葡萄糖水平显著低于对照，表明胰岛素敏感性的改善，可能是因为胰岛素信号转导的改善。此外，近来发现，随着突变的乙酰辅酶A羧化酶小鼠(Acc2-/-突变小鼠)中脂肪酸氧化的增加，脂肪细胞脂解作用增加导致血中酮体较高且NEFA增加(Abu-Elheiga等，2001；Abue-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。与对照相比，处理小鼠血清中的甘油三酯(TG)水平提高约30％，分别为115±11和79±12(P＝0.006)，表明法图他汀A能提高肝脏TG的分泌和转移。总胆固醇的血清水平在法图他汀处理动物中表现为较低趋势，183±16相对于219±18mg/dl(P＝0.06)。然而，LDL显著降低约35％(31±3相对于48±8；P＝0.02)，HDL降低程度较小，约为22％(144±11和183±12；P＝0.02)。由于法图他汀A处理小鼠血清中LDL水平比HDL下降更多，表明用法图他汀A处理的小鼠获得所需的结果。基于TG水平计算，转运甘油三酯、磷脂和胆固醇的VLDL的水平增加约50％(23.1±2.3相对于15.8±2.4mg/dl)。
法图他汀A减小附睾脂肪大小并改善脂肪肝
由于不受控制的食物摄取，ob/ob小鼠变成病态肥胖，脂肪组织和其他器官如肝中蓄积了过高的脂肪水平，导致非酒精性脂肪肝疾病和胰岛素耐性(Hookman和Barkin，2003)。约8-9周龄时，与用法图他汀A处理组相比，对照未处理小鼠的肝脏尺寸变大且脂肪蓄积，从其苍白颜色可见(图10A)。法图他汀A处理小鼠肝脏的平均重量比对照组小约32％(1.59±0.2相对于2.34±0.15；P＝0.06)(图10D)。用脂滴油红染色的对照小鼠肝脏切片显示包含丰富的脂滴，而法图他汀A处理小鼠没有脂滴，脂滴主要是甘油三酯(图10B)。已表明，过度表达SREBP 1的转基因小鼠发生脂肪肝(Horton等，2003)。然而，在缺乏SREBP-1的ob/ob小鼠(lepob/ob X Srebp 1-/-)中，脂肪肝得到小鼠改善，提示SREBP 1是导致ob/ob小鼠脂肪肝的主要作用因素(Yahagi等，2002)。
如上所述，法图他汀A处理4周结束时，处理小鼠体重比对照轻。通过测定作为主要白色脂肪组织的附睾脂肪垫发现，法图他汀A处理小鼠的脂肪垫显著较小(图10C)。脂肪垫的平均重量比对照小约20％(2.7±0.1相对于3.6±0.2；P＝0.02)(图10D)。脂肪垫较小可能是因为脂质储量减少和/或脂肪生成减少和脂肪组织中的脂肪酸氧化增加。过去对Acc2-/-突变小鼠的研究表明，缺乏ACC2也可导致肝脏中脂肪减少、附睾脂肪垫减小并且包括肝脏在内的不同组织中脂肪酸氧化增加(Abu-Elheiga等，2001；Abu-Elheiga等，2003；Oh等，2005)。在这里指出，由于缺乏ACC2-产生的丙二酸单酰辅酶A对肉毒碱棕榈酰转移酶的抑制，脂肪酸氧化增加，小鼠变得高度胰岛素敏感并避免饮食诱导的肥胖和糖尿病。在具体的方面，法图他汀A下调ACC酶能增加脂肪酸氧化并抑制不同组织如肝脏、脂肪组织和肌肉中的脂肪酸合成。测定法图他汀A储量的ob/ob小鼠肝脏中的TG和胆固醇水平并与ob/b对照进行比较。如图11所示，处理小鼠肝脏中的TG水平下降约65％(分别为14.8±3.7和38.7±6.0毫克/克肝脏；P＝0.0004)。法图他汀A还能使肝脏中的胆固醇水平下降超过20％(2.8±0.5和3.6±0.1；P＝0.03)(图11)。这些结果进一步证实了油红O染色，表明部分地由肝脂肪生成增加引起的ob/ob小鼠脂肪肝可通过法图他汀A治疗完全防止。在本发明的具体方面，处理的ob/ob小鼠肝脏中这些脂质的下降是因为合成TG和胆固醇或其前体所需的脂肪生成酶的显著抑制。此外，由于不同小鼠组织(包括肝脏)中脂肪酸氧化需求的提高，脂肪酶肝脏活性提高，并且还促进脂质从肝脏转移到循环中，由各种脂肪酸氧化组织如心脏和肌肉利用。在具体的方面，与法图他汀A处理的ob/ob小鼠血中较高水平的TG有关。
法图他汀A下调ob/b小鼠肝脏中的脂肪生成酶
脂肪生成途径中的酶受到转录因子如PPAR和SREBP的调节。测定处理的ob/ob小鼠中法图他汀A对脂肪生成酶水平和活性的影响。测定执行脂肪酸合成限速步骤的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的活性。ACC催化乙酰辅酶A的羧化而产生丙二酸单酰辅酶A，即脂肪酸合成中的构建模块，而脂肪酸的合成由另一种多功能酶脂肪酸合酶(FAS)执行。丙二酸单酰辅酶A除了在脂肪酸合成的作用之外，还能抑制肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT 1)而在脂肪酸氧化中发挥重要作用。ob/ob小鼠中脂肪生成酶得到显著诱导，部分地解释了这些小鼠的病态肥胖表型。法图他汀A处理小鼠肝脏提取物中ACC的活性下降约40％(3.44±0.44相对于5.55±0.57纳摩尔/分钟.毫克)(图12A)。法图他汀A处理ob/ob小鼠肝脏提取物中的脂肪酸合酶活性也显著下调。处理小鼠中FAS活性下降超过70％(8.64±1.91相对于22.6±1.37纳摩尔/分钟.毫克)(图12B)。ACC和FAS活性的下降是由于两种酶表达水平的下降，如两种酶的Western印迹分析所示(图12C)。法图他汀处理ob/ob小鼠肝脏中的产物脂肪酸C14:0和C16:0明显较少，相对于未处理对照小鼠约为50％(见表2)。
ACC受到磷酸化/去磷酸化机制的急剧调节，分别导致酶的抑制和活化。如图12C所示，对照组中磷酸-ACC的水平较高，但因为ACC的表达水平也较高且升高程度相同，说明法图他汀A没有改变特定的磷酸化水平(P-ACC/ACC蛋白质)。这些结果表明，ACC活性的下调仅仅是因为酶水平下降，而不是磷酸化状态的下降(图12C)。过去表明，肝脏中存在两种ACC同种型；ACC1(肝脏中的主要同种型)和ACC2(肌肉中的主要同种型)，颓靡在调节脂质合成和氧化中分别发挥独特功能(Abu-Elheiga等，2001，Abu-Elheiga等，1997；Abu-Elheiga等，2000；Abu-Elheiga等，1995)。ACC和FAS活性的下降表明脂肪生成减少，而法图他汀A处理小鼠肝脏中脂肪燃烧显著提高，这与法图他汀A处理ob/ob小鼠中酮体增加7倍一致，如图9所示。测定脂肪酸代谢中两种关键酶的水平，这两种酶也受到SREBP-1、ATP柠檬酸裂解酶(ACL)和硬脂酸辅酶A去饱和酶1(SCD1)的转录调控。法图他汀A处理小鼠肝脏提取物中使胞浆柠檬酸盐转化为乙酰辅酶A的ACL的蛋白质水平下降约70％。脂肪生成组织如肝脏中ACL水平的这种下调被法图他汀A对脂肪生成过程中降低的影响进一步扩大。SCD1催化单不饱和脂肪酸生物合成中的限速步骤，通过在脂肪酰基辅酶A如棕榈酰-CoA和硬脂酰辅酶A的Δ9位引入顺式双键。产物棕榈油酰辅酶A(16:1)和油酰辅酶A(18:1)是甘油三酯和胆固醇酯的重要成分，包括ob/ob小鼠在内的小鼠SCD1的删除导致代谢速率增加，肥胖减轻，防止脂肪肝并避免饮食对糖尿病的诱导作用(Cohen等，2002；Ntambi等，2002；Miyazaki等，2000)。如图12C所示，与对照相比，法图他汀A处理小鼠肝脏提取物中SCD1的蛋白质水平下降约50％。这可通过以下结果证实：单不饱和脂肪酸C16:1、C18:1和C20:1下降约70％以及其延长产物(C18:2)N-6、(C18:3)N-6、(C20:2)N-6和(C20-3)N-6的变性减少约50％(见表2)。这种对SCD1的减少的影响是体重减轻的重要因素，在本发明的具体实施方式中，降低肝脏中的TG水平并避免脂肪酸。有趣的是，法图他汀A处理不会导致FADS 1或Δ5去饱和酶的蛋白质水平的变化。去饱和酶是高度不饱和脂肪酸合成中的关键酶，主要酯化形成细胞膜磷脂成分(Marquardt等，2000；Hastings等，2001；Nakamura和Nara，2004)。
表2：OB/OB处理小鼠和未处理对照小鼠肝脏中的脂肪酸的气相色谱-质谱(GC-MS)分析
  法图他汀A   对照
  脂肪酸   微摩尔/克肝脏   微摩尔/克肝脏   比率(处理∶对照)   P值
  (14:0)   1224.567±508.88   2378.586±329.454   0.51483   0.047781
  (16:0)   37143.23±3656.16   85044.75±5716.175   0.436749   0.001619
  (18:0)   15067.14±916.48   14129.2±272.7029   1.066383   0.260833
  (20:0)   164.3537±22.89   192.9773±16.46977   0.851674   0.059842
  (22:0)   116.1305±25.97   91.74762±12.60782   1.26576   0.2499
