CN102008563A - 一种抗癌中药及其配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗癌中药,是由以下重量份的原料药制成:大黄110-130份,土鳖虫110-130份,炮山甲130-150份,制马钱子55-75份,三七55-75份,炮附片110-130份,熊胆粉55-75份,雄黄粉8-12份,甘草90-110份。该药经毒理学研究、急性毒性实验,LD50及长期毒生试验结果证明该药临床用药安全,经药效学研究和十多年临床应用显示本品能抑制肿瘤生长,缩小瘤体,化瘀解毒,软坚散结,对治疗肝癌、肺癌特别是延长晚期肝癌患者生存期、提高癌症患者生活质量、镇痛效果显著。
Description
技术领域
本发明属于抗癌中草药制备领域,具体涉及一种抗癌中药及其配制方法。
背景技术
众所周知,癌症严重威胁人类健康和生命,其发病率越来越高,成为了当今世界各国医学界难以攻克的难题;本发明人在综合多种民间秘方的基础上,经过多年的潜心研究和改进得出本发明的独特配方及其制备的方法。该药经毒理学研究、急性毒性实验,LD50及长期毒性试验结果证明该药临床用药安全,经药效学研究和十多年临床应用显示本品能抑制肿瘤生长,缩小瘤体,化瘀解毒,软坚散结,对治疗肝癌、肺癌特别是延长晚期肝癌患者生存期、镇痛效果显著。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗癌中药及其配制方法。
一种抗癌中药是由以下重量份的原料药制成:大黄110-130份,土鳖虫110-130份,炮山甲130-150份,制马钱子55-75份,三七55-75份,炮附片110-130份,熊胆粉55-75份,雄黄粉8-12份,甘草90-110份。
所述的抗癌中药的配制方法,包括以下步骤:
(1)称取1/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七粉碎成细粉备用;
(2)土鳖虫加5-7倍质量的75%乙醇,70℃~90℃回流提取2.5-3.5小时,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度1.2-1.4的稠膏备用;
(3)炮山甲粉碎后布包,浸泡0.5-0.8小时过滤后,与炮附片、甘草,剩余的5/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七,以及步骤(2)制备土鳖虫稠膏后的药渣加水煎煮二次,合并滤液,滤过,滤液减压浓缩成稠膏,再加入步骤(2)制得的土鳖虫稠膏,真空干燥粉碎成细粉,再加入熊胆粉、雄黄粉以及步骤(1)得到的大黄、制马钱子、三七细粉,混匀即可。本发明中药可用于制备片剂,冲剂,丸剂,胶囊等等剂型。
步骤(1)所述的细粉均为80-120目。
步骤(3)中所述的加水煎煮过程中,第一次煎煮加入8倍固体质量的水,煎煮2小时;第二次煎煮加入6倍固体质量的水,煎煮1.5小时。
配方中大黄,味苦、性寒,归脾、胃、大肠、肝经,功具荡涤邪毒,逐淤通经,擅“破症瘕积聚,推陈致新”(《本经》)。《本草纲目》说:“大黄乃足太阴、手足阳明、手足厥阴五经血分之药,凡病在五经之血分者,宜用之。”故用为君药。炮山甲,性寒凉,味咸。“入厥阴、阳明经。”(《纲目》)。“治疥癞痈毒,破气行血,胸膈膨胀逆气。”(《纲目》)《本草再新》云其:“解热败毒。”《医学衷中参西录》则云:“味淡性平,气腥而窜,其走窜之性,无微不至,故能宣通脏腑,贯彻经络,透达关窍,凡血凝血聚为病,皆能开之。至症瘕积聚,疼痛麻痹,二便秘塞诸证,用药治不效者,皆可加山甲作向导。”土鳖虫,味咸、性寒,有小毒,归肝经。功能逐瘀破积,主治“血积症瘕”,有“破坚,下血闭”之功(《本经》)。《新修本草》亦云:“张仲景治杂病方及久瘕积结,有大黄庶虫丸,又有鳖甲煎丸,并用之,以其有破坚下血之功也。”二活血逐瘀,软坚散结,以消症瘕积块,并能败毒,共助大黄而为臣药。马钱子,味苦、性寒,有毒,归肝、脾经。功能通络散结,化瘀定痛。临床应用本品对肝、肺多种癌肿均有一定疗效。三七,味甘、苦,性微温,归肝、胃经。功能化瘀止血,活血定痛。用于症瘕癌肿,有破瘀散结之功。炮附片,味辛、性大热,有大毒,归心、肾、脾经。