CN101613690A - 一种脂肪酶的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂肪酶的固定化方法，是将脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液与粘合剂互混，得到粘合剂与脂肪酶的互混浆状物，将上述互混浆状物在基布上涂层，干燥后得到固定化脂肪酶。本发明具有基布的选择范围更大、固定化脂肪酶的负载量大、催化反应的寿命长、方法简单、条件要求温和及易于实现等优点。

Description

一种脂肪酶的固定化方法

技术领域

本发明涉及脂肪酶的固定化方法，具体涉及一种将脂肪酶采用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的固定化脂肪酶的方法。

背景技术

随着脂肪酶研究的深入和脂肪酶工程的发展，脂肪酶的应用越来越广泛。将脂肪酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的脂肪酶，叫固定化脂肪酶。固定化脂肪酶既保持了脂肪酶的催化特性，又克服了游离脂肪酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。

固定化脂肪酶使工业用脂肪酶的稳定性提高并延长了脂肪酶的使用寿命，因此脂肪酶的固定化受到了较为广泛的关注。脂肪酶通常是被固定于不溶性的固体载体上，这有利于提高脂肪酶的热稳定性、使用稳定性、结构稳定性，从而降低其使用成本。另一方面，固定化载体也是影响固定化脂肪酶性能的一个重要的因素。生物相容性不好的载体会引起脂肪酶的变性和活力的下降，具有良好生物相容性的载体能够为脂肪酶创造适宜的微环境，减少非生物特异性的“脂肪酶-载体”相互作用，有效降低无机物及杂质的吸附。因此，选取合适的载体和恰当的固定化方法显得尤为重要。

选用不同的材料为载体、特别是在固体粉体材料上固定化脂肪酶已有大量的报道，但载体成本高又无法回收成为一个重要的制约。以膜状物为载体有一定的报道，但这些膜，如静电纺丝膜、中空纤维膜等，虽然功能性较强，但也普遍存在成本偏高，尚不能规模化生产等限制。近年来，随着纳米技术的进一步发展，也设计开发了不少微观结构规整的纳米多孔材料，研究得较多的如：二氧化硅、碳酸钙、碳纳米管、氧化铝等。但这类无机材料本身生物相容性较差，固定化的过程易引起蛋白构象的改变，在对其的修饰改性中又容易带入新的影响脂肪酶构象的因素，而脂肪酶这类生物大分子的活性往往是基于其特定的三维结构，因此这类多孔纳米材料也还有待进一步改善。

在固定化方法上，常见的吸附法操作简单但作用力不强，负载量有限并且吸附不牢固；共价法作用力强，但会导致脂肪酶部分位点的失活，造成脂肪酶活的降低；交联涉及多步化学反应使得成本高昂。

虽然现有的固定化脂肪酶的方法很多，但由于均存在一定的缺点，有的载体成本偏高，有的脂肪酶的负载量有限，有的脂肪酶与载体结合不牢固，有的方法复杂等等，因此很难找到一种理想的固定化脂肪酶的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶的固定化方法，该方法具有基布的选择范围更大、固定化脂肪酶的负载量大及催化反应寿命长等优点。

本发明的脂肪酶的固定化方法的基本构思是使用一种纺织物或者无纺布等薄膜状材料为基布载体，通过涂层胶与脂肪酶的互混，形成可涂层的浆状物，于基布上实现脂肪酶的固定化。

实现上述发明目的的技术方案如下：

一种脂肪酶的固定化方法，包括如下步骤：

a、将脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液与粘合剂互混，得到粘合剂与脂肪酶的互混浆状物；

b、将步骤a得到的互混浆状物在基布上涂层；

c、将步骤b所述涂层干燥后即得。

其中步骤a所述脂肪酶可为提纯干燥后的脂肪酶粉、胞外产脂肪酶或细胞破壁后的发酵液。

步骤a所述粘合剂可为具有粘合功能的水溶性市售商品或自制剂方，粘合剂与脂肪酶能够实现良好的互混并且不会对脂肪酶的生物活性造成损害，如聚氨酯类、聚丙烯酸酯类或有机硅类粘合剂等等。

