CN101647815A - 一种动物骨的仿生酶解产物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物骨的酶解产物及其用途,属中药领域,其特征是采用仿生酶解的方法,取动物骨,粉碎成细粉,加水匀浆后,在适当的条件下,先以胃蛋白酶保温酶解,再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解,所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。本发明产物在治疗骨折、风湿痹痛、腰膝酸软、骨质疏松方面具有良好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药动物骨的仿生酶解产物及其在治疗骨折、风湿痹痛、腰膝酸软和骨质疏松中的应用。属中药领域。
背景技术
动物骨类作为传统中药应用,已有悠久的历史,临床应用很广泛。虎骨在77版中国药典中记载强筋骨、祛风湿、止痛,用于治疗关节疼痛、腰腿酸软无力等症,虎骨最早以药酒剂型始见于《外台秘要》卷15转载南齐徐文伯方的虎骨酒,此后大多方书载有虎骨酒方,初为单用,逐步复方使用,《万病回春》虎骨酒方已达74味,而今北京同仁堂虎骨酒方达147味。狗骨具有健脾和络、活血生肌的功效,《名医别录》谓之“烧灰疗下利,生肌”,主治风湿痹痛、腰腿无力、四肢麻、久痢、疮痰、冻疮,现有学者认为,狗骨还有良好的接骨作用,以狗骨为主药制成的制剂有狗骨胶、狗骨胶药酒、复方狗骨胶、复方狗骨胶药酒、壮骨伸筋胶囊、驳骨丸等。豹骨具有追风定痛,强壮筋骨的功效,性微温,味辛,治筋骨疼痛,风寒湿痹,四肢拘挛、麻木,腰膝酸楚。鹿骨具有补虚羸,强筋骨的功效,味甘,微热,无毒,《别录》中记载“安胎,下气”,《千金·食治》中记载“主内虚,续绝伤,补骨,可作酒”,《唐本草》中记载“主虚劳,可为酒;主风虚,补骨髓”。牛骨甘,温,无毒,《日华子本草》中记载“烧灰,治吐血,鼻洪,崩中,带下,肠风,泻血,水泻”,《纲目》中记载“治邪疟”,内服:烧存性入散剂,外用:烧存性调敷。另外牦牛骨、猪骨、猴骨、羊骨、猫骨、鸡骨等其他动物的骨也多见有报道用于一些疾病的治疗。动物骨类药物的应用现多为醋制后入药或泡酒后服用,在入药的方式上比较传统,由于动物骨质地坚硬,水提时有效成分不易完全提取出来,药材利用率较低,有效成分没有获得充分利用。经现代较为系统的与临床功效相关的生物活性和物质基础评价研究,动物骨中的水溶性蛋白及肽类、游离的氨基酸成分的疗效越来越受到关注。人体经口服动物骨后,经胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化,以小分子肽类成分吸收入血发挥疗效,小分子的寡肽类物质和氨基酸很容易被小肠吸收,而大分子的蛋白类在小肠里也很难被吸收。传统的原粉直接服用,原药粉中大分子蛋白,只有少量在体内经过胃肠道的分解,变成小分子的寡肽而被吸收,由于药材粉碎的细度、胃肠道pH的变化及口服其他食物的干扰造成水解的不完全,有效成分被吸收利用的少,造成大量药材的浪费疗效大大降低。水提的提取工艺使得有大部分不溶入水的蛋白被滤过除去,造成大量的药材浪费,疗效同样大大降低。
应用酶解法水解动物骨蛋白,获得具有一定生理活性的生物活性肽越来越受到人们的关注。由于不同的酶作用的部位不一样,酶解法得到的产物也不一样,用单一的胃蛋白酶或胰酶来酶解,只能使药材中的蛋白部分酶解,药材中的蛋白得不到最大程度的利用,这样就迫切的需要一种仿生的酶解方法——在动物或人体生物进化过程中已被证实、疗效确切、模拟人体的消化过程的仿生酶解方法,将动物骨酶解后得到的有效成分更容易吸收,更加安全的利用,同时更加充分利用原药材。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种更有效的,安全的动物骨仿生酶解产物;本发明的第二目的是提供该提取物在制备治疗骨折、风湿痹痛、腰膝酸软、骨质疏松的药物中的应用。
发明人提供一种动物骨的酶解产物,该产物采用仿生酶解的方法制备:
取动物骨,粉碎成细粉,加水,调节pH至1.0~3.0,加入胃蛋白酶于35~45℃保温酶解0.5~4.0小时,再调节pH至7.5~8.5,加入胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解2~8小时,即得。
进一步优化为:
取动物骨,粉碎成细粉,加水匀浆,调节pH至1.5~2.5,加入动物骨量的0.5%~5%的胃蛋白酶于35~45℃保温酶解1~3小时,再调节pH至7.5~8.5,加入动物骨量的0.5%~5%的胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解3~6小时,即得。