其用有二,一是用其辛散之力,通经络,“除阴毒”(《本草纲目》),以“破症坚积聚血瘕”(《本经》)。盖“血得温则行,遇寒则凝”,故二是以其大热之性,监制方中大黄及他药之寒凉,借鉴“附子大黄汤”去性存用配伍之妙。雄黄,昧辛,性温,有毒,归肝、大肠经。功能解毒,燥湿,祛痰。熊胆,昧苦、性寒,归肝、胆、心经,功能解毒、止疼,且能利胆退黄。五药以毒攻毒,逐瘀散结,活血定痛,利胆退黄,同为佐药。甘草,味甘性平,甘缓和中,调和诸药,缓解药毒,并能顾护脾胃,为使约。诸约配伍,解毒逐瘀以除其因,软坚散结以祛其积,活血通经以定其痛,病证症兼顾,以毒攻毒,故可用于原发性肝癌瘀毒内结所见胁下痞块、疼痛拒按,舌质青紫等症。
本发明制备的药临床上主要用于抗肿瘤治疗(化瘀解毒,软坚散结),通过对动物移植肿瘤小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌、大鼠W256肉瘤及小鼠艾氏腹水瘤的抑瘤实验,结果表明其表现较强而且较广泛的抗肿瘤活性,其高剂量组作用接近抗肿瘤常用西药CTX。临床等倍剂量也表现较强的抗瘤活性,对小鼠肝癌H22、肉瘤S180、肉瘤W256的杀伤与相同浓度对照药比较,其作用明显强于安替可。
我们正在对本发明药抗癌机理进行深入研究:在小鼠肝癌细胞与同种异体脾淋巴细胞体外融合后再移植回患癌鼠后,由主要组织相容性抗原系统对同种异体脾淋巴细胞的排斥而诱发对肝癌细胞的排斥,最终达到对野生型肝癌细胞的排斥,初步结果表明本品对这一作用全过程有明显的促进作用。其可能机制为促进机体固有的强大的排异瓜转化及放大为机体对肿瘤的排斥,进面激发肿瘤细胞凋亡的发生。
由于抗肿瘤实验及人临床预试以及有关机理研究基础,表明本发明药对肿瘤的治疗作用与机体的整体机能有密切关系,而且对肝癌表现较强的活性,故以荷肝癌动物为观察对象,检测了与肿瘤免疫密切相关的动物非特异性免疫功能中巨噬细胞吞噬功能、细胞免疫中脾淋巴细胞转化功能、最重要的淋巴细胞因子白细胞介素-2的诱生及活性水平、天然杀伤细胞、肿瘤坏死因子(7)(8)。结果表明,对荷肝癌鼠上述指标均有不同程度的促进作用及趋势,尤其对淋巴细胞转化功能,天然杀伤细胞、肿瘤坏死因子有较明显的作用,其作用均有强于对照药安替可趋势。实验结果证明本发明制备的胶囊对患肿瘤机体有较强促进有关肿瘤免疫功能的作用,加强了机体对肿瘤的排斥及杀伤作用,与其对肿瘤的直接抑制作用相结合,有机地动员全身抗肿瘤功能,发挥有效的抗肿瘤作用,对荷瘤动物有明显的镇痛作用,结果表明对临床肿瘤治疗在改善症状,提高肿瘤患者生活质量方面是有益的。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。
以下实施例均按照如下步骤配制:
(1)称取1/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七粉碎成80-120目细粉备用;
(2)土鳖虫加5-7倍质量的75%乙醇,70℃~90℃回流提取2.5-3.5小时,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度1.2-1.4的稠膏备用;
(3)炮山甲粉碎后布包,浸泡0.5-0.8小时过滤后,与炮附片、甘草,剩余的5/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七,以及步骤(2)制备土鳖虫稠膏后的药渣加水煎煮二次,第一次煎煮加入8倍固体质量的水,煎煮2小时;第二次煎煮加入6倍固体质量的水,煎煮1.5小时。合并滤液,滤过,滤液减压浓缩成稠膏,再加入步骤(2)制得的土鳖虫稠膏,真空干燥粉碎成细粉,再加入熊胆粉、雄黄粉以及步骤(1)得到的大黄、制马钱子、三七细粉,混匀即可。
实施例1
大黄115份,土鳖虫115份,炮山甲135份,制马钱子60份,三七60份,炮附片115份,熊胆粉60份,雄黄粉8份,甘草95份。
实施例2
大黄115份,土鳖虫115份,炮山甲130份,制马钱子55份,三七55份,炮附片115份,熊胆粉55份,雄黄粉8份,甘草90份。
实施例3
大黄115份,土鳖虫110份,炮山甲140份,制马钱子55份,三七65份,炮附片125份,熊胆粉70份,雄黄粉9份,甘草90份。
实施例4
