CN101672792A - 一种喹诺酮类药物的检测方法、检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种喹诺酮类药物的检测方法、检测试剂盒和应用，该方法是采用二氯甲烷和盐酸对样品进行预处理，硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液进行显色反应，根据显色结果实现对喹诺酮类药物的检测。本发明采用紫外灯下检视荧光对大批量待测样品进行初筛，操作简单可快速挑选出疑似阳性样品，再利用高专属性和高灵敏度的显色反应，从而使得检测正确率高达99％。本发明采用的预处理方法，不但去除掉待测样品中复杂多样的干扰物质的影响，而且使得待测样品中目的化合物浓度提高，有利于后期显色反应结果的肉眼观察。本发明的检测试剂盒可用于检测化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中掺杂喹诺酮类药物，以及喹诺酮类药物及其制剂的鉴别。

Description

一种喹诺酮类药物的检测方法、检测试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种喹诺酮类药物的检测方法、检测试剂盒和应用。

背景技术

喹诺酮类抗菌药(4-quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类较新的合成抗菌药，该类药物的开发始于1962年的萘啶酸，自1978年诺氟沙星的问世以来，已开发及正在开发的超过五十种。

喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂，主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。

喹诺酮抗菌药按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代，第一代喹诺酮类抗菌药的品种有萘啶酸(Nalidixic acid)和吡咯酸(Piromidicacid)等，第二代喹诺酮类抗菌药的品种有新恶酸(Cinoxacin)和甲氧恶喹酸(Miloxacin)等，第三代喹诺酮类抗菌药的品种有诺氟沙星(Norfloxaicin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)和环丙沙星(Ciprofloxacin)等，第四代喹诺酮类抗菌药的品种有加替沙星(Gatifloxacin)与莫昔沙星(Moxifloxacin)等。

喹诺酮类药物可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染及其他类的各种感染，还可用于抗肿瘤和抗病毒作用，但该类药物对人体也存在很大的不良反应，如胃肠道反应、中枢反应、可诱发癫痫、影响软骨发育、易产生结晶尿及易导致肝损伤等。

目前在抗感染药物市场中，喹诺酮类抗菌药在临床上的用量已超过青霉素类，成为第二大类抗菌药物，因其良好的抗感染作用，喹诺酮类药物在各种领域中被大量非法添加，尤其是在化妆品和保健品中，造成大规模的滥用，并引发抗菌素耐药性等一系列问题。因此，快速检测化妆品和保健品中的喹诺酮抗菌素成为社会的迫切需求。

目前对于非法添加喹诺酮类药物的检测，我国药典主要是采用液相色谱、红外光谱法，《药品快速鉴别手册》采用丙二酸、醋酐；枸橼酸醋酐；酒石酸、醋酐；碘铋酸钾/醋酸试液鉴别法，国外药典(USP32、BP2009)采用红外及薄层色谱法，然而现有技术中的酸/酸酐法操作复杂，需水浴，不适合现场检测及推广，另外，碘化铋钾醋酸或盐酸溶液，属于生物碱试剂，大多数生物碱可与该试剂反应生成橙红色沉淀，专属性差。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种专属性强、操作简单快速、抗干扰物质少，灵敏度高、结果直观的针对喹诺酮类药物的检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述检测方法的专用检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒在检测化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中非法添加喹诺酮类药物，或鉴别喹诺酮类药物及其制剂中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

通过对比各类喹诺酮类药物的分子结构式，本发明人发现喹诺酮类药物具有三种母核：喹啉羧酸、萘啶酸和曾啉羧酸，喹啉羧酸的结构式如式(I)所示，萘啶酸的结构式如式(II)所示，曾啉羧酸的结构式如式(III)所示。

本发明人通过研究发现，硫酸铁铵可与上述三种母核分别发生螯合反应，生成淡橙红色至橙红色复合物，该反应专属性强，且显色现象直观易于观察，因此可将硫酸铁铵用于鉴别喹诺酮类药物及其制剂和检测非法添加喹诺酮类药物，尤其是化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中非法添加喹诺酮类药物的检测。

作为待测样品的化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药，其成分复杂，现有技术中对待测样品进行预处理多采用的萃取、柱色谱分离等操作，其操作步骤繁琐，且干扰物质很多，对后续检测影响较大，尤其是本发明采用直观的显色结果进行判断，对前期的预处理中是否能有效去除杂质要求更高，因此本发明还提供一种利用二氯甲烷和盐酸溶液结合的方法，对待测样品进行预处理，不但操作简单，而且能有效地去除杂质，提高显色结果的准确性。

