CN101668768B - 制备a2a-腺苷受体激动剂及其多晶型物的方法 - Google Patents

制备a2a-腺苷受体激动剂及其多晶型物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于大规模生产A2A-腺苷受体激动剂的方法，本发明还涉及该化合物的多晶型物、以及分离具体的多晶型物的方法。

Description

制备A2A-腺苷受体激动剂及其多晶型物的方法
本申请是2007年2月2日提交的美国专利申请序列号No.11/701,699的部分继续再申请，其要求享有于2006年5月18日提交的美国临时专利申请序列号No.60/801,857和于2006年5月18日提交的美国专利申请序列号No.60/765,114的优先权，将其全部的公开内容结合于此作为参考。
技术领域
本发明涉及用于大规模制备A2A-腺苷受体激动剂的方法，还涉及该化合物的多晶型物，以及涉及分离具体多晶型物的方法。
背景技术
腺苷是天然存在的核苷，其通过与一个家族的称为A1、A2A、A2B和A3的腺苷受体的相互作用而发挥其生物作用，而这一家族的所有腺苷受体都调节着重要的生理过程。腺苷的生物作用之一是起到冠状血管扩张药的作用；该结果是通过与A2A腺苷受体相互作用产生的。腺苷的这种作用已经发现可以用于心脏造影的助剂，其中冠状动脉在给予造影剂(例如铊201)之前进行扩张，因而通过观察由此形成的造影图像，就能够检测冠状动脉存在或不存在疾病。这种技术的优点是其避免了通过在跑步机(或脚踏车)上锻练而诱使冠状血管扩张的更传统的方法，这些传统方法很显然对于具有冠心病的患者是不合乎要求的。
然而，给予腺苷具有几个缺点。腺苷在人体中半衰期很短(小于10s)，而与A1、A2A、A2B和A3所有的受体激动都具有相关的作用。因此，使用选择性的A2A腺苷受体激动剂将会提供产生冠状血管扩张的上好方法，尤其是半衰期更长且很少或没有副作用的腺苷更是如此。
一类具有这些所需功效的化合物公开于美国专利US No.6,403,567，将其全部公开内容结合于此作为参考。具体而言，在该专利中所公开的一种化合物，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺，已经显示出对于A2A-腺苷受体激动剂具有高度的选择性，目前正用于心脏造影中所用的冠状血管扩张剂的临床试验。
人们对这种和类似的化合物给予了高度关注，对于提供这些物质的高产高纯度的大规模制备的方便方法的合成新方法已经变成所需要的。公开所关注的化合物的专利(美国专利US No.6,403,567)提供了用于制备该化合物的几种方法。然而，尽管这些方法适于小规模合成，但是在该专利中公开的所有合成方法都采用了保护基团，这对于大规模合成是不希望的。
另外，人们已经发现，所需要的产物(即(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺)能够至少以三种不同的晶形存在，最稳定的是单水合物。这种多晶型物在相对湿度的应力条件下直至其熔点的温度是稳定的。因此，在新的合成中生成的最终产物作为稳定的单水合物而获得是合乎需要的。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于大规模制备(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺及其多晶型物优选作为其单水合物的便利的合成方法。因此，在第一方面，本发明涉及结构式I的化合物的制备：
Figure G2007800529263D00031
结构式I
包括：
将结构式(3)的化合物
Figure G2007800529263D00032
与甲胺接触。
在一种实施方式中，反应在甲胺的水溶液中最初在温度约0～5℃下接着通过温热到约50～70℃而进行。可替代地，反应如上但在密封的压力反应器中进行。
在第二实施方式中，通过将产物溶于溶剂例如二甲亚砜中，加入纯水，对由此形成的浆料进行过滤，用水接着用乙醇冲洗过滤器中的内容物，并在不超过40℃的温度下真空干燥剩余的固体，作为纯净的单水合物而分离出产品。
在第二方面，本发明涉及结构式(3)的化合物的制备，
Figure G2007800529263D00041
包括：
将结构式(2)的化合物
与2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯接触。
在一种实施方式中，反应在乙醇中于约80℃的温度下与约1.1摩尔当量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯进行反应。
在第三方面，本发明涉及结构式(2)的化合物的制备，
Figure G2007800529263D00051
包括：
将结构式(1)的化合物
与肼接触。
所使用的肼可以以摩尔计过量14.3～16.7倍，反应可以在约60～65℃的温度下进行。在一种实施方式中，肼首先被加热到约60～65℃，接着加入结构式(1)的化合物。结构式(2)的化合物可以通过以下步骤进行分离：(a)将反应混合物冷却到约40℃，(b)加入4.2～4.9质量当量的水同时将温度维持在约40℃，(c)将混合物冷却至约10℃，并维持该温度至少约1h，(d)过滤，(e)用水再用乙醇冲洗该过滤器的内容物，以及(f)在不超过30℃的温度下真空干燥所剩余的固体至少12h。
以上描述的合成方法适用于所需产品的大规模合成，尽管能够在最终产品中看到一种次要(少量)杂质，但是该方法能够提供高产。该杂质已经证明是未变化的结构式(2)的中间体；即，以下结构式的化合物：
Figure G2007800529263D00061
尽管该杂质能够通过结晶的方法从最终产品中除去，但是仍然决定寻求具有以上合成方法的所有优点而没有给出结构式(2)的化合物作为最终产品中的杂质的替代合成方法。
