CN107121428A - 一种喹诺酮类药物的检测方法 - Google Patents

一种喹诺酮类药物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种喹诺酮类药物的检测方法，包括以下步骤：（1）预处理：制备待测样品预处理液；（2）对所述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行显色反应；（3）向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为0.08‑500mg/ml的硫酸铁铵溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。本发明利用硫酸铁按直接与喹诺酮类药物发生鳌合反应，根据反应产物的颜色从而实现了喹诺酮类药物的检测，硫酸铁按与喹诺酮类药物的鳌合反应具有高专属性和高灵敏度；操作简单可快速挑选出疑似阳性样品，将荧光检测和硫酸铁按显色检测两个方法结合起来，对疑似阳性样品进行更加精确地检测。

Description

一种喹诺酮类药物的检测方法
技术领域
本发明涉及一种较大范围，具体是一种喹诺酮类药物的检测方法。
背景技术
喹诺酮类（4-quinolones），又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸（DNA）为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。
喹诺酮类和其他抗菌药的作用点不同，它们以细菌的脱氧核糖核酸（DNA）为靶。细菌的双股DNA扭曲成为袢状或螺旋状（称为超螺旋），使DNA形成超螺旋的酶称为DNA回旋酶，喹诺酮类妨碍此种酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，而使细菌细胞不再分裂。它们对细菌显示选择性毒性。当前，一些细菌对许多抗生素的耐药性可因质粒传导而广泛传布。本类药物则不受质粒传导耐药性的影响，因此，本类药物与许多抗菌药物间无交叉耐药性。
喹诺酮类是主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱（某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用）。
喹诺酮按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代。第一代喹诺酮类，只对大肠杆菌、痢疾杆菌、克雷白杆菌、少部分变形杆菌有抗菌作用。具体品种有萘啶酸（Nalidixic acid）和吡咯酸（Piromidic acid）等，因疗效不佳现已少用。第二代喹诺酮类，在抗菌谱方面有所扩大，对肠杆菌属、枸橼酸杆菌、绿脓杆菌、沙雷杆菌也有一定抗菌作用。吡哌酸是国内主要应用品种。此外尚有新恶酸（Cinoxacin）和甲氧恶喹酸（Miloxacin），在国外有生产。第三代喹诺酮类的抗菌谱进一步扩大，对葡萄球菌等革兰阳性菌也有抗菌作用，对一些革兰阴性菌的抗菌作用则进一步加强。本类药物中，国内已生产诺氟沙星。尚有氧氟沙星（Ofloxacin）、培氟沙星（Perfloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）等。本代药物的分子中均有氟原子。因此称为氟喹诺酮。第四代喹诺酮类与前三代药物相比在结构上修饰，结构中引入8-甲氧基，有助于加强抗厌氧菌活性，而C-7位上的氮双氧环结构则加强抗革兰阳性菌活性并保持原有的抗革兰阴性菌的活性，不良反应更小，但价格较贵。对革兰阳性菌抗菌活性增强，对厌氧菌包括脆弱拟杆菌的作用增强，对典型病原体如肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌以及结核分枝杆菌的作用增强。多数产品半衰期延长，如加替沙星与莫昔沙星。
本类药物的不良反应主要有：①胃肠道反应：恶心、呕吐、不适、疼痛等；②中枢反应：头痛、头晕、睡眠不良等，并可致精神症状；③由于本类药物可抑制γ-氨基丁酸（GABA）的作用，因此可诱发癫痫，有癫痫病史者慎用；④本类药物可影响软骨发育，孕妇、未成年儿童应慎用；⑤可产生结晶尿，尤其在碱性尿中更易发生；⑥大剂量或长期应用本类药物易致肝损害。
喹诺酮类药物被广泛用于人和动物疾病的治疗，由于喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，造成人体疾病对该药物的严重耐药性，影响人体疾病的治疗，俗话说的好，是药三分毒，长期摄入含有喹诺酮类药物的动物源食品，对人体有百害而无一利。
人类长期食用含较低浓度QNs药物的动物性食品、中成药保健食品等，容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药物的临床疗效。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用 。
我国也于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10～500μg/kg。喹诺酮类药物在动物组织中的残留分析方法主要有酶联免疫吸附测定法( EL ISA)、高效液相色谱法(HPLC) 和液相色谱2质谱分析法(LC2MS)。
因此，快速检测喹诺酮类抗菌素成为社会的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种喹诺酮类药物的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种喹诺酮类药物的检测方法，包括以下步骤：
（1）预处理：向待测样品中加入1-3ml的二氯甲烷，振摇4-6分钟，静置5-10分钟，收集下层萃取液；向所述萃取液中加入浓度为0.0004 mol/L-1.2mol/L的盐酸溶液，振摇4-6分钟，静置5-10分钟，收集上层液体，得到待测样品预处理液；
（2）对所述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行显色反应；
（3）向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为0.08-500mg/ml的硫酸铁铵溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。
作为本发明进一步的方案：所述喹诺酮类为恩诺沙星、环丙沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星中的一种或几种。
作为本发明再进一步的方案：步骤（3）中所述硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为10-40%。
作为本发明再进一步的方案：步骤（3）中所述硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为25%。
作为本发明再进一步的方案：步骤（3）中向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为10-100mg/ml的三氯化铁溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。
作为本发明再进一步的方案：所述硫酸铁铵溶液浓度为250mg/ml。