  (24:0)   157.8261±7.02   120.6449±19.37201   1.308188   0.052305
  (16:1)   11429.29±2227.5   34787.26±4482.311   0.328548   0.005542
  (18:1)   44471.72±8840.37   152218.4±12872.57   0.292157   0.001621
  (20:1)   593.7212±119.68   1829.537±230.8927   0.32452   0.00368
  (22:1)   94.94588±14.91   109.0117±11.47413   0.870969   0.379216
  (24:1)   397.92±216.3   234.2073±26.9417   1.699008   0.214302
  (18:2)N-6   29673.93±2456.22   46513.4±2825.032   0.637965   0.004558
  (18:3)N-6   237.1671±40.5   560.4358±61.89641   0.423183   0.00546
  (20:2)N-6   426.6694±63.52   914.0388±90.59441   0.466796   0.001424
  (20:3)N-6   1630.394±193.18   2589.236±154.791   0.629682   0.008568
  (20:4)N-6   8747.289±781.41   7772.095±110.7878   1.125474   0.171108
  (22:4)N-6   280.2708±46.1   292.2569±11.81504   0.958988   0.810355
  (22:5)N-6   172.9715±64.89   146.5646±14.54166   1.180173   0.879433
  (18:3)N-3   4416.975±643.658   3625.879±220.5747   1.21818   0.703923
  (20:5)N-3   2145.643±265.17   3067.856±299.7701   0.699395   0.04467
  (22:5)N-3   1720.424±221.16   2338.451±234.2185   0.735711   0.092988
  (22:6)N-3   9223.38±700.31   8718.014±532.5817   1.057968   0.448218
图例：肝脏样品(100mg)从法图他汀A处理的ob/ob小鼠和未处理对照小鼠获取，在-80℃储存直到进行脂肪酸含量分析。根据Folch方案提取脂肪酸并用气相色谱-质谱检测(GC-SM)进行定量。如上表所示，脂肪酸从头合成产物C14:0和C16:0下降约50％，单不饱和脂肪酸C16:1，C18:1和C20:1及其延长变性产物(C18:2)N-6、(C18:3)N-6、(C20:2)N-6、(C20-3)N-6和(C20:5)N-3下降约70％。FAS产物肉豆蔻酸酯(C14:0)和棕榈酸酯(C16:0)下降约50％(P＜0.05)。不仅是FAS脂肪酸从头合成中的C18，而且包括食物链延长系统中的C18水平均无变化。有趣的是，存在C20:0下降约15％(P+0.059)而C24:0增加(P＝0.05)的强烈趋势。与长链饱和脂肪酸的显著减少平行，结果表明单不饱和脂肪酸C16:1、C18:1和C20:1的水平显著减少约70％(P＜0.004)。并且，多不饱和长链脂肪酸(18:2)N-6、(18:3)N-6、(20:2)N-6、(20:3)N-6和(20:5)N-3的水平下降30-60％。这些减少是在转录和翻译水平脂肪生成途径中关键酶(FAS，ACC和SCD，ACL)的下调导致的结果。这些结果有助于解释法图他汀A通过降低肝脏中合成的甘油三酯的水平来改善脂肪肝的效果。
脂肪生成酶mRNA水平的下调
蛋白质水平下降可能是因为转录或翻译调控。采用实时PCR除测定脂肪生成转录因子PPARγ外，还测定代表性的脂肪生成基因ACC1、FAS和SCD1的mRNA水平。ACC1、FAS和SCD1的mRNA水平下降约80％(图13)。这些结果与较低的酶蛋白水平和活性相一致，强烈提示法图他汀A能通过抑制SREBP-1的成熟降低脂肪生成。在具体实施方式中，脂肪生成酶的下调涉及其主要转录因子PPARγ之一。在法图他汀A处理小鼠的提取物中，该转录因子的mRNA水平下降约40％(图13)。涉及从ob/ob小鼠肝脏删除PPARγ的研究还导致脂肪肝的改善(Matsusue等，2003)。然而，如果PPARγ仅从肝脏删除，这些小鼠中糖尿病表型加剧(Matsusue等，2003)。其他研究表明，肝PPAR γ-/-小鼠血中葡萄糖较低，具有提示该结果的功能性瘦激素基因在高脂饮食15周后可避免胰岛素耐性(Kubota等，1999)。由于用法图他汀A处理的小鼠高血糖降低且防止脂肪肝，这就提示在具体的方面，肝脏中的PPARγ是可能影响这些病理学病症的一些因素之一。此外，其他问题如白色脂肪粒可能在抗高血糖效果中起作用，当肝脏中脂肪生成受抑制时通过提高脂肪生成进行补偿。
总之，法图他汀A能够在处理的ob/ob小鼠中减少肝TG储量，缓解肥胖并降低高血糖症，通过其对SREBP-1的作用改善脂肪肝。这些研究提示，法图他汀A及其类似物是有用的对抗肥胖、脂肪肝和糖尿病的药物。
示例性的材料和方法
动物研究过程
4-5周龄的纯合雄性肥胖(ob/ob)小鼠(C57BL/6J，杰克逊实验室(TheJackson Laboratory)，缅因州巴港(Bar Harbor，ME))在拜尔医学院动物研究中心的受控条件下(12小时白天/晚上循环；25℃)进行饲养。根据美国国立健康机构出版的实验动物的护理与使用指导(NIH出版号85-23，1996修订)进行动物实验。每只笼子饲养5只小鼠，分配后1周小鼠自由摄取标准实验饲料(印第安纳州雷明德的PM公司(Purina Mill，Richmond IN))和水。实验第一天以及随后的每一天，测定小鼠重量以及消耗的食物量。ip注射法图他汀A(30mg/kg；150mL)之前每天下午3-5点间测定小鼠重量和剩余的食物。
每天继续给予法图他汀A或给予对照组(n＝5)10％DMSO的PBS溶液，持续4周直到实验结束。
血成分
每天注射法图他汀A 28天后，小鼠禁食过夜，取血，用极高精度的血糖测计仪(Glucometer Precision Xtra，Abbott)测定全血葡萄糖和β-羟基丁酸酯。通过比较病理学实验(拜尔医学院)进行血清成分、葡萄糖、甘油三酯和胆固醇的测定。采用NEFA C试剂盒(弗吉尼亚州里士满的WC公司(WakoChemical，Richmond，VA))测定血清非酯化脂肪酸(NEFA)。
肝脏分析
处死小鼠，测定肝脏和脂肪垫。用油红O染色来自各个动物的肝脏冻干切片以观察肝脏切片中的脂肪滴(TG)，如先前所述(Abu-Elheiga等，2001)。剩余的肝脏组织在液氮中冻干并在-80℃保存以备进一步分析。
组织甘油三酯和胆固醇含量
采用适配成适合96-孔板模式的比色分析的胆固醇E试剂盒(Wako)和无限度甘油三酯试剂盒(澳大利亚墨尔本的TE公司(Thermo Electron，Melbourne，Australia))，如文献中所述测定肝脏甘油三酯和胆固醇的含量(Chandler等，2003)。
酶活性和Western印迹分析
在液氮中将冻干的肝脏部分研磨成粉末。将粉末化组织悬浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/ml蛋白酶抑制剂混合物(罗氏(Roche))的10ml PBS中，并用Polytron(3x 30秒，高速)匀浆化，短时超声以降解DNA。16,000x g离心20分钟分离提取物。测定上清液中的蛋白质浓度并用针对以下酶的市售抗体进行Western印迹分析：FAS(BD生物科学公司)、柠檬酸裂解酶SCD1、FADS1、ACC和磷酸-ACC抗体。用安玛西亚ECL PlusTMWestern印迹检测试剂观察蛋白质。扫描感兴趣的特定蛋白质带的强度并针对β-肌动蛋白标准化进行定量。
如上所述测定肝脏提取物的FAS和ACC活性(Mao等，2006)。
定量实时PCR
