CN101600799B - 使用食肉植物产生重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提供一种产生至少一种蛋白质的方法，包括栽培食肉植物，其特征在于所述植物经过遗传修饰以表达所述一种或多种蛋白质，并且从所述食肉植物诱捕器的消化分泌物收集所述一种或多种蛋白质，尤其是从胶粘诱捕器、瓶状体诱捕器、喇叭状诱捕器或囊状物诱捕器的消化分泌物收集所述一种或多种蛋白质。尽管存在消化酶，目的蛋白是功能性的。
Description
本发明涉及产生至少一种蛋白质的方法，包括栽培食肉或食虫的植物，其特征在于所述植物经过遗传修饰以表达所述一种或多种蛋白质。
今天，蛋白质代表一类广泛用于治疗或诊断领域并且用作实验室试剂的分子。因此，对于改进现有的重组蛋白产生方法或开发新的更有效的产生系统做出了许多努力。
用于产生重组蛋白的常规系统包括能够进行遗传修饰的不同类型的活体：微生物(细菌、酵母、真菌)，培养的哺乳动物细胞，培养的昆虫细胞，转基因动物或转基因植物。
转基因植物系统展现出优势。具体而言，它们提供更好的生物安全性，因为没有已知的致病剂能够同时感染植物和动物。此外，通过栽培这些转基因植物可以进行大规模生产。与其它工业生产系统相比也可以更廉价。使用转基因植物还允许即将产生的蛋白质经历一种或多种翻译后的成熟过程。最后，使用目前的植物生物技术，可以特异性地定向将在其中积累感兴趣蛋白质的组织，例如叶或种子，这些组织是易于获得的。
重组蛋白的表达通常定向于叶或种子。叶为合成提供多种可能性(1)。因此，例如，将经遗传修饰的烟草用于产生人血红蛋白。然而，有时叶含有难以去除的不想要的物质(烟草叶中存在的多酚)。此外，重组蛋白必需迅速地从这些叶中提取，因为它们快速地变质。
有时也使用种子作为贮藏组织，因为蛋白质在其中积累的环境具有低含水量，稳定性更好。因此，例如，将经遗传修饰的玉米用于产生胃脂肪酶。种子具有的局限性主要是由于合成能力较低，以及必需等到开花，从而增加了因交叉授粉而扩散转基因的风险。
在这两种情况下，这些在转基因植物的叶或种子中产生重组蛋白的系统的主要缺点与这样一个事实有关，即无论叶或种子，都需要要求苛刻的提取/纯化阶段从植物组织分离重组蛋白。事实上，将重组蛋白插入植物组织基质，这使得提取和纯化变得困难，同时这个步骤必需尽快进行，原因是在均化之后的迅速蛋白质水解(2)。因此这最后一步限制了现有系统使用转基因植物产生重组蛋白的优势。所以对于保留了目前使用转基因植物的产生系统的优势而尽可能减少了它们的缺陷(尤其是通过大大简化重组蛋白的提取/纯化)的系统存在实际需求。
食肉植物是能够捕捉猎物并且同化猎物的全部或部分来获得它们的一部分氮需求的植物。除了它们从空气中固定二氧化碳用于它们的光合作用以及经由它们的根吸收水和无机盐的能力之外，这些通常生活在缺乏营养的环境中的植物在它们的叶上发育出不同类型的诱捕器(trap)，以多种方式发挥功能来捕捉为它们提供额外的氮的猎物。尽管它们的形式和发挥功能的方式不同，食肉植物的诱捕器具有共同的特性，即产生含有消化酶的液体，所述消化酶或多或少允许了对猎物的有效消化和同化。
在食肉植物中存在表达并转运消化酶至诱捕器中的系统，在所述诱捕器中这些存在于多少有些粘稠的液体中的酶可直接获得且易于纯化。此外，从诱捕器中收集消化液可以在不破坏植物的条件下进行，因此植物能够继续生产。在特定的属中，并且采取特定的措施，即使植物栽培在非无菌环境中，消化液的收集可以在无菌条件下进行。最后，诱捕器中消化液的分泌可以由因捕获昆虫的存在而产生的化学刺激甚或机械刺激来诱导。化学刺激可以通过应用含有有机氮、磷酸盐、氯化钠、明胶、水杨酸或壳多糖的溶液来代替(3；4)，由此潜在地简单增加纯化蛋白自消化液的产生。
因此多篇文献描述了食肉植物蛋白的纯化。申请EPO019808(5)描述在癌症的治疗中使用食肉植物的消化液。按照相同的方式，申请WO9942115(6)描述使用食肉植物的消化液来抑制特定疾病中涉及的激酶蛋白。专利申请WO02057408(7)描述使用猪笼草属(Nepenthes genus)食肉植物叶汁中以天然状态存在的壳多糖酶蛋白用于药物用途(抗真菌)或农业用途(抗隐花植物病)。然而，在这些文献的每一篇中，产生和纯化的蛋白质均为食肉植物的天然内源蛋白。因为所述食肉植物未经遗传修饰，所以不产生重组蛋白。这些专利均未述及从食肉植物产生除那些天然条件下已经存在于这些植物中的蛋白质之外的蛋白质。
