CN101485753B - 一种治疗乙型肝炎的中药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗乙型肝炎的中药及其制备方法，本品由下述重量配比的原料组成：虎杖总苷0.2～0.4重量份、白花蛇舌草10～14重量份、丹参6～10重量份、金钱草6～10重量份、黄芩提取物0.8～1.2重量份、五味子4～8重量份。本发明经提取、浓缩、精制、干燥等加工工艺制成丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸及口服液体制剂。本品具有清热解毒，舒肝理气，祛瘀通络之功效，用于治疗急、慢性乙型肝炎等病毒性肝炎。

Description

一种治疗乙型肝炎的中药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药及其制备方法，特别是涉及一种治疗乙型肝炎的中药及其制备方法，属于新药技术领域。

背景技术

乙型肝炎是全球性的公共卫生问题，广泛流行于世界各国，是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。

我国属乙型肝炎高感染区。随着医疗水平的不断提高，虽然乙肝感染率有所下降，但我国目前仍有乙肝感染者9700余万人，感染率达7.18％。

乙肝病毒慢性感染的远期后果为肝硬化和肝癌，已成为严重威胁人类健康的世界性疾病。调查显示，乙肝感染率有10％～20％可发展为肝硬化，1％～5％可演变为肝癌，男性HBV感染者最终死于相关肝病的危险为50％，女性为15％。据世界卫生组织(WHO)统计，全球60亿人口中，约1/2的人生活在HBV高流行区，乙肝病毒携带者超过20亿人，全球每年有1000万至3000万人感染乙肝病毒，3.6亿乙肝慢性患者的病情正在恶化，其中25％～40％最终将死于肝硬化和肝癌，在全球前10位疾病死因中，乙肝占第7位，每年因乙肝死亡者约为75万例。

乙型肝炎潜伏期长、病情变化多端、流行范围广、危害性强、治疗周期长、迁延难愈、复发率高，且需长期用药，医疗费用巨大，给患者身心健康造成巨大伤害，给社会和家庭带来巨大的经济负担。然而，与乙肝治疗药物的巨大市场需求相比，虽然治疗乙肝新药种类繁多，但迄今为止还没有一种能够完全治愈乙肝的药物，更重要的是，目前已上市药物在临床治疗中存在易产生耐药性(如核苷类药物拉米夫定、阿德福韦酯等)、病毒清除效果低等不足，成为世界肝炎治疗领域的一大难题。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种治疗乙型肝炎的中药，该中药具有清热解毒，舒肝理气，祛瘀通络之功效，用于治疗急、慢性乙型肝炎。

本发明目的之二在于提供该中药的制备方法。

本发明运用现代药物研究方法，经提取、浓缩、精制等加工工艺，制成临床可接受的药物剂型，有效成分含量高，生物利用度高，疗效确切，无毒副作用。

本发明提供的治疗乙型肝炎的中药，是由下述重量配比的原料组成：

虎杖8～16重量份        白花蛇舌草8～16重量份

丹参4～12重量份        金钱草4～12重量份

黄芩3～9重量份            五味子3～9重量份

本发明提供的治疗乙型肝炎的中药，优选为由下述重量配比的原料组成：

虎杖10～14重量份          白花蛇舌草10～14重量份

丹参6～10重量份           金钱草6～10重量份

黄芩4～8重量份            五味子4～8重量份

进一步，本发明提供的治疗乙型肝炎的中药，是由下述重量配比的原料组成：

虎杖总苷0.2～0.4重量份    白花蛇舌草10～14重量份

丹参6～10重量份           金钱草6～10重量份

黄芩提取物0.8～1.2重量    份五味子4～8重量份

本发明提供的治疗乙型肝炎的中药，最佳为按下述重量配比的原料组成：

虎杖总苷0.3重量份         白花蛇舌草12重量份

丹参8重量份               金钱草8重量份

黄芩提取物1.0重量份       五味子6重量份

上述中药中的虎杖总苷是采用以下方法制备：

取虎杖，加6-10倍量的50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次1～2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至1.10～1.20(50～70℃)，上聚酰胺柱，以水、20％乙醇、90％乙醇洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，即得。