本发明人还发现采用三氯化铁代替硫酸铁铵进行显色反应，也可以起到很好的显色检测效果，实现本发明，三氯化铁的显色结果判断和硫酸铁铵相同。

一种喹诺酮类药物的检测方法，该方法包括预处理和显色反应两步：

(1)预处理

a.采用二氯甲烷对待测样品进行溶解萃取处理：二氯甲烷将待测样品中的目的化合物萃取出来，减少干扰物质对后期检测的影响；

b.向萃取液中加入盐酸溶液：用盐酸溶液对萃取液进行浓缩富集，使得目的化合物的浓度增加，有利于后期检测的观察；盐酸溶液浓缩富集后，收集上层液体，该上层液体即为待测样品的预处理液；

(2)显色反应

向上述待测样品预处理液中加入硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液，观察显色结果；若硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液加入后，即显淡橙红色至橙红色，则判定为阳性，待测样品中添加有喹诺酮类药物；其余显色结果判定为阴性，说明待测样品中没有添加喹诺酮类药物。

上述检测方法中，二氯甲烷采用分析纯试剂，二氯甲烷的用量根据实际待测样品的量来选择，实际操作时二氯甲烷的用量可选择1～3ml。

上述检测方法中，盐酸溶液为盐酸水溶液，盐酸溶液的浓度为0.0005mol/L～1mol/L，盐酸溶液的用量根据实际萃取液的量来选择，实际操作时盐酸水溶液的用量可选择0.5～1ml。

上述检测方法中，若待测样品为无色的水溶液，那么可不经过试剂A和试剂B的预处理，直接对待测样品进行显色检测。

上述检测方法中，硫酸铁铵溶液是将硫酸铁铵固体【NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O】溶解于溶剂水中配制而成，硫酸铁铵溶液中硫酸铁铵的浓度为0.1～400mg/ml；当硫酸铁铵在溶液中浓度增大的时候，会存在溶解困难的问题，且长期保存有水解趋势，浓度会降低，因此本发明的硫酸铁铵溶液，当硫酸铁铵在溶液中的浓度为0.1～20mg/ml时，采用将硫酸铁铵直接溶于溶剂水中，此时硫酸铁铵溶液中硫酸铁铵的浓度优选2mg/ml，而当硫酸铁铵在溶液中的浓度大于20mg/ml时，需要向硫酸铁铵溶液中加入硫酸，硫酸的加入量为溶液总体积的5～35％，此时硫酸铁铵溶液中硫酸铁铵的浓度优选200mg/ml；硫酸有利于硫酸铁铵的溶解，而且促进硫酸铁铵溶液的稳定。

上述检测方法中，三氯化铁溶液为三氯化铁水溶液，三氯化铁溶液的浓度为9～90mg/ml；优选三氯化铁溶液的浓度为18mg/ml；

上述检测方法中，作为显色剂的硫酸铁铵或三氯化铁均十分灵敏，因此实际操作中只需要加入一滴即可检测，实现本发明。

本发明人对比各种喹诺酮类药物的分子结构，发现喹诺酮类药物均具有如下结构特征：

(1)大的共轭π键结构；

(2)刚性的平面结构；

(3)取代基团为给电子取代基；

(4)最低的激发单重态S1为π，π^*型，而不是n，π^*型。

上述四个结构特征说明喹诺酮类药物具有荧光物质特性，紫外灯下366/254nm均有检视结果也证明，喹诺酮类药物确实具有强荧光现象。

因此，本发明在采用硫酸铁铵进行喹诺酮类药物检测前，可先用紫外灯下检视荧光对待测物质进行初筛，对有荧光现象的样品再进行硫酸铁铵或三氯化铁的专属性鉴别检测，从而能够快速在大量样品中将非法添加有喹诺酮类药物的样品筛选出来。

本发明的检测方法可用于对化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测以及喹诺酮类药物及制剂的鉴别，因该方法操作简单、所用试剂成本低且无需大型仪器，因此可用于大规模的现场检测。

利用本发明的检测，可制备相关的检测试剂盒，从而实现对化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中是否非法添加有喹诺酮类药物进行快速方便的检测，也可以实现对喹诺酮类药物及其制剂的鉴别。

