CN101642465A - 广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用 - Google Patents
广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。本发明公开了广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。广东海风藤多糖是从植物广东海风藤Kadsura heteroclita(Roxb.)Craib中提取分离得到的。本发明的优点在于:发掘了广东海风藤多糖在预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的用途,安全性高,疗效显著,可长期限服用;原料来源丰富、价廉并可制成各种剂型。
Description
技术领域
本发明涉及广东海风藤多糖在制药中的应用,具体涉及广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。
背景技术
广东海风藤为五味子科南五味子属植物异型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.)Craib的干燥藤茎,临床用于风湿痹痛、关节不利、筋脉拘挛等症的治疗。化学成分研究表明,广东海风藤含有木脂素、三萜酸、多糖、挥发油等多种有效成分,其中对于广东海风藤多糖的药物用途未见报道。
目前,全世界老年痴呆(即阿尔茨海默病)患者已达到1800万人,预计未来25年内老年痴呆患者将达到3400万人,其中66%来自发展中国家。在我国,60岁以上人群已超过总人口的10%,并且仍在继续快速增长。流行病学调查显示,60岁以上增长率为3.2%,80岁以上增长率为5.4%。为此,中国老龄委员会将“老年期痴呆早期诊断研究”列入了1996-2000年国家“九五”攻关课题;2000年“九七三”课题中有“衰老”的基础研究;2001年开始的“十五”攻关课题中确立了老年期痴呆的课题。国家“九五”攻关课题研究发现,中国老年期痴呆的患病率与其他国家相近,60岁组约占5.22%,且随年龄增高而增高,每长5岁,发病率就增1倍。据此计算,我国60岁以上老年痴呆患者应超过500万,相当于世界总老年痴呆患者的四分之一。
老年痴呆患者已给家庭和社会造成沉重负担。由于其病程5-10年,从记忆减退、认知障碍,到人格改变、生活不能自理,整个过程均耗资不菲。在美国,治疗老年痴呆所需的社会费用已达到1000亿美元,并且随着患者认知功能的下降,看护费用还在不断增长。在我国,据北京市老龄协会的一份调查报告,一个家庭用于患重度老年痴呆症、生活不能自理的老人的护理费用,一年约为2万元。因此,我国用于治疗老年痴呆的费用每年将不低于数百亿元人民币。
但现有老年痴呆症治疗药物的中远期效果不理想、毒副作用强、价格昂贵。而从中药和天然药物中寻找预防和/或治疗老年痴呆症的有效成分制备药物已越来越成为精神神经系统医学家和药物学家的共识。
发明内容
本发明的目的在于提供广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。
为实现上述目的,本发明对广东海风藤多糖预防和/或治疗老年性痴呆症的作用及机理方面进行了全面而深入地研究,结果发现广东海风藤多糖具有神经细胞保护作用、对抗β-淀粉样蛋白作用、胆碱酯酶抑制作用;即广东海风藤多糖可在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中应用。
上述应用具体可以是提供一种具有预防和/或治疗老年性痴呆症的药物,该药物的活性成分包括广东海风藤多糖。
上述药物的活性成分中还可包括治疗和/或预防老年痴呆症的公知药物。
上述药物可包括药学上可接受的载体,如:淀粉、糊精、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。还可以按需选择可药用的辅剂、助剂等。
上述任何一种药物的剂型可以是适合临床使用的任何一种剂型,例如:可以是口服给药的剂型,如片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等;也可以是非口服给药的剂型,如注射剂、粉针剂等;还可以是局部给药的剂型,如软膏剂、栓剂等。
