具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
本发明下述实施例中,1%壳聚糖溶液的配置:取壳聚糖1g,加1%冰醋酸水溶液100ml使溶解。静置24小时,即得。
实施例1
称取黄芪2502g、石斛2502g、麦冬2502g、白术2001g和薄荷500g,白术与薄荷提取挥发油;黄芪、石斛、麦冬加10倍的水浸泡0.5小时后,加入上述提取挥发油后的白术等药渣,煎煮2次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.04(20℃),加入的1%壳聚糖溶液使之含量达到总体积的0.1%,静置24小时,离心,取上清液,浓缩,经真空干燥后粉碎成细粉。所提挥发油喷入上述细粉中,加入辅料,混匀,干法制粒,压片,包衣,制成1000片(每片重1.7g,含生药10.0g)(以下称复方斛芪含片)。本实施例制得的复方斛芪含片用于药理药效试验一:高剂量组1.66片/Kg(16.6g/kg);中剂量组0.83片/Kg(8.3g/kg);低剂量组0.415片/Kg(4.15g/kg)。相当于人临床日用量的18倍、9倍和4.5倍。
实施例2
称取黄芪2252g、石斛3002g、麦冬2002g、白术2501g和薄荷250g,白术与薄荷提取挥发油;黄芪、石斛、麦冬加10倍的水浸泡0.5小时后,加入上述提取挥发油后的白术等药渣,煎煮2次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.04(20℃),加入的1%壳聚糖溶液使之含量达到总体积的0.1%,静置24小时,离心,取上清液,浓缩,经真空干燥后粉碎成细粉。所提挥发油喷入上述细粉中,加入辅料,混匀,干法制粒,压片,包衣,制成1000片(每片重1.7g,含生药10.0g)。本实施例制得的复方斛芪含片用于药理药效试验二:高剂量组1.66片/Kg(16.6g/kg);中剂量组0.83片/Kg(8.3g/kg);低剂量组0.415片/Kg(4.15g/kg)。相当于人临床日用量的18倍、9倍和4.5倍。
实施例3
称取黄芪2752g、石斛2002g、麦冬3002g、白术1501g和薄荷750g,白术与薄荷提取挥发油;黄芪、石斛、麦冬加10倍的水浸泡0.5小时后,加入上述提取挥发油后的白术等药渣,煎煮2次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.04(20℃),加入的1%壳聚糖溶液使之含量达到总体积的0.1%,静置24小时,离心,取上清液,浓缩,经真空干燥后粉碎成细粉。所提挥发油喷入上述细粉中,加入辅料,混匀,干法制粒,压片,包衣,制成1000片(每片重1.7g,含生药10.0g)。本实施例制得的复方斛芪含片用于药理药效试验三:高剂量组1.66片/Kg(16.6g/kg);中剂量组0.83片/Kg(8.3g/kg);低剂量组0.415片/Kg(4.15g/kg)。相当于人临床日用量的18倍、9倍和4.5倍。
实施例4
称取黄芪2402g、石斛2602g、麦冬3253g、白术1501g和薄荷250g,白术与薄荷提取挥发油;黄芪、石斛、麦冬加10倍的水浸泡0.5小时后,加入上述提取挥发油后的白术等药渣,煎煮2次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.04(20℃),加入的1%壳聚糖溶液使之含量达到总体积的0.1%,静置24小时,离心,取上清液,浓缩,经真空干燥后粉碎成细粉。所提挥发油喷入上述细粉中,加入辅料,混匀,干法制粒,压片,包衣,制成1000片(每片重1.7g,含生药10.0g)。本实施例制得的复方斛芪含片用于药理药效试验四:高剂量组1.66片/Kg(16.6g/kg);中剂量组0.83片/Kg(8.3g/kg);低剂量组0.415片/Kg(4.15g/kg)。相当于人临床日用量的18倍、9倍和4.5倍。
实施例5
称取黄芪2652g、石斛2352g、麦冬2252g、白术1748g和薄荷1000g,白术与薄荷提取挥发油;黄芪、石斛、麦冬加10倍的水浸泡0.5小时后,加入上述提取挥发油后的白术等药渣,煎煮2次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.04(20℃),加入的1%壳聚糖溶液使之含量达到总体积的0.1%,静置24小时,离心,取上清液,浓缩,经真空干燥后粉碎成细粉。所提挥发油喷入上述细粉中,加入辅料,混匀,干法制粒,压片,包衣,制成1000片(每片重1.7g,含生药10.0g)。本实施例制得的复方斛芪含片用于药理药效试验五:高剂量组1.66片/Kg(16.6g/kg);中剂量组0.83片/Kg(8.3g/kg);低剂量组0.415片/Kg(4.15g/kg)。相当于人临床日用量的18倍、9倍和4.5倍。