较优的制备方法为:
取动物骨,粉碎成细粉,加水匀浆,调节pH至2.0,加入动物骨量的1%~2%的胃蛋白酶于40℃保温酶解1~3小时,再调节pH至8.0,加入动物骨量的1%~2%的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3~6小时,即得。
发明人经过试验筛选,动物骨药材细粉加水匀浆后,可预先加热至80~100℃,保温15~30分钟,再降温至酶解所需温度,按以上操作酶解,其效果更佳。按本发明技术方案进行酶解,当胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g,胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg,胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0时,效果较为充分;酶活力越高,酶解速度越快、效果越好。
经现代研究证明,动物骨中的肽类成分也是有效部位。人体经口服动物骨后,经胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化,以小分子肽类成分吸收而发挥疗效。发明人根据人体口服动物骨等动物药的过程,创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法,先后对原料进行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解,和人体直接口服药材原粉比较,所得被小肠吸收消化的有效物质群相同,但体外酶解选择较优的试验条件,酶解的更充分,再口服所得的药效更强,酶解成寡肽或小分子的活性部位群经注射或粘膜、皮肤等途径给药时更容易被吸收,免疫原性更低,更有效。经过试验筛选,单独以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解动物骨,效果均优于直接口服,但都低于本发明的仿生酶解方法,本发明方法在很大程度上增强了动物骨等动物药的疗效,而且由于以小分子寡肽的形式入药,口服给药是吸收更充分,发挥疗效迅速,增强疗效,值得推广应用。
本领域技术人员可以方便地将本发明酶解产物配合适当的辅料,制备成各种常规制剂,如:
a、将酶解液滤过直接喷雾干燥,加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂或片剂。
b、将酶解液滤过浓缩成稠膏,加入适量的糖粉和糊精制成颗粒剂。
本发明提供的动物骨酶解产物可以单独使用,也可以与其他药物成分联合使用,即:在药物活性成分中,可以只有该产物,还可以是其与其他药物的混合物,达到配合治疗、辅助治疗的目的。
本发明中所用的原料除动物骨外,还可以是动物的皮、腱、韧带及角膜。
本发明动物骨酶解产物可以用于骨折、骨质疏松、腰膝酸软、软骨损伤、风湿痹痛、骨关节炎等骨科疾病的治疗。
有益效果
为进一步验证本发明产物的治疗作用,发明人进行了“促进骨折愈合的实验研究”,实验中的“仿生酶解组”即为按本发明技术方案制得的相应的动物骨酶解产物:
1、材料
1.1动物 家兔,购自山东大学动物实验中心。
1.2试剂 胃蛋白酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20070914;胰蛋白酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20071228;胰酶,购自国药集团化学试剂有限公司,批号:F20071130。
1.3供试样品的制备 未酶解组:取狗骨药材细粉(80目)50g,加入10倍量生理盐水,匀浆30分钟,搅匀,取1/5量,滤过,即得;
胃蛋白酶酶解组:取1/5匀浆液,加入狗骨药材量的1%胃蛋白酶,同时调节pH至2.0,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,滤过,即得;
胰蛋白酶酶解组:取1/5匀浆液,加入狗骨药材量的1%胰蛋白酶,同时调节pH至8.0,温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,滤过,即得;
胰酶酶解组:取1/5匀浆液,加入狗骨药材量的1%胰酶,同时调节pH至8.0,温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,滤过,即得;