上述虎杖总苷中虎杖苷的含量不低于50％，白黎芦醇的含量不低于10％。

本发明可加工制成多种临床药物剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸及口服液体制剂中的一种。

本发明中药制剂主要用于治疗急、慢性乙型肝炎，具有清热解毒，舒肝理气，祛瘀通络之功效，通过抗乙型肝炎病毒、提高免疫功能、保肝降酶等作用达到治疗乙肝的目的。

下述实验例和实施例进一步证明但不限于本发明。

实验例一本发明胶囊体外抗病毒作用-对HBsAg、HBeAg分泌和HBV-DNA复制的抑制作用

1.对细胞毒性试验：用0.06％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，用含10％胎牛血清的DMEM培养配成浓度为3×10⁵/mL的细胞悬液，按0.1ml/孔分种于96孔板，置37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养，2d后换含药培养液0.1ml/孔，每个浓度四孔。将本发明胶囊药液作系列倍比稀释成以下8个浓度4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25ug/mL。继续培养，并设不加药物的对照；6d后收集上清，用MTT法测药物细胞毒性，计算半数有毒浓度(TC₅₀)，最大无毒浓度(TC₀)。

2.对HBeAg、HBsAg抑制试验：细胞处理，接种，培养均同前，给药剂量设不加药物的对照和拉米夫定8ug/mL作为阳性对照；后收集上清后ELISA法测定HBSAg、HBeAg。计算抑制率，计算半数有效浓度(IC₅₀)。

3.HBV-DNA抑制试验：细胞处理，接种，培养及给药浓度均同前，收集细胞上清液后提取其HBV-DNA，采用实时定量PCR技术分析HBV-DNA，计算对HBV-DNA抑制率。

4.结果：

4.1对细胞的毒性作用：经MTT法测定，本发明胶囊体外对2.2.15细胞的TC₅₀＝896.4ug/mL，TC₀＝250ug/mL结果见表1。

表1本发明胶囊体外对2.2.15细胞的毒性

4.2对HBeAg、HBsAg抑制作用：本发明胶囊在62.5ug/mL浓度以上，对HBsAg有显著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)，抑制率为90.4％-30.4％，IC50＝104.5ug/mL，TI＝8.58；本发明在62.5ug/mL浓度以上，对HBeAg有显著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)，抑制率为85.9％-30.4％，IC50＝63.2，TI＝14.14。量效关系均较好，均在无毒剂量就有显著抑制作用，TI很高，显示药物高效低毒。结果见表2，3。

4.3对HBV-DNA的抑制作用：本发明胶囊在62.5ug/mL浓度以上，对HBV-DNA合成有显著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01)，IC50＝67.6ug/mL，TI＝13.26。量效关系均较好，均在无毒剂量就有显著抑制作用，TI很高，显示药物高效低毒。结果见表2，3。

表2本发明胶囊体外对2.2.15细胞HBeAg的抑制作用

与对照组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01

表3本发明胶囊体外对2.2.15细胞HBsAg的抑制作用

与对照组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01

表4本发明胶囊体外对2.2.15细胞HBV-DNA合成的抑制作用

与对照组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01

实验例二本发明胶囊的体内抗病毒活性-对鸭乙型肝炎模型的治疗作用

1.分组与给药

1日龄雄性上海麻鸭，将动物购回后适应性喂养2d后，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交检测选出先天自然感染DHBV者作为实验用动物。DHBV感染雏鸭随机分6组进行药物治疗试验，每组6只：模型对照组(DHBV)，本发明胶囊50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg组，拉米夫定10mg/kg组，口服给药，每日2次，共10d，模型对照组(DHBV)以生理盐水代替药物。在给药前1天(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。

2.DHBV-DNA检测方法

取上述待检鸭血清，按缺口翻译试剂盒操作说明书，用³²P标记作探针，将40pL血清点于硝酸纤维膜上，进行斑点杂交，放射自显影图片斑点，在酶标仪上检测OD值(滤光片为490nm)，以OD值间接代表病毒载量，用t检验进行统计分析。