在本发明提供的应用中,所述的广东海风藤多糖应该是通过任何可行方法从广东海风藤中获得的一类多糖类物质。其形式可以是一种水提取物或其他形式的提取物;也可以是将广东海风藤多糖提取物经任何方法降解制得的不同分子量的产物。
优选地,上述广东海风藤多糖提取物的分子组成中包括D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和D-半乳糖中的任一种或任意几种。
本发明与现有技术相比,具有如下优点:
1、安全性高,可长期服用。本发明经过急性毒性和长期毒性试验,结果表明广东海风藤多糖毒性低、有效剂量低,用量小,可长期服用。适用于老年性痴呆症患者的临床用药特点和要求。
2、针对病因发挥作用。目前老年痴呆症治疗药物效果不理想,其主要原因为没有针对发病的根本原因发挥作用。研究表明:与老年性痴呆发病有关的毒性蛋白——β-淀粉样蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)引起突触、突起溃变,甚至神经元死亡,使神经网络遭到破坏,导致大脑整合机能异常,其中包括多种神经递质系统的改变,是引发老年痴呆症的“源头”,本发明将广东海风藤多糖用于制备预防和/或治疗老年痴呆症的药物,可以在“源头”上阻止Aβ的过度产生,达到“治本效果”。同时还具有神经营养作用,保护神经细胞不受损伤,从而达到预防老年痴呆症发病的效果。
附图说明
图1是PBS对照组、Aβ1-42组和Aβ1-42+实施例1广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、0.625、1.25μg·mL-1)中存活细胞数量的变化;
与PBS组相比,*:P<0.05,**:P<0.01;
图2是PBS对照组、Aβ1-42组和Aβ1-42+实施例2广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、0.625、1.25μg·mL-1)中存活细胞数量的变化;
与PBS组相比,*:P<0.05,**:P<0.01;
图3是PBS对照组、Aβ1-42+实施例2广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、0.625、1.25μg·mL-1中)Aβ1-42的浓度变化;
与PBS组相比,*:P<0.05,**:P<0.01;
图4是假手术组、AD模型组+蒸馏水、AD模型+石杉碱甲组、AD模型+低剂量广东海风藤多糖组、AD模型+中剂量广东海风藤多糖组、AD模型+高剂量广东海风藤多糖组中小鼠在定位航行实验中的逃避潜伏期;
与模型组相比,*:P<0.05;
图5是如图4所述各实验组中小鼠在空间探索实验中在平台所在象限的停留时间;
与模型组相比,*:P<0.05;
图6是如图4所述各实验组中小鼠在空间探索实验中跨越原平台位置的次数;
与模型组相比,*:P<0.05;
图7是如图4所述各实验组中小鼠的皮质AchE活性;
与模型组相比,*:P<0.05;
图8是是如图4所述各实验组中小鼠的皮质ChAT活性;
与模型组相比,*:P<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述,本发明的实施方式并不限于此。
实施例1
广东海风藤总多糖的制备:取海风藤药材干燥,粉碎成细粉,95%乙醇回流脱脂。脱脂后药渣挥干溶剂,加水回流提取二次,合并提取液,浓缩。浓缩液加入95%乙醇至终浓度为40%除淀粉,离心,上清液回收乙醇,浓缩液80%醇沉,抽滤,沉淀以无水乙醇、丙酮、石油醚分次洗涤,低温干燥得海风藤粗多糖。
实施例2
广东海风藤多糖P1的制备:将广东海风藤总多糖加蒸馏水溶解后以Sevag法除蛋白,80%醇沉二次,沉淀用Sephadex G-100、Sephadex G-80和SephadexG-25凝胶柱分别洗脱,按峰收集流分,合并,冻干。得到广东海风藤多糖P1。
实施例3
广东海风藤多糖P2的制备:将广东海风藤总多糖加蒸馏水溶解后用100Kd超滤膜过滤,收集滤液,再以10Kd超滤离心管离心,收集上层液,冻干,制得广东海风藤多糖P2。
实施例4
广东海风藤多糖胶囊的制备:将广东海风藤多糖P2加水溶解后以糊精、微晶纤维素为辅料制成颗粒,干燥,整粒后以胶囊填充剂填充,制成广东海风藤多糖胶囊。
实施例5