另外，Hirsikorpi等的文章描述通过具有萤光素酶的载体农杆菌属(Agrobacterium)转化圆叶茅膏菜(Drosera rotundifolia)(8)。然而，绝无任何结果显示萤光素酶蛋白存在于所述植物叶表存在的汁液中。
事实上，仅特定的蛋白质被转运至食肉植物的消化液中。食肉植物分泌蛋白质的过程是许多解剖学内容的主题(9)。尽管没有正式的证据，但是似乎应该说叶分泌物的产生是由于从内质网(ER)产生的高尔基体小泡的增加，在其它植物中已是如此(10)。然而，蛋白质存在于ER内不能保证其将会由植物分泌。
概括而言，最近的公开文献不时地描述了有关蛋白质位置的意料之外的结果。因此无法确保一种不具任何定位信号(addressing signal)或者甚至具有定向于ER的定位信号的蛋白质将以足以检出的量分泌至食肉植物诱捕器的消化分泌物中。基于这个原因，时至今日只纯化过已经天然存在于食肉植物诱捕器的消化分泌物中的蛋白质。没有文献描述或建议过生成将重组蛋白分泌至其诱捕器中的经遗传修饰的食肉植物的可能性。
此外，分泌至食肉植物诱捕器中的消化液含有消化酶，例如蛋白酶、过氧化物酶、核糖核酸酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶、酸性磷酸酶、壳多糖酶和糖基化酶。这种分泌消化酶尤其是蛋白酶的天然能力据推测对通过分泌至诱捕器中来产生重组蛋白形成了阻碍，原因是因这些蛋白酶的存在而诱导的降解风险。
然而，发明人惊讶地发现可以生成表达外源重组蛋白的经遗传修饰的食肉植物，大量的外源重组蛋白可以在诱捕器的消化分泌物中检出。此外，发明人对几种截然不同的重组蛋白进行的测试已经证明，可以分离功能性蛋白质，因此所述蛋白质不因消化酶而显著降解。发明人已经证明，与预期相反，通过遗传修饰食肉植物使其表达重组外源蛋白，尽管存在消化酶，也有可能在植物的消化分泌物中检出足量的这种重组蛋白并且有可能以功能形纯化出这种蛋白。现在已经克服了关于重组蛋白向诱捕器中的转运和被消化酶分解的问题，这种产生系统表现出多种与从诱捕器的消化分泌物收集重组蛋白有关的优势：
-植物不因收集而受到破坏或显著损害，并且因此能够持续不断生长用于其它的后续收集；
-诱捕器天然是容易获得的器官，允许消化分泌物的简单收集；
-在一些食肉植物中，尤其是在那些具有瓶状体(pitcher)或囊状物(bladder)形式诱捕器的食肉植物中，特定量的消化分泌物产生并分泌至接近外部环境的诱捕器中；仅在诱捕器准备好消化猎物时，它才对外部环境开启。即使所述植物生长在非无菌环境中，在诱捕器准备的过程中，消化液在天然的无菌条件下分泌。在诱捕器开启之前进行消化液的收集并且采取一些措施，重组蛋白的收集在特定的产生方法中能够在无菌条件下进行。
-有待纯化的重组蛋白存在于植物之外的液体介质中，而非存在于固体植物组织(例如叶或种子)中，这个事实使纯化重组蛋白的阶段大大简化；
-最后，这个系统可以受到诱导，因为消化液的分泌能够通过模拟猎物存在的机械和/或化学信号来增加。
本发明涉及产生至少一种蛋白质的方法，包括栽培(cultivation)食肉植物，其特征在于所述植物经过遗传修饰以表达所述一种或多种蛋白质。
在优选的实施方案中，所述方法进一步的特征在于所述一种或多种蛋白质收集自所述食肉植物诱捕器的消化分泌物。
术语“食肉植物”的意思是任何能够捕获和消化动物猎物的植物，任何类型的来自动物界的猎物均包括在此定义中，所述植物使用表达消化酶并将消化酶转运至诱捕器中的系统。动物猎物通常是昆虫(则将所述植物更精确地称作食虫植物)，但是特定食肉植物的诱捕器也能够捕捉小型啮齿动物或无尾两栖类(batrachian)，或者甚至小型水生动物(在水生食肉植物的情况下)。因此本文使用的术语“食肉植物”包括所有类型的食肉植物，其具有表达消化酶并将消化酶转运至诱捕器中的系统，并且具体为(但不限于)食虫植物。另一方面，仅将具有表达消化酶并将消化酶分泌至诱捕器中的食肉植物包括在本发明的含意中。具体而言，通过分泌消化酶的植物外部微生物的存在来补偿消化酶分泌的缺乏的特定植物属，尽管通常也被考虑在食肉植物之列，但是不认为是本发明含意中的食肉植物。因此，布洛凤梨属(Brochinia)、贝尔特罗嘉宝凤梨(Catopsis berteroniana)、黄花单角胡麻(Ibicella lutea)、太阳瓶子草属(Heliamphora)和眼镜蛇草属(Darlingtonia)不认为是本发明含意中的食肉植物。