大黄130份,土鳖虫115份,炮山甲135份,制马钱子60份,三七55份,炮附片115份,熊胆粉60份,雄黄粉10份,甘草100份。
动物学实验:
将上述实施例制备的胶囊(以下简称为A胶囊)进行了以下药理研究:
一、抗肿瘤作用
(一)体内抗肿瘤作用
观察了对小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌、大鼠肉瘤W256及艾氏腹水瘤的抑制作用。
(二)体外抑瘤实验
观察了对以下五种肿瘤的体外抑癌作用:小鼠肝癌H22、小鼠Lcwis肺癌、小鼠肉癌S180、大鼠肉瘤W256及艾氏腹水瘤。
二、抗肿瘤辅助作用
1.对荷肝癌小鼠的鸡红细胞吞噬功能的影响;
2.对荷肝癌小鼠白细胞介素-II诱生的影响;
3.荷肝癌小鼠脾淋巴细胞转化功能;
4.荷肝癌小鼠NK细胞活性的检测;
5.荷肝癌小鼠肿瘤坏死因子的检测。
三、镇痛作用
具体过程如下:
一、实验材料
1.动物清洁级BALB/c小鼠,体重17-22g,雌雄兼用,购自湖南省中医药研究院动物室,合格证号:湘医动字第027。清洁级C157/6J小鼠,体重17-22g,雌雄兼用;清洁级SD大鼠,体重80-110g,雌雄兼用,购自上海西普尔一必凯实验动物有限公司,合格证号:沪医动字153号及沪医动字第02-49-2号。
2.药物
A胶囊:本发明方法制备,人用量为7.2g生药/人/日,(以下所提剂量均指生药量)。受试药样品放于干燥器中保存,实验时临时配制,小鼠、大鼠用量及浓度见表a、表b。
安替可(Antike):深圳蛇口海王生物工程有限公司长春公司,0.22g/粒,人日服12粒,动物实验均用临床等倍量。
表a A胶囊及安替可小鼠药效学给药剂量
表b A胶囊及安替可小鼠药效学给药剂量
3.试剂
1)环磷酰胺:上海第十二制药厂。
2)三氯化铁:湘中地质实验研究所。
3)二甲苯:湖南试剂厂。
4)三氯醋酸:湖南试剂厂。
5)3H-TDR(胸腺嘧啶核苷):中国原子能研究所提供。
6)RPMI1640培养基:GIBCO产品。
7)ConA(刀豆蛋白):Sigma产品。
8)氢化可的松:北京第三制药厂。
9)2.5-二苯基恶唑(PP0):FARC0产品。
10)POPOP(1,4-BIS-BENZENE):FARCO产品。
11)肿瘤坏死因子放免分析盒中国原子能研究所提供.
12)台盼兰:上海生化试剂厂产品。
13)阿斯匹林:湖南制药厂,0.3g/片,临用时用蒸馏水配成1.2%混悬液,用临床2倍量。
14)冰醋酸:湖南试剂厂,AR,临用时配成0.6%的水溶液。
4.瘤株及细胞
YAC-1细胞、CTLL-2细胞,由湖南医科大学免疫研究室提供,小鼠肝癌A22、大鼠肉瘤W256、小鼠肉瘤S180、小鼠Lcwis肺癌及艾氏腹水瘤均由军事医学科学研究院基础研究所提供。
5.仪器
RF-530型荧光检测仪;FJ-2008P型r-免疫计数仪;FJ-2107P液体闪烁计数仪;7223分光光度计;二氧化碳培养箱;MINIMASH细胞收集器;XSJ倒置显微镜;GL21低温高速离心机;SEAC全自动血球计数仪。
二、方法与结果
A、抗肿瘤实验
(一)体内抑瘤实验
1.对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制实验
1)抑肝癌方法
无菌条件下抽取H22瘤液,以生理盐水1∶3稀释,取BALB/c小鼠,每批实验单用一种性别,体重17-22g,按无菌操作于有右腋皮下接种小鼠肿瘤无菌稀释液0.2ml/只,24小时后称重分组,随机分为荷瘤对照组(动物数多一倍),受试药物大、中、小剂量组,安替可(ATK)组,环磷酰胺组(CTX),CTX每日20mg/kg i.p,其余各组每日灌胃,模型对照组给等容积蒸溜水。给药剂量见前述表。另设正常动物(未接种肿瘤,接种等量生理盐水作为假接种组)10只,每日灌服等容积蒸溜水作为正常对照组。每日一次,连续7天,停药次日处死小鼠,称重并剥离皮下瘤块,称瘤重,统计死亡率、体重、瘤重并计算抑瘤率。本实验重复三批,每批结果作组间t检验,ATK与A胶囊中剂量组比较(1)(2)(3)。
2)抑肝癌结果