3.结果：

结果显示，本发明胶囊100，200mg/kg组在用药第5d起DHBV-DNA含量开始降低，与对照组及用药前比较，差异均无显著性(P＞0.05)；第10dDHBV-DNA含量继续降低，与对照组比较差异非常显著性(P＜0.01)，与自身用药前比较，差异有显著性(P＜0.01)；停药后第3d DHBV-DNA含量回升不明显，与对照组比较差异非常显著性(P＜0.05；P＜0.01)，与自身用药前比较，差异有显著性P＜0.05；P＜0.01)。结果显示本发明可显著抑制鸭血清中DHBV-DNA滴度，且停药后无明显回升趋势。结果见表5。

表5本发明胶囊对鸭血清DHBV DNA滴度的影响

与模型对照组比较：^*P＜0.05  ^**P＜0.01；与给药前比较：^△P＜0.05  ^△△P＜0.01

实验例三本发明胶囊对于实验性急慢性肝损伤的保护作用

1.对CCl₄致小鼠急性肝损伤的保护作用

取小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，随机分对照组、模型组、联苯双脂40mg/kg组，本发明胶囊175mg/kg，350mg/kg，700mg/kg组。ig，每日1次，连续7d。第6天除对照组外均ip0.1％CCl₄10mL/kg，12h后(第7天给药后2h)，各组小鼠摘眼球取血，制取血清，测定ALT、AST，并取肝脏作病理学检查。

结果显示：与对照组比较，造模后模型组动物两项转氨酶均显著升高(p＜0.01)；本发明胶囊350mg/kg，700mg/kg组可明显降低小鼠CCl4急性肝损伤的ALT、AST含量(p＜0.01)，结果见表6。本发明胶囊还可明显减轻肝组织病理损伤，以1000mg/kg组作用最佳。

表6本发明胶囊对小鼠急性肝损伤的保护作用

与正常对照组比较^##P＜0.01与模型对照组比较：^**P＜0.01  ^*P＜0.05

2.对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的保护作用

取大鼠60只，雌雄兼用，除正常对照组10只外，其余动物按0.5ml/100g体重，腹腔注射10％的CCL₄，每周2次。2周后眼眶采血测定血清中GPT，去除GPT含量低于100卡门单位的动物，其余动物根据GPT含量均匀分5组：模型组、联苯双脂30mg/kg组，本发明120mg/kg，240mg/kg，480mg/kg组。分组与给药同3.1。分组后各组仍继续用腹腔注射10％的CCL₄造模，每周2次，连续8周。给药组同时开始灌胃给药，每日剂量分2次给予，连续8周。正常对照组在同等情况下腹腔注射生理盐水和灌胃给蒸馏水。观察下列指标：每周称体重，记录死亡情况；每2周检测血清中GPT含量；分别于给药后6周、8周采血测定血清中GPT、GOT、ALP、ALB、TP、TBIL的含量；病理检查。

结果显示：对大鼠血清生化指标的影响：本发明胶囊240mg/kg，480mg/kg组在给药第6周开始可明显降低血清中ALT含量；本发明胶囊240mg/kg，480mg/kg给药第6周开始、150mg/kg给药第8周开始可明显降低血清中AST含量；本发明胶囊120，240mg/kg，480mg/kg组在给药第6周开始可明显降低血清中ALT含量；本发明胶囊240mg/kg，480mg/kg给药第6周可降低血清中TBIL(总胆红素)的含量，均与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，结果见表7。病理结果显示：经HE染色后，给药不同剂量组与模型组比较肝组织纤维增生、汇管区的炎性细胞浸润、结节的形成均有减轻的趋势，尤其240mg/kg，480mg/kg组的肝组织病变明显好于模型组。经GA染色后给药不同剂量组肝组织间质纤维VG染色呈弱阳性，240mg/kg，480mg/k组肝组织纤维增生呈现明显的弱阳性。肝脏病理程度分级采用秩和检验进行统计学处理，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。