用TRIzol试剂(英吉公司)从小鼠组织制备总RNA。从5只小鼠收集等量RNA并用DNA酶I(Turbo DNA-free，安百公司(Ambion，Inc.))处理。用Superscript II RNA酶H-逆转录酶(英吉公司)以随机六聚体引物从2μg DNA酶I-处理的总RNA合成第一链cDNA。实时PCR在20μl的终体积中包含10ng逆转录的总RNA、0.5μM正向和反向引物、10μl来自DyNAmo HS SYBRGreen qPCR试剂盒(飞酶公司(Finnzymes))的2x主混合物。采用DNA EngineOpticon系统(MJ研究有限公司(MJ Research，Inc))，在96-孔板中进行PCR。所有反应一式三份进行，用比较C(t)方法计算mRNA的相对量。用Opticon监测软件2.02(MJ研究公司)计算循环阈值C(t)。小鼠β-肌动蛋mRNA用作内标准。
统计学分析
数据表示为均值±SD。组间差异用未配对的双尾斯氏t-检验进行评价。
实施例8
法图他汀A目标分子及其类似物或衍生物的鉴定
在本发明的某些方面，鉴定了一种或多种法图他汀A的目标分子或其类似物或衍生物。虽然可采用任何合适的方法进行这种鉴定，但在具体的实施方式中，对法图他汀A或其类似物或衍生物进行标记。示例性的标记包括例如生物素。
实施例9
示例性的化合物及其修饰
图14显示了本发明的示例性化合物，它们的名称如表3所示。图15-17显示了根据图2A所示的相同方法，以20μM对这些示例性化合物进行的示例性的荧光素酶报道基因试验结果。如上所述进行脂肪形成试验(Choi等，2003)。完全抑制细胞油滴形成的类似物记为脂肪形成抑制性类似物。
表3：本发明示例性的化合物
                                                                脂肪形成
名称                                   条目 Luc/Gal   标准差    的抑制
                                       无   9.4426    1.0577
2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶     1    6.2297    1.1014    +
4-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶   2    4.5130    0.6176    -
4-(4-苯基噻唑-2-基)-2-丙基吡啶         3    7.4643    2.2215    -
4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶   4    6.3808    2.0425    -
4-(4-(4-乙基苯基)噻唑-2-基)吡啶        5    7.6190    1.6221    -
4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶            6    13.4689   1.6735    -
                                                                         脂肪形成
名称                                           条目 Luc/Gal    标准差    的抑制
4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)吡啶              7    18.3174    2.9172    -
4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基苯甲酸
酯                                             8    7.7585     1.6193    +
4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚           9    14.5234    2.7276    +
2-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯氧基)乙
酸甲酯                                         10   10.7717    0.8662    -
4-(4-氯苯基)-2-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑         12   5.9214     1.2693    -
4-(4-(3，4-二氯苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶      13   5.2391     0.4021    -
4-(4-(4-氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶           14   9.6605     0.9824    -
4-(4-(2，4-二氟苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶      15   10.8383    1.7661    -
4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺           16   10.3338    2.0763    +
N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯
胺                                             17   4.7079     1.2781    +
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰
胺                                             18   11.7685    6.8358    +
                                               无   15.0759    0.8305
2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶             1    7.5537     0.9784    +
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺
酰胺                                           19   4.1981     0.4653    +
N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺    20   5.6748     0.0613    +
N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-
基)苯胺                                        21   6.4378     1.2736    +
4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸    22   21.5911    0.8383    -
4-(4-溴苯基)-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸
甲酯                                           23   8.1137     2.5369    +
4-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶       24   11.0367    2.1112    -
4-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶       25   7.8536     1.2799    -
4-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-2-丙基吡啶       26   8.3046     2.6780    +
2-苯基-4-对甲苯基噻唑                          27   13.8222    1.3938    -
3-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯酚           28   12.7791    1.1429    -
2-(2-(2-丙基吡啶4-基)噻唑-4-基)苯酚            29   8.2379     1.9501    -