如先前所述，对食肉植物感兴趣的原因是分泌至诱捕器消化液中的蛋白质的存在。所述蛋白质可以直接获得，易于纯化，因为它们不嵌入植物组织，并且至少在特定情况和特定时间由植物以无菌形式贮存。
为了受益于这些优势，由植物表达的重组蛋白必须也分泌至植物诱捕器中。因此，在本发明的方法中，所述一种或多种蛋白质在植物细胞中便利地表达并且通过分泌所述植物的天然蛋白的天然系统分泌。
因此，由经遗传修饰的食肉植物表达的重组蛋白或蛋白质能够简单地从所述植物诱捕器的消化分泌物中收集。
术语“经遗传修饰的植物”意指已经将基因或基因片段插入其中的植物。因此这包括已经使用感兴趣的基因或基因片段的表达载体转化的植物，使得这种基因或基因片段能够在这种植物中表达。完全或部分插入所述植物的感兴趣的基因可以是不由所述植物天然表达的外源基因(exogenic gene)，或是已经由所述植物天然表达但是希望增加其表达的内源基因。
具体而言，在本发明的方法的优势实施方案中，已经通过农杆菌、生物弹射(biolistics)、电穿孔或显微注射转化或通过病毒载体的使用对栽培的食肉植物进行了遗传修饰。
使用农杆菌的植物转化是本领域技术人员熟知的技术。简而言之，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，一种植物中的病原微生物，自20世纪初期已经为人所知。根癌农杆菌具有出众的天然能力，将特定DNA区段(T-DNA)从它的根瘤诱导质粒(Ti)转移至受感染植物细胞的胞核，然后在所述胞核中以稳定形式整合入宿主基因组并转录，引起冠瘿病。T-DNA片段的侧翼为25个碱基对(bp)的直接重复，为转移机构(transfer apparatus)发挥顺式调节元件信号的作用。已经证明了事实上置于这些T-DNA边界之间的所有外源DNA均能转移至植物细胞。因此能够生成这样的农杆菌菌株，其中将引起疾病的基因用按照特定方式选择的DNA替代，由此允许这种特异性选择的DNA以稳定的方式整合入植物的基因组。
植物的生物弹射转化，也称为粒子轰击，是用于将DNA直接释放至宿主基因组中的技术，正如在本领域工作的人员所熟知的。
概括而言，是将含有关注的一个或多个基因的质粒或线性DNA固定于钨粒或金粒(微型珠(microbead))，将所述钨粒或金粒以高速释放至宿主细胞中从而刺入(penetrate)植物胞核。在胞核中，所述DNA能够从载体微型珠上分离，并使自身并入宿主的基因组中。粒子轰击或生物弹射可以用于转化大多数植物种类的组织。
原生质体电穿孔技术是在本领域工作的人员熟知的，其使用电脉冲，也能够用于转化植物。简而言之，所述技术由向原生质体和DNA的混合物施加一系列短暂的高压电击组成。电场通过极化形成质膜的磷脂来引起质膜的去稳定化，并由此诱导DNA分子能够通过的孔的形成。如果电击不是非常强烈，那么所述现象是可逆的，而膜将回复至其初始状态，完全保持原生质体的存活。
显微注射技术由在显微镜下使用微量加液器或微量注射器直接注入所选择的DNA至原生质体的胞核中组成。
病毒载体也可用于转化。这种在本领域工作的人员熟知的技术由使用具有双链DNA的植物病毒组成，在所述植物的基因组中已经将致病基因失活并且插入了感兴趣的基因。因此通过使用所述经修饰的病毒来转化植物。
已经使用根癌农杆菌、通过生物弹射和通过电穿孔这些正在使用的最常规技术进行了植物的转化。
认为术语“蛋白质”意指任何类型的含有氨基酸骨架的聚合物。因此这个术语不仅包括完整蛋白质，还包括对应于完整蛋白质的亚单位或片段的肽或多肽，以及任何感兴趣的肽或多肽，即使其不对应于已知蛋白质的片段，也无论其是否是这种片段的变体(相对于参照片段具有突变)或是创造的肽或多肽。具体而言，在本发明的含意中，蛋白质可以包括在自然状态下不存在的经修饰的氨基酸。类似地，肽键可以是经过修饰的。此外，本发明的含意中的术语蛋白质还包括兼性存在的通过糖基化、磷酸化或甲基化进行的翻译后修饰。