表1.aA胶囊对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制作用(第一批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表1.b A胶囊对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制作用(第二批,全用雌)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表1.b A胶囊对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制作用(第三批,全用雌)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,△P<0.05。
结果见表1,A胶囊大,中、小剂量组对肝癌H22的抑制率三批结果相近,高剂量组最大抑瘤率达60.3%,中剂量组达41.6%,其抑瘤率均高于相当倍数剂量对照药安替可,第三批结果显示,抑瘤率明显高于安替可,差异有统计学意义(P<0.05=。正常空白组动物均未见假性肿块形成,体重及死亡率均符合要求,表明肿瘤生长良好,与正常空白对照组比较,荷瘤动物体重有一定下降趋势荷瘤动物有少量在中途死亡,死亡数、体重各组间比较无统计学意义(P>0.05)。抑制作用呈一定的剂量依赖性,临床等倍剂量表现出较好的活性,抑瘤率>30%。西药CTX也表现较稳定的抑瘤作用,A胶囊大剂量组作用强度比环磷酰胺组稍强,但无统计学意义(P>0.05)。
3)抑肝癌小结
以上结果提示,A胶囊对小鼠肝癌H22有较强的,较稳定的抑制作用,临床等倍剂量表现较强活性,其抗肝癌作用优于安替可。
2.对小鼠Lcwis肺癌的抑瘤实验
1)抑小鼠肺癌方法
取带生长良好的实体瘤的肺癌种鼠,无菌条件下剥离瘤快,生理盐水1∶4制成匀浆,取C57/6J小黑鼠,雌雄兼用,体重17-22g,按无菌操作于右腋皮下接种小鼠肿瘤无菌稀释液0.2ml/只,24小时后称重分组,分组给药及结果处理均同肝癌H22。
2)抑制癌实验结果
表2.a A胶囊对小鼠Lcwis实体瘤的抑制作用(第一批,全用雌)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P<0.05。
表2.b A胶囊对小鼠Lcwis实体瘤的抑制作用(第二批,全用雌)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P<0.05。
表2.c A胶囊对小鼠Lcwis实体瘤的抑制作用(第三批,全用雌)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P<0.05。
结果见表2a、2b、2c,A胶囊大、中、小剂量组对Lcwis肺癌的抑制率三批结果相近,高剂量组最大抑瘤率达39.8%,中剂量组达35.1%,其抑瘤率均高于相当倍数剂量对照药安替可,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常空白对照组比较,荷瘤动物体重有一定下降趋势;荷瘤动物有少量在中途死亡、死亡数、体重各组间比较无统计学意义(P>0.05)。A胶囊对Lewis肺癌抑制作用呈一定的剂量依赖性,临床等倍剂量表现出较好的活性,抑瘤率>30%。
3)抑Lewis肺癌小结
以上结果提示,A胶囊对小鼠Lewis肺癌有较强的、较稳定的抑制作用,临床等倍剂量表现较强活性,其抗小鼠Lewis肺癌作用优于安替可。
3.对大鼠肉瘤W256的影响
1)对大鼠肉瘤W256抑制实验方法
无菌条件下抽取生长良好的W256瘤液,以生理盐水1∶3稀释,取SD大鼠,每批用单一性别,体重80-150g按无菌操作于右腋皮下接种大鼠肿瘤无菌稀释液0.2ml/只,24小时后称重分组,分组同前,给药剂量见大鼠给药剂量表,CTX每日15mg/kgi.p,其余各组每日灌胃给药,每日一次,连续7天,停药次日处死大鼠,称重并剥离皮下瘤快,称瘤重,并计算抑瘤率。本实验重复三批,各批结果进行组间t检验。
2)抑制大鼠肉瘤W256实验结果
表3.aA胶囊对大鼠肉瘤W256的抑制作用(第一批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表3.bA胶囊对大鼠肉瘤W256的抑制作用(第二批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表3.cA胶囊对大鼠肉瘤W256的抑制作用(第三批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