4-(4-溴苯基)N-异丙基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻
唑-5-羧酰胺                                    30   16.0226    2.1917    -
4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)吡啶                  31   16.9971    2.6512    -
4-(4-(4-氯苯基)噻唑-2-基)-2-乙基吡啶           32   9.5798     0.8524    -
4-(4-氯苯基)-2-苯基噻唑                        33   17.8175    3.7158    -
2-丙基-4-(4-(噻吩-2-基)噻唑-2-基)吡啶          34   12.1593    1.5587    +
                                               无   18         2
2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶             1    9.413845   0.840651  +
4-(4′-甲基[1，1′-联苯基]-4-基)-2-丙基)吡啶   35   11.35866   0.881475  +
2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸      36   18.98889   2.082093
2-乙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶             37   9.869906   0.71108
4-苯基-2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-5-羧酸          38   22.65811   3.898667
2-(2-丙基吡啶-4-基)-4-对甲苯基噻唑-5-羧酸甲    39   14.92978   2.600443
                                                                         脂肪形成
名称                                          条目  Luc/Gal   标准差    的抑制
酯
                                              无    8.2181    0.5097
2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶            1     3.4437    0.2720
4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲
酸叔丁酯                                      40    2.4390    0.4730
N-环己基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯
胺                                            41    6.5229    0.8638
4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)-N-甲苯磺酰
基苯胺                                        42    3.3957    0.3619
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-8-
喹啉磺酰胺                                    43    2.8506    0.6396
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)-2-
噻吩磺酰胺                                    44    1.8538    0.1240
而且，技术人员应理解，适合修饰示例性化合物的一个或多个方面以助于鉴定其他合适的化合物。例如，通过确定特定化合物对于一种或多种代谢疾病的治疗和/或预防的适当性，可修饰化合物以鉴定适用于相同或不同代谢疾病的其他相关化合物。在具体的实施方式中，这些改变可根据本文所述示例性的化学基团进行。
实施例10
通过抑制SREBP的活性阻断脂肪合成
细胞中脂肪消耗后，甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)由膜蛋白水解释放而易位进入核，在核中它们激活参与胆固醇和脂肪酸生物合成的基因的转录。在本发明中，阻断脂肪形成的小合成分子是SREBP激活的选择性抑制剂。二芳基噻唑衍生物，现称为法图他汀，能够削弱SREBP的蛋白水解激活，从而降低细胞中脂肪形成基因的转录。法图他汀的分子靶点似乎是SREBP切割激活蛋白(SCAP)。法图他汀阻断肥胖ob/ob小鼠中体重增加、血糖和肝脂蓄积，即使在不受控制的食物摄取统计学。法图他汀可用作对SREBP的调控进行进一步研究的工具，可提供新型代谢疾病药理学干预的起点。
代谢综合征常常归因于长期摄入过量富含脂肪或碳水化合物的饮食。碳水化合物通过脂肪酸和胆固醇从头合成转化为酰基甘油酯的过程涉及许多酶反应。编码这些酶的基因的表达水平受到三种转录因子的控制：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2(Brown和Goldstein，1997；Osbome，2000)。SREBP合成作为ER-膜结合前体，需要由结合到高尔基体膜的两种蛋白酶，位点-1和位点-2蛋白酶(S1P和S2P)蛋白水解释放，以产生激活核中靶基因的转录的活性形式(Brown和Goldstein，1997；Sakai等，1996)。SREBP的蛋白水解激活通过与SREBP切割激活蛋白(SCAP)，一种SREBP的ER-膜结合护卫蛋白相互作用而受到甾醇的密切调控(Goldstein等，2006；Hua等，1996)。当甾醇在ER膜中累积时，SCAP/SREBP复合物不能从ER转移至高尔基体膜，SREBP的蛋白水解加工过程受到抑制。因此，SREBP是控制脂肪代谢内稳态的关键脂肪生成转录因子。
如本文所述，法图他汀(图18a)抑制3T3-L1细胞中胰岛素诱导的脂肪形成以及DU145细胞血清非依赖性生长(Choi等，2003)。对经药物处理和未处理细胞的基因表达分布图进行比较以获取关于法图他汀作用特定分子途径的信息。用法图他汀或仅DMSO处理DU145细胞，通过描绘33,000种基因的Affymetrix DNA微阵列分析mRNA样品。在这些基因中(所有都从互联网生物技术信息GenBank数据库的国立中心获得，其全部内容被纳入本文作为参考)，法图他汀处理导致63种基因的转录水平下降至少35％(图23)。24种受影响基因与脂肪或甾醇合成直接相关，例如编码生物合成酶的基因，并且已报道18种受影响基因受到SREBP的控制(Horton等，2003)。受影响的SREBP-效应基因的下调在RT-PCR实验中得到证实(图18b和18c)。下调的基因列表中已知SREBP效应基因和脂肪/胆固醇生物合成基因的高发生率预示着法图他汀直接或间接地作用于SREBP途径。
为了证实法图他汀削弱SREBP的功能，在有或没有法图他汀存在的情况下，测定CHO-K1细胞中内源性SREBP激活SREBP-效应性报道基因的能力(图18d)。法图他汀减少报道基因的激活，其中荧光素酶的表达受到甾醇调控元件的控制。法图他汀对外源性表达的SREBP-1的成熟形式(氨基酸1-436)激活报道基因的能力的影响有限(图18e)，表明法图他汀削弱SREBP激活过程。
为了测定法图他汀是否影响ER-高尔基体易位和SREBP的蛋白水解过程，我们采用Sakai等(1998)开发的报道分子试验。在该试验中，与缺乏NH2-末端DNA-结合域的SREBP-2片段融合的分泌型碱性磷酸酶(PLAP-BP2513-1141)能够通过产生荧光的磷酸酶底物的变化监测易位和加工过程(图18f)。当用编码PLAP-BP2513-1141和SCAP的质粒共转染细胞时，PLAP磷酸酶分泌，产生荧光信号。加入法图他汀或甾醇可类似地减少分泌(图18f)。法图他汀介导的SREBP激活的抑制通过SREBP的Western印迹分析得到证实。用法图他汀处理CHO-K1细胞可降低SREBP-2 68KDa成熟形式的量并增加125KDa前体形式的量(图18g)。SREBP-1获得类似结果(图24)。这些结果共同表明，法图他汀能够阻断两种SREBP同种型的激活过程。