此外，所述通过本发明的方法产生的蛋白质可以与人类活动的任何领域有关。具体地，所述蛋白可以选自用于兽医学或人类使用的药用产品、美容剂(cosmetic agent)、植物药理剂、诊断剂、营养剂或实验室试剂。
术语“药用”蛋白意指任何符合销售许可(subject to marketingauthorisation)用于治疗人类或兽医学疾病的蛋白质。这种药用蛋白包括特定的蛋白质激素(性激素、生长激素等)、酶、抗体(具体而言单克隆抗体)等。
术语“美容剂”蛋白意指任何使人体外部能够得到清洁、保持良好状态或得到修饰(embellished)的蛋白质，尤其是对皮肤或毛发。美容剂蛋白的实例包括皮肤护理中使用的胶原、肉毒杆菌毒素和蛇毒蛋白。
术语“植物药理剂”蛋白意指：任何保护植物或植物产品免于任何有害生物或避免有害生物的作用的蛋白质，特别包括杀虫剂；任何作用于植物的生命过程的蛋白质，例如通过增加或减少它们的生长来作用；或任何保护(preserve)植物产品的蛋白质。
术语“诊断剂”蛋白意指任何体外或体内检测中涉及的蛋白质，所述检测测定受试者中特定疾病或症状的存在与否。这类诊断剂蛋白具体包括：
-抗蛋白质的抗体，样品中它的发生指示疾病的存在，例如，抗致病微生物抗原或肿瘤抗原的抗体，由此允许微生物或癌症得到检测；
-在疾病事件中特异性表达的蛋白质，例如，致病微生物的蛋白质，由此允许在受试者中检测抗这些蛋白质的抗体的存在，并因此诊断疾病。
术语“实验室试剂”蛋白意指任何用于医学实验室分析或研究的蛋白质，例如，具体而言，抗体、酶、抗原、激素、细胞因子、趋化因子、细胞受体等。
术语“营养蛋白”意指任何因其声称的健康益处而用于保持消费者健康状态的蛋白质，例如具体而言作用于细胞再生或增殖的蛋白质，作用于中枢神经系统、心血管系统、变态反应和代谢疾病(肥胖症、糖尿病)的预防的蛋白质。
本发明的方法中使用的食肉植物的栽培以常规方式进行，并将选择的食肉植物类型的特殊性质考虑在内。不同类型食肉植物的栽培方法是在本领域工作的人员所熟知的。概括而言，许多食肉植物在非常富含有机物质的土壤(例如泥炭沼泽)中生长，或者甚至如生长在宿主树上的藤本植物(对于猪笼草属正是这种情况)。一些是水生的，如狸藻(utricularias)。食肉植物栽培的常规方案在Juniper等的书(11)中描述，则本领域技术人员能够轻易地调整所述方法以适应每种特定的植物。
先前提到的与使用食肉植物的天然系统来分泌蛋白质有关的优势之一是所述系统能够通过模拟猎物存在的机械和/或化学信号来诱导。因此，在本发明的方法的优势实施方案中，对所述植物施以化学和任选地机械刺激，模拟猎物的捕获，并且诱导通过所述植物产生蛋白质并将它们分泌至诱捕器中的系统的活化。这种化学刺激可以特别地包括含有有机氮、磷酸盐、氯化钠、明胶、水杨酸或壳多糖的溶液的应用(1，2)。然而，所述植物也可以在缺乏任何化学和/或机械刺激的条件下培养，所述化学和/或机械刺激模拟猎物的捕获并且诱导通过所述植物产生蛋白质并将它们分泌至诱捕器中的系统的活化。
如先前所述，与在诱捕器的消化分泌物中感兴趣的重组蛋白分泌有关的潜在问题之一涉及这些分泌物中消化酶的存在，尤其是蛋白酶。除了发明人已经证明了这些消化酶的存在实际上不妨碍纯化功能性蛋白质这个事实，为了进一步降低与这些酶相关的风险，也可以在本发明的方法中包括抑制由所述食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成，并且具体而言一种或多种蛋白酶的合成。因此，根据本发明的方法的一种实施方案，所述方法进一步包括抑制由所述食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成。有利地，所述合成受到抑制的消化酶中的至少一种是蛋白酶。事实上，这些是最有可能损害诱捕器中分泌的重组蛋白的酶。然而，也可以以其它能够降解重组蛋白的蛋白质为目标。例如，在糖基化蛋白的情况下，可以单独或与蛋白酶同时将一种或多种糖基化酶作为目标。其它可能损害其它类型翻译后修饰的酶也可以作为目标。
这种抑制可以是部分的或完全的，并且可以以多种方式诱导。
首先，可以使用产生这种修饰的遗传技术来诱导。
具体而言，可以直接靶向希望抑制其表达的基因，特别是通过从基因组缺失所述消化酶的一种或多种基因，或通过关闭这些基因的转录，即一种称作“基因沉默”的方法。