仿生酶解组:取1/5匀浆液,加入狗骨药材量的1%胃蛋白酶,同时调节pH至2.0,温度为40℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,然后调pH至8.0,加入狗骨药材量的1%胰蛋白酶,温度为50℃±2℃,保温同时搅拌酶解4h,85℃保温20min,放冷,滤过,即得;
空白对照组:即生理盐水组。
2、方法与结果
2.1试验方法 3%戊巴比妥麻醉(30mg/kg/iv),用两条线锯并拢,将左桡骨中段锯断,造成2mm缺损,骨折位于旋前园肌肌止点的远端,不做任何外固定。术后当日随机分空白组、未酶解组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、胰酶酶解组、仿生酶解组,每组10只,即开始给药(1.0g/kg)。家兔分别于术后1、2、3、4W在相同条件下拍伤肢X线平片,以观察骨痂出现的时间和数量,用“-”表示无骨痂形成;“+”表示骨折边缘趋向模糊,有少量骨痂出现;“++”表示骨折边缘明显模糊,有中等量的骨痂出现;“+++”表示骨折边缘接近消失,有较多的骨痂出现;“++++”表示骨折边缘基本消失,两骨折端已完全连接,有大量密度高的骨痂,密度接近正常骨。
2.2试验结果:
表1 给药1周对骨痂形成的影响
表2 给药2周对骨痂形成的影响
表3 给药3周对骨痂形成的影响
表4 给药4周对骨痂形成的影响
上述试验结果表明,酶解组对骨折愈合的效果好于空白组,仿生酶解组的效果优于单酶酶解组,仿生酶解组对骨折愈合有明显效果。
具体实施方式
下面列举实施例,进一步说明本发明,各实施例仅用于说明本发明,并不限制本发明:
实施例1
取狗骨500g,粉碎成细粉,加10倍量水匀浆,调节pH至2.0,加入狗骨量的1%的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,调节pH至8.0,加入狗骨量的1%的胰酶于50℃保温酶解4小时,喷雾干燥,加入适量的糖粉和糊精,制粒,干燥,整粒,制成颗粒剂。
实施例2
取猪骨500g,粉碎成细粉,加8倍量水匀浆,调节pH至2.6,加入猪骨量的2%的胃蛋白酶于37℃保温酶解3小时,调节pH至7.5,加入猪骨量的2%的胰蛋白酶于40℃保温酶解6小时,喷雾干燥,加入适量的微晶纤维素,制粒,干燥,整粒,压制成片。
实施例3
取牦牛骨500g,粉碎成细粉,加15倍量水匀浆,调节pH至3.0,加入牦牛骨量的5%的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时,调节pH至8.5,加入牦牛骨量的5%的胰蛋白酶于45℃保温酶解5小时,喷雾干燥,加入适量的糖粉和糊精,制粒,干燥,整粒,制成颗粒剂。
实施例4
取牛骨500g,粉碎成细粉,加15倍量水匀浆,调节pH至2.5,加入牛骨量的5%的胃蛋白酶于40℃保温酶解2.5小时,调节pH至8.5,加入牛骨量的5%的胰蛋白酶于45℃保温酶解5小时,喷雾干燥,加入适量的淀粉,制粒,干燥,整粒,填装胶囊。
实施例5
取虎骨500g,粉碎成细粉,加10倍量水匀浆,调节pH至2.5,加入虎骨量的2%的胃蛋白酶于37℃保温酶解3小时,调节pH至8.0,加入虎骨量的2%的胰蛋白酶于40℃保温酶解6小时,喷雾干燥,加入适量的微晶纤维素,制粒,干燥,整粒,压制成片。
实施例6
取狗骨300g、三七150g、红花50g,狗骨粉碎成细粉,加10倍量水匀浆,调节pH至3.0,加入狗骨量的2%的胃蛋白酶于37℃保温酶解3.5小时,调节pH至8.0,加入狗骨量的2%的胰蛋白酶于40℃保温酶解6小时,喷雾干燥,得干粉;三七、红花加水提取两次,第一次加水10倍量,第二次加水8倍量,每次1小时,合并水提液浓缩至药材∶药液=1∶2,加乙醇至乙醇含量至60%,乙醇液回收乙醇并浓缩至相对密度约1.5(60℃),加入狗骨仿生酶解液喷干粉,加入适量的微晶纤维素,制粒,干燥,整粒,压制成片。
实施例7
取实施例1所制颗粒治疗风湿痹痛患者85例。
本组85例,其中男38例,女47例;年龄17~76岁;
病程:1年以下者21例,1~5年者37例,5年以上者27例;
中医辨证分类:行痹26例,痛痹39例,着痹20例。
诊断依据:参照国家中医药管理局1994年发布的《中医病证诊断疗效标准》中风湿痹证的诊断依据拟定。(1)以四肢关节走窜疼痛为主,伴重着、酸楚、麻木、关节屈伸不利;(2)实验室检查:血沉增快,抗链球菌溶血素“O”>500u。
证候分类:(1)行痹(风邪偏胜):肢体关节肌肉疼痛,游走不定,屈伸不利,舌苔薄白,脉浮;(2)痛痹(寒邪偏胜):肢体关节疼痛较剧,遇寒加重,得热痛减,昼轻夜重,关节屈伸不利,痛处不红,触之不热,舌苔白滑,脉弦紧;(3)着痹(湿邪偏胜):肢体关节重着酸痛,痛处固定,下肢为甚,或有肿胀,肌肤麻木,天气变化或阴雨时加重,舌苔白腻,脉濡缓。