药理药效试验一(观察不同浓度的复方斛芪含片对S180肉瘤小鼠经60Co照射所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有否明显的升高作用,并能否改善荷瘤鼠的一般状况,提高抑瘤率和免疫功能)
[实验方法及结果分析]
1.动物模型的制备
1.1.S180肉瘤腹水瘤小鼠的制备:取指数生长期的S180骨肉瘤细胞,离心收集,显微镜下常规计数细胞数,调整细胞浓度为1×108/ml,取健康雄性昆明小鼠3只,体重约20g,无菌条件下每只小鼠腹腔接种细胞悬液1ml,约10d成腹水瘤。
1.2.小鼠皮下S180肉瘤模型的制备:取腹部接种S180瘤株8d的荷瘤小鼠,无菌操作下抽取腹腔瘤液,以灭菌蒸馏水稀释成1∶4浓度的瘤细胞液(镜检含瘤细胞数5×107/ml),于健康小鼠右后肢外侧皮下接种0.2ml/只。
1.3.放疗损伤模型的制备:除空白对照组和单纯荷瘤组外,其余7组均在灌胃后第5天予一次性6Gy的60Co全身照射。
2.分组及给药
2.1.分组:昆明种小鼠分9组,每组10只,即空白对照组、放疗对照组、荷瘤对照组、荷瘤+放疗对照组、荷瘤+放疗+生脉饮组、荷瘤+放疗+利血生组,荷瘤+放疗+复方斛芪含片高剂量组、荷瘤+放疗+复方斛芪含片中剂量组、荷瘤+放疗+复方斛芪含片低剂量组。
2.2.给药及处理:以上各组均在小鼠S180肉瘤荷瘤后第2d始给予灌胃治疗,0.4ml/(只.d),共15天。其中空白对照组和3个阴性对照组给予蒸馏水,阳性对照组予生脉饮和利血生,治疗组分别予低、中、高三个剂量浓度的复方斛芪含片灌胃。灌胃治疗的第5天给予一次性6Gy的60Co全身照射,并于照光后第3、7、11天尾静脉取血,行外周血细胞计数。予末次给药后第24小时眼眶后取血并分离血清,同时处死小鼠,称取体重、脾重、胸腺重及瘤重,计数骨髓有核细胞数等。
3.方法
3.1.外周血细胞计数:
分别于放射治疗后的第3d、7d及11d取小鼠尾静脉丛采血,采用鼠尾刺血法,取1.5ml试管数支,预先加入白细胞稀释液500μl。固定小鼠并露出鼠尾,将尾部毛剪去后消毒,然后浸在45℃左右的温水中数分钟,使尾部血管充盈。用静脉输液器8号注射针头,刺入鼠尾静脉,拔出针头时即有血滴出,用一次性定量移液器准确吸取外周血20μl,立即插入试管底部,轻轻将血放出,并吸取上清液洗吸管3~4次,充分混匀,静置10min,全自动血球计数仪检测。
3.2.骨髓有核细胞计数:于末次给药后24h,小鼠脱颈椎处死,剥离左侧股骨,以PBS液冲出骨髓细胞,按白细胞计数方法,计算1根股骨内的骨髓有核细胞数量。具体方法如下:
3.2.1.取材(小鼠股骨及股骨头):先用脱颈椎法处死小鼠,用剪刀剪开一侧腹股沟皮肤,钝性分离股骨及胫骨两侧的肌肉和组织,然后用剪刀剪断胫骨下端,夹起股骨上段向腹中线反向提起,继续分离组织,直至看到髋关节囊,然后逐层剪破,直到看到白色的股骨头,然后小心的剪开周围组织,分离出股骨,用干净纱布把股骨周围的软组织包括胫骨部分剔除,注意动作轻柔,防止断裂,尤其是股骨头。
3.2.2.配置骨髓单核细胞悬液:取5ml的注射器,用其针头在股骨远端开一小孔,插入约1-2mm,然后用1ml注射器抽取约1mlPBS液反复冲洗和抽吸,直至股骨变白。最后用1ml注射器把冲取出来的骨髓液,过滤成骨髓的单个核细胞悬液,注入1.5ml eppendof管中,保存。
3.2.3.计数:用移液枪取10ul骨髓液加入2%冰醋酸溶液190ul中,充分搅拌,然后静置5分钟,吸出10μl混匀的液体充入细胞计数池和盖玻片之间的缝隙中,静置2~3min。用低倍显微镜计数四角四个大格内的单个核细胞数,并按以下公式计算骨髓有核细胞数。
骨髓有核细胞数(个/L)=四大格有核细胞数/4×10×20×108/L。
3.3.小鼠血清IL-2的检测:
3.3.1.末次灌胃后第24小时,小鼠眼眶静脉取血,约1.0~1.5ml/只。自然存放1~2小时后,离心15分钟(3000r/min),移液器吸取上层血清,标号后,放置于2~8℃冰箱中待用。
3.3.2.建立标准曲线:设立标准孔8孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混均匀后用加样器吸出100ul,移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
3.3.3.加样:待测品孔每孔各加入待测样品100ul。
3.3.4.将反应板充分混均匀后置37℃120分钟。
3.3.5.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
3.3.6.每孔中加入第一抗体工作液50ul。
3.3.7.将反应板置37℃60分钟。
3.3.8.洗板:同前。
3.3.9.每孔加酶标抗体工作液100ul。
3.3.10.将反应板置37℃60分钟。
3.3.11.洗板:同前。
3.3.12.每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应5-10分钟。
3.3.13.每孔加入50ul终止液混匀。