广东海风藤多糖注射剂的制备:将广东海风藤多糖P1加注射用水溶解后以NaCl调节渗透压,灌装,溶封,灭菌,制成广东海风藤多糖注射剂。
通过以下试验实施例来说明广东海风藤多糖的药理活性。
试验实施例1
广东海风藤多糖对Aβ(β-amyloid peptide,Aβ)损伤嗜铬细胞瘤株PC12的保护作用:
本实施例研究了广东海风藤多糖对Aβ损伤PC12细胞的神经保护作用。
材料:PC12细胞购自中科院上海细胞库;胎牛血清购自TBD公司;DMEM为Gibco公司产品;Aβ1-42购自Sigma公司,用0.01mol·L-1PBS(pH7.2)配成溶液,浓度为1mg/ml,密封后置于37℃,孵育7天使之聚集。MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)购自Sigma公司,取MTT250mg溶解于0.01mol·L-1PBS(pH7.2)50mL中,制备成浓度为5g·L-1的MTT,用0.22μm微孔过滤器过滤除菌,4℃保存。
广东海风藤多糖样品的配制:称取广东海风藤多糖(如实施例1制备)0.5g,溶于40mL的0.01mol·L-1PBS,配成12.5mg·mL-1广东海风藤多糖母液。取12.5mg·mL-1的广东海风藤多糖100μL,加入PBS至终体积10mL,配制成高剂量浓度0.125mg·mL-1的广东海风藤多糖原液。取0.125mg·mL-1的广东海风藤多糖2mL,加入PBS至终体积4mL,配制成中剂量浓度0.625mg·mL-1的广东海风藤多糖原液。取0.625mg·mL-1的广东海风藤多糖2mL,加入PBS到终体积4mL,配制成低剂量浓度0.3125mg·mL-1广东海风藤多糖原液,过滤除菌,4℃保存。
细胞培养及给药方法:取对数生长期的PC12细胞,接种于96孔板中,每孔细胞为8000个细胞,每孔加入含10%胎年DMEM培养液200μL。分别设PBS对照组、Aβ1-42组和Aβ1-42广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、0.625、1.25μg·mL-1),每组设8个复孔。
MTT测定:给药后24小时后,进行MTT测定。每孔加入5g·L-1MTT溶液20μl。继续培养4h。吸出培养液,加入DMSO200μL,混匀,振荡10min,使黑色结晶充分溶解。在酶标仪(Biorad公司680型)上490nm波长测A490nm值,以A490nm反映存活细胞数量及其功能状态。
结果:如图1所示,广东海风藤多糖在三个浓度均能显著对抗10μMAβ1-42神经毒性作用,提高PC12细胞的存活率。而且呈现剂量依赖性,即随着广东海风藤多糖浓度的增加,其存活率越高。PC12细胞为一种神经源性细胞株,与正常神经元形态和生理功能相似,能较好的代表正常神经元。而Aβ的神经毒性被公认为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病原因。以上实验表明广东海风藤多糖对Aβ损伤的PC12有明显的神经保护作用,广东海风藤多糖可用于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的治疗。
试验实施例2
广东海风藤多糖转AD痴呆基因细胞M146L分泌的Aβ生成的抑制作用
本发明研究广东海风藤多糖转AD痴呆基因细胞M146L分泌的Aβ生成的抑制作用。
材料:M146L细胞株:美国哈佛大学医学院张冀民教授赠送。药物及试剂:DMEM为Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品;0.25%胰酶购自Hyclone公司。抗生素G418、Puromycin均为Sigma公司产品;人类Aβ42测试试剂盒为IBL公司产品;MTT购自Sigma公司,取MTT250mg溶解于0.01mol·L-1PBS(pH7.2)50mL中,制备成浓度为5g·L-1的MTT,过滤除菌,4℃保存。
广东海风藤多糖样品的配制:称取广东海风藤多糖0.5g,溶于40mL的0.01mol·L-1PBS,配成12.5mg·mL-1广东海风藤多糖母液。取12.5mg·mL-1的广东海风藤多糖100μL,加入PBS至终体积10mL,配制成高剂量浓度0.125mg·mL-1的广东海风藤多糖原液。取0.125mg·mL-1的广东海风藤多糖2mL,加入PBS至终体积4mL,配制成中剂量浓度0.625mg·mL-1的广东海风藤多糖原液。取0.625mg·mL-1的广东海风藤多糖2mL,加入PBS到终体积4mL,配制成低剂量浓度0.3125mg·mL-1广东海风藤多糖原液,过滤除菌,4℃保存。