因此，在第四方面，本发明涉及一种合成(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的方法，
Figure G2007800529263D00071
通过将结构式(4)的化合物与甲胺接触而合成。
在一种实施方式中，反应在甲胺的水溶液中最初在约0～5℃的温度下接着在温热到约50～70℃的温度下而进行。优选反应在密封的压力反应器中进行。
在另一实施方式中，反应在约2.5～7.5℃的温度下进行。
在还有的另一实施方式中，通过将产物溶于溶剂例如二甲亚砜中，加入纯水，过滤由此形成的浆料，用水接着用乙醇冲洗过滤器的内容物，并在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体，而产品作为纯净的单水合物被分离出来。在一些其它的实施方式中，通过(a)在不超过35℃的温度下真空脱气而除去过量的甲胺，(b)释放真空并冷却至0～5℃约15min～1h，(c)过滤由此形成的浆料，(d)先用水接着用乙醇冲洗过滤器的内容物，和(e)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体，作为纯净的单水合物而分离出产品。
在一些实施方式中，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺通过以下步骤被进一步纯化而提供单水合物：(i)在加热至约78～88℃的溶剂如二甲亚砜中溶解该化合物，(ii)从溶液中滤出任何固体杂质，(iii)用另外的溶剂清洗，(iv)向温度维持在约78～88℃的纯水中加入溶液而由此形成浆料，(v)搅拌浆料，(vi)冷却浆料，(vii)过滤，(viii)用水接着用乙醇冲洗过滤器的内容物，以及(ix)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体。
在第五方面，本发明涉及合成结构式(4)的化合物
Figure G2007800529263D00081
的方法，包括：
将结构式(2)的化合物
Figure G2007800529263D00082
与过量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯，优选以摩尔计过量约2～10倍，更优选过量约5～10倍，进行接触。在一种实施方式中，反应在乙醇中于约80℃的温度下进行。2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯以5～10倍过量而存在。
在另一种实施方式中，还提出了合成结构式(4)的化合物的其它方法，包括在酸存在下将结构式(2)的化合物
Figure G2007800529263D00091
与过量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯接触。反应在回流下一般在乙醇中进行。使用HCl作催化剂或不使用HCl作催化剂反应都能发生。所使用的HCl高达0.1摩尔当量，优选过量约0.05摩尔，而所使用的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯以摩尔计过量约5～10倍，优选以摩尔计过量约6.8～7.5倍。该反应的产物可以通过以下步骤进行分离：(a)将全部的反应混合物冷却至约10℃，(b)过滤，(c)用乙醇冲洗过滤器的内容物，以及(d)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体。
附图说明
图1是1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物(晶形A)的1H NMR谱图。
图2显示了(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物的热分析。
图3显示了(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物的X-射线衍射图样。
图4显示了(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺晶形B的X-射线衍射图样。
图5显示了(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺晶形C与晶形A对比的X-射线衍射图样。
具体实施方式
定义和一般参数
正如在本说明书中所使用的，除非在上下文的范围内另外指出，以下词语一般意指具有以下所给出的含义。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况(环境条件)可以发生或者可以不发生，并且这些描述包括其中所述事件或情况(环境条件)发生的实例和其中不发生的实例。
术语“治疗有效剂量”是指，当向需要这种治疗的哺乳动物给药时，正如以下所定义的，结构式I的化合物的量足以发挥治疗作用。这种治疗有效剂量将会根据受试者和所治疗的疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药的方式等而变化，这对于本领域的普通技术人员而言很容易确定。
术语“治疗”或“处治”是指对哺乳动物的疾病进行的任何治疗，包括：
(i)预防疾病，即致使该疾病临床症状不再发展；
(ii)抑制疾病，即控制临床症状的发展；和/或
(iii)缓解疾病，即促使临床症状的消退。
如本文中所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种用于药物活性物质的介质和试剂的使用在本领域是众所周知的。除非任何惯常的介质或试剂与活性成分不相容，其在治疗组合物中的使用都可以设想到。辅助活性成分也能够引入到组合物中。