本发明者认为，法图他汀可削弱高尔基体中的SREBP蛋白水解切割或SCAP/SREBP复合物的ER-高尔基体易位。已知布雷菲德菌素A，一种阻断蛋白质ER顺行转移至高尔基体的天然产物，可导致SREBP对甾醇无应答，通过使S1P从高尔基体重新配置到ER导致SREBP在ER中结构性加工(DeBose-Boyd等，1999)。在布雷菲德菌素A的存在下，法图他汀对SREBP加工过程无影响(图19a)，提示法图他汀不能阻断其自身蛋白水解。
为了测定法图他汀是否阻断SCAP/SREBP复合物的ER-高尔基体易位，本发明者分析高尔基体中SCAP的N连接糖基化的程度。与EF结合SCAP相比，已易位的SCAP具有较高的糖基化水平，对内切糖苷酶H的耐受性更强。甾醇通过抑制ER-高尔基体易位可防止SCAP变得耐受内切糖苷酶H(图19b)(Nohturfft等，1998)。细胞在有或没有法图他汀或甾醇的存在下生长，相继用胰蛋白酶和内切糖苷酶H处理膜片段。在不含法图他汀和甾醇的情况下生长的细胞中，SCAP胰蛋白酶片段对内切糖苷酶H的耐受性较强，具有一或两条糖链(图19c，道1)。细胞在法图他汀或甾醇的存在下生长时，SCAP片段对内切糖苷酶H的耐受性较小，具有零或一条糖链(图19c，道2和3)。因此，法图他汀似乎能够抑制SCAP从ER到高尔基体的易位。
法图他汀构效关系的研究表明，用各种烷基或芳基磺酰胺基团修饰甲苯部分时，分子的生物学活性被保留或者甚至提高。一种荧光衍生物，丹酰法图他汀(图20a)保留其阻断SREBP激活的能力(图26)，可用作显微探针。共聚焦显微镜分析揭示了用ER-追踪红(一种ER特异性标记物)覆盖的丹酰法图他汀的位置(图20b)。相反，缺少法图他汀的丹酰分子不能定位到任何细胞群(图27)。选择性ER定位预示着，法图他汀能结合ER中的蛋白质；最有可能的候选物是SCAP，它是控制SREBP的胆固醇靶点(Radhakrishnan等，2004)。为检验这种假设，从细胞裂解物纯化结合于法图他汀-聚脯氨酸接头-生物素偶联物的蛋白质(图20a)(Sato等，2007)并用针对SCAP、SREBP-1、SREBP-2和ATF6(一种不相关的ER结合转录因子)的抗体通过Western印迹进行分析(Ye等，2000)。结果表明，法图他汀结合于SCAP，但不结合其他蛋白质(图20c)。加入过量法图他汀后结合丧失，过量胆固醇却不能(图20d)，提出一种有趣的可能性，即法图他汀可能在不同于胆固醇的位点与SCAP相互作用。
已建立SREBP在脂肪生成中的关键作用，在不受控制的食物摄取统计学，检查法图他汀对ob/ob小鼠(一种肥胖小鼠模型)的作用。每天腹膜内给予法图他汀，监测摄食和体重。处理小鼠每天的平均食物摄取与对照组无限制性差异(分别为5.4.1.5和5.9.1.4克/小鼠/天，p＞0.05)，处理期间未观察到明显毒性(图4a，b)。用法图他汀处理28天后，处理小鼠体重比未处理对照组小约12％(分别为32.1+1.4和36.2 2.2克/小鼠，p＝0.02)。ob/ob小鼠中最独特的表型之一是胰岛素耐性导致的高血糖症。血成分检查(图21c)揭示，处理小鼠平均葡萄糖水平比未处理小鼠低约70％(分别为153.2.30.5和429.4.87mg/dl，p＝0.003)，在正常葡萄糖水平的范围内。这些结果与肝胰岛素耐性发病机理中报道的SREBP-1c的作用相一致(Ide等，2004)。
ob/ob小鼠的另一种表型是器官中脂肪过度蓄积，包括非酒精性脂肪肝。由未处理ob/ob小鼠苍白颜色可知肝脏膨大和脂肪肝，而用法图他汀处理的小鼠肝脏表现正常(图22a)。处理小鼠肝脏体重平均下降约32％，脂肪垫比未处理小鼠小(图22b)。肝脏切片油红染色表明，未处理ob/ob小鼠的肝脏含有丰富的脂肪滴，而处理小鼠肝脏包含较低水平的脂质蓄积(图22c)。处理小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平也下降(图22d)。法图他汀防止ob/ob小鼠脂肪肝的结果符合报道的SREBP-1在脂肪肝发生中的作用：过度表达SREBP-1的转基因小鼠发生脂肪肝(Horton等，2003)，而缺乏SREBP-1的ob/ob小鼠(lepob/ob X Srebp1-/-)具有健康的肝脏(Yahagi等，2002)。
认为处理小鼠中肝脂质水平的下降是因为SREBP-响应性脂肪生成酶的肝表达降低。因此，检查法图他汀对代表性SREBP-响应性脂肪生成酶，包括脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)和ATP柠檬酸裂解酶(ACL)的肝蛋白质水平和酶活性的作用。生物化学分析表明，法图他汀-处理小鼠的肝脏提取物中脂肪生成酶的蛋白质水平和活性下降(图28)。因此，法图他汀能够阻断肝脏SREBP-1的加工，下调脂肪生成酶和降低肝甘油三酯储量。
小分子对SREBP途径的调节并非新发现。葛兰素史克的研究人员发现能够激活SREBP和通过表达LDL降低血胆固醇水平的小分子(Grand-Perret等，2001)。然而，法图他汀是第一种能够抑制SREBP活性的非甾醇样合成分子。法图他汀和葛兰素史克的分子都能靶向SCAP并调节其功能，导致对实验底物的脂肪酸和/或胆固醇代谢的独特影响。虽然这些分子如何结合SCAP和调节其功能尚未明了，SCAP可能是顺应简单合成分子正负控制的关键受体。法图他汀和SCAP配体可用作对SCAP-介导的SREBP途径的调控进行进一步研究的工具并最终用作代谢综合征药理学干预的种子分子。
示例性材料和方法
荧光素酶报道分子试验。第0天，将CHO-K1细胞接种到含培养基A(含5％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的Ham’s F-12培养基与Dulbecco改进的Eagle培养基的1∶1混合物)的96-孔板上。第2天，采用脂转染试剂(英吉公司)，用pSRE-Luc(一种SRE-1-驱动的荧光素酶报道分子构建物)(Hua等，1995)和pAc-β-gal(β-gal报道分子，其中β-gal受到肌动蛋白启动子控制)瞬时共转染细胞。培育5小时后，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，然后在有或没有法图他汀的存在下，在培养基B(含5％无脂质血清，100单位/毫升青霉素，100μg/mL硫酸链霉素，50μM制甲羟素和50μM甲羟戊酸钠的Ham’s F-12培养基与Dulbecco改进的Eagle培养基的1∶1混合物)中进行培育。培育20分钟后，溶解每孔中的细胞，试样用于测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。由β-半乳糖苷酶的活性标准化荧光素酶活性。对于SREBP-1c的N末端成熟形式的过度表达，用pSRE-Luc和pAc-β-gal共转染pCMV-SREBP-1c(1-436)。
SREBP加工过程的Western印迹分析。第0天，将CHO-K1细胞接种到100mm含培养基A的培养皿中。第2天，用PBS洗涤细胞，然后在有或没有法图他汀的存在下，在培养基B中进行培育。第3，细胞用冷的PBS洗涤一次，然后用含10mM Tris-HCl，pH 7.6，100mMNaCl，1％(w/v)SDS和蛋白酶抑制剂混合物(1μg/ml抑胃酶肽A、10μg/ml亮抑酶肽、200μM苯基甲磺酰基氟化物)的缓冲液处理。测定每个全细胞提取物的蛋白质浓度(BCA试剂盒；皮尔斯公司(Pierce))，然后22-33μg细胞提取物的等分试样与0.25体积的缓冲液(250mM Tris-HCl，pH 6.8，10％SD，25％甘油，0.2％(w/v)溴苯酚蓝和5％(v/v)2-巯基乙醇)混合，在95℃加热7分钟。样品在10％SDS-PAGE凝胶上进行分离，用抗SREBP-2的小鼠单克隆抗体(IgG-7D4)印迹(Yang等，1995)。用增强的化学发光(ECL)检测试剂(安玛西亚公司)观察特定的带。
SCAP寡糖的修饰。如本文其他部分所述制备细胞膜片段。将膜团粒重悬于含有10mM Hepes·KOH(pH 7.4)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mMEDTA钠和100mM NaCl的0.1mL缓冲液中。然后，蛋白质试样在30℃、总体积58μL、有或没有1μg胰蛋白酶存在下培育30分钟，加入2μL(400单位)大豆胰酶抑制剂终止反应。对于用内切糖苷酶H的后续处理，各个样品接受10μl含有3.5％(重量/体积)SDS和7％(体积/体积)2-巯基乙醇的溶液。在100℃加热10分钟，各个样品相继接受9μl 0.5M柠檬酸钠(pH 5.5)，5μL含有17□蛋白酶抑制剂的溶液(浓度1x，对应于10μg/mL亮抑酶肽，5μg/mL抑胃酶肽A和2μg/mL抑蛋白酶肽)，然后是1μL(5单位)内切糖苷酶H。反应在37℃进行过夜，加入20μL含有0.25MTris·HCl(pH 6.8)，2％SD，10％(v/v)甘油，0.05％(重量/体积)溴苯酚蓝和4％2-巯基乙醇的缓冲液终止反应。然后将混合物在100℃加热5分钟，进行SDS/PAGE(12％凝胶)。