细胞培养及给药方法:取对数生长期的M146L细胞株,接种于96孔板中,每孔细胞为8000个细胞,含15%胎年DMEM培养。分别设PBS对照组、低、中、高剂量(终浓度0.3125、0.625、1.25μg·mL-1)广东海风藤多糖组,每组设8个复孔。
MTT测定:给药后24小时后,进行MTT测定。每孔加入5g·L-1MTT溶液20μl。继续培养4h。吸出培养液,加入DMSO200μL,混匀,振荡10min,使黑色结晶充分溶解。在酶标仪(Biorad公司680型)上490nm波长测A490nm值,以A490nm反映存活细胞数量及其功能状态。
ELISA方法定量检测Aβ42的含量:给药后24小时后,进行ELISA测定。每孔取100μL培养液,按ELISA试剂盒上所要求的方法测定Aβ42含量。
结果:MTT结果:如图2所示,低、中、高剂量的广东海风藤多糖对细胞活性没有影响,表明在此剂量下,广东海风藤多糖不具有细胞毒作用。ELISA结果:如图3所示,低,中、高剂量的广东海风藤多糖可以明显降低Aβ42的产量,特别是高剂量组抑制率超过50%,呈现一定的量效关系。AD重要的病理标志物为神经元胞外的老年斑,而老年斑的核心成份为Aβ。现代研究证明其与AD的发病有着密切关系,多数学者认为Aβ的沉积是AD病理的始发因素和中心环节。Aβ的过度产生并聚集产生神经毒性被公认为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病原因。本研究所用的M146L细胞株为人类阿尔茨海默病APP及突变型PS1基因双重转染的CHO细胞。以该细胞株能含有阿尔茨海默病病人的突变型基因,在体外培养条件下能过度表达Aβ42,因此,M146L细胞为一理想的AD治疗药细胞筛选模型。MTT结果表明低、中、高剂量的广东海风藤多糖对细胞的生长代谢没有影响,排除了广东海风藤多糖的细胞毒作用。而ELISA结果则表明广东海风藤多糖能抑制M146L分泌的Aβ,可用于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的治疗。
试验实施例3
广东海风藤多糖对Aβ损伤致痴呆鼠预防保护作用
材料:实验动物:成年昆明种小鼠,清洁级,体重18~22g,雄雌各半,广东省医学实验动物中心提供,合格证号:2007A006。标准鼠饲料饲养。药物及试剂:Aβ1-42购自Sigma公司,用0.01mol·L-1PBS(pH7.2)配成溶液,浓度为1mg/ml,密封后置于37℃,孵育7天使之聚集。阳性对照药石杉碱甲片购自上海复旦复华药业有限公司。
广东海风藤多糖样品的配制:称取广东海风藤多糖10g,溶于100mL的0.9%的生理盐水,配成100mg·mL-1高剂量浓度广东海风藤多糖。取100mg·mL-1的高剂量浓度广东海风藤多糖50mL,加入生理盐水至终体积100mL,配制成中剂量浓度50mg·mL-1的广东海风藤多糖原液。取50mg·mL-1的广东海风藤多糖50mL,加入生理盐水至终体积100mL,配制成低剂量浓度25mg·mL-1的广东海风藤多糖,过滤除菌,4℃保存。
Aβ损伤致痴呆鼠的制备及给药方法:成年昆明种小鼠适应性饲养一周后,按体重随机分成6组,每组20只,分为假手术组、AD模型组+蒸馏水、AD模型+石杉碱甲组、AD模型+低剂量广东海风藤多糖组、AD模型+中剂量广东海风藤多糖组、AD模型+高剂量广东海风藤多糖组。除对照假手术组外,其它各组均侧脑室注射Aβ1-42以制作AD痴呆鼠模型。小鼠戊巴比妥钠麻醉小鼠(40mg/kg),将小鼠固定在定位仪上,剪开头顶部皮肤,酒精棉擦拭,暴露出前囟。采用右侧脑室定位,自前囟向后1.8mm,矢状缝旁开1.5mm处,即为侧脑室的体表部位。用微量注射器在此位置穿一小孔,深度为颅骨表面向下3mm处,每只小鼠注射4μl Aβ1-42,注射时间5min,留针5min。假手术组为注射等体积的无菌生理盐水。所有操作均在无菌条件下进行,拔针后用沾有75%酒精棉球消毒手术部位,缝合头皮。造模手术完成后后1周开始给药组小鼠分别灌胃相应剂量的广东海风藤多糖或石杉碱甲,连续4周。