结果见表3a、3b、3c,A胶囊大、中、小剂量组对大鼠肉瘤W256的抑制率三批结果相近,高剂量组最大抑瘤率22.2%,中剂量组达18.8%,与荷瘤对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),其抑瘤均高于相当倍数剂量对照药安替可,但差异无统计学意义(P>0.05)。与正常空白对照组比较,荷瘤动物体重有一定下降趋势;荷瘤动物有少量在中途死亡,死亡数、体重各组间比较无统计学意义(P>0.05)。A胶囊对大鼠肉瘤W256抑制作用呈一定的剂量依赖性,结果表明本品对大鼠肉瘤W256有一定抑制作用。
3)抑大鼠肉瘤W256小结
以上结果提示,A胶囊对大鼠肉瘤W256有一定抑制作用,对照药安替可作用不明显。
4.对小鼠艾氏腹水瘤的影响
1)实验方法
选择接种7天后腹水生长良好的小鼠,无菌抽吸腹水,以生理盐水作1∶3倍的稀释,取BALB/c小鼠,每一批用单一性别,体重17-22g,于腹腔接种稀释液0.2ml/只,24小时后称重分组,随机分为对照组,受试药物大、中、小剂量组,安替可组,环磷酰胺组(CTX),CTX每日20mg/kgi.p,其余各组每日灌胃给药,每日一次,连续7天,停药后称体重一次,作为治疗后体重,并开始观察动物的生存日数,并教育处生命延长率。另设正常注射生理盐水组同前,本实验重复三批,分别统计三批结果,进行组间t检验。
2)实验结果
表4.aA胶囊对小鼠艾氏腹水瘤的抑制作用(第一批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表4.bA胶囊对小鼠艾氏腹水瘤的抑制作用(第二批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
表4.CA胶囊对小鼠艾氏腹水瘤的抑制作用(第三批,全用雄)
与荷瘤模型组比较,**:P<0.01;与相当倍数ATK比较,P>0.05。
结果见表4a、4b、4c,A胶囊大、中、小剂量组对小鼠艾氏腹水瘤有明显的抑制作用,生命延长率三批结果相近,高剂量组最高生命延长率达52.7%,中剂量组达42.4%,其生命延长率均高于相当倍数剂量对照药安替可,但差异无统计学意义(P>0.05)。与正常空白对照组比较,荷腹水瘤动物体重有明显增加(荷瘤模型组与正常动物比较,P<0.01);荷瘤动物有少量在中途死亡,死亡数、各组间比较无统计学意义(P>0.05),各荷瘤模型组比较无统计意义(P>0.05)。康龙胶囊对小鼠艾氏腹水瘤抑制作用呈一定的剂量依赖性,临床等倍剂量表现出较好的活性。
3)抑小鼠艾氏腹水瘤小结
以上结果提示,A胶囊对小鼠艾氏腹水瘤有较强的、较稳定的抑制作用,临床等倍量表现较强活性,其抑制小鼠艾氏腹水瘤作用有强于安替可的趋势。
(二)体外抑瘤实验
1.方法
每次在25ml玻璃培养瓶中加PRMI1640培养基4ml和五种肿瘤细胞之一种细胞4.0×104个,加入受试药物40ul;在含5%二氧化碳的培养箱37℃培养72小时;取细胞悬液(贴壁细胞先用胰蛋白酶消化)0.4ml,加0.4%台盼兰液0.1ml,在室温作用5分钟,在5分钟内计数200个细胞,统计染色及未染色细胞,计算肿瘤细胞生长抑制率,进行组间(1)(2)。
表5对体外培养肿瘤细胞的影响结果
ATK为安替可,EAC为艾氏腹水瘤细胞。与相同剂量安替可比较,*P<0.05,**P<0.01
由表5可见,A胶囊5mg/ml,即有一定的体外杀瘤作用,在20mg/ml时,已非常明显,在80mg/ml时钟瘤细胞生长抑制率几乎达100%,几乎杀灭所有失本外培养肿瘤细胞,本品肝癌H22、肉瘤S180、肉瘤W256的杀伤与相同浓度对照药比较,A胶囊作用明显强于安替可。台盼兰拒染,主要是药物直接杀死了肿瘤细胞,死亡肿瘤细胞膜功能受损而当染色,结果提示有较经中较广泛的体外抑瘤作用,对肿瘤细胞有较强的直接杀伤作用。
3.体外抑瘤小结