术语“多晶型物”意指包括(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的无定形物和溶剂化物。
已经发现这种化合物能够以至少三种不同的晶形存在，在本文中称之为晶形A、晶形B、晶形C和无定形产物。
晶形A：这种多晶形物能够通过1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺从质子溶剂例如乙醇或乙醇/水混合物，或从极性溶剂例如二甲亚砜/水中结晶而形成。晶形A已经显示是单水合物，是在室温下各种多晶型物中最稳定的。其在相对湿度应力条件下高至其熔点都是稳定的。
晶形B：这种多晶型物是通过1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺在三氟乙醇中的溶液在室温下真空蒸发而形成。这种晶体的X-射线分析明显不同于其它任何多晶型物(参见图4)，但是很难确定其结构构造(或构型)，因为X射线分析给出的是无序宽峰，且这种多晶型物含有不同含量的水分。已经发现很难可靠地再现这种多晶型物的制备。
晶形C：这种多晶型物通过在60℃下在乙腈中用1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺长时间地调浆而形成。这种晶体的X-射线分析明显不同于其它任何多晶型物(参见图5)。多晶型物C已经显示是易变水合物，在升高温度时就会发生去溶剂化作用而形成不稳定形式。
无定形物质：这种多晶型物通过在温度高达200℃时加热晶形A多晶型物而产生。这种多晶型物在大气湿度存在下是不稳定的，形成易变水合物。
A、B、C和无定形物质的分析技术
X-射线粉末衍射
X-射线粉末衍射(XRPD)分析采用Cu Kα辐射在ShimadzuXRD-6000 X-射线粉末衍射仪上进行。这种仪器装配有精细聚焦X-射线管，而管电压和电流分别设定为40kV和40mA。分散和衍射狭缝设定为1″，而接受狭缝设为0.15mm。衍射辐射通过NaI闪烁检测器检测。采用从2.5-40°2θ以3°/min(0.4s/0.02°步长)θ-2θ连续扫描。硅标准用于检查仪器的校准。数据收集和分析采用XRD-6000 v.4.1软件。
X-射线粉末衍射(XRPD)分析也采用配备有120°的28范围的CPS(弯曲定位灵敏性)检测器的Inel XRG-3000衍射仪。仪器校正采用硅参照标准进行。管压和电流分别设定为40kV和30mA。单色器狭缝设定为5mm×80μm。将样品放置于具有硅插件的铝样品固定器上或玻璃XRPD-质量的毛细管中。每一毛细管都安装到测角器头上，测角器头由马达驱动而允许毛细管在数据获取期间旋转。实时数据采用Cu-Kα辐射以0.03°2θ的解析度(分辨率)来收集。一般而言，数据在300s的时间内收集。仅仅在2.5-40°2θ范围内的数据点显示于标绘的XRPD图上。
热分析
热重(TG)分析在TA仪2050或2950热重分析仪上实施。校准标准是镍和AlumelTM。样品放置于铝样品盘上，插入到TG炉中，精确称重。将样品在氮气氛下以10℃/min的速率加热到300℃或350℃。除非另外指出，样品重量在分析前于TGA炉中在25℃下平衡。
示差扫描量热仪(DSC)分析在TA仪示差扫描量热仪2920上进行。将精确称重的样品放置于卷边的样品盘(crimped pan)或含针孔允许压力释放的气密盘中。每一样品在氮气氛下以10℃/min的速率加热到300℃或350℃。将铟金属用作校正标准。在跃迁最大值时报告温度。
红外光谱
红外光谱在配备有Ever-Glo中/远IR源、扩展范围的溴化钾分光镜和氘代硫酸三甘肽(DTGS)检测器的Magna
Figure G2007800529263D00141
傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪(Nicolet Instrument Corp.)上获得。除非另外指出，将Spectra-Tech，Inc.的漫反射附件(the CollectorTM)用于取样。每一光谱表示在4cm-1的光谱解析度下的256共附加扫描(co-added scans)。对于化合物的样品制备包括将样品放入微皿池中并用毛玻璃片压平物质。背景数据设置用适当位置的校准镜获取。光谱表示样品单光束数据校正对背景单光束数据校正的比率。仪器的波长校准采用聚苯乙烯进行。
NMR谱
化合物的溶液相1H NMR谱在室温下于Bruker model AM-250光谱仪上以5.87T(Larmor频率：1H＝250MHz)进行工作而获取。时-域数据采用5000Hz光谱窗口的7.5ps脉冲宽度和1.6834s获取时间而获得。收集总计16,384个数据点。在瞬态(或过渡，transient)之间采用5s的弛豫延迟时间。每个数据校正一般包含128个共平均过渡。光谱采用GRAMS 132 A1 v 6.00版本的软件处理。自由诱导衰减(FID)为零填充到4倍数据点的数量，并在傅里叶变换前以指数乘以线扩因子0.61Hz。1H谱内参比于加入作为内标的四甲基硅烷(0ppm)。
可替代地，NMR分析按照实施例4中的描述进行。
水分吸收/解析分析
水分吸收/解吸分析数据在VTI SGA-100蒸气吸收分析仪(Vapor Sorption Analyzer)上收集。吸收和解吸数据在氮气流下以10％的RH间隔在5％～95％相对湿度(RK)的范围内收集。氯化钠(NaCl)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用作校准标准。如果重量标准不满足，用于分析的平衡标准是在5min内小于0.0100％重量变化，具有最大平衡时间180min。标绘的数据没有对初始水分含量进行校正。
命名
化合物(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的结构如下：