3.3.14.在492nm处测吸光值。
3.3.15.根据标准品的OD值在半对数纸上作图,绘制标准曲线。
3.3.16.根据样品OD值在该曲线上查出相应IL-2含量。
小鼠眼眶取血,3000r/min离心15min,分离血清,采用酶标免疫ELISA试剂盒检测。安照试剂盒操作说明书进行,从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,除空白孔外,分别将标本或不同浓度标准品加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温孵育60分钟。洗板4次,除空白孔外,加入检测工作液。封住板孔,室温孵育60分钟。洗板4次。加入显色剂,避光室温10-15分钟。加入终止液,混匀后即刻测量OD492值,画出标准曲线,然后再根据标准曲线,换算血清IL-2的浓度值。
4.实验结果:见表1.1~1.8,数值采用(x±S)表示。
4.1.体重变化:见表1.1。
表1.1.小鼠体重的变化情况(g)
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
4.2.免疫功能:
表1.2.复方斛芪含片对小鼠经6Gy的60CO照射后第11天的免疫功能的影响
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
肉眼可见,放疗对小鼠胸腺的影响大,肿瘤的影响不大,放疗荷瘤组的胸腺明显比其他组小。肿瘤对小鼠脾脏的影响大,放疗荷瘤对照组的脾脏指数是正常组的2.6倍,放疗对其影响也较大,放疗后放疗对照放疗组脾脏指数是正常组的0.6。两者综合作用体现在放疗荷瘤对照组上,故其脾脏指数与正常组接近并大于。从统计学分析可知,放疗荷瘤的各组均脾脏指数均较高,与放疗对照组有统计学差异(P<0.001)。高剂量复方斛芪含片具有明显提高小鼠的脾脏指数作用,阳性对照药物生脉饮具有提高小鼠胸腺指数的作用,两者与放疗荷瘤对照组有统计学差异(P<0.05)。
从表1.2可见,放疗会使小鼠血清中白介素-2含量的明显下降,肿瘤对它的影响不是很大。高、中剂量的复方斛芪含片具有明显升高血清中白介素-2浓度的作用,与放疗荷瘤组有统计学差异(P<0.05),与阳性对照药物生脉饮和利血生有统计学差异(P<0.05),而后两者与模型组无统计学差异(P>0.05)。
4.3.骨髓有核细胞数:见表1.3。
表1.3.对小鼠经6Gy的60CO照射后第11天的骨髓有核细胞数量的影响
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
于末次给药后24h处死小鼠,剥离左侧股骨,以1mlPBS液冲出骨髓细胞,按白细胞计数方法,镜下计算1根股骨内的骨髓有核细胞数量。从表1.3的结果看,放疗后各组均出现了骨髓有核细胞数减少,造血功能受抑制的毒副反应,经统计学分析,放疗的各组与正常对照组和荷瘤对照组有统计学差异(P<0.001)。阳性对照药物利血生具有明显抑制骨髓有核细胞减少的作用,与放疗荷瘤对照组有统计学差异(P<0.05),高、中剂量复方斛芪含片的骨髓有核细胞数是放疗荷瘤组和放疗对照组的约两倍,具有明显的改善放疗后骨髓有核细胞数减少的作用,与模型对照组比较有统计学差异(P<0.05),与阳性对照药利血生无统计学差异(P>0.05)。
4.4.外周血细胞数:
表1.4.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血白细胞数的变化(×109/l)
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
表1.5.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血红细胞数的变化(×1012/l)
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
表1.6.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血血红蛋白的变化(g/l)
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
表1.7.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血血小板数量的变化(×1012/l)
(*与正常组比较●与放疗对照组比较▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较*●▲★◆P<0.05**●●▲▲★★◆◆P<0.001)