本品5mg/ml,即有一定的体外杀瘤作用,在20mg/ml时,已明显,在80mg/ml时肿瘤细胞生长抑制率几乎达100%,几乎杀灭所有的体外培养肿瘤细胞,本品对肝癌H22、肉瘤S180、肉瘤W256的的杀伤与相同浓度对照药比较,A胶囊作用明显强于安替可。
B、对肿瘤免疫的影响
1.对荷肝癌H22小鼠吞噬功能的影响
1)对荷肝癌小鼠鸡红细胞吞噬功能的影响方法
取小鼠,按前述方法接种肝癌后随机分组,见表6,各组灌胃给药,连续7天,第3天每鼠腹腔注射0.5淀粉溶液0.5ml,第7天每鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.5ml,间隔3小时,颈椎脱臼处死小鼠,采用滴片法,取腹腔液滴于载玻片上,37℃温育30分钟,用生理盐水冲去滴片上悬浮的未被吞噬的鸡红细胞及其它细胞,甲醇固定,Giemsa-wright染色,油镜下观察,计算吞噬百分率和吞噬指数,结果进行组间t检验。
2)结果
表6A胶囊对荷肝癌巨噬细胞吞噬功能的影响(X±S)
各组间比较P>0.05
由表6可以看出,荷肝癌小鼠模型组的巨噬细胞吞噬指数及吞噬百分率与正常对照鼠比,均有降低趋势,经用A胶囊治疗后,荷肝癌鼠巨噬细胞吞噬指数及吞噬百分率均有提高趋势,以A胶囊中剂量组较为明显。
3)小结
结果提示A胶囊对荷肝癌小鼠的巨噬细胞吞噬功能有增强趋势。
2.对荷肝癌小鼠淋巴细胞转化功能的影响
1)方法
取接种肝癌24小时后BALB/c小鼠,分组同前,各组每日灌胃一次,连续7天,第8天断头处死动物,无菌条件下取脾脏置于盛有Hank’s溶液的平皿中,用注射器芯研碎,200目铜网过滤,离心,洗涤三次,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液,调细胞浓度至2.5×106个/ml。取0.1ml加入96孔平底培养析中,加入2ugCONA,三个平行管,37℃,5%二氧化碳培养箱孵育72小时,终止培养前6小时,每孔加入3H-TdR(胸腺嘧定啶核苷)luci。用MINIMASH2000多头细胞收集器收集细胞,J-2107P液体闪烁计数仪计数CPM值,结果进行且间t检验(1)(4)(8)。由于淋巴细胞的母细胞化过程需要报入DNA前体物质TdR,CPM值的大小反应掺入的多少,间接瓜脾淋巴细胞的转化功能。
2)结果
表7A胶囊对荷肝癌鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(X±S)
与正常鼠对照组比较,**P<0.01,与肝癌鼠模型组比较,△:P<0.05,△△:P<0.01,安替可组与相当剂量的A胶囊组比较,P>0.05。
由表7可以看出,荷肝癌鼠组的脾淋巴细胞DNA前体掺人明显低于正常鼠(P<0.01),表明荷肝癌鼠的淋巴细胞转化功能受到抑制,经用A胶囊治疗后,大、中剂量组淋巴细胞转化功能明显提高,A胶囊中剂量组接近正常鼠水平,中剂量组与安替可组比较,作用稍强,但无统计学意义。
3)小结
以上结果提示,A胶囊能明显提高荷肝癌小鼠机体的淋巴细胞转化功能,促进机体的细胞免疫功能。
3.对荷肝癌小鼠脾淋巴细胞IL-2的诱生及测定
1)方法
取小鼠,先接种肝癌,再分组及给药,另设未接种肝癌鼠作对照,详见表8。
a、IL-2诱生:断头处死小鼠,无菌条件下取脾置于盛有Hanks液的平皿中,用毛玻璃片研磨成单个细胞悬液,经200目铜网过滤,离心洗涤,用10%FCS-1640培养液调整至2.5×106/ml。取24孔培养板,每孔加入1ml脾悬液,5ugConA,平行样2份,置37℃5%CO2培养箱孵育40hr,离心收集上清液,置-30℃冰箱中冻存,待测定活性。
b、IL-2活性测定:用96孔培养板,每孔加入CTLL-2细胞5×104个(100ul),待测样品终浓度为1∶4,培养24小时,终止培养前4h,每孔加入2uci3H-TDR,用多头细胞收集器收获,液体闪烁计数仪测量CPM,结果采用谭岩,杨贵贞方法计算活性单位(u/l),结果进行组间t检验(5)。
2)结果
表8A胶囊对荷肝癌鼠脾淋巴细胞IL-2诱生活性的影响(X±S)
与正常鼠对照组比较,**P<0.01,与肝癌鼠模型组比较,P>0.05,安替可组与相当剂量的A胶囊组比较,P>0.05。
由表8可以看出,荷肝癌鼠组的脾淋巴细胞IL-2诱生能力明显低于正常鼠(P<0.05),表明荷肝癌鼠的淋巴细胞转化功能受到抑制,经用康龙胶囊治疗后,大、中、小剂量组脾淋巴细胞IL-2诱生能力有提高趋势,中剂量组与安替可组比较,作用相当。