(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6- 氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的合成
一种用于大规模合成(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的方法如在反应流程I中所示。所有反应一般在氮气氛下进行。
反应流程I
Figure G2007800529263D00161
步骤1-结构式(2)化合物的制备
结构式(2)的化合物由结构式(1)的化合物通过与肼单水合物在没有溶剂存在下反应而制备。反应在约45～55℃的温度下进行。当反应完成时，结构式(2)的产物通过用在其中结构式(2)的化合物具有有限溶解度的质子溶剂例如乙醇或异丙醇搅拌而分离。混合物搅拌约1～5h，然后过滤。固体通过用水搅拌、过滤并用水接着用异丙醇冲洗后真空干燥而进行纯化，其无需纯化就能用于下一步骤中。
步骤2-结构式(3)化合物的制备
结构式(2)的化合物然后通过与约1～1.2摩尔当量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯反应而转化成结构式(3)的化合物。反应在约回流温度下于质子溶剂优选乙醇中进行约2～4h。在冷却至约0℃之后，滤出固体，用冷乙醇冲洗，并减压干燥。结构式(3)的产品无需纯化就可以直接用于下一步骤。
步骤3-最终产品的制备
最终产品由结构式(3)的化合物与甲胺，优选甲胺水溶液进行反应而制备。反应在室温下进行约4h。结构式I的产品通过惯常方式例如过滤、用冷乙醇冲洗固体并在减压下干燥而分离。
原料的制备
(4S，2R，3R，5R)-2-(6-氨基-2-氯嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3，4-二醇用作步骤1的原料。这种化合物可商购获得。
2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯用作步骤2中的原料。其可以商购获得，或可以如下反应流程II中所示来制备。
反应流程II
Figure G2007800529263D00171
其中Et是乙基
3，3-二乙氧基丙酸乙酯在强碱，优选氢化钠存在下与甲酸乙酯反应。反应在约0～5℃下进行约24h。通过惯常方法例如通过加入水并用惯常溶剂例如叔丁基甲基醚萃取杂质、用例如盐酸酸化水相并在减压下从干燥的萃取物中除去溶剂而分离产物。通过减压蒸馏而纯化2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯。
用于大规模合成(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的优选方法如在反应流程III中所示。
反应流程III
Figure G2007800529263D00181
步骤1-结构式(2)化合物的制备
如前所述，结构式(2)的化合物由结构式(1)的化合物通过与肼单水合物在没有溶剂存在下反应来制备。但是，在这种方法中，将以摩尔计过量14.3～16.7倍的肼单水合物首先加热到约60～65℃，接着加入结构式(1)的化合物。在反应期间将温度维持在约60～65℃，而反应进行约1～3h完成。当混合物中残余的结构式(1)的化合物含量不超过约0.10％时，然后将反应混合物冷却至约40℃。在维持温度的同时缓慢加入水。一旦加入约4.2～4.9质量当量的水之后，就将混合物冷却至约10℃，并保持该温度不少于1h。
然后通过过滤、用水冲洗并随后用无水乙醇冲洗而分离出产品。固体在高达30℃的温度下真空干燥不少于12h，然后无需进一步纯化直接用于下一步骤。
步骤2-结构式(4)化合物的制备
结构式(2)的化合物然后通过与过量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯，例如过量2～10倍，优选约5～10倍，理想地约6.8～7.5倍，进行反应而转化成结构式(4)的化合物。反应可以在如反应流程I中的结构式(3)化合物的制备所描述的相同条件下进行。
可替代地，也可以将约0.05摩尔当量的酸如HCl加入反应混合物中。反应允许在回流温度下进行约2～4h，直至残余的结构式(2)化合物的含量不超过0.50％，可形成的任何结构式(3)的化合物的量不超过2.5％。在冷却到约10℃后，滤出固体，用无水乙醇冲洗并在高达40℃下真空干燥以除去残余乙醇。结构式(4)的产品无需纯化就可以直接用于下一步骤。
将结构式(4)的化合物画成(2E)烯烃衍生物，因为这是在该反应中形成的主要异构体。然而，应该注意到，在该反应中也可以形成大量的(2Z)烯烃异构体；即：
命名为(2Z)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基-丙-2-烯酸乙酯。
因此，尽管结构式(4)的化合物仅表示成(2E)烯烃衍生物，但是术语“结构式(4)的化合物”意指包括其中单独是(2E)异构体的情况，和其中主要产物部分是(2E)异构体而次要产物部分(2Z)异构体也存在的情况。无论结构式(4)的化合物是作为(2E)异构体存在还是作为(2E)异构体和(2Z)异构体的混合物存在，结构式(4)的化合物通过按照在步骤3中所描述的与甲胺反应而以相同的方式转化成最终产物。
步骤3-最终产物的制备
最终产物由结构式(4)的化合物通过与甲胺优选甲胺水溶液反应而制备。反应最初在约0～5℃下进行8h，优选在压力反应器中进行，接着在约1h内升温到50～60℃，并维持该温度15～20min。
可替代地，将甲胺首先放入压力容器中并冷却至约2.5～7.5℃，然后加入结构式(4)的化合物，同时维持该温度不变。反应进行到直至残余的结构式(3)的化合物含量低于约0.10％。