从植物的基因组缺失所靶向的一种或多种消化酶的一种或多种基因也称作“敲除”或“KO”，使用现在在本领域工作的人员熟知的技术来进行。
通过沉默关闭所靶向的一种或多种消化酶的一种或多种基因的转录包括一系列针对植物详细描述的技术。
因此，病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)需要将靶向植物基因的短序列克隆入植物病毒中。在含有所述基因片段的病毒感染之后的几周期间，植物的天然防御机制特异性地分解与所靶向的植物内源基因相应的mRNA。使用这种技术并且从正常植物开始，使用以病毒系统性污染植物的原理，不用转化体的体外再生，靶向的基因在病毒感染3-4周之内迅速沉默(12)。
共缺失(co-deletion)也可以特异性地关闭靶向基因的表达。这种关闭通过向植物中再插入在组成型或诱导型或组织特异性启动子调控下的靶基因来实现。基因转移可以使用任何遗传转化技术(农杆菌感染、病毒载体、显微注射、生物弹射等)。在一些经遗传转化的植物中，能够看到由靶基因编码的特征或功能的消失(13)。基因的转录后失活也可以通过任何植物遗传转化技术(农杆菌感染、病毒载体、显微注射、生物弹射等)，使用干扰RNA(RNAi(14))原理，通过向靶植物插入有待关闭其转录的基因的片段来实现。
对靶向的一种或多种消化酶的一种或多种基因的遗传抑制也可以通过在食肉植物中异位表达至少一个蛋白酶抑制剂基因(protease inhibitor gene)来间接地进行，即异位表达至少一个其表达导致至少一种蛋白酶的表达部分或完全降低的基因。因此，在一种具体的实施方案中，使用的食肉植物也经转化以表达至少一个蛋白酶抑制剂基因，所述转化通过任何在本领域工作的人员已知的技术进行，并且尤其是通过先前描述的任何技术。可以使用任何类型的蛋白酶抑制剂基因。大多数蛋白酶在酸性pH具有最佳酶活性。例如，猪笼草属植物中已知的两种蛋白酶(一种内肽酶和nepenthesin)是在酸性pH具有最佳活性的酶(15)。出于这种原因，使用已知抑制酸性蛋白酶表达的基因可能是有用的。具体而言，已知编码糖胃蛋白酶(saccharopepsin)抑制剂的酵母基因IPA3YEAST(Swissprot登录号PO 1094)编码酸性蛋白酶的抑制剂，所述酸性蛋白酶与猪笼草属植物中的蛋白酶相近。因此，在对至少一种蛋白酶的表达进行抑制的本发明方法的一种具体实施方案中，抑制由所述食肉植物进行的一种或多种蛋白酶的合成通过选自以下的遗传技术来进行：从植物的基因组缺失至少一个蛋白酶基因，通过沉默关闭至少一个蛋白酶基因的转录，和/或异位表达至少一个蛋白酶抑制剂基因。
或者，抑制由食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成可以使用非遗传技术诱导。具体而言，所述抑制也可以通过向诱捕器中的消化液直接添加抑制所靶向的一种或多种消化酶的溶液来诱导，或者甚至通过调控消化液的pH和/或温度条件从而限制靶向的一种或多种消化酶的活性来诱导。事实上，大多数酶的抑制剂是本领域已知的，并且大多数酶具有的最佳pH和/或温度条件在它们的活性受到限制的条件之外。因此可以通过将消化液置于存在抑制剂的条件下和/或置于其酶活性的最佳条件范围之外来限制靶酶的活性。
事实上，因为诱捕器容易接近，可以通过向具有瓶状体诱捕器的植物(例如猪笼草属)或具有囊状物诱捕器的植物(例如狸藻属(Utricularia))的瓶状体或囊状物中注射所述溶液，或者通过将溶液喷雾至具有胶粘诱捕器(glue trap)的胶上(例如茅膏菜属(Drosera)中的植物)，来向诱捕器中的消化液添加含有靶向的一种或多种消化酶的抑制剂的溶液。
更具体地关于蛋白酶，可以使用不同类型的蛋白酶抑制剂。具体而言，已经证明了猪笼草属蛋白酶的活性受到动物和真菌中存在的酸性蛋白酶抑制剂DDE(二氯二苯二氯乙烯(dichlorodiphenyldichloroethylene)，(16))的抑制。两种另外的酸性蛋白酶抑制剂，分离自砖红色链霉菌(Streptomycintestaceus)和其它放线菌类的DAN(重氮基乙酰-DL-正亮氨酸甲酯)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(3S，4S-4-氨基-3-羟基-6-甲基-庚酸)，与天冬氨酸蛋白酶形成复合物，完全抑制猪笼草属瓶状体(也称为囊(ascidia))的消化活性(15，17)。