3)小结
以上结果提示,A胶囊能对荷肝癌小鼠机体的脾淋巴细胞IL-2诱生能力有促进作用趋势,对机体的细胞免疫功能有一定促进作用。
4.对荷肝癌小鼠NK(天然杀伤)细胞活性的检测
1)方法
a、标记靶细胞
取培养1-2天的YAC-I细胞,调细胞浓度1×105,按5uci/ml加入3H-TDR,37℃,5%二氧化碳培养箱培养24小时。
b、效应细胞(NK细胞)制备
无菌取上述动物脾淋巴细胞同前,Han’s洗两次,再用含10%,小牛血清RPMI1640完全培养基洗一次,调细胞浓度1×107/ml。
c、细胞毒试验
在96孔V型板中,每孔加入效应细胞100ul及靶细胞100ul,另设不加效应细胞的靶细胞对照,每个样品设三个平行管,二氧化碳培养箱培养16小时,轻吸去各孔培养液,分别加入DNA酶及胰蛋白酶各100ul,在37℃、饱和温度、无二氧化碳培养2小时,用细胞收集器收集细胞于滤纸上,液体闪烁计数仪计数取三孔平均值,计算NK细胞活性,结果进行组间t检验(6):
NK细胞活性=1-3H-TdR释放率。
2)结果
表9A胶囊对荷肝癌小鼠脾NK细胞活性的影响(X±S)
与正常鼠对照组比较,**P<0.01,与肝癌鼠模型组比较,△/P<0.05,安替可组与相当剂量的A胶囊组比较,P>0.05。
由表9可以看出,荷肝癌鼠组的脾NK细胞活性明显低于正常鼠(P<0.01),表明荷肝癌鼠的脾NK细胞活性功能受到抑制,经用A胶囊治疗后,大中剂量组脾NK细胞活性明显提高。中剂量组强于安替可组,但无统计学意义(P>0.05)。
3)小结
以上结果提示,A胶囊能明显提高荷肝癌小鼠机体的脾NK细胞活性,促进机体的细胞免疫功能。
5.对荷肝癌小鼠肿瘤坏死因子活性的影响
1)方法
在上述荷肝癌小鼠血清,用肿瘤坏死因子放免分析药盒,由4-计数仪检测其活性(7)。方法简述:按药盒说明书分别在NSB管及零标准管加温育液300ul、200ul、各标准管加标准TNF-a标准各200ul,样品管加200血清,各管再加100ul抗体,摇匀,4℃3小时,再加碘标125I-TNF-a100ul,摇匀,4℃17小时,再加沉淀剂PR500ul,摇匀,室温15分钟,离心,3500转/分,15分钟,弃上清液,测沉淀cpm,由r-计数仪设置浓度方式,直接换算成浓度(ug/L),结果进行组间t检验。
2)结果
表10A胶囊对荷肝癌小鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)的影响(X±S)
与正常鼠对照组比较,**P<0.01,与肝癌鼠模型组比较,△/P<0.05,△△/P<0.01,可替可组与相当剂量的A胶囊组比较,P>0.05。
由表10可以看了同,荷肝癌鼠组的血清肿瘤坏死因子(TNF)明显高于正常鼠(P<0.01),可能系负荷的肿瘤激活肿瘤坏死因子的产生,而正常鼠由于不存在肿瘤刺激因子,故维持在较低的水平。经A胶囊治疗后,各剂量组血清肿瘤坏死因子(TNF)活性明显提高。中剂量组有强于安替可组的趋势,但无统计学意义(P<0.05)。
3)小结
以上结果提示,A胶囊能明显提高荷肝癌小鼠机体肿瘤坏死因子(TNF)活性,促进机体的直接杀伤肿瘤细胞作用。
C、对小鼠醋酸扭体镇痛实验的影响
1)方法
取接种肝癌24小时后BALA/c小鼠,雌性,17-22g,分组见下表、级药剂量与方法均同前项实验,各组每日灌胃,连续7天,第8天给药45min后,各组小鼠均腹腔注0.6%醋酸0.2ml/只,观察10min内小鼠出现的扭体瓜(腹部内凹、伸屈后肢、臀部抬高)次数,比较组间差异,计算扭体反应抑制率,并进行组间t检验(1)。
2)结果
表11A胶囊对小鼠的镇痛作用(扭体法)(X±S)
与正常鼠对照组比较,**P<0.05,**:P<0.01与相当剂量的安替可组比较,P>0.05。
结果由表11所示,A胶囊能明显减少少小鼠的扭体次数,与蒸馏水对照组比较,差异有显著性意义;其镇痛作用不弱于相当剂量安替可。
3)小结
A胶囊对荷瘤动物具有一定的镇痛作用
实验分析及讨论
1.体内抗肿瘤