共聚焦显微镜分析。将汇合约70％的玻璃底96孔板(Grainer)上的CHO-K1细胞与0.2μM ER-追踪红(英吉公司)和5μM丹酰法图他汀培育1小时。用配备CSU10转盘共聚焦扫描仪(横滨电子公司(Yokogawa Electric Corporation))和ORCA-CCD相机(滨松光电设备公司(Hamamatsu Photonics))的卡尔蔡司LSM 510共聚焦显微镜获取和分析荧光图像。用IPLab软件(溶液系统公司(Solution Systems))分析图像。
结合试验。如辅助方法中所述制备细胞膜片段。用含有0.1％FOS-胆碱10(汉普顿研究公司(Hampton Research))的PBS提取膜片段。将提取物与用生物素化法图他汀饱和的中性链亲和素-琼脂糖珠(10μL)混合并培育1小时。结合蛋白用含有0.1％FOS-胆碱10的PBS洗涤四次，在25μL SDS样品缓冲液中煮沸，并进行Western印迹。对于竞争试验，将饱和量的胆固醇或法图他汀加入膜提取物中，然后与所述珠培育。
动物研究过程。4-5周龄的雄性肥胖(ob/ob)小鼠(C57BL/6J，杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，缅因州巴港(Bar Harbor，ME))在拜尔医学院动物研究中心的受控条件下(12小时白天/晚上循环；25℃)进行饲养。根据美国国立健康机构出版的实验动物的护理与使用指导(NIH出版号85-23，1996修订)进行动物实验。每只笼子饲养5只小鼠，分配后1周小鼠自由摄取标准实验饲料(印第安纳州雷明德的PM公司(Purina Mill，Richmond IN))和水。实验第一天以及随后的每一天，下午3-5点间测定每只小鼠的重量以及食物摄取量。重量测定后，处理小鼠接受ip注射法图他汀(30mg/kg；150mL)，对照小鼠接受10％DMSO的PBS溶液。每天注射持续4周，直到实验结束。
血成分。每天注射法图他汀A 28天后，小鼠禁食5-6小时，用极高精度的血糖测计仪(Glucometer Precision Xtra，Abbott)测定全血葡萄糖和β-羟基丁酸酯。通过比较病理学实验(拜尔医学院)进行血清成分、葡萄糖、甘油三酯和胆固醇的测定。采用NEFA C试剂盒(弗吉尼亚州里士满的WC公司(Wako Chemical，Richmond，VA))测定血清非酯化脂肪酸(NEFA)。
肝脏分析。处死小鼠，测定肝脏和附睾脂肪垫重量。用油红O染色来自各个动物的肝脏冻干切片以观察肝脏切片中的脂肪滴(甘油三酯)，如先前所述(Abu-Elheiga等，2001)。剩余的肝脏组织在液氮中冻干并在-80℃保存以备进一步分析。
组织甘油三酯和胆固醇含量。采用胆固醇E试剂盒(Wako)和无限度甘油三酯试剂盒(澳大利亚墨尔本的TE公司(Thermo Electron，Melbourne，Australia))，如Chandler等，2003所述测定肝脏甘油三酯和胆固醇的含量。
合成法图他汀(1)，丹酰法图他汀(2)和法图他汀-聚脯氨酸接头-生物素偶联物(3)。合成法图他汀(1)：2-丙基-4-(4-对甲苯基噻唑-2-基)吡啶。搅拌的同时将丙硫异烟胺(5)(1.03g，5.70mmol)和2-溴-4’-甲基苯乙酮(6)(1.22g，5.70mmol)的乙醇(20ml)混合物在70℃加热0.5小时，然后冷却至0℃。对形成的黄色沉淀进行过滤，用冷乙醇洗涤，干燥后得到黄色针状法图他汀(1)HBr盐(1.78g，83％)。熔点：190-193℃；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ8.88(d，J＝6.2Hz，1H)，8.54(s，1H)，8.46(d，J＝1.4Hz，1H)，8.36(dd，J＝1.4，6.2Hz，1H)，7.99(d，J＝7.6Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，2H)，3.03(t，J＝7.6Hz，2H)，2.35(s，3H)，1.80(m，2H)，0.96(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)：δ161.3，158.5，156.9，146.2，143.2，138.4，130.4，129.5，126.3，122.3，120.3，119.5，35.0，22.4，20.9，13.4；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C18H19N2，295.1269；实测值，295.1269。
合成4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺(9)。在压力管中加入7(1.08g，3.0mmol)、苯甲酮亚胺(0.57g，3.3mmol)、Pd2dba3(86mg，0.15mmol)、BINAP(280mg，0.45mmol)、叔丁醇钠(1.44g，9.0mmol)和无水甲苯(30mL)并用氩气吹扫。将压力管密封并在100℃浴中加热20小时。冷却至室温后，反应混合物经色谱分离(SiO2，4∶1己烷∶EtOAc)，得到1.35g黄色油状产物8(98％)。然后，在8(1.35g，2.9mmol)的THF(20mL)溶液中加入2N HCl水溶液(15mL)。室温下搅拌2小时后，反应混合物进行减压浓缩，然后用EtOAc(100mL)稀释，用饱和Na2CO3(50mL)溶液洗涤。含水洗涤液用EtOAc(3x 40mL)萃取，合并的EtOAc层在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，4∶1己烷∶EtOAc)，得到0.73g白色结晶9(82％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.61(d，J＝4.8Hz，1H)，7.80(d，J＝8.9Hz，2H)，7.75(d，J＝1.4Hz，1H)，7.67(dd，J＝1.4，4.8Hz，1H)，7.36(s，1H)，6.75(d，J＝8.9Hz，2H)，3.82(br，1H)，2.85(t，J＝7.6Hz，2H)，1.83(m，2H)，1.01(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ164.9，163.4，157.3，150.0，146.8，140.8，127.7，124.8，119.2，117.8，115.1，111.3，40.4，23.1，13.9；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C17H18N3，296.1221；实测值，296.1228。
合成丹酰法图他汀(2)。向磁力搅拌的9(50mg，0.17mmol)和吡啶(27mg，0.34mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中加入丹酰氯(50mg，0.18mmol)。搅拌17小时后，反应混合物减压浓缩，残留物在EtOAc(50mL)和饱和NH4Cl溶液(20mL)间进行分配。水相用EtOAc(2x 20mL)提取。合并的提取物用饱和NaHCO3溶液洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黄色结晶2(65mg，73％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.60(d，J＝4.8Hz，1H)，8.50(d，J＝8.2Hz，1H)，8.36(d，J＝8.3Hz，1H)，8.21(d，J＝8.3Hz，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，2H)，7.70(d，J＝1.5Hz，1H)，7.62(dd，J＝1.5，4.8Hz，1H)，7.61(t，J＝8.3Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.43(dd，J＝7.5，8.2Hz，1H)，7.19(d，J＝7.5Hz，1H)，7.04(d，J＝8.6Hz，2H)，6.97(br，1H)，2.87(s，6H)，2.84(t，J＝7.6Hz，2H)，1.81(m，2H)，1.00(t，J＝7.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)：165.5，163.5，156.1，152.2，150.0，140.5，136.7，134.0，131.1，131.0，130.5，129.8，129.7，128.7，127.3，123.1，121.6，119.2，118.3，117.8，115.3，113.8，45.4，40.4，23.1，13.9；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C29H29N4O2S2，529.1732；实测值，529.1733。