其它蛋白酶抑制剂和甚至是几种靶向不同蛋白质的蛋白酶抑制剂的混合物是可以通过商业途径获得的。这些混合物抑制多种不同的蛋白酶(例如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，还有胃蛋白酶抑制剂)并且为保存我们感兴趣的蛋白提供更好的保护。
因此这些抑制剂中的一种或多种能够以注射入诱捕器中或喷雾至诱捕器上的溶液的形式添加。
也有可能通过调控消化液的温度和/或pH来限制诱捕器蛋白酶的活性。事实上，已经具体证明了从猪笼草属瓶状体的消化液提取的蛋白酶的消化活性随着温度增加，在约50℃/60℃达到最佳值(15)。因此可以通过将植物从瓶状体进行发育的时间开始保持在较低温度来限制它们的活性。有利地，为了限制蛋白酶活性，温度应该在5-25℃，在5-20℃更好，在5-15℃还更好，并且优选5-10℃。
此外，已经证明了食肉植物消化液的蛋白酶活性在低pH下最佳(15)，因为酸化所述液体使消化活性增加。消化似乎主要归因于囊幼嫩且pH低时腺体分泌的酶。然而，伴随着老化，pH增加，而微生物开始负责消化中越来越多的部分。例如，在长毛猪笼草(Nepenthes villosa)中，消化液保持4-5个月有活性，在这期间，pH保持在约2。在这段时间之后，pH迅速升高至6。因此可以通过调控消化液的pH来利用这点，尤其是通过添加碱性溶液，将其注射入瓶状体或囊状物中或将其喷雾至胶粘诱捕器上。这样限制蛋白酶活性。因为蛋白酶活性在pH 2-3左右最佳，应该将pH保持在4以上或4.5以上，更有利地在5以上或5.5以上，还更有利地在6以上或6.5以上，并且优选在7以上或7.5以上。优选地，pH也不应该太过碱性，因此应该保持在9以下，有利地8.5以下，优选地8以下。因此，为了调控蛋白酶活性，pH应该在4-9，有利地应该在5-8.5，更有利地在6-8，并且优选7-8。
另一种对本发明方法的可能的改进在于增强重组蛋白向诱捕器的分泌，通过在蛋白质中存在允许其转运进入内质网(ER)的肽信号序列，或藉由跨膜途径，通过过表达植物中SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白吸附蛋白受体)蛋白家族的基因，增强从ER向高尔基体的转运，继而增强从高尔基体向质膜和诱捕器的转运。
至于肽信号序列，如先前所述，尽管这样的肽的存在不一定足以允许向诱捕器消化液的转运，但是似乎诱捕器中存在的消化酶的分泌途径经过ER，因此针对内质网的肽信号序列的存在可能对更好地将重组蛋白转运至诱捕器有贡献。因此，在本发明的方法的一种实施方案中，有待产生的感兴趣的蛋白质包含允许该蛋白质转运至内质网中的肽信号序列。这样的信号序列可以天然存在于蛋白质中，或者可以与不具有肽信号序列的蛋白质融合。
通过两种可供选择的机制来测定定位至ER膜内区室的蛋白质：
1/蛋白质的N-末端部分存在的信号序列，所述蛋白质可以是可溶性或稍后与膜结合的。这种信号序列通常包括疏水基序，该基序使得所述蛋白质能够进入ER。在进入ER之后，所述蛋白质可由蛋白伴侣掌控，该蛋白伴侣确保所述蛋白质的最佳空间构象。
2/在膜结合核糖体的辅助下，mRNA成为蛋白质的翻译过程可(全部或部分)发生在ER附近。因此对于特定的蛋白质，在N-末端部分存在几十个氨基酸的疏水信号序列。在翻译过程期间，胞质SRP(信号识别蛋白)与核糖体的表面结合，终止翻译过程。与核糖体结合的SRP颗粒自身附着于网膜表面的受体。因此蛋白质的疏水信号序列跨过ER膜。翻译再次起始，蛋白质随后释放到腔内(19)。
因此，对于引起特定兴趣的蛋白质，可以通过向基本序列的N-末端位置中添加具有疏水性质的肽信号序列来增强该蛋白质向ER的定位。疏水N-末端基序的实例可在真核细胞P450细胞色素家族中找到，所述家族是位于ER膜上的酶(CYP2C5，CYP73A1)。