小鼠学习记忆力检测:采用Morris水迷宫方法。Morris水迷宫实验共测试5d。前5d进行定位航行实验,5d下午撤去平台,进行空间探索实验。定位航行实验(place navigation):Morris水迷宫为直径100cm,高50cm的圆形黑色水池,水深30cm,池水中加入适量墨汁染黑。水温维持24℃±1℃。池壁标记4个入水点(E、S、W、N),在ES象限中央、距池壁30cm处放置一平台,高29cm(低于水平面1cm),直径8cm。小鼠分别从E、S、W、N 4个入水点面向池壁放入水中,记录小鼠从入水至找到并爬上平台的时间,即逃避潜伏期(escape latency)。小鼠被允许在平台停留15s。60s未找到平台的动物,实验者将其引上平台,潜伏期记录为60s,在平台上停留15s。测试过程保持室内安静,周围实验人员及物体位置固定不变。空间探索实验(spatial probe):定位航行实验结束后撤除平台,选择一入水点将小鼠放入水中,测定60s内小鼠平台所在象限停留时间和跨越原平台位置的次数。
小鼠皮质乙酰胆碱酯酶(AchE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性的测定:学习记忆力测试结束后,小鼠断头取脑,于冰浴中迅速剥离海马,分离得到皮质,以预冷的生理盐水制成10%的组织匀浆。按照试剂盒说明书方法,测定皮质中乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶的活性。
结果:小鼠学习记忆力检测结果:如图4、5、6所示,模型组与假手术组相比,小鼠找到平台的潜伏期明显延长(P<0.05),平台所在象限停留时间及穿台次数明显减少,说明Aβ1-42侧脑室注射致小鼠学习记忆力减退,痴呆模型建立成功。低、中、高剂量的广东海风藤多糖组与模型组相比,潜伏期缩短(P<0.05),平台所在象限停留时间及穿台次数增加(P<0.05),说明广东海风藤多糖能改善痴呆鼠的学习记忆力。小鼠皮质AchE和ChAT活性的测定结果:如图7、8所示,在皮质中,与模型组相比,低、中、高剂量的广东海风藤多糖组,能明显提高痴呆鼠中乙酰胆碱转移酶的活性,抑制痴呆鼠中乙酰胆碱酯酶的活性,达到减少乙酰胆碱的分解,从而提高皮质内乙酰胆碱的含量。乙酰胆碱酯酶及乙酰胆碱转移酶分别是乙酰胆碱的分解酶和合成酶,两者共同调节脑内乙酰胆碱的含量。而乙酰胆碱的浓度与学习记忆力密切相关,AD患者脑的乙酰胆碱含量减低。这是广东海风藤多糖提高痴呆鼠学习记忆能力的机制之一,表明广东海风藤多糖能用于AD的预防和/或治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1、广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。
2、根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的药物的活性成分包括所述广东海风藤多糖。
3、根据权利要求2所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的药物的活性成分还包括公知的预防和/或治疗老年性痴呆症的药物。
4、根据权利要求2或3中所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的药物还包括药学上可接受的载体。
5、根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的广东海风藤多糖是从广东海风藤中提取分离得到的。
6、根据权利要求5所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的广东海风藤多糖提取物的组份中包括D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和D-半乳糖中的任一种或任意几种。
7、根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用,其特征在于:所述的药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。
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