合成4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(10)。向磁力搅拌的9(0.57g，1.92mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(5mg，0.4mmol)的THF(20mL)溶液中加入二(叔丁基)碳酸氢酯(0.49g，2.21mmol)。搅拌17小时后，反应混合物减压浓缩，残留物在EtOAc(100mL)和饱和NH4Cl溶液(30mL)间进行分配。水相用EtOAc(2x 50mL)提取。合并的提取物用饱和NaHCO3溶液洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黄色泡沫状10(0.33g，43％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.68(d，J＝5.1Hz，1H)，7.93(d，J＝8.4Hz，2H)，7.79(s，1H)，7.72(d，J＝5.1Hz，1H)，7.52(s，1H)，7.47(d，J＝8.4Hz，2H)，6.58(s，1H)，2.90(t，J＝7.5Hz，2H，)，1.87(m，2H)，1.55(s，9H)，1.03(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ163.1，156.5，152.3，149.6，140.6，138.5，128.7，128.1，127.0，118.3，117.7，114.3，112.9，80.6，41.0，28.4，24.1，13.7；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C22H26N3O2，396.1746；实测值396.1738。
合成中间体12。在N2气氛中，将10(200mg，0.51mmol)加入NaH(60％在矿物油中的分散体，24mg，0.6mmol)在DMF(5mL)的悬浮液中，将该混合物在室温下搅拌2小时。然后，加入用DMF(2mL)配制的NaI(91mg，0.6mmol)和4-溴丁酸乙酯(0.12g，0.6mmol)。搅拌18小时后，将该反应混合物倒入水(20mL)中，用EtOAc(2x 50mL)提取。合并的提取物在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，2∶1己烷∶AcOEt)，得到黄色油状11(35mg，13％)。然后在11(30mg，2.9mmol)的THF(1mL)和MeOH(0.5mL)的溶液中加入2N NaOH水溶液(0.2mL)。室温下搅拌18小时后，将该反应混合物减压浓缩，然后用EtOAc(10mL)稀释，用饱和NH4Cl溶液(5mL)洗涤。含水洗涤液用EtOAc(2×10mL)提取，合并的EtOAc层在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，EtOAc)，得到14mg白色泡沫状12(50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.69(d，J＝5.1Hz，1H)，7.95(d，J＝8.4Hz，2H)，7.80(s，1H)，7.73(d，J＝5.1Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.51(d，J＝8.4Hz，2H)，6.58(s，1H)，2.92(m，4H)，2.33(m，2H)，1.90(m，4H)，1.50(s，9H)，1.02(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：174.2，162.9，156.3，152.9，149.6，140.6，138.5，129.3，128.9，127.2，119.0，117.9，114.8，113.3，80.8，41.0，40.3，32.1，28.4，24.1，21.1，13.7；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C26H32N3O4，482.2114；实测值，482.2120。
合成4-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基氨基)-N-异丙基丁酰胺(14)。在12(17mg，0.035mmol)、三乙胺(17μl，0.14mmol)和异丙基胺(4μL，0.046mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入HATU(16mg，0.042mmol)。搅拌18小时后，将该反应混合物减压浓缩，残留物在EtOAc(20mL)和饱和NH4Cl溶液(10mL)间进行分配。水相用EtOAc(2x 10mL)提取。合并的提取物用饱和NaHCO3溶液洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到黄色油状13(14mg，77％)。然后在13(12mg，2.9mmol)的THF(1mL)溶液中加入TFA(0.2mL)。室温下搅拌18小时后，将该反应混合物减压浓缩，然后用EtOAc(20mL)稀释，用饱和NH4Cl溶液(10mL)洗涤。含水洗涤液用EtOAc(2×5mL)提取，合并的EtOAc层在Na2SO4上干燥并浓缩。粗产物经色谱纯化(SiO2，2∶1己烷∶EtOAc)，得到6.2mg黄色泡沫状14(63％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.69(d，J＝5.4Hz，1H)，8.04(1H，s)，7.96(d，J＝8.7Hz，2H)，7.96(s，1H)，7.72(d，J＝5.4Hz，1H)，7.51(s，1H)，6.65(d，J＝8.7Hz，2H)，3.95(m，1H)，3.03(m，4H，)，2.35(m，2H)，1.92(m，4H)，1.25(d，J＝6.3Hz，6H)，1.03(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：171.6，162.9，156.3，152.9，140.6，138.5，129.3，128.9，127.2，119.0，117.9，114.8，113.3，42.2，41.0，40.3，32.1，24.1，23.2，21.1，13.7；HRMS(m/z)：[M+H]+理论值C24H31N4O，423.2219；实测值423.2216。
合成法图他汀-聚脯氨酸接头-生物素偶联物(3)：法图他汀-KPGQFLYELKKPPPPPPPPPKK(SEQ ID NO：15)-氨基己酸-生物素。在Rink-Amide MBHA树脂上使N-α-Fmoc-保护的氨基酸、N-8-Fmoc-ε-氨基己酸、12、生物素偶联合成偶联物3和4，如上所述反相HPLC进行纯化(Sato等，2007)。偶联物3：理论值C155H238N35O29S2 +为3119.9.实测值(MALDI-TOF-MS)3119.7[M+H]+。
质粒。pSRE-Luc，pCMV-SREBP-1c(1-436)，pCMV-PLAP-BP2(513-1141)和pCMV-SCAP由J.L.Goldstein和M.S.Brown(德克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center))(Sakai等，1998；Hua等，1995)赠送。
抗体。单克隆抗-SREBP-1 IgG(2A4)、抗-SCAP IgG(9D5)和抗-ATF6IgG(H-280)购自桑塔克鲁茨生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。单克隆抗-SREBP-2 IgG-7D4由J.L.Goldstein和M.S.Brown(德克萨斯大学西南医学中心)赠送。多克隆抗-FA、抗-ACC、抗-SCD1和抗-ACL IgG购自BD生物科学公司(BD Biosciences)。