作为本发明再进一步的方案：所述三氯化铁溶液浓度为55mg/m。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用硫酸铁按直接与喹诺酮类药物发生鳌合反应，根据反应产物的颜色从而实现了喹诺酮类药物的检测，硫酸铁按与喹诺酮类药物的鳌合反应具有高专属性和高灵敏度；操作简单可快速挑选出疑似阳性样品，将荧光检测和硫酸铁按显色检测两个方法结合起来，对疑似阳性样品进行更加精确地检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，选择甲硝唑对照品、氯霉素标准品、地塞米松片、水杨酸对照品、恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、恶喹酸对照品、沙拉沙星对照品、双氟沙星对照品、氟甲喹对照品、氧氟沙星对照品、诺氟沙星对照品、丹诺沙星对照品作为待测样品，对这十一种样品进行检测，检测方法分为如下两种：
方法一：
（1）预处理：向待测样品中加入1ml的二氯甲烷，振摇4分钟，静置5分钟，收集下层萃取液；向所述萃取液中加入浓度为0.0004 mol/L的盐酸溶液，振摇4分钟，静置5分钟，收集上层液体，得到待测样品预处理液；
（2）向所述待测样品预处理液中加入浓度为0.08mg/ml的硫酸铁铵溶液，观察显色结果。
方法二：
（1）预处理：向待测样品中加入2ml的二氯甲烷，振摇5分钟，静置7分钟，收集下层萃取液；向所述萃取液中加入浓度为0.05 mol/L的盐酸溶液，振摇5分钟，静置8分钟，收集上层液体，得到待测样品预处理液；
（2）对所述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行显色反应；
（3）向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为200mg/ml的硫酸铁铵溶液，硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为25%，观察显色结果。
方法一的实验结果：
甲硝唑对照品的显色结果是无色，为阴性；
氯霉素标准品的显色结果是无色，为阴性；
地塞米松片的显色结果是无色，为阴性；
水杨酸对照品的显色结果是紫红色，为阴性；
恩诺沙星、环丙沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星的显色结果均为橙红色，为阳性。
方法二的实验结果：
除了甲硝唑对照品和氯霉素标准品无荧光外，其余样品均有荧光，其中:地塞米松片有微黄色荧光，水杨酸对照品有蓝色荧光，恩诺沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星均有黄绿色荧光出现，环丙沙星出现蓝色荧光，因此将无荧光出现的甲硝哩对照品、氯霉素标准品判定为阴性样品，不再进行后续的显色反应，而其他样品均有荧光出现，判定为疑似阳性样品，进行后续的显色反应。
显色结果为：
地塞米松片的显色结果是无色，为阴性；
水杨酸对照品的显色结果是紫红色，为阴性；
恩诺沙星、环丙沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星的显色结果均为橙红色，为阳性。
根据方法一和方法二的实验结果可以看出，硫酸铁按溶液能够专一性地检测喹诺酮类药物，且荧光检测也可以实现对喹诺酮类药物的初筛，继而搭配硫酸铁按溶液检测，可简化检测操作，提高检测效率。
实施例2
本发明实施例中，选择甲硝唑对照品、氯霉素标准品、地塞米松片、水杨酸对照品、恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、恶喹酸对照品、沙拉沙星对照品、双氟沙星对照品、氟甲喹对照品、氧氟沙星对照品、诺氟沙星对照品、丹诺沙星对照品作为待测样品，对这十一种样品进行检测，检测方法分为如下：
（1）预处理：向待测样品中加入3ml的二氯甲烷，振摇6分钟，静置10分钟，收集下层萃取液；向所述萃取液中加入浓度为1.2 mol/L的盐酸溶液，振摇6分钟，静置10分钟，收集上层液体，得到待测样品预处理液；
（2）对所述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行显色反应；
（3）向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为55mg/ml的三氯化铁溶液，观察显色结果。
实验结果：
除了甲硝唑对照品和氯霉素标准品无荧光外，其余样品均有荧光，其中:地塞米松片有微黄色荧光，水杨酸对照品有蓝色荧光，恩诺沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星均有黄绿色荧光出现，环丙沙星出现蓝色荧光，因此将无荧光出现的甲硝哩对照品、氯霉素标准品判定为阴性样品，不再进行后续的显色反应，而其他样品均有荧光出现，判定为疑似阳性样品，进行后续的显色反应。
显色结果为：
地塞米松片的显色结果是无色，为阴性；
水杨酸对照品的显色结果是紫红色，为阴性；
恩诺沙星、环丙沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星的显色结果均为橙红色，为阳性。
根据实验结果可以看出，该结果和本实施例1中的硫酸铁铵检测一致。
因此，本发明在向待测样品预处理液中加入硫酸铁铵溶液或三氯化铁溶液，即显淡橙红色至橙红色，则判定为阳性，待测样品中添加有喹诺酮类药物；其余显色结果判定为阴性，说明待测样品中没有添加喹诺酮类药物。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理：向待测样品中加入1-3ml的二氯甲烷，振摇4-6分钟，静置5-10分钟，收集下层萃取液；向所述萃取液中加入浓度为0.0004 mol/L-1.2mol/L的盐酸溶液，振摇4-6分钟，静置5-10分钟，收集上层液体，得到待测样品预处理液；
（2）对所述待测样品预处理液采用紫外灯下检视荧光，取有荧光反应的待测样品预处理液进行显色反应；
（3）向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为0.08-500mg/ml的硫酸铁铵溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。
2.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，所述喹诺酮类为恩诺沙星、环丙沙星、恶喹酸、沙拉沙星、双氟沙星、氟甲喹、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为10-40%。
4.根据权利要求3所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述硫酸铁铵溶液中加有硫酸，硫酸的体积百分比浓度为25%。
5.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，步骤（3）中向所述有荧光反应的待测样品预处理液中加入浓度为10-100mg/ml的三氯化铁溶液，根据显色结果判断待测样品中有无喹诺酮类药物。
6.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，所述硫酸铁铵溶液浓度为250mg/ml。
7.根据权利要求5所述的喹诺酮类药物的检测方法，其特征在于，所述三氯化铁溶液浓度为55mg/ml。
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