从表1.4~1.7可见,6Gy的60CO照射对小鼠外周血细胞数量的影响较大,肿瘤对外周血象的影响较小,外周血细胞的四个指标里,白细胞放疗后出现下降最快幅度最大,第3天就很明显,第7天到低谷,第11天略有回升,红细胞,血红蛋白和血小板第7天才开始出现下降,第11天回升明显。经统计分析,高剂量复方斛芪含片能够延缓放疗后白细胞下降,并且回升较快,具有明显的升白作用,与放疗对照组和放疗荷瘤组有统计学差异(P<0.001),阳性对照药利血生对白细胞的升高作用不明显,但其对红细胞、血红蛋白和血小板数量具有明显的作用,与放疗荷瘤组和放疗对照组有统计学差异(P<0.001),复方斛芪含片中、高剂量组具有明显升高红细胞、血红蛋白和血小板的作用,与模型组有统计学差异(P<0.001),与阳性对照药物利血生无统计学差异(P>0.05)。
4.5.对肿瘤生长的影响:见表1.8。
表1.8.荷瘤小鼠经6Gy的60CO照射后瘤重和皮下瘤体积的变化
(▲与荷瘤对照组比较★与放疗荷瘤组比较◆与阳性药物组比较▲★◆P<0.05▲▲★★◆◆P<0.001)
停药24小时后处死取材,肉眼可见放疗后肿瘤生长受抑制,并有缩小和脱落坏死的趋势,且给药组比不给药物治疗组缩小更明显,经统计学分析,放疗后各组肿瘤生长明显抑制,第11天各组皮下瘤体积和瘤重,与荷瘤对照组有统计学差异(P<0.05),阳性对照组与复方斛芪含片三各剂量组对肿瘤生长无促进作用,并具有一定的抑制作用,但与模型组即放疗荷瘤组比较无统计学差异(P>0.05)。
复方斛芪含片减轻荷瘤动物放射治疗毒副反应的实验结果表明:复方斛芪含片可以改善荷瘤小鼠放疗后导致的脱毛、活动度减少、扎堆、消瘦等一般情况。高、中剂量组的复方斛芪含片一方面具有明显减轻放射治疗后骨髓抑制以及白细胞减少等毒副反应,作用效果与西药利血生无统计学差异;另一方面,高、中、低剂量组复方斛芪含片能提高血清白介素-2水平,高剂量组还能提高小鼠的脾脏和胸腺指数,与生脉饮对照组无统计学差异。复方斛芪含片无促进肿瘤生长作用,高、中剂量组还具有一定的抑瘤作用。
药理药效试验二(观察不同浓度的复方斛芪含片对正常小鼠经照射所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有否明显的升高作用,并能否改善小鼠的一般状况,提高免疫功能)
[实验方法及结果分析]□
1.放疗损伤模型的制备:除空白对照组外,其余6组均在灌胃后第5天予一次性6Gy的60Co全身照射。
2.分组:昆明种小鼠分7组,每组10只,即空白对照组、放疗对照组、放疗+生脉饮组、放疗+利血生组和放疗+复方斛芪含片高剂量组、放疗+复方斛芪含片中剂量组、放疗+复方斛芪含片低剂量组。
3.给药及处理:以上各组均在常规饲养后第3d始给予灌胃治疗,0.4ml/(只.d),共15天。其中空白对照组和放疗对照组给予蒸馏水,阳性对照组予生脉饮和利血生,治疗组分别予低、中、高三个剂量浓度的复方斛芪含片灌胃。灌胃治疗的第5天给予一次性6Gy的60Co全身照射,并于照光后第3、7、11天尾静脉取血,行外周血细胞计数。予末次给药后第24小时眼眶后取血并分离血清,同时处死小鼠,称取体重、脾重及胸腺重,计数一根股骨内的骨髓有核细胞数等。
4.实验结果:
4.1.体重变化:见表2.1。
表2.1.小鼠经6Gy的60Co照射前后体重的变化(g)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
结果显示,放疗前5天各组小鼠体重增长稳定,放疗后体重增长幅度减缓,特别是放疗对照组,放疗后5天体重增长量波动在1~2g,与正常对照组有统计学差异(P<0.05)。高剂量的复方斛芪含片体重增长稳定,对放疗后动物的体重增长缓慢有明显的抑制作用,与放疗对照组有统计学差异(P<0.05)。
4.2.免疫功能:见表2.2。
表2.2.小鼠经6Gy的60CO照射后第11天的免疫功能
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
肉眼可见,放疗对小鼠胸腺和脾脏的影响较大,放疗后对照组的胸腺和脾脏明显比其他组小。阳性对照药物的胸腺缩小明显,脾脏缩小不是很明显。复方斛芪含片三个剂量组的胸腺和脾脏变化不大,尤其是高、中剂量组。从统计学分析可知,阳性对照药物生脉饮具有提高小鼠胸腺指数和脾脏指数的作用,两者与放疗对照组有统计学差异(P<0.05)。高、中、低三个剂量组复方斛芪含片能明显提高小鼠放疗后的胸腺指数和脾脏指数,与放疗对照组有统计学差异(P<0.05),高、中剂量组与阳性对照药物组有统计学差异(P<0.05)。
小鼠眼眶取血,3000r/min离心15min,分离血清,采用酶标免疫ELISA试剂盒检测(操作同试验一)。从表2.2可见,放疗会使小鼠血清中白介素-2含量的明显下降。高、中、低三个剂量的复方斛芪含片均具有明显升高血清中白介素2浓度的作用,与放疗对照组有统计学差异(P<0.001),与阳性对照药物生脉饮和利血生有统计学差异(P<0.05),而后两者与模型组无统计学差异(P>0.05)。表明复方斛芪含片具有一定增强正常小鼠放疗后血清白介素2的作用。
4.3.骨髓有核细胞数计数:见表2.3。
表2.3.小鼠经6Gy的60CO照射后第11天的骨髓有核细胞数(×1010/l)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