步骤b所述基布为纺织物、无纺布或其它的薄膜材料，所述纺织物包括棉布或丝绸等，所述无纺布包括丙纶、氨纶、聚酯纤维、晴纶、涤纶或尼龙等。

其中，步骤a中脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液与粘合剂的体积比为0.1∶1-20∶1。以脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液的体积V计，粘合剂的用量为dV(d＝0.1-20)，缓慢搅动将二者均匀混合，即得到粘合剂与脂肪酶的互混浆状物。

其中，步骤a中的脂肪酶是脂肪酶粉时，加适量水进行溶解稀释后可形成脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液。具体为：将脂肪酶粉均匀分散溶于1-10倍重量的水中形成脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液，然后再与粘合剂按体积比为0.1∶1-20∶1互混。

其中，步骤c具体为：将步骤b所述涂层晾干或冷冻干燥后即得。

其中，步骤c中的涂层晾干后可在60-150℃短时间烘焙1-15分钟。

本发明以廉价的纺织物或者无纺布等薄膜状材料为基布载体，直接将涂层粘合剂与脂肪酶混合后均匀涂布在基布上将脂肪酶固定。本发明中所用的脂肪酶的固定化方法有如下优点：

1、基布的选择范围更大：对于基布的选择可以根据应用的需要和反应器的具体情况，选择不同厚度、不同硬度等；

2、固定化脂肪酶的负载量大：可负载的脂肪酶量远大于吸附或共价法的负载量；

3、催化反应的寿命长：涂层胶通常为单组分或多组分的聚合物单体，固化的过程可聚合形成网状结构，更牢固地将脂肪酶分子附着在基布载体上，同时涂层后的载体表面具备一定的疏水性质，有利于脂肪酶在微水相合成体系中高活性和稳定性的保持；

4、处理方法简单，条件要求温和，易于实现；

5、固定化脂肪酶形态多：固定化脂肪酶可以膜状、碎片状、筒状、条状等形态出现，适应于更广泛形式的反应器，减少压降和扩散阻力。

附图说明

图1为本发明涂层法固定化脂肪酶与直接吸附法固定化脂肪酶在无溶剂体系时酯化活性及稳定性对比图。图中(□)表示直接吸附，(○)表示脂肪酶粉经聚氨酯涂层胶固定于无纺布。

图2为本发明涂层法固定化脂肪酶与直接吸附法固定化脂肪酶在有溶剂体系时酯化活性及稳定性对比图。图中(□)表示直接吸附，(○)表示脂肪酶粉经聚氨酯涂层胶固定于无纺布。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明的脂肪酶的固定化方法及其带来的技术效果。本发明中所使用的原料或组分如无特别说明均可以通过商业途径购得或采用本领域常规方法制得。

实施例1聚氨酯粘合剂与脂肪酶溶液共混涂层固定化脂肪酶

本实施例所用的聚氨酯粘合剂为单组分，牌号为R120，上海蓝欧材料有限公司。步骤如下：

1)取0.25g脂肪酶粗酶粉，将其均匀分散溶解于1mL水中，搅拌至均相。再向脂肪酶混合水溶液中加入1mL聚氨酯粘合剂R120，充分搅拌形成浆状物；

2)用排笔蘸取混合液，并将全部的混合浆状物均匀的涂刷于10cm²丝绸基布的上下两个表面；

3)固定基布的一个角，置于阴凉通风处，室温下晾干即可。

实施例2聚氨酯粘合剂与发酵液上清液共混涂层固定化脂肪酶

本实施例所用聚氨酯粘合剂为多组分，牌号为R113，上海蓝欧材料有限公司。步骤如下：

1)将发酵液3000rpm离心，取上清液1mL。依R113粘合剂与固化剂的使用比例(R113占体积的75％，固化剂为体积的15％)，调兑好多组分粘合剂并搅拌均匀，向脂肪酶发酵液上清液中加入1mL调兑好的多组分粘合剂，充分搅拌形成浆状物；