一旦反应完成，通过惯常方法例如在不超过约35℃的温度下真空脱气以除去过量的甲胺而分离出产品。然后释放真空并将混合物冷却至0～5℃，并在该温度下保温约15min～1h，接着过滤。由此获得的固体用水接着用乙醇冲洗，并在不超过约40℃的温度下减压干燥。
该方法是作为其单水合物来提供(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的。这种多晶形物能够进一步通过溶解于二甲亚砜中，从溶液中滤出任何固体杂质，用另外的DMSO冲洗，并通过加水而从溶液中沉淀出单水合物而进一步进行纯化。该方法在将DMSO溶液和水加热到约78～88℃并保持在该温度下搅拌约1h时尤其有效。搅拌后，将浆料缓慢冷却至约20℃。然后通过过滤、用水接着用乙醇冲洗、并按先前的描述干燥而分离出最终产品。
实施例1
2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯的制备
Figure G2007800529263D00211
将装配有磁力搅拌棒、热电偶、数字温度计、进气口和出气口以及滴液漏斗的三口或四口圆底烧瓶用氩气吹扫。向滴液漏斗中加入3，3-二乙氧基丙酸乙酯(64.5g)的四氢呋喃溶液。将氢化钠(21.2g的60％分散液)加入到反应烧瓶中，接着加入四氢呋喃。将烧瓶内容物在冰浴中冷却至0～5℃，并加入甲酸乙酯(257g)。将混合物冷却至0～5℃，逐滴滴加滴液漏斗中的内容物，维持内部温度低于5℃。除去冰浴，并将内容物温热到室温。通过TLC分析监测3，3-二乙氧基丙酸乙酯的消耗。反应通过加入冰水(10.6体积)淬灭(中止)，并用甲基叔丁基醚(每次5.4体积)萃取3次，去掉有机层。水相用浓盐酸酸化至pH 1～1.5。酸化的水层用二氯甲烷萃取3次，合并的有机层用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，将残余物真空蒸馏而获得2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯，27.92g，产率70％。
实施例2
A.2-肼基腺苷(2)的制备
Figure G2007800529263D00221
将装配有机械搅拌、进气口、出气口和热电偶的烧瓶用氩气吹扫。加入2-氯腺苷半水合物(53.1g)，接着加入肼单水合物(134g)。混合物搅拌的同时加热至40～45℃持续2h。反应进程通过TLC分析跟踪。当反应完成时，除去热源并加入乙醇(800mL)。将混合物在室温下搅拌2h，然后通过过滤收集沉淀。滤饼用乙醇冲洗，并在减压下干燥30min。将固体转移至装配有机械搅拌的干净烧瓶中，并加入水(300mL)。将悬浮液在室温下搅拌18h，通过过滤分离固体。将滤饼用冰冷的水(300mL)冲洗，接着用冰冷的乙醇(300mL)冲洗。将固体在减压下干燥而提供2-肼基腺苷(41.38g，产率81.4％，纯度99.3％)。
B.2-肼基腺苷(2)的可替代制备法
将装有水合肼(258g，250mL)的反应容器加热到40～50℃.向温热的混合物中分份加入2-氯腺苷半水合物(100g)，维持温度在45～55℃之间。在该温度下保温2h，然后在30min的时间内加入去离子水(500mL)，维持温度在45～55℃之间。然后将混合物在3h内逐渐降温至0～5℃，然后在该温度下再搅拌30min。随后滤出固体，用冷的(2～5℃)去离子水(200mL)冲洗，接着用乙醇(400mL)冲洗。将固体在真空下干燥12h，而获得2-肼基腺苷。
C.2-肼基腺苷(2)的可替代制备法
反应容器充入水合肼(1285g)。将溶液加热至约62℃，并加入2-氯腺苷(500g)，同时维持约62℃的温度。将混合物维持在目标温度62℃至少2h，直至混合物中的残余2-氯腺苷不超过0.10％。将混合物冷却至约40℃，并检查混合物确证固体的存在。缓慢加入水(2275g)，同时维持温度为约40℃。将混合物冷却至约10℃，并维持该温度不少于1h。通过过滤，用水(1195mL)然后用无水乙醇(1885g)冲洗而分离出产品。产品在高达30℃下真空干燥不少于12h，而获得2-肼基腺苷。
实施例3
1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌 呤-2-基}吡唑-4-甲酸乙酯(3)的制备
将2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯(23.93g，0.17mol)装入带有机械搅拌、进气口、出气口和回流冷凝器的烧瓶中。向烧瓶中加入2-丙醇，接着加入2-肼基腺苷(44.45g，0.15mol)。将混合物在搅拌下加热回流2～4h，反应进程用TLC分析跟踪。当判断反应完成时，去除热源，并将混合物冷却至室温。将悬浮液在搅拌下于冰浴中冷却约1.5～2h。将固体通过真空过滤分离，并用冰冷的2-丙醇冲洗。将产品，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-甲酸乙酯，在减压下干燥至恒重。
实施例4
(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6- 氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的制备
Figure G2007800529263D00242
将1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-甲酸乙酯(46.4g)和甲胺(40％水溶液，600ml)的混合物在室温下搅拌约4h，反应进程通过HPLC分析跟踪。在减压下除去大部分过量的甲胺，将剩余混合物在0℃下冷却2h。滤出固体物质，用冰冷的200标准度数的乙醇(定强酒精，proof ethanol)冲洗，并在减压下干燥，而提供作为单水合物的(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺。