至于从ER定位至高尔基体和其后的从高尔基体定位至诱捕器的外部，称作SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白附着蛋白受体)的附着于小泡或膜的肽基序似乎通过膜融合机制参与了植物中的胞吐过程，在膜融合机制之前是SNARE-SNARE型分子相互作用(18)。具体而言，这种靶向含蛋白质小泡从ER向高尔基体的转运的SNARE肽基序已经在拟南芥属(Arabidopsis)的蛋白质中有所描述(18)：它们是突触融合蛋白(Syntaxin)-41、突触融合蛋白-42、突触融合蛋白-43肽(AtSYP41-43，分别为Genbank登录号065359、Q9SWH4和Q9SUJ1)的SNARE结构域。在拟南芥属中还已知其它SNARE型肽。它们存在于高尔基体小泡的表面，并且决定从高尔基体向质膜的转运(胞吐作用)；它们对应于突触融合蛋白-121至突触融合蛋白125(AtSYP 121-125，Genbank登录号：Q9ZSD4、Q9SVC2、Q9ZQZ8、064791、et Q9SXB0)。将多种SNARE结构域总结在下表1中。
表1.已知的拟南芥(Arabidopsis thaliana)SNARE结构域
| 基因 | Genbank登录号 | 对应于SNARE结构域的区域(氨基酸) |
| 突触融合蛋白-41 | O65359(GI：28380151) | 237-293 |
| 突触融合蛋白-42 | Q9SWH4(GI：28380167) | 232-289 |
| 突触融合蛋白-43 | Q9SUJ1(GI：38503420) | 246-302 |
| 突触融合蛋白-121 | Q9ZSD4(GI：28380149) | 217-276 |
| 突触融合蛋白-122 | Q9SVC2(GI：28380140) | 216-275 |
| 突触融合蛋白-123 | Q9ZQZ8(GI：28380148) | 209-268 |
| 突触融合蛋白-124 | O64791(GI：28380117) | 206-265 |
| 突触融合蛋白-125 | Q9SXB0(GI：28380142) | 201-260 |
因此，经遗传转化的食肉植物过表达这两个SNARE蛋白家族中的至少一个或表达具有一个或多个SNARE结构域或衍生物的蛋白质，这种食肉植物应该导致在其ER中存在的蛋白质分泌增加。在本发明的方法的一个实施方案中，栽培的食肉植物额外经遗传修饰以表达包括至少一个SNARE型结构域的至少一个基因，由此导致感兴趣的一种或多种蛋白质向诱捕器中的分泌增加。“SNARE型结构域”意指任何与表1中列出的SNARE结构域之一至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、甚至100％相同的肽基序。具体而言，包括表1中所述SNARE结构域的基因能够在使用的食肉植物中过表达。
本发明的方法可以用于任何类型的食肉植物。可以根据食肉植物诱捕器的类型将它们分成不同类别，因此本发明方法的实践方面依赖于诱捕器类型而不同。所述方法对应于不同类型诱捕器的多种具体优势实施方案在下文描述。具体而言，依赖于使用的食肉植物的类型，或更精确地依赖于选择的食肉植物所含诱捕器的类型，诱捕器消化分泌物的收集步骤使用多种合适的方法来进行。适用于具体诱捕器类型的几种收集方法在下文描述。
然而，其它实施方案可以由在本领域中工作的人员轻松地开发，并且因此不能将本发明的方法限定为下文所述的具体优势实施方案。
能够在本发明的方法的优势实施方案中使用的第一类食肉植物是拥有胶粘诱捕器的食肉植物类别。
术语“胶粘诱捕器”旨在表示通过粘性叶形成的诱捕器。这些叶分泌称为胶或粘液的小滴粘住猎物。这些诱捕器可以是被动的(分泌粘液滴的叶不可移动)或半主动的(分泌粘液滴的叶卷起以增加接触表面，由此允许更好的消化)。几种食肉植物属具有胶粘诱捕器。因此，在使用具有胶粘诱捕器的食肉植物的本发明方法中，所述植物选自茅膏菜属、捕虫堇属(Pinguicula)、腺毛草属(Byblis)、露叶毛毡苔属(Drosophyllum)和穗叶藤属(Triphyophyllum)。有利地，所述具有胶粘诱捕器的食肉植物属于茅膏菜属。