A胶囊为临床抗肿瘤经验方,功能主治化瘀解毒,软坚散结,主要用于抗肿瘤治疗,药理研究观察发现对小鼠肝癌H22、Lewis肺癌、大鼠肉瘤W256及艾氏腹水瘤均表现较好的药理活性;本品对小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌抑瘤作用明显强于对照药安替可。
2、体外抗肿瘤
通过观察对小鼠肝癌H22、肉瘤S180、大鼠肉瘤W256、小鼠Lewis肺癌及艾氏腹水瘤细胞体外抑瘤实验,本品5mg/ml,即有一定的体外杀瘤作用,在20mg/ml时,已非常明显,在80mg/ml时肿瘤细胞生长抑制率几乎达100%,几乎杀灭所有的体外培养肿瘤细胞,本品对肝癌H22、肉瘤S180及肉瘤W256的杀伤与相当浓度对照药比较,A胶囊作用明显强于安替可。
3.肿瘤免疫
观察了对荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能:1)鸡红细胞吞噬功能;2)荷瘤动物脾白细胞介素-II诱生活性水平;3)肿瘤坏死因子;4)NK细胞活性;5)脾淋巴细胞转化功能;结果表明对机体抗肿瘤免疫有较好的促进作用,其促进机体抗肿癌免疫功能作用有强于对照药安替可的趋势。
4.对荷肝癌动物有明显的镇痛作用。
综合以上结果,包括体内抑制肿瘤生长、体外直接杀伤肿瘤细胞、促进机体的肿瘤免疫,按中医理论出发,结果提示该药有较好的化瘀解毒、软坚散结作用,药理研究结果为临床用于肝癌等肿瘤治疗提供了较好的实验室依据。
此外,还对本发明药进行了动物长期毒性试验。
通过给大鼠连续灌胃给予抗癌A胶囊高剂量5.2g/kg、中剂量2.6g/kg及低剂量1.3g/kg(按公斤体重换算分别相当于临床用量的43.3倍、21.6倍及10.8倍)连续4个月,并行恢复性观察3周,结果给药盒期间高剂量组、部分中剂量组大鼠出现不同程度的兴奋、肌肉震颤或抽搐等症状;高剂量组有2例死亡,中剂量组有1例死亡,高、中剂量组血液学、血液生化学少数指标与对照组比较有显著差异,其他指标未见明显差异;低剂量组未见任何异常。恢复性观察期间高、中剂量组出现上述症状,检查指标亦未见异常。结果表明,抗癌A胶囊低剂量组1.3g/kg在给大鼠长期服用中未出现异常,是安全剂量,随着剂量的增大可表现出一定的毒性反应。结果提示:1、现推荐的人临床日用量0.12g/kg仅相当于大量安全剂量十分之一,提示该药长期应用是较为安全的。2、临床上应谨慎控制用药剂量,建议临床用药期间注意病人的神经系统反应情况及肝、肾功能。
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Claims (4)
1.一种抗癌中药,其特征在于,它是由以下重量份的原料药制成:大黄110-130份,土鳖虫110-130份,炮山甲130-150份,制马钱子55-75份,三七55-75份,炮附片110-130份,熊胆粉55-75份,雄黄粉8-12份,甘草90-110份。
2.权利要求1所述的抗癌中药的配制方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取1/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七粉碎成细粉备用;
(2)土鳖虫加5-7倍质量的75%乙醇,70℃~90℃回流提取2.5-3.5小时,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度12-1.4的稠膏备用;
(3)炮山甲粉碎后布包,浸泡0.5-0.8小时过滤后,与炮附片、甘草,剩余的5/6原料药重量份的大黄、制马钱子、三七,以及步骤(2)制备土鳖虫稠膏后的药渣加水煎煮二次,合并滤液,滤过,滤液减压浓缩成稠膏,再加入步骤(2)制得的土鳖虫稠膏,真空干燥粉碎成细粉,再加入熊胆粉、雄黄粉以及步骤(1)得到的大黄、制马钱子、三七细粉,混匀即可。
3.根据权利要求2所述的抗癌中药的配制方法,其特征在于,步骤(1)所述的细粉均为80-120目。
4.根据权利要求2所述的抗癌中药的配制方法,其特征在于,步骤(3)中所述的加水煎煮过程中,第一次煎煮加入8倍固体质量的水,煎煮2小时;第二次煎煮加入6倍固体质量的水,煎煮1.5小时。
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