CN101647391B - 一种东方百合试管鳞茎的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种东方百合试管鳞茎的培育方法。本发明采用含有0.1-10.1mg·L-16-苄基嘌呤；0.1-10.0mg·L-1萘乙酸的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基，在25℃黑暗条件下培养，直接从外植体上诱导出百合小鳞茎，再经过两次继代培养，5个月后形成周径在4-5cm，重量在1.5g以上的试管鳞茎，将这种鳞茎经6-BA结合10-15℃变温处理8-15天，再经3-5℃低温冷藏50-70天解除休眠，种入田间后抽茎率在95％以上，经过一个生长周期后鳞茎周径达到10-12cm。本发明通过对试管鳞茎形态发育的调控，经6-BA结合变温诱导，低温解除休眠，提高了东方百合试管鳞茎在田间的抽茎率，使鳞茎膨大速度提高至原来的一倍，将脱毒原种的培育时间由原来的3个生长周期缩短至2个，使生产成本降低了将近1/3。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术，具体的说，涉及到一种东方百合试管鳞茎的培育方法。
背景技术
百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)具有地下鳞茎的多年生球根花卉，是世界著名的观赏花卉之一，在国际花卉市场占有重要地位。近年来我国百合切花产业迅猛发展，然而，百合种球却一直依赖进口。
脱毒百合试管鳞茎的生产及种植是百合种球商业化生产的核心步骤之一。周径在3-5cm的试管鳞茎经过一个生长周期(6-7个月)后，周茎会长到6-9cm。这种大小的鳞茎再经过一个生长周期，周径会达到10-12cm，必须经过第三个生长周期鳞茎周径才能达到16-18cm，形成脱毒原种，进一步进行鳞片扦插。因此，从百合试管鳞茎到脱毒原种一般需要3个生长周期。
已有研究表明，若试管鳞茎在第一个生长周期可以生长到8-10cm的周径，则在第二个生长周期鳞茎周径即可达到16-18cm，这样可将脱毒原种的培育时间缩短至2个周生长期，节约将近1/3的生产成本。
试管鳞茎在第一个周期的生长速度，主要取决于试管鳞茎的大小和鳞茎在田间的萌发方式。目前，我国百合试管鳞茎生产大多采用诱导丛生芽-分切丛生芽-鳞茎膨大生根的技术路线，这种方式生产的鳞茎会生成较多的鳞片叶，导致鳞片生长瘦弱，鳞茎膨大缓慢。一般由外植体诱导到长成周径3cm左右的鳞茎需要5-6个月的时间，而且，这种生产方式通常需要光照培养，对能源的需求量很大，生产成本也很高。
试管鳞茎在田间的萌发方式有两种，一种是抽茎，一种是不抽茎，同样大小的试管鳞茎抽茎的生长速度大约是不抽茎的一倍(MerelLangens-Gerrits，2000)。
因此，提高试管鳞茎的抽茎率对于加快鳞茎的生长速度至关重要。目前，国内对试管鳞茎的发育机理以及休眠解除机理的研究尚不清楚，对于试管鳞茎抽茎技术的研究尚处于空白阶段。
本发明是在研究试管鳞茎发育及休眠解除机理的基础上，提出一种提高东方百合试管鳞茎田间抽茎率，缩短百合商品种球生产时间的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种东方百合试管鳞茎的培育方法。
本发明所述的培育方法是从百合外植体鳞片上直接诱导鳞茎的生成，经过两次继代培养，每次2-3个月，形成试管鳞茎，采用的诱导培养基和继代培养基为含有0.1-10.1mg·L-16-苄基嘌呤(简称6-BA)；0.1-10.0mg·L-1萘乙酸(简称NAA)的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基。
为保证鳞茎的迅速膨大，所述诱导培养和继代培养都为暗培养，培养温度为20-28℃。经过两次继代培养，试管鳞茎的周径可达4-5cm，重量在1.5g以上。
本发明所述培育方法还包括将所述试管鳞茎在诱导抽茎培养基中，温度为10-15℃变温处理8-15天；所述诱导抽茎培养基为含有0.1-10.1mg·L-16-BA的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基。
实验证明，在试管鳞茎出瓶前一阶段，即结束两次继代培养后，通过含有6-BA的培养基结合10-15℃变温处理8-15天，改变了试管鳞茎生长原基的发育方式，诱导茎尖生长锥细胞纵向垂周分裂，细胞形态见图2所示。
本发明所述培育方法还包括将变温处理后的试管鳞茎在3-5℃低 温冷藏50-70天解除休眠，然后栽种。
经过上述步骤得到的试管鳞茎栽种后可在一周后萌发，抽茎率达到95％以上，生长7个月后鳞茎周径达到10-12cm。
本发明中，采用的MS培养基为固体或液体培养基，其基本配方为：配制1升(1000毫升)培养基，加硝酸铵1.65g、硝酸钾1.9g、氯化钙0.44g、硫酸镁0.37g、磷酸二氢钾0.17g、碘化钾0.83mg、硼酸5.2mg、硫酸镁22.3mg、硫酸锌3.6mg、钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钴0.025mg、硫酸铁27.8mg。琼脂6g和蔗糖30g，液体培养基中不含琼脂，优选固体培养基。
与以往诱导丛生芽-分切丛生芽-鳞茎膨大生根的生产方式相比，本发明直接从外植体诱导鳞茎生成，并采用黑暗培养的方式使鳞茎不生成叶片，更有利于鳞茎的膨大，且减少了能源消耗，降低了生产成本；然后变温处理，诱导茎尖生长锥细胞纵向垂周分裂，再经5℃低温9周解除休眠，栽种到草炭-珍珠岩-沙子(7∶2∶1)的基质中，2周后，抽茎率可达95％以上。