4.4.外周血细胞数
表2.4.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血白细胞数的变化情况(×109/l)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表2.5.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血红细胞数变化情况(×109/l)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表2.6.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血血红蛋白数量的变化(×109/l)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表2.7.小鼠经6Gy的60CO照射后外周血血小板数量的变化(×109/l)
*与正常组比较●与放疗组比较◆与阳性药物组比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从表2.4~2.7可见,6Gy的60CO照射对小鼠外周血细胞数量的影响较大,外周血细胞的四个指标里,白细胞放疗后出现下降最快幅度最大,第3天就很明显,第7天到低谷,第11天略有回升,红细胞,血红蛋白和血小板第7天才开始出现下降,第11天回升明显。经统计分析,高、中剂量复方斛芪含片能够延缓放疗后白细胞下降,并且回升较快,具有明显的升白作用,与放疗对照组有统计学差异(P<0.05),阳性对照药利血生对外周血细胞的升高作用不明显,与放疗对照组无统计学差异(P>0.05)。复方斛芪含片高、中剂量组具有明显升高红细胞、血红蛋白和血小板的作用,与模型组有统计学差异(P<0.05),与阳性对照药物利血生有统计学差异(P<0.05)。
复方斛芪含片减轻正常动物放射治疗毒副反应的实验结果也表明:复方斛芪含片可以改善正常小鼠放疗后导致的脱毛、活动度减少、扎堆、消瘦等一般情况。高、中剂量组的复方斛芪含片一方面具有明显减轻放射治疗后骨髓抑制以及白细胞减少等毒副反应,作用效果与西药利血生组无统计学差异似;另一方面,高、中、低剂量组复方斛芪含片能提高血清白介素-2的水平,高剂量组还能提高小鼠的脾脏和胸腺指数,与生脉饮对照组无统计学差异。
药理药效试验三(观察复方斛芪含片对小鼠瘤重或荷瘤生存时间的影响:①对肿瘤生长无明显影响或有一定抗癌作用;②对荷瘤机体的正常功能无明显损伤作用)
[实验方法及结果分析]
1.动物模型的制作
1.1.S180肉瘤腹水瘤小鼠的制备:
取指数生长期的S180骨肉瘤细胞,离心收集,显微镜下常规计数细胞数,调整细胞浓度为1×108/ml,取健康雄性昆明小鼠3只,体重约20g,无菌条件下每只小鼠腹腔接种细胞悬液1ml,约8d成腹水。
1.2.小鼠S180肉瘤皮下瘤模型的制备:
取腹腔接种S180瘤株8d的荷瘤小鼠,无菌操作下抽取腹腔瘤液,以三蒸馏水稀释4倍(镜检含瘤细胞数5×107/ml),于健康小鼠右后腹壁外侧皮下接种0.2ml/只。
1.3.H22肝癌腹水瘤小鼠的制备:
取健康雄性昆明小鼠3只,体重约20g,无菌条件下每只小鼠腹腔接种H22肝癌细胞悬液1ml,约10d成腹水。无菌操作下抽取腹腔瘤液,以三蒸馏水稀释4倍(镜检含瘤细胞数5×107/ml),以0.2ml/只接种于腹腔。
2.分组及给药
(1)分组:昆明种小鼠分为9组,即空白对照组、S180肉瘤实体组、H22肝癌腹水组和S180肉瘤实体+复方斛芪含片(高、中、低)组,H22肝癌腹水+复方斛芪含片(高、中、低)组,每组第一批12只。第二、三批为10只。
(2)处理:S180肉瘤小鼠在荷实体瘤后第2d随机分组,并开始给予灌胃治疗,H22肝癌小鼠也在荷腹水瘤后第2d分组并始给予灌胃治疗,灌胃剂量0.4ml/(只.d),其中H22肝癌腹水瘤组灌胃10天,S180肉瘤实体瘤组灌胃15天。其中空白对照组和阴性对照组给予蒸馏水,治疗组予各剂量浓度的复方斛芪含片。
3.观察和检测指标:
3.1.小鼠S180肉瘤实体瘤组:
3.1.1.测量小鼠的体重、皮下瘤体积和抑瘤率:分别于治疗第1、5、10、15天,称取体重,并测量皮下瘤体积。于末次给药后第24小时,摘眼球放血处死,称体重,并测量皮下瘤体积,按公式V=ab2/2计算肿瘤体积(a:肿瘤最大直径;b:肿瘤最大横径)。剥离肿瘤称重,计算抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%
3.1.2.肝、肾功能指标:分别于末次给药后第12小时,摘眼球放血处死,用全自动生化分析仪检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。
3.2.H22肝癌腹水瘤组:观察荷瘤生存期
生命延长率=(治疗组平均生存期-对照组平均生存期)/对照组平均生存期。