上述检测试剂盒中包含二氯甲烷、盐酸水溶液和硫酸铁铵溶液，或者包含二氯甲烷、盐酸水溶液和三氯化铁溶液。

上述检测试剂盒中还可以包含作为阳性对照的检测试纸条，使用时只需要将待检测样品的颜色和试纸条上的颜色进行比对，只要符合其中的颜色，均为阳性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明首次利用硫酸铁铵直接与喹诺酮类药物发生螯合反应，根据反应产物的颜色从而实现了喹诺酮类药物的检测，硫酸铁铵与喹诺酮类药物的螯合反应具有高专属性和高灵敏度，保证了检测结果的准确率可高达99％；

2.本发明将荧光检测和硫酸铁铵显色检测两个方法结合起来，开创了物理、化学试剂法成功对非法添加喹诺酮类药物的检测，在分析化学、药物分析学和化妆品监督检验等领域均属首创；

3.本发明运用荧光发光检测对大批量待测样品进行初筛，操作简单可快速挑选出疑似阳性样品，继而结合硫酸铁铵可与喹诺酮类药物生成螯合物的性质，对疑似阳性样品进行更加精确地检测，两步检测方法的结合，使得检测正确率高达99％，同时也为物理化学试剂法在非法添加化合物的检测领域提供了重要的方法参考；

4.本发明采用二氯甲烷将待测样品中的目的化合物溶解萃取出来，然后由盐酸溶液将萃取液中的目的化合物浓缩富集，不但可以去除掉待测样品中复杂多样的干扰物质的影响，而且使得待测样品中目的化合物浓度提高，有利于后期显色反应结果的肉眼观察，两步预处理操作和显色反应的结合，极大地简化了现有繁琐的检测步骤，可现场对大规模的化妆品、保健食品、保健品、消毒产品或中成药中非法添加喹诺酮类药物进行检测；

5.本发明人采用本发明的检测方法已经对2006、2007、2008、2009年生产化妆品的共86批(102个)进行了检测，结果发现检出阳性样品7批(9个)，其中08年批次1个，09年批次6批(8个)，由此可见化妆品中非法添加喹诺酮类药品是一种新的发展趋势，因此建立相关的非法添加检测方法，以及靶向性抽样的快筛方法都是迫在眉睫的，而本发明的检测方法正好能满足这一需要。

具体实施方式

实施例1专属性试验

本实施例选择甲硝唑对照品、氯霉素标准品、头孢泊肟酯对照品、地塞米松片、水杨酸对照品、盐酸小檗碱片、氧氟沙星对照品、加替沙星对照品、诺氟沙星对照品、环丙沙星对照品和培氟沙星对照品作为待测样品，对这十一种样品进行检测，检测方法分为如下两种：

方法一：

(1)将待测样品分别配制成大于1mg/ml浓度的溶液；

(2)配置100mg/ml硫酸铁铵溶液，该溶液中包含20％硫酸；

(3)向步骤(1)配制好的各待测样品溶液中分别加入一滴步骤(2)制备的硫酸铁铵溶液，观察显色结果。

方法二：

(1)将待测样品分别配制成大于1mg/ml浓度的溶液；

(2)配置200mg/ml硫酸铁铵溶液，该溶液中包含9％硫酸；

(3)将步骤(1)制备的各待测样品溶液，分别用塑料管吸取1滴滴入白瓷板孔A、B中；

(4)在紫外灯下观察各待测样品的孔A中液体是否有荧光，如果有荧光，则继续向个待测样品的孔B中加入步骤(2)制备的硫酸铁铵溶液，观察显色结果。

方法一的实验结果：

甲硝唑对照品的显色结果是无色，为阴性；

氯霉素标准品的显色结果是无色，为阴性；

头孢泊肟酯对照品的显色结果是无色，为阴性；

地塞米松片的显色结果是无色，为阴性；

水杨酸对照品的显色结果是紫红色，为阴性；

盐酸小檗碱片的显色结果是黄色，为阴性；

氧氟沙星、加替沙星、诺氟沙星、环丙沙星和培氟沙星的显色结果均为橙红色，为阳性。

方法二的实验结果：

本实施例中的11个样品中，除了甲硝唑对照品、氯霉素标准品和头孢泊肟酯对照品无荧光外，其余样品均有荧光，其中：地塞米松片有微黄色荧光，水杨酸对照品有蓝色荧光，盐酸小檗碱片有暗黄色荧光，氧氟沙星、加替沙星、诺氟沙星和培氟沙星均有黄绿色荧光出现，环丙沙星出现蓝色荧光，因此将无荧光出现的甲硝唑对照品、氯霉素标准品和头孢泊肟酯对照品判定为阴性样品，不再进行后续的显色反应，而其他8种样品均有荧光出现，判定为疑似阳性样品，进行后续的显色反应。