表7本发明胶囊对大鼠慢性肝损伤的保护作用6周

本发明胶囊对大鼠慢性肝损伤的保护作用8周

与正常对照组比较^##P＜0.01与模型对照组比较：^**P＜0.01  ^*P＜0.05

实验例四本发明胶囊的免疫调节作用

1.对免疫性肝损伤的保护作用

分组及用药剂量同3.1。灌胃给药，每日剂量分2次给予，连续13d。第3天除生理盐水组外均尾静脉注射新鲜卡介苗2mg/只(5×10⁶个/只)，注射卡介苗后第10天尾静脉注射LPS7.5μg/只，12h后各组小鼠摘眼球取血，制取血清，测定ALT、AST，并取肝组织作病理学检查。

结果显示：造模后，模型组动物ALT，AST活性显著升高(p＜0.01)；本发明175mg/mL，350mg/mL，700mg/mL小鼠血清ALT及AST活性比模型组显著降低(p＜0.05；p＜0.01)，结果见表8。本发明胶囊还可明显减轻肝组织病理损伤，以700mg/kg组作用最佳。提示本品对小鼠免疫性肝损伤具有显著的保护作用。

表8本发明胶囊对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

与正常对照组比较^##P＜0.01与模型对照组比较：^**P＜0.01  ^*P＜0.05

2.对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

2.1对免疫功能低下小鼠碳粒廓清作用的影响

取健康雄性ICR种小鼠，随机分组：对照组，模型组，左旋咪唑16mg/kg组，本发明胶囊175mg/kg，350mg/kg，700mg/kg组，分别灌胃给药，每日剂量分2次给予，连续给药10天。空白对照组和模型组在同等条件下给蒸馏水分组与给药同上，在给药第三天，除空白对照组外，其余各组均一次性皮下注射环磷酰胺100mg/kg。空白对照组一次性皮下注射等剂量的生理盐水。给药的第11天以20％印度墨汁0.2ml/只给小鼠尾静脉注射。在注射后的2分钟和10分钟分别眼球后静脉丛取血0.02ml，加到装有2ml0.1％碳酸钠溶液的试管中溶解红细胞，然后在波长为600nm的紫外分光光度计测定光密度(OD)值，计算在单位时间内血清中碳粒廓清的速度，并计算校正指数α。

结果表明：模型组小鼠吞噬指数较正常对照组明显降低(P＜0.05)。本发明胶囊350mg/kg，700mg/kg能显著增高模型小鼠吞噬指数(P＜0.05)。结果见表9.

表9本发明胶囊对免疫功能低下小鼠碳粒廓清作用的影响

与对照组比较^#P＜0.05与模型组比较^*p＜0.05

$K(K=\frac{\log \mathrm{OD}2-\log \mathrm{OD}1}{t10-t2}),$ 并计算校正指数α

2.2.对免疫功能低下小鼠血清溶血素IgM的影响

健康雄性ICR种小鼠，分组给要与造模同4.2.1，在给药第3天，每只小鼠腹腔注射5％羊红细胞(SRBC)0.25ml进行免疫，免疫后的第5天，由眼球后静脉丛取血，离心，分离血清，以血清溶血素实验测定抗体。把收集的血清用生理盐水做800倍稀释后，吸取0.5ml稀释的血清放入另一试管中，依次加入5％SRBC、补体、生理盐水各0.5ml，空白管用生理盐水代替血清，混匀，置37℃温箱温育1h，然后离心(3000r/min，5min)，取上清，在紫外分光光度计490nm处测OD值。按下列公式计算溶血素含量：HCIgM＝样本血清的OD值×稀释倍数。

结果表明：造模后，模型组动物血清IgM含量显著降低(p＜0.01)；本发明350mg/kg，700mg/kg组可明显提高免疫功能低下小鼠的血清IgM含量(P＜0.05，P＜0.01)。结果见表10。