4.实验结果:
4.1.体重变化:见表3.1-3.3。
表3.1.第(1)批S180实体瘤小鼠的体重变化(g)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.2.第(2)批S180实体瘤小鼠体重的变化情况(g)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.3.第(3)批S180实体瘤小鼠体重的变化情况(g)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
4.2.免疫功能:见表3.4-3.6。
表3.4.第(1)批小鼠的胸腺指数和脾脏指数
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.5.第(2)批小鼠的胸腺指数和脾脏指数
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.6.第(3)批小鼠的胸腺指数和脾脏指数
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从大体解剖看,荷瘤小鼠的肝脏、脾脏、胸腺均比正常小鼠大,从表3.4-3.6统计结果看,荷瘤对胸腺指数和脾脏指数的影响不大,低剂量的复方斛芪含片能够明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数,高剂量复方斛芪含片能够抑制荷瘤导致小鼠脾脏指数增大的趋势,与荷瘤对照组有统计学差异(P<0.05)。
4.3.肝、肾功能:见表3.7-3.9。
表3.7.第(1)批小鼠的血清肝、肾功能测定值
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.8.第(2)批小鼠的血清肝、肾功能测定值
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
表3.9.第(3)批小鼠的血清肝、肾功能测定值
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从肝、肾功能四项指标分析,肿瘤对小鼠的肝、肾功能影响较大,荷瘤鼠的肝、肾功能明显比正常鼠差,有统计学差异(P<0.05),复方斛芪含片低剂量组能够明显改善荷瘤小鼠的肝肾功能,与对照组有统计学差异(P<0.05),与正常组无统计学差异(P>0.05)。
4.4.瘤重和皮下瘤体积的变化:见表3.10-3.12、图2-3。
表3.10.第(1)批S180肉瘤小鼠皮下实体肿瘤生长的情况
●与对照组比●P<0.05●●P<0.001
表3.11.第(2)批S180肉瘤小鼠皮下实体肿瘤生长的情况
●与对照组比●P<0.05●●P<0.001
表3.12.第(3)批S180肉瘤小鼠皮下实体肿瘤生长的情况
●与对照组比●P<0.05●●P<0.001
停药24小时后处死取材,肉眼可见,复方斛芪含片低剂量组和对照组肿瘤生长较快,大约400mg左右,与皮肤粘连不易剥离,复方斛芪含片中、高剂量组容易剥离,且比模型组小。统计学分析结果表明,复方斛芪含片没有促进肿瘤生长的作用,与对照组无统计学差异(P>0.05)。
图1表明,复方斛芪含片能够明显延长H22肝癌腹水小鼠的生存期,对照组从第5天就开始出现死亡,死亡时间段集中,每天死亡2~4只,前后只有7天。而复方斛芪含片三个剂量组出现死亡时间略迟,每天死亡0~2只,前后分别为14、11、15天。
图2对肿瘤生长影响的实验表明:无论是实体瘤还是腹水瘤,复方斛芪含片对肿瘤的生长无促进作用,高、中剂量组还具有一定的提高机体免疫功能、改善肝肾功能、抑制肿瘤生长以及延长生存期作用。该实验重复三次,结果基本相同。
药理药效试验四(观察不同浓度的复方斛芪含片对大黄致脾虚模型小鼠的治疗作用,能否改善小鼠的脾虚症状,并提高机体的免疫功能)
[实验方法及结果分析]
1.脾虚模型制作:生大黄粉悬液灌胃0.4ml/(只.d),大黄粉浓度为100%,共14天。
2.分组及给药
2.1.分组:将60只昆明种小鼠随机分为6组,即空白对照组、脾虚对照组、脾虚+生脉饮组、脾虚+复方斛芪含片低剂量组、脾虚+复方斛芪含片中剂量组和脾虚+复方斛芪含片高剂量组,每组10只,雌雄各半,体重18-22g。
2.2.处理:采用造模与治疗同步的方式,即上午阳性对照组予生脉饮,治疗组分别予高中低三个剂量浓度的复方斛芪含片灌胃,模型组和空白组给予蒸馏水灌胃。下午以上各组除空白对照组予蒸馏水外,均给予生大黄粉灌胃,大黄粉浓度为100%,共14天。予末次给药后12小时测小鼠负重游泳时间,并于眼眶后静脉取血并分离血清检测血清IL-2,同时处死小鼠,称取体重、脾重及胸腺重等。
3.方法
3.1.免疫器官重量的测定颈椎脱臼处死小鼠,称小鼠体重,取脾脏、胸腺称其湿重,计算脾指数和胸腺指数。