该物质的结构通过1H NMR确认(参见图1和以下内容)。热分析(参见图2)提供的结果证实存在1分子的水。还获得了X-射线衍射图(图3)
Figure G2007800529263D00251
1H和13C NMR按照相同的方式获得。将以上获得的物质的两个样品称重并溶解于d6-DMSO-5.3mg用于1H谱，而20.8mg用于13C谱。所有谱图在室温下于JEOL Eclipse+400光谱仪上在400MHz下获得1H谱而在100MHz下获得13C谱。
  标记   13C化学位移(ppm)   1H化学位移(ppm)   多重度，裂分(Hz)
  2   150.5或150.3   -
  4   156.4   -
  4a   117.9   -
  6   140.0   8.41   s
  7a   150.5或150.3   -
  1′   86.9   5.94   D，6.2
  2′   73.7   4.62   m
  2′-OH   -   5.50   D，6.2
  3′   70.5   4.17   m
  3′-OH   -   5.23   D，4.7
  4′   85.7   3.96   m
  5′   61.5   3.67，3.57   m
  5′-OH   -   5.02   D，5.7
  A   140.9   8.07   D，0.8
  B   120.2   -
  C   129.6   8.95   D，0.8
  D   161.7   -
  E   25.6   2.76   D，4.6
  NH2   -   7.77   br
  NH   -   8.35   Q，4.6
实施例5
A.(2E)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2- 基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基丙-2-烯酸乙 酯(4)
Figure G2007800529263D00271
将2-肼基腺苷(100g，0.34mol)、2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯(242g，1.7mol)和无水乙醇的混合物装入反应器中，将混合物加热回流2h。当判断反应完成时，去除热源，并将反应混合物在3小时的时间内逐渐冷却至5～10℃。将浆料在该温度下搅拌30min，并过滤混合物。将固体物质用冷的(5～10℃)无水乙醇冲洗，然后在不超过40℃的温度下真空干燥，而获得(2E)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基丙-2-烯酸乙酯。
B.(2E)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃 -2-基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基丙-2-烯酸 乙酯(4)的替代制法
将反应容器充入2-肼基腺苷(450g)和无水乙醇(11376g)。加入HCl(7.47g)和2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯(1557g)。将混合物加热回流，取样分析直至残余的2-肼基腺苷在混合物中的含量不超过2.5％。将混合物缓慢冷却至约10℃。将产品，结构式(4)的化合物通过过滤分离并用无水乙醇(5121g)冲洗。产品在高达40℃下真空干燥直至残余的乙醇不超过5000ppm，而获得(2E)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基丙-2-烯酸乙酯。
实施例5A的产品的元素分析结果如下：C，48.75％；H，4.86％；N，18.05％；O，27.57。理论值：C，49.72％；H，4.74％；N，18.45％；O，27.09％。分析对应于所需产品半水合物的实验误差限(C，48.89％；H，4.81％；N，18.1％；O，28.12)。
1H和13C NMR谱按以下方式获得。将20.2mg结构式(4)的化合物溶解于约0.75mL的DMSO-d6中，并在室温下于JEOLECX-400NMR光谱仪上在400MHz下获得1H谱而在100MHz下获得13C谱。化学位移参比于DMSO溶剂，对于1H为2.50ppm而对于13C为39.5ppm。
结果
1H和13C化学位移列于表1中。两种异构体在1H和13C谱中观察到比率为约60/30，在表中标记为“主”和“次”。
  原子a   13C化学位移(ppm)   1H化学位移(ppm)   多重度，裂分(Hz)
  21(主)   192.4   9.96   d，3.6
  21(次)   187.6   9.83   s
  22(次)   167.1   -   -
  22(主)   165.2   -   -
  15(次)   161.8   -   -
  15(主)   161.7   -   -
  6(主)   153.1   -   -
  6(次)   152.9   -   -
  2(次)   149.4   -   -
  2(主)   149.3   -   -
  19(次)   148.0   9.22   d，13.0
  4(次)   147.9   -   -
  4(主)   147.8   -   -
  19(主)   147.5   9.26   d，12.4，d，3.6
  8(主)   144.9   8.87   s
  8(次)   144.7   8.85   s
  12   143.1   8.20-8.23   m