显色结果为：

地塞米松片的显色结果是无色，为阴性；

水杨酸对照品的显色结果是紫红色，为阴性；

盐酸小檗碱片的显色结果是黄色，为阴性；

氧氟沙星、加替沙星、诺氟沙星、环丙沙星和培氟沙星的显色结果均为橙红色，为阳性。

根据方法一和方法二的实验结果可以看出，硫酸铁铵溶液能够专一性地检测喹诺酮类药物，且荧光检测也可以实现对喹诺酮类药物的初筛，继而搭配硫酸铁铵溶液检测，可简化检测操作，提高检测效率。

实施例2最低检测限试验

本实施例选择氧氟沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、帕珠沙星、加替沙星、甲苯磺酸托氟沙星和盐酸恩诺沙星作为待测样品，先分别制备这十二样品的系列浓度溶液，所述浓度为：0.04、0.09、0.15、0.20、0.25、0.30、0.38、0.76、1.52和3.00mg/ml；

按照实施例1中方法一的操作步骤，分别向各待测样品的系列浓度溶液中加入一滴硫酸铁铵溶液，观察显色结果。

从显色结果可以看出，这十二个待测样品的最低检测限均为0.20mg/ml(肉眼可见)，显色结果为淡橙红色至橙红色。

实施例3消痘无痕精华液的检测

本实施例选择市售的消痘无痕套装中的消痘无痕精华液作为待测样品，对其是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测。

待测样品：消痘无痕精华液，水剂，规格为20ml；

显色剂：0.1mg/ml硫酸铁铵溶液(不含硫酸)；

预处理：

(1)取消痘无痕精华液2ml，用滴管加入二氯甲烷1ml，强力振摇30秒，静置，收集下层液体；

(2)向上述下层液体中加入1ml 0.05mol/L盐酸水溶液，强力振摇30秒，静置，收集上层液体；

检测：将上述上层液体中加入1滴0.1mg/ml硫酸铁铵溶液，即显橙红色，判定为阳性，说明本实施例的消痘无痕精华液中含有喹诺酮类药物。

验证试验：将经过预处理的消痘无痕精华液采用本领域常规操作进行高效液相色谱检测，结果证实该消痘无痕精华液中含有氧氟沙星，该结果和本实施例的硫酸铁铵检测一致。

实施例4祛痘消印精华霜的检测

本实施例选择市售的消痘无痕套装中的祛痘消印精华霜作为待测样品，对其是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测。

待测样品：祛痘消印精华霜，霜剂，规格为20g；

显色剂：2mg/ml硫酸铁铵溶液(不含硫酸)；

预处理：

(1)取祛痘消印精华霜1g，用滴管加入二氯甲烷2ml，强力振摇30秒，静置，收集下层液体；

(2)向上述下层液体中加入1ml 1mol/L盐酸水溶液，强力振摇30秒，静置，收集上层液体；

检测：将上述上层液体中加入1滴2mg/ml硫酸铁铵溶液，即显橙红色，判定为阳性，说明本实施例的祛痘消印精华霜中含有喹诺酮类药物。

验证试验：将经过预处理的祛痘消印精华霜采用本领域常规操作进行高效液相色谱检测，结果证实该消痘无痕精华液中含有氧氟沙星，该结果和本实施例的硫酸铁铵检测一致。

实施例5痘痘消皮肤调理修复液的检测

本实施例选择市售的痘痘消皮肤调理修复液作为待测样品，对其是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测。

待测样品：痘痘消皮肤调理修复液，水剂，规格为30ml；

显色剂：20mg/ml硫酸铁铵溶液(含35％硫酸)；

预处理：

(1)取痘痘消皮肤调理修复液2ml，用滴管加入二氯甲烷1ml，强力振摇30秒，静置，收集下层液体；

(2)向上述下层液体中加入1ml 1mol/L盐酸水溶液，强力振摇30秒，静置，收集上层液体；

检测：将上述上层液体中加入1滴200mg/ml硫酸铁铵溶液，不显橙红色，判定为阴性，说明本实施例的痘痘消皮肤调理修复液中不含有喹诺酮类药物。

验证试验：将经过预处理的痘痘消皮肤调理修复液采用本领域常规操作进行高效液相色谱检测，结果证实该痘痘消皮肤调理修复液中不含有喹诺酮类药物，该结果和本实施例的硫酸铁铵检测一致。

实施例6保列康离子态软膏的检测

本实施例选择市售的保列康离子态软膏(保健品)作为待测样品，对其是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测。