3.2.造模前后及治疗前后的肛温变化情况。分别于第1天、第5天、第10天及第15天测小鼠的肛温,先用75%的酒精消毒肛温计,并把水银柱甩到凹槽以下,然后用左手抓取并固定小鼠,右手轻轻揉按肛门部,使肛门括约肌松弛,并用酒精消毒,然后把肛温计的金属头对准肛口,与小鼠的尾巴平行并沿着正中线的方向轻轻插入小鼠肛门,深度为1~1.5cm,静止约3分钟,然后读数,该温度即为小鼠的肛温。
小鼠负重游泳时间的影响(抗疲劳实验):参照文献玻璃缸内加水,水深30cm,水温保持在20±1℃。各用药组小鼠尾部负相当于体重10%的重物,将小鼠分别放入玻璃缸内游泳,立即记时。当小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面者,即为体力耗竭,立刻记时,为小鼠游泳时间。
3.4.小鼠血清IL-2的检测:同试验一。
4.实验结果
4.1.体重变化
表4.1.脾虚模型小鼠体重的变化情况(g)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从表4.1可见,大黄灌胃的各组体重增长缓慢,尤其是脾虚对照组,波动在1~2g/5天,而正常组的增长量则为它的3-4倍,复方斛芪含片高、中剂量组体重增加幅度与正常组接近,阳性对照药物生脉饮也能较好的增加脾虚动物的体重,治疗结束时它的增加量是对照组的2倍。从统计学结果来看,对照组从灌胃大黄第5天始体重增长缓慢,与正常组和高、中剂量的复方斛芪含片有统计学差异(P<0.05)。生脉饮对照组从后10天体重增加幅度加大,而复方斛芪含片的高、中剂量组体重一直增长较快,这说明复方斛芪含片比生脉饮起效更快,作用更强。
4.2.免疫功能
表4.2.大黄灌胃14天后小鼠免疫功能的情况
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
肉眼可见,脾虚对照组的胸腺和脾脏明显缩小,阳性对照药物的胸腺缩小明显,脾脏缩小不是很明显。复方斛芪含片三个剂量组的胸腺和脾脏与正常组比较变化不大。从统计学分析可知,阳性对照药物生脉饮具有提高小鼠胸腺指数和脾脏指数的作用,但与对照组无统计学差异(P>0.05)。高、中、低三个剂量组复方斛芪含片能明显提高脾虚模型小鼠的胸腺指数和脾脏指数,与脾虚对照组有统计学差异(P<0.05)。
小鼠眼眶取血,3000r/min离心15min,分离血清,采用酶标免疫ELISA试剂盒检测(操作同试验一)。从表4.2可见,脾虚小鼠血清中白介素-2含量的明显下降。高、中剂量的复方斛芪含片均具有明显升高血清中白介素-2浓度的作用,与脾虚对照组有统计学差异(P<0.05),阳性对照药物生脉饮与脾虚对照组无统计学差异(P>0.05)。
4.3.负重游泳时间:见表4.3。
表4.3.模型小鼠的负重游泳时间(s)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从抗疲劳实验的结果看,脾虚小鼠负重游泳时间明显缩短,对照组70%的小鼠都没有坚持到1分钟,最短的只坚持了25秒。而正常组50%的小鼠负重游泳时间大于3分钟,最长的坚持了4分种,给药组均能延长小鼠的游泳时间,从统计学角度,只有复方斛芪含片的中剂量组能够明显延长脾虚小鼠负重游泳时间,与脾虚对照组有统计学差异(P<0.05)。
4.4.肛温变化
表4.4.小鼠肛温的变化情况(℃)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从表4.4可见,大黄灌胃的各组体温波动幅度较大,第5天开始体温下降明显,但第10天又有一定程度的回升,第15天下降的更明显,可能中期阶段对大黄产生了一定的依赖性。药物组一开始温度也下降,后迅速回升,复方斛芪含片的高、中剂量组的体温与正常组接近,优于生脉饮组。从统计结果看,脾虚对照组从大黄灌胃的第5天开始肛温就开始明显下降,虽有回升但始终与正常组有统计学差异(P<0.001),复方斛芪含片高、中剂量组在治疗过程中都能明显抑制脾虚模型小鼠肛温下降,与脾虚对照组有统计学差异(P<0.001),与正常组无统计学差异(P>0.05)。生脉饮组和复方斛芪含片低剂量组体温也出现明显下降,与正常组有统计学差异(P<0.05),但在治疗的最后,肛温明显升高,与脾虚对照组比较有统计学差异(P<0.05)。结果说明:高、中剂量的复方斛芪含片具有明显改善脾虚小鼠畏冷,体温下降等症状,发挥作用较快,并持续稳定,低剂量组和生脉饮组也能改善脾虚小鼠体温下降,但发挥作用较慢。
4.5.饮食变化
表4.5.小鼠的平均饮食情况
从表4.5看出,各组小鼠间的饮食和饮水量变化也不大,总体来说灌胃大黄的组与正常组比,饮食相对减少,饮水相对增加,这可能跟腹泻脱水有关。
对脾虚模型小鼠的治疗结果表明:高、中、低剂量的复方斛芪含片均具有明显健脾益气作用,能明显改善小鼠的脾虚症状,体重和体温下降不明显,略优于生脉饮组。此外从免疫指标来看,复方斛芪含片高、中、低三个剂量组均具有明显提高小鼠脾脏指数、胸腺指数和白介素-2的作用,与正常组和生脉饮组无统计学差异。在抗疲劳实验中,复方斛芪含片高、中、低剂量组均具有明显延长小鼠负重游泳时间的作用,并优于生脉组。