  14(次)   132.8   9.20   d，～0.7
  14(主)   132.6   9.12   d，～0.7
  5(主)   120.7   -   -
  5(次)   120.6   -   -
  13   116.7   -   -
  20(次)   107.2   -   -
  20(主)   106.1   -   -
  1′(主)   87.9   6.07   d，5.3
  1′(次)   87.9   6.06   d，5.3
  4′   85.8   4.02   q，3.9
  2′(次)   74.1   4.62   q，～5.4
  2′(主)   74.1   4.61   q，～5.4
  3′   70.1   4.22   q，4～
  5′   61.0   3.62，3.73   m
  23，16   60.3-60.8   4.25～4.39   m
  17，24   14.1-14.2   1.28～1.38   m
  18(主)   -   12.51   d，12.4
  18(次)   -   11.47   d，13.0
  2′-OH(主)   -   5.63   d，6.1
  2′-OH(次)   -   5.62   d，6.1
  3′-OH   -   5.30   d，5.1
  5′-OH   -   5.08   t，5.5
结构式(4)的化合物经确认为以下两种异构体的混合物：
Figure G2007800529263D00301
实施例6
A.由化合物(4)制备(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟 甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺
Figure G2007800529263D00302
将40％甲胺水溶液(1300mL)置于压力反应器中，冷却到0～5℃，加入实施例5A的产品((2E)-3-({9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-2-[4-(乙氧羰基)吡唑基]嘌呤-6-基}氨基)-2-甲酰基丙-2-烯酸乙酯)(100g)。将混合物在0～5℃下搅拌至少8h，监测反应是否完全。当反应完全时，将混合物温热，而维持温度在50～60℃之间1h，然后在1小时的时间内冷却至低于30℃。当温度低于30℃时，混合物采用100～500mmHg的压力脱气，而使温度降低至0～5℃。将混合物在0～5℃下搅拌至少1h，维持压力100～500mmHg。然后中断真空，并用氮气置换，将温度维持在0～5℃下不少于30min。然后滤出固体产物，用水(3×500mL)冲洗，随后用无水乙醇(625mL)冲洗。产品在真空下干燥，不要使温度超过40℃，而获得作为单水合物的(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺。
B.由化合物(4)制备(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟 甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺的 替代制法
压力容器中充入47％甲胺溶液(10080g)。将溶液冷却并加入以上实施例5B中制备的结构式(4)的化合物(600g)，同时维持目标温度5℃。将混合物在目标温度5℃下搅拌，直至残余的结构式(3)化合物的含量在混合物中低于0.10％。将反应混合物在真空下不超过35℃的温度下脱气而除去过量的甲胺。释放真空，将混合物冷却至2.5℃，并维持至少30min。然后通过过滤分离产品，用水(不少于9000g)然后用无水乙醇(不少于2964g)冲洗。在高达40℃的真空下干燥产品直至残余的乙醇不超过5000ppm而获得粗的(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物。
1H和13C NMR谱按照以下方式获得。将实施例6A中获得的物质的两个样品称重并溶解于d6-DMSO中——5.3mg用于1H谱，而20.8mg用于13C谱。所有谱图在室温下于JEOL Eclipse+400光谱仪上获得，在400MHz下获得1H谱而在100MHz下获得13C谱。
  标记   13C化学位移(ppm)   1H化学位移(ppm)   多重度，裂分(Hz)
  2   150.5或150.3   -
4 156.4 -
  4a   117.9   -
  6   140.0   8.41   s
  7a   150.5或150.3   -
  1′   86.9   5.94   D，6.2
  2′   73.7   4.62   m
  2′-OH   -   5.50   D，6.2
  3′   70.5   4.17   m
  3′-OH   -   5.23   D，4.7
  4′   85.7   3.96   m
  5′   61.5   3.67，3.57   m
  5′-OH   -   5.02   D，5.7
  A   140.9   8.07   D，0.8
  B   120.2   -
  C   129.6   8.95   D，0.8
  D   161.7   -
  E   25.6   2.76   D，4.6
  NH2   -   7.77   br s
  NH   -   8.35   Q，4.6
元素分析得到以下结果：C，43.96％；H，4.94％；N，27.94。理论值：C，44.12％；H，4.94％；N，27.44％；O，27.09％。分析对应于单水合物的实验误差限中。
实施例7