细胞培养。中国仓鼠卵巢细胞K1(CHO-K1)细胞在含有5％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基/Ham′s F12培养基[1:1]中，37℃、5％CO2下进行培养。人雄激素-非依赖性前列腺癌细胞(DU145)在含有2mM L-谷胺酰胺，1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和1.5g/L碳酸氢钠以及10％胎牛血清，100单位/mL青霉素和100μg/mL硫酸链霉素的伊格尔氏最少必需培养基中，37℃、5％CO2下进行培养。
细胞膜片段的制备。收集细胞，然后重新悬浮在缓冲液(10mMHepes·KOH(pH 7.4)、10mM KCl、1.5mM MgCl2和1mM EDTA钠)中，通过22-号针头，并在1,000×g离心5分钟。然后将核后上清液在15,000x g离心30分钟，去除上清液。
寡核苷酸微阵列分析。在1μg/mL IGF1的存在下，在无血清培养基中用5μM法图他汀或仅DMSO处理DU145前列腺癌细胞，在TRI反应试剂(分子研究中心)中提取总RNA并通过RNeasy微量试剂盒(恰根公司)进一步分离。在医学微阵列核心实验室的拜尔学院(Baylor College of Medicine MicroarrayCore Facility)通过Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0分析纯化的mRNA。代表超过39,000种转录物的由大约45,000种探针组构成的阵列来源于大约33,000种已证实的人类基因(阿弗麦特有限公司(Affymetrix，Inc.))。
RT-PCR实验。从DU145细胞将总RNA提取到TRI反应试剂(分子研究中心)中并用RNeasy微量试剂盒(恰根公司)进行分离。采用Access RT-PCR系统(普美加)对RNA样品进行RT-PCR分析。RT-PCR反应液包含总RNA，1μM的各种引物，0.2mM dNTP，1mM MgSO4，AMV逆转录酶(2单位)和TflDNA聚合酶(2单位)，终体积25μL。所用引物对如下：对于低密度脂蛋白受体(LDLR)是5′-TCA GAC CGG GAC TGC TTG GAC GGC TCA GTC-3′(SEQ ID NO：16)和5′-CCA CTT AGG CAG TGG AAC TCG AAG GCC G-3′(SEQ ID NO：17)；对于硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是5′-GCC TGC TTGATA ATA TAT AAA C-3′(SEQ ID NO：18)和5′-CAC TTG AAT TGA GCTTTA G-3′(SEQ ID NO：19)；对于ATP柠檬酸裂解酶(ACL)是5′-AAG AAAAAG TGT CAG ACA GCT GG-3′(SEQ ID NO：20)和5′-TGG ACT GAA GGGGTG TTA GC-3′(SEQ ID NO：21)；对于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoAR)是5′-GCC CGA CAG TTC TGA ACTGGA ACA-3′(SEQ ID NO：22)和5′-GAA CCT GAG ACC TCT CTG AAA GAG-3′(SEQ ID NO：23)；对于甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)是5′-CTG CCT GACTGC CTC AGC-3′(SEQ ID NO：24)和5′-ACC TCT CCT GAC ACC TGG G-3′(SEQ ID NO：25)；对于胰岛素诱导基因1(INSIG1)是5′-AAG ACT TCA GGGTAA GTC ATC A-3′(SEQ ID NO：26)和5′-CGT GTA TAA TGG TGT CTA TCAG-3′(SEQ ID NO：27)。扩增条件如下：在94℃1次循环持续4分钟，然后在94℃变性40秒，在50℃退火40秒，在68℃延长2分钟，对于SCD和HMGCoA R是22次循环，对于LDLR和INSIG1是在58℃退火并进行24次循环，或者对于ACL是在60℃退火并进行24次循环，对于MVD是在55℃退火并进行30次循环。通过琼脂糖凝胶分析扩增的DNA并用Scion-image软件进行定量。
PLAP-BP2切割。第0天，将CHO-K1细胞接种到含培养基A的96孔板上。第2天，采用脂转染试剂(英吉公司)，用pCMV-PLAP-BP2(513-1141)、pCMV-SCAP和pAc-β-gal瞬时共转染细胞。培育5小时后，细胞用PBS洗涤，然后在有或没有法图他汀(20μM)或甾醇(10μg/mL胆固醇和1μg/mL 25-羟基胆固醇)的存在下，在培养基B中培育。培养20小时后，测定培养基试样中分泌的碱性磷酸酶活性。溶解每孔中的细胞，用于测定β-半乳糖苷酶活性。通过β-半乳糖苷酶的活性标准化碱性磷酸酶活性。
酶活性和Western印迹分析。在液氮中将冻干的肝脏部分研磨成粉末。将粉末化组织悬浮在含有0.1mM PMSF、5mM苯甲脒和5mg/ml蛋白酶抑制剂混合物(罗氏(Roche))的10ml PBS中，并用Polytron(3x 30秒，高速)匀浆化，短时超声以降解DNA。16,000x g离心20分钟分离提取物。测定上清液中的蛋白质浓度并用针对FAS、ACC、SCD1和ACL的抗体进行Western印迹分析。扫描感兴趣的特定蛋白质带的强度并针对β-肌动蛋白标准化进行定量。如上所述测定肝提取物中FAS和ACC的活性(Mao等，2006)。
参考文献
说明书中提到的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物的内容被纳入本文作为参考，如同每份出版物单独且特定地纳入本文作为参考。
专利
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虽然已详细描述了本发明及其优点，但应理解可进行各种改变、取代和变化而不背离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。而且，本发明的范围并不限于说明书中所述的过程、机器、制造、物质组成、方式、方法和步骤的具体实施方式。本领域普通技术人员应理解，通过本发明的内容，可开发执行基本相同功能或实现基本相同结果的过程、机器、制造、物质组成、方式、方法或步骤，可根据本发明利用这里所述相应的实施方式。因此，所附权利要求书表示包括在这些过程、机器、制造、物质组成、方式、方法或步骤的范围内。

Claims (9)

1.一种选自下组的化合物：
N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)乙酰胺；
N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺；
N-苄基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；
N-(环丙基甲基)-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺；
及其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：N-异丙基-4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯胺和N-(4-(2-(2-丙基吡啶-4-基)噻唑-4-基)苯基)甲磺酰胺。
3.一种组合物，其包含如权利要求1所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。
4.至少一种如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗个体代谢疾病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述代谢疾病是肥胖。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述代谢疾病选自：肥胖、高脂血症、糖尿病、脂肪肝、高血压、前列腺癌和心血管病。
7.一种药盒，其包含如权利要求1所述的化合物，所述化合物装在合适的容器中。
8.至少一种如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制个体SREBP途径的成员的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述SREBP途径的成员是SREBP-1、SREBP-2或两者。
CN200880008035.2A 2007-02-02 2008-02-01 用于治疗代谢疾病的组合物和方法 Active CN101674730B (zh)

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