药理药效试验五(观察不同浓度的复方斛芪含片对甲状腺激素致阴虚模型的小鼠作用,能否改善小鼠的阴虚症状,和提高机体的抗氧化保护作用)
[实验方法及结果分析]
1.阴虚动物模型制作:甲状腺片悬液灌胃,日给药量为16.7832mg/kg,连续给药10天。
2.分组及给药
(1)分组:将60只昆明种小鼠随机分为6组,即空白对照组、阴虚对照组、阴虚+生脉饮组、阴虚+复方斛芪含片低剂量组、阴虚+复方斛芪含片中剂量组和阴虚+复方斛芪含片高剂量组,每组10只,雌雄各半,体重18-22g。
(2)处理:采用造模与治疗同步的方式,即上午阳性对照组予生脉饮,治疗组分别予高、中、低三个剂量浓度的复方斛芪含片灌胃,对照组和空白组给予蒸馏水灌胃。下午以上各组除空白和对照组予蒸馏水外,均给予生甲状腺片悬液混灌胃,共10天。予末次给药后2小时测小鼠活动计数情况,给药后24小时予眼眶后静脉取血并分离血清检测血清丙二醛(MDA)等。
3.方法
3.1.一般状况的观察:包括精神、运动、粪质、毛色、体形、饮水食欲、大小便等。
3.2.造模前后及治疗前后的肛温变化情况:同试验四。
3.3.小鼠活动次数记录实验:应用小鼠活动计数仪记录。
3.4.小鼠血清中丙二醛含量的检测:小鼠眼眶取血,3000r/min离心15min,分离血清待测,采用丙二醛(MDA)试剂盒说明书检测。
4.实验结果:
4.1.体重变化:见表5.1。
表5.1.小鼠体重的变化情况(g)
4.2.小鼠的肛温变化::见表5.2。
表5.2.小鼠肛温的变化情况(℃)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
从表5.2可见,甲状腺激素灌胃的小鼠体温升高明显,尤其是给药后的第5天,最高有38.8℃,到第10天体温有一定程度的回降,可能是对药物产生了一定的抵抗性,也可能是环境因素所致。从统计学结果看,阴虚对照组的肛温升高与正常组有统计学差异(P<0.05),说明阴虚动物模型制作是成功的。高、中、低三个剂量的复方斛芪含片能够抑制阴虚模型小鼠的肛温升高,与阴虚对照组有统计学差异(P<0.05),与正常组和生脉饮组无统计学差异(P>0.05)。生脉饮组也能降低阴虚小鼠的体温,但发挥作用较慢,治疗结束后体温与对照组有统计学差异(P<0.05)。
4.3.血清丙二醛
表5.3.小鼠血清丙二醛的含量(nmol/ml)
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
过氧化脂质指标是反应细胞受损伤程度的指标,值越高,说明细胞自由基增多,氧化损伤程度高,反之也成立。从表5.3实验的结果分析看,阴虚对照组血清中丙二醛的含量最高,与正常组有统计学差异(P<0.001),阳性药物生脉饮组能够明显减少血清中丙二醛的含量,与阴虚对照组有统计学差异(P<0.001),复方斛芪含片的高、中剂量组与生脉饮作用接近,也与阴虚对照组有统计学差异(P<0.001),低剂量组作用相对小,但也与阴虚对照组有统计学差异(P<0.05)。
4.4.活动情况:见表5.4。
表5.4.小鼠活动量的比较
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
造模第10天,末次灌胃后2小时,记录小鼠的活动情况,包括5分钟内的活动次数,活动时间和平均速度。从统计结果看,阴虚对照组小鼠活动次数未见明显增加,但活动时间和平均速度明显减少,与正常组有统计学差异(P<0.05)。生脉饮组活动时间和速度未有明显增加,与正常组有统计学差异(P<0.05)。复方斛芪含片中、高剂量组,能明显增加阴虚小鼠活动时间和平均速度,与阴虚对照组和生脉饮组有统计学差异(P<0.05)。
4.5.饮食情况:见表5.5。
表5.5.小鼠的饮食情况比较
*与正常组比较●与对照组比较◆给药组间比较
*●◆P<0.05**●●◆◆P<0.001
统计学结果现示,阴虚对照组每天的饮食量增加明显,与复方斛芪含片三个剂量组有统计学差异(P<0.05)。阴虚对照组的口干,口渴程度也较严重,其日均饮水量明显比正常组增高,有统计学差异(P<0.05),高、中剂量的复方斛芪含片能够改善阴虚小鼠口渴等症状,日均饮水量与正常组无统计学差异。结果,复方斛芪含片在改善小鼠饮食亢进,口干,口渴饮水量增多等症状方面作用好(P<0.05),而阳性药物生脉饮作用不佳(P>0.05)。因为存在较大的误差,故从每天的饮食和饮水量的数据资料,只能作为参考或趋势的观察。
对阴虚模型小鼠的治疗结果表明:复方斛芪含片高、中、低三个剂量组均具有改善小鼠阴虚症状的作用。从肛温变化情况看,服用复方斛芪含片三个剂量组的小鼠第10天肛温明显低于模型组,与生脉饮组无统计学差异;从血清丙二醛检测来看,三个剂量组均优于模型组,与生脉饮组亦无统计学差异;从小鼠活动计数情况来看,各组活动次数无统计学差异,但活动时间和平均速度,复方斛芪含片高、中剂量组明显优于模型对照组,与生脉饮组无统计学差异。