A.(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2- 基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物的纯化
将如在实施例4中制备的(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物(100g)在二甲亚砜(300mL)中的溶液通过0.6～0.8μm的预过滤器和0.2μm的过滤器过滤而除去任何固体杂质。然后，搅拌下在1h的时间内将滤液缓慢加入去离子水(1L)中，搅拌由此形成的浆料不少于1h。滤出固体，用去离子水(2×1L)冲洗，并在真空下干燥不少于1h。
干燥的产品然后再次用去离子水(1.5L)制成浆料不少于2h，过滤，并用去离子水(1L)接着用无水乙醇(750mL)冲洗。经纯化的产品在不超过40℃的温度下真空干燥不少于12h，而获得无任何2-肼基腺苷杂质的(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物。
B.(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2- 基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物的可替代 纯化法
将(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物的溶液(400g)溶于DMSO(1320g)中，溶液通过0.6～0.8μm和0.2μm的成线形串联的过滤器过滤。用另外的DMSO(880g)冲洗过滤器系统。将溶液缓慢加入纯水(5000g)中，同时维持目标温度83℃。产品在加入期间开始结晶，将浆料在目标温度83℃下搅拌约1h。将混合物缓慢冷却至20℃。将产品通过过滤并用纯水(8000g)冲洗而分离。
将固体装入容器中，加入纯水(6000g)。将浆料混合约1h。产品通过过滤并用纯水(4000g)接着用无水乙醇(3160g)冲洗而分离。产品在高达40℃下真空干燥直至残余的水含量不超过5.5％，而残余的乙醇不超过2000ppm，从而获得(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺单水合物。

Claims (13)

1.一种合成(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺
Figure FSB00000694062000011
的方法，
通过将结构式(4)的化合物
与含水的甲胺在2.5～7.5℃的温度下接触而合成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在密封压力反应器中进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述产物通过以下步骤进行分离：
(a)在不超过35℃的温度下真空脱气而除去过量的甲胺，
(b)释放真空并冷却至0～5℃15分钟～1小时，
(c)过滤由此形成的浆料，
(d)用水接着用乙醇冲洗所述过滤器的内容物，以及
(e)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基羧酰胺终产物进一步通过以下步骤纯化：
(i)在溶剂中溶解根据权利要求3的步骤(e)的所述干燥固体，
(ii)从溶液中滤出任何固体杂质，
(iii)用另外的溶剂清洗，
(iv)向维持温度为78～88℃的纯水中加入溶液而由此形成浆料，
(v)搅拌所述浆料，
(vi)冷却所述浆料，
(vii)过滤，
(viii)用水接着用乙醇冲洗所述过滤器的内容物，以及
(ix)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(i)和步骤(iii)中所使用的溶剂是二甲亚砜。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在最后产物中残余的水含量不超过5.5％，而残余的乙醇不超过2000ppm。
7.一种合成结构式(4)的化合物
Figure FSB00000694062000031
的方法，包括
将结构式(2)的化合物
Figure FSB00000694062000032
与过量的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯可选地在酸存在下接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应在乙醇中进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其中使用的所述酸是高达0.1摩尔当量的HCl。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应在回流下发生。
11.根据权利要求7所述的方法，其中使用的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯以摩尔计过量5～10倍。
12.根据权利要求11所述的方法，其中使用的2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯以摩尔计过量6.8～7.5倍。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述产物通过以下步骤分离：
(a)将所述全部的反应混合物冷却至10℃，
(b)过滤，
(c)用乙醇冲洗所述过滤器的内容物，以及
(d)在不超过40℃的温度下真空干燥所剩余的固体。
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