待测样品：保列康离子态软膏，膏剂，规格为5ml；

显色剂：400mg/ml硫酸铁铵溶液(含9％硫酸)；

预处理：

(1)取保列康离子态软膏0.1g，用滴管加入二氯甲烷2ml，强力振摇30秒，静置，收集下层液体；

(2)向上述下层液体中加入1ml 0.0005mol/L盐酸水溶液，强力振摇30秒，静置，收集上层液体；

检测：将上述上层液体中加入1滴400mg/ml硫酸铁铵溶液，即显橙红色，判定为阴性，说明本实施例的保列康离子态软膏中含有喹诺酮类药物。

验证试验：将经过预处理的保列康离子态软膏采用本领域常规操作进行高效液相色谱检测，结果证实该保列康离子态软膏中含有氧氟沙星、环丙沙星该结果和本实施例的硫酸铁铵检测一致。

实施例7金列保雄健胶囊的检测

本实施例选择市售的金列保雄健胶囊(保健食品)作为待测样品，对其是否非法添加有喹诺酮类药物进行检测。

待测样品：金列保雄健胶囊，胶囊，规格为0.45g×12粒/板×2板；

显色剂：18mg/ml三氯化铁溶液；

预处理：

(1)取金列保雄健胶囊0.1g，用滴管加入二氯甲烷3ml，强力振摇30秒，静置，收集下层液体；

(2)向上述下层液体中加入1ml 0.05mol/L盐酸水溶液，强力振摇30秒，静置，收集上层液体；

检测：将上述上层液体中加入1滴18mg/ml三氯化铁溶液，即显橙红色，判定为阴性，说明本实施例的金列保雄健胶囊中含有喹诺酮类药物。

验证试验：将经过预处理的金列保雄健胶囊采用本领域常规操作进行高效液相色谱检测，结果证实金列保雄健胶囊中含有氧氟沙星，该结果和本实施例的硫酸铁铵检测一致。

实施例8

本实施例的待测样品有祛痘螨灵霜、醋疗套装消痘无痕精华液、藏药速效逗消膏、痘宁平疤消痕霜和祛痘无痕原液，五种市售产品。

将上述五种待测样品分别采用实施例3所用的预处理方法，先经二氯甲烷萃取，然后用盐酸水溶液浓缩后用于后续检测。

首先将经过上述预处理的五个待测样品进行紫外灯下荧光检视：

祛痘螨灵霜有强荧光，黄绿色；

醋疗套装消痘无痕精华液有强荧光，黄绿色；

藏药速效逗消膏有荧光，黄绿色；

痘宁平疤消痕霜有荧光，黄绿色；

祛痘无痕原液有荧光，黄绿色。

五个样品均出现荧光，因此判定为疑似阳性样品，进行后续的硫酸铁铵溶液检测。

向五个样品中分别滴入一滴200mg/ml硫酸铁铵溶液(含9％硫酸)，祛痘螨灵霜即显橙红色，醋疗套装消痘无痕精华液即显橙红色，藏药速效逗消膏即显橙红色，痘宁平疤消痕霜即显淡橙红色，祛痘无痕原液即显橙红色。

说明本实施例的五个待测样品均为阳性样品，都含有喹诺酮类药物。

Claims (9)

1、一种喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于该方法是将待测样品先用二氯甲烷进行溶解萃取处理后，再用盐酸溶液进行浓缩处理，最后用硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液进行显色反应，根据显色结果实现对喹诺酮类药物的检测。

2、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述盐酸溶液的浓度为0.0005mol/L～1mol/LHCl。

3、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述硫酸铁铵溶液的浓度为0.1～400mg/ml。

4、根据权利要求3所述检测方法，其特征在于所述硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为5～35％。

5、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述三氯化铁溶液的浓度为9～90mg/ml。

6、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液在进行显色反应前，先采用紫外灯下检视荧光对喹诺酮类药物进行初筛。

7、根据权利要求6所述检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)预处理

a.向待测样品中加入二氯甲烷，振摇，静置，收集下层萃取液；

b.向上述萃取液中加入盐酸溶液，振摇，静置，收集上层液体，得到待测样品预处理液；

(2)对上述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行后续显色反应；

(3)向上述有荧光反应的待测样品预处理液中加入硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。

8、一种权利要求1所述检测方法的专用检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含二氯甲烷、盐酸溶液和硫酸铁铵溶液，或包含二氯甲烷、盐酸溶液和三氯化铁溶液。

9、权利要求8所述专用检测试剂盒在检测化妆品、保健品、保健食品、消毒产品或中成药中掺杂喹诺酮类药物，或鉴别喹诺酮类药物及其制剂中的应用。