治疗方法:(1)口服给药,每天服用量相当于15g原药材量;(2)指导患者进行适当功能锻炼;(3)适宜配合理疗方法,缩短疗程,提高疗效。30天为1疗程,治疗2疗程进行疗效评定。
疗效标准:参照《中医病证诊断疗效标准》中的有关标准拟定。
临床治愈:关节疼痛、肿胀消失,活动功能恢复正常,实验室检查结果正常;好转:关节疼痛、肿胀减轻,活动功能好转,实验室检查结果有所改善,未愈:关节疼痛、肿胀及实验室检查结果均无改善。
治疗结果:本组85例中,临床治愈32例(37.64%),好转49例(57.66%),未愈4例(4.7%),总有效率为95.3%。
实施例8
取实施例3所制颗粒治疗骨质疏松症的临床观察。
共观察治疗60例,随机分为治疗组37例,其中男11例,女26例;年龄52岁~82岁,平均64.7岁;5例发生腰椎压缩性骨折,CT示椎管完整无神经压迫症状,3例有腰椎椎体压缩性病变,2例发生股骨粗隆间骨折;对照组23例,其中男7例,女16例;年龄48岁~80岁,平均63.2岁;7例有腰椎侧弯或(和)椎体压缩改变,1例椎体压缩性骨折,CT检查示椎管未受压,2例桡骨远端骨折。
按照1999年10月通过的中国人骨质疏松症建议诊断标准:全身、腰椎或股骨颈任一处骨密度(BMD)低于正常同性别峰值骨量2.0SD为骨质疏松。
纳入标准:患者3~6个月内未采用性激素和相关药物治疗,临床确诊为骨质疏松症。
排除标准:肝肾功能严重损害者;内分泌代谢疾病,包括糖尿病、甲状腺功能亢进、类风湿性关节炎等。
治疗方法:治疗组:实施例3所制颗粒,口服给药,每日服用量相当于10g原药材。对照组:采用骨合注射液(南京新百药业有限公司,5ml/支)10ml静脉滴注,每日1次;两组均治疗3个月为1个疗程。
观察指标:测量骨矿含量(BMD),测定腰椎2~4、股骨大转子的BMD,以g/cm2表示。结果如表5所示:
表5 两组治疗前后BMD比较
与本组治疗前比较,**P<0.05;与对照组治疗后比较,ΔΔP<0.05。
结果显示,治疗组经治疗后骨矿含量发生明显增长。
Claims (10)
1、一种动物骨的仿生酶解产物,其特征在于该产物是按以下方法制备的:
取动物骨,粉碎成细粉,加水,调节pH至1.0~3.0,加入胃蛋白酶于35~45℃保温酶解0.5~4.0小时,再调节pH至7.5~8.5,加入胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解2~8小时,即得。
2、根据权利要求1所述的动物骨酶解产物,其特征在于该产物是按以下方法制备的:
取动物骨,粉碎成细粉,加水匀浆,调节pH至1.5~2.5,加入动物骨量的0.5%~5.0%的胃蛋白酶于35~45℃保温酶解1~3小时,再调节pH至7.5~8.5,加入动物骨量的0.5%~5.0%的胰酶或胰蛋白酶于40~50℃保温酶解3~6小时,即得。
3、根据权利要求2所述的动物骨酶解产物,其特征在于该产物是按以下方法制备的:
取动物骨,粉碎成细粉,加水匀浆,调节pH至2.0,加入动物骨量的1%~2%的胃蛋白酶于40℃保温酶解1~3小时,再调节pH至8.0,加入动物骨量的1%~2%的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3~6小时,即得。
4、根据权利要求1至3中任一所述的动物骨酶解产物,其特征在于将动物骨粉碎成细粉加水匀浆后先加热至80~100℃并保温15~30分钟,再降温至所需温度进行酶解。
5、根据权利要求1至3中任一所述的动物骨酶解产物,其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g,胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg,胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0。
6、根据权利要求1至5中任一所述的动物骨酶解产物中的动物骨可以是狗骨、虎骨、豹骨、鹿骨、猴骨、牛骨、猪骨、羊骨、牦牛骨、猫骨、鸡骨、鼠骨。
7、根据权利要求1至5中任一所述的动物骨酶解产物,其特征在于加入常规药用辅料制成口服制剂。
8、权利要求1至5中任一所述的动物骨酶解产物在制备用于治疗骨折的药物中的应用。
9、权利要求1至5中任一所述的动物骨酶解产物在制备用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软的药物中的应用。
10、权利要求1至5中任一所述的动物骨酶解产物在制备用于治疗骨质疏松的药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100217 |