表10本发明胶囊对免疫功能低下小鼠血清溶血素IgM的影响

与对照组比较，^##P＜0.01；与模型组比较，^**P＜0.01

2.3.对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群的影响

健康雄性ICR种小鼠，分组给要与造模同4.2.1，最后一次给药后1小时处死小鼠，收集血液测定外周血T细胞亚群数及相应比值：取血液置于EDTA抗凝管中，用流式细胞仪测CD4⁺，CD8⁺T淋巴细胞亚群。

结果表明：模型组对T细胞亚群中的CD4⁺、CD8⁺T均有明显抑制作用，与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)；各给药组均可明显升高CD4⁺、CD8⁺T计数，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。结果见表11。

表11本发明胶囊对免疫功能低下小鼠T淋巴细胞亚群的影响

综上所述：本发明胶囊具有明显的体内外抗乙肝病毒作用；对于实验性急慢性肝损伤具有良好的保护作用，可以保肝降酶；此外还可减轻免疫性肝损伤，提高巨噬细胞吞噬功能，具有明显的免疫增强作用。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1

取虎杖300g、丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的清膏，药渣备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g、黄芩150g，与上述药渣合并，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的清膏，与上述清膏合并，干燥，加入辅料，按常规制成胶囊1000粒。

实施例2

取虎杖130g、丹参200g、五味子50g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，提取醇液滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，药渣备用；取白花蛇舌草130g、金钱草160g、黄芩150g，与上述药渣合并，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，与上述稠膏合并，干燥，加辅料，按常规方法制成颗粒1000g。

实施例3

取虎杖总苷5g、黄芩提取物30g，粉碎成极细粉，备用；取丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，干燥，粉碎成细粉，备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，干燥，粉碎成细粉，备用；取上述极细粉，混合均匀，加辅料，按常规方法制成软胶囊1000粒。

实施例4

取虎杖总苷7.5g、黄芩提取物25g，粉碎成细粉，备用；取丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，干燥，粉碎成细粉，备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，干燥，粉碎成细粉，备用；取上述细粉，加入辅料，按常规制得片剂1000片。

Claims (5)

1.一种治疗乙型肝炎的中药，其特征在于该中药是由下述方法制备：

取虎杖300g、丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的清膏A，药渣备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g、黄芩150g，与上述药渣合并，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的清膏B，与上述清膏A合并，干燥，加入辅料，按常规方法制成胶囊1000粒。

2.一种治疗乙型肝炎的中药，其特征在于该中药是由下述方法制备：

取虎杖130g、丹参200g、五味子50g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，提取醇液滤过，合并滤液，减压回收乙醇并在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏A，药渣备用；取白花蛇舌草130g、金钱草160g、黄芩150g，与上述药渣合并，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏B，与上述稠膏A合并，干燥，加辅料，按常规方法制成颗粒1000g。

3.一种治疗乙型肝炎的中药，其特征在于该中药是由下述方法制备：

取虎杖总苷5g、黄芩提取物30g，粉碎成极细粉，备用；取丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏A，干燥，粉碎成细粉，备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏B，干燥，粉碎成细粉，备用；取上述极细粉，混合均匀，加辅料，按常规方法制成软胶囊1000粒。

上述虎杖总苷中虎杖苷的含量不低于50％，白黎芦醇的含量不低于10％。

4.一种治疗乙型肝炎的中药，其特征在于该中药是由下述方法制备：

取虎杖总苷7.5g、黄芩提取物25g，粉碎成细粉，备用；取丹参200g、五味子150g，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇并在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏A，干燥，粉碎成细粉，备用；取白花蛇舌草300g、金钱草200g，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，煎液合并，滤过，滤液在60℃浓缩至相对密度为1.25～1.30的稠膏B，干燥，粉碎成细粉，备用；取上述细粉，加入辅料，按常规制得片剂1000片。

上述虎杖总苷中虎杖苷的含量不低于50％，白黎芦醇的含量不低于10％。

5.如权利要求3或4所述的中药，其特征在于所述虎杖总苷按如下方法制备：

取虎杖，加6-10倍量的50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次1～2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并在50～70℃浓缩至1.10～1.20，上聚酰胺柱，以水、20％乙醇、90％乙醇洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，即得。