2)用排笔蘸取混合液，并将全部的混合浆状物均匀的涂刷于10cm²聚酯无纺布基布的上下两个表面；

3)固定基布的一个角，置于阴凉通风处，晾置3-4h，70℃烘焙1分钟，即可。

实施例3有机硅粘合剂与脂肪酶溶液共混涂层固定化脂肪酶

本实施例所用有机硅粘合剂，牌号为CF-508E，北京度辰新材料有限公司。步骤如下：

1)取0.25g脂肪酶粗酶粉，将其均匀分散溶解于1mL水中，搅拌至均相。再向脂肪酶混合水溶液中加入1mL有机硅粘合剂CF-508E，充分搅拌形成浆状物；

2)用排笔蘸取混合液，并将全部的混合浆状物均匀的涂刷于10cm²丙纶无纺布基布的上下两个表面；

3)固定基布的一个角，置于阴凉通风处，室温下晾干即可。

比较例1本发明涂层法固定化脂肪酶与直接吸附法固定化脂肪酶在无溶剂体系时酯化活性及稳定性比较

具体方法如下：

1)按照实施例2操作实现脂肪酶借助涂层胶在基布(聚酯纤维无纺布)的固定化；

2)取和实施例2中同样的一块基布，取0.25g脂肪酶粗酶粉，将其均匀分散溶解于2mL水中，搅拌至均相。将基布浸渍在脂肪酶溶液中，在10℃固定化3h，固定基布的一个角，置于阴凉通风处，晾置3-4h，70℃烘焙1分钟，制得直接吸附法固定化脂肪酶；

3)无溶剂体系油酸-乙醇酯化合成油酸乙酯：2.82g油酸(10mM)，反应时间24小时，分8次流加乙醇583μ1(10mM)，每相邻两次间隔不小于2小时，反应结束后将固定化脂肪酶投入新鲜的底物溶液中继续下一批反应；

4)每次反应残余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量，确定转化率。

实验结果如图1。从图1可见本发明的涂层法固定化脂肪酶对于脂肪酶活的保持和使用寿命较直接吸附法都有明显的改善。

比较例2本发明涂层法固定化脂肪酶与直接吸附法固定化脂肪酶在有溶剂体系时酯化活性及稳定性比较

1)按照实施例1操作实现脂肪酶借助涂层胶在基布(丝绸布)的固定化。

2)取和实施例1中同样的一块基布，取0.25g脂肪酶粗酶粉，将其均匀分散溶解于2mL水中，搅拌至均相，将基布浸渍在脂肪酶溶液中，在10℃固定化3h，固定基布的一个角，置于阴凉通风处，室温下晾干即可制备直接吸附法固定化脂肪酶。

3)有溶剂体系大豆油转酯化合成生物柴油(脂肪酸甲酯)：1g豆油，200μl水，3ml正己烷，分3次每8h流加甲醇46μl，反应时间24小时。反应结束后将固定化脂肪酶投入新鲜的底物溶液中继续下一批反应。

4)每次反应后取样1μl反应液用高效气相色谱测定的脂肪酸甲酯含量，确定转化率。

实验结果如图2。从图2可见本发明的涂层法固定化脂肪酶对于脂肪酶活的保持和使用寿命较直接吸附法都有明显的改善。

以上实施例只是用于进一步说明本发明，而不是用来限制本发明的保护范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式及应用范围上的些许变动，也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1、一种脂肪酶的固定化方法，其特征在于包括如下步骤：

a、将脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液与粘合剂互混，得到粘合剂与脂肪酶的互混浆状物；

b、将步骤a得到的互混浆状物在基布上涂层；

c、将步骤b所述涂层干燥后即得。

2、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤a所述脂肪酶包括提纯干燥后的脂肪酶粉、胞外产脂肪酶或细胞破壁后的发酵液。

3、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤a所述粘合剂包括聚氨酯类、聚丙烯酸酯类或有机硅类粘合剂。

4、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤b所述基布为纺织物或无纺布。

5、根据权利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述纺织物包括棉布或丝绸。

6、根据权利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述无纺布包括丙纶、氨纶、聚酯纤维、晴纶、涤纶或尼龙。

7、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤a所述脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液与粘合剂具体按体积比为0.1∶1-20∶1互混。

8、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤a具体为：将脂肪酶粉均匀分散溶于1-10倍重量的水中形成脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液，然后再与粘合剂按体积比为0.1∶1-20∶1互混。

9、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤c具体为：将步骤b所述涂层晾干或冷冻干燥后即得。

10、根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤c具体为：将步骤b所述涂层晾干，晾干后在60-150℃短时间烘焙1-15分钟。

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