本发明通过对试管鳞茎在组培阶段形态发育的调控，6-BA结合变温诱导，低温解除休眠，提高了东方百合试管鳞茎在田间的抽茎率，使鳞茎膨大速度提高至原来的一倍，将脱毒原种的培育时间由原来的3个周期缩短至2个，使生产成本降低了将近1/3，在百合种球生产中具有广泛应用前景，尤其适用于东方百合，特别是东方百合“西伯利亚”品种的试管鳞茎的培育。
附图说明
图1为试管鳞茎的生成。
图2为试管鳞茎在诱导抽茎前后茎尖生长锥细胞形态比较，其中左图：未抽茎；右图：抽茎。
图3为试管鳞茎在田间栽种后抽茎与未抽鳞茎的比较，其中左图：未抽茎；右图：抽茎。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
配置蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
选取东方百合西伯利亚(Siberia)品种无病、无外伤健康种球，将外层鳞片剥去，留出种球中间部分的鳞片，在0.1％的升汞溶液中消毒6分钟，用无菌水冲洗3遍备用
(1)以试管鳞茎的鳞片作为鳞茎再生的起始外植体，直接诱导鳞茎生成。诱导培养基为含有1mg·L-16-BA，0.1mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
(2)2个半月后将再生的鳞茎从母鳞片上剥下来，放入继代培养基中培养，每次继代培养时间为75天，培养两次，得到的鳞茎见图1的照片所示，继代培养基为含有0.5mg·L-16-BA，0.2mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
(3)将继代培养两次的试管鳞茎(周径5cm左右；重量1.5-2.0g)放在诱导抽茎的培养基(含有0.2mg·L-16-BA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基)中，15℃变温处理2周。
(4)5℃低温处理9周，解除休眠。
(5)将解除休眠后的鳞茎种到草炭-珍珠岩-沙子(7∶2∶1)的基质中。
(6)鳞茎抽茎率达95％以上，而常规方法进行两次继代培养的百合鳞茎没有抽芽，对比结果见图3所示。
(7)生长7个月后，鳞茎周径可达11-12cm，收获。
实施例2
选取东方百合“索邦”品种无病、无外伤健康种球，将外层鳞片剥去，留出种球中间部分鳞片，在0.1％的升汞溶液中消毒6-10分钟，用无菌水冲洗3-4遍备用
(1)将消毒过的鳞片作为起始外植体，接种在含有 1.5mg·L-16-BA，0.5mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
(2)3个月后将再生的鳞茎从母鳞片上剥下来，放入继代培养基中培养。继代培养基为含有1mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基，每次继代培养时间为3个月。
(3)将继代培养两次的试管鳞茎放在诱导抽茎的培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+60g·L-1蔗糖)中，15℃变温处理2周。
(4)4℃低温处理9周，解除休眠。
(5)将解除休眠后的鳞茎种到草炭-珍珠岩-沙子(7∶2∶1)的基质中。
(6)鳞茎抽茎率达95％以上。
(7)生长7个月后，鳞茎周径可达11-12cm，收获。
实施例3
选取东方百合西伯利亚(Siberia)品种无病、无外伤健康种球，将外层鳞片剥去，留出种球中间部分的鳞片，在0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，用无菌水冲洗4遍备用
(1)以试管鳞茎的鳞片作为鳞茎再生的起始外植体，直接诱导鳞茎生成。诱导培养基为含有8mg·L-16-BA，7.5mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
(2)2个半月后将再生的鳞茎从母鳞片上剥下来，放入继代培养基中培养，每次继代培养时间为80天。继代培养基为含有7mg·L-16-BA，8.5mg·L-1NAA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基。
(3)将继代培养两次的试管鳞茎(周径5cm左右；重量1.5-2.0g)放在诱导抽茎的培养基(含有8.5mg·L-16-BA的蔗糖含量为60g·L-1的MS固体培养基)中，10℃变温处理10天。
(4)4℃低温处理8周，解除休眠。
(5)将解除休眠后的鳞茎种到草炭-珍珠岩-沙子(7∶2∶1)的 基质中。
(6)鳞茎抽茎率达95％以上。
(7)生长7个月后，鳞茎周径可达11-12cm，收获。
Claims (2)
1.一种东方百合试管鳞茎的培育方法，其特征在于，从百合外植体鳞片上直接诱导鳞茎的生成，诱导鳞茎的时间为2个半月或3个月，经过两次继代培养，每次2-3个月，形成试管鳞茎；采用的诱导培养基为含有1.0-8.0mg·L-16-苄基嘌呤和0.1-7.5mg·L-1萘乙酸的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基；采用的继代培养基为含有0.5-7.0mg·L-16-苄基嘌呤和0.2-8.5mg·L-1萘乙酸的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基；其中，诱导培养和继代培养都为暗培养，培养温度为20-28℃；
将所述试管鳞茎在诱导抽茎的培养基中，温度为10-15℃变温处理8-15天；所述诱导抽茎的培养基为含有0.2-8.5mg·L-16-BA的蔗糖含量为60g·L-1的MS培养基；
将变温处理后的试管鳞茎在3-5℃低温冷藏50-70天解除休眠，然后栽种。
2.如权利要求1所述的培育方法的应用，其特征在于，用于培育东方百合“西伯利亚”品种的试管鳞茎。
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