在这些具有胶粘诱捕器的食肉植物中，所述粘液与外界(open air)直接接触，并且能够通过收获曝露在外的胶直接获得感兴趣的蛋白质。因此从诱捕器收获胶可以如下进行：通过浸泡、喷射或清洗经过栽培的具有胶粘诱捕器的食肉植物，通过将胶吸取(suck)或吸收(absorb)至织物(尤其是任何类型的纸，例如吸水纸(blotting paper))上，或通过将胶从经过栽培的具有胶粘诱捕器的食肉植物直接移除。具体而言，在优势实施方案中，将具有胶粘诱捕器的食肉植物栽培在刚性系统(rigid system)上，该系统允许对一组植物进行操作、翻转并且使它们的气生部分浸泡在溶液中。或者，可以将具有胶粘诱捕器的食肉植物栽培在用不透水材料覆盖的斜面上，并且通过喷雾和/或清洗植物的气生部分从诱捕器收获胶，在斜面底部收集获得的溶液。
能够在本发明的方法的优势实施方案中使用的第二类食肉植物是拥有瓶状体、喇叭体(trumpet)或囊状物的食肉植物类别。
术语“瓶状体诱捕器”意指叶的末端为瓶状体或囊，顶部由称为囊盖(operculum)的某种遮蔽物覆盖。猎物受到蜜腺的吸引，进入诱捕器并在内壁上滑倒，所述内壁上有不可穿透的环；猎物溺死在诱捕器中所含的液体中。具有瓶状体诱捕器的食肉植物显然包括猪笼草属和土瓶草属(Cephalotus)。
术语“喇叭状诱捕器”认为意指由变形成管状喇叭的叶形成的诱捕器。受到蜜腺吸引的昆虫藉由位于诱捕器顶部附近的开口进入。诱捕器的内壁有粘性或覆盖有朝下的毛，防止猎物爬出并且使猎物最终向前一种情况一样溺死。具有喇叭状诱捕器的食肉植物显然包括瓶子草属(Sarracenia)。
术语“囊状物诱捕器”意指由或多或少有些透明的小袋或囊状物组成的诱捕器，所述小袋或囊状物沿着根的长度排列，一端具有由分枝的毛围绕的孔，一些毛在猎物(通常为显微可见的猎物)拂过它们时控制诱捕器的触发(springing)。囊状物突然(1/500秒)吸入水和猎物而充满。然后囊状物在大约1/2小时中缓慢回复成它原始的形状，在这段时间猎物没有任何逃脱的机会。这类诱捕器主要存在于属于狸藻属(Utricularia)的物种中。因此，本发明的方法中使用的具有囊状物诱捕器的食肉植物有利地属于狸藻属。
有利地，使用的食肉植物具有瓶状体诱捕器并且选自猪笼草属或土瓶草属。
在这种情况下，以及在具有喇叭状诱捕器的植物的情况下，在其中分泌感兴趣的蛋白质的消化分泌物在无菌或非无菌条件下在瓶状体或喇叭体的底部形成能够被轻易收集的液体。因此，当本发明的方法中使用的食肉植物具有瓶状体或喇叭状诱捕器时，感兴趣的蛋白质有利地通过收获瓶状体内存在的分泌液获得。这可以在无菌条件下进行，通过牺牲瓶状体或通过使用能够刺入瓶状体内所述液体的装置，例如注射器等。在非无菌条件下，消化分泌物可以例如使用移液管或注射器或任何合适的收集手段从开启的瓶状体收集。
瓶状体诱捕器(即具有囊盖的那些)的重要性是，植物仅在诱捕器发育的中的特定阶段开启囊盖。在这个阶段之前，囊盖是关闭的，因此分泌至诱捕器中的消化分泌物处于无菌条件下。当使用这类植物时，在囊盖开启之前进行消化分泌物的收集并且在无菌条件下进行收集，则由食肉植物产生的并且分泌至诱捕器中的重组蛋白能够以无菌形式收集。因此，有利地，本发明的方法中使用的食肉植物具有瓶状体诱捕器，并且选自猪笼草属或土瓶草属。因此在这种情况下，有利的是在植物的瓶状体自然开启之前收获瓶状体内的液体。具体而言，瓶状体内的所述液体可以在无菌条件下通过牺牲瓶状体或通过使用能够刺入瓶状体内所述液体的装置来收获。
无论考虑的是瓶状体或喇叭状诱捕器，由植物产生的天然蛋白酶都在所述瓶状体或喇叭体的底部逐渐积累。为了限制感兴趣的蛋白质被所述消化酶降解的风险，有利的是在植物产生的天然蛋白酶尚未在所述液体中大量积累的植物发育阶段收获瓶状体内的液体。对于各种类型的植物，在本领域工作的人员能够简单地测定在哪个阶段感兴趣的蛋白质的量最高，同时由植物产生的天然蛋白酶的量仍然处于有限的阶段。
当在本发明的方法中使用具有囊状物诱捕器的食肉植物时，有利的是通过收获囊状物内分泌的液体来获得所述蛋白质。具体而言，囊状物内的液体可以通过施用机械应力来释放，例如梳(comb)、拂(brush)或用细丝轻抚(stroke)，或通过发射至囊状物表面上的超声或甚至其它声波来释放。
附图说明
图1.使用紫外显微镜对圆叶茅膏菜植物的观察，用GFP转化的(A和B)和对照植物(C)。箭头指示的是与GFP表达相关的荧光区域(最亮区域)的部位。
图2.对在具有分泌昆虫消化酶的腺体的圆叶茅膏菜植物的叶上存在的腺毛的观察——对照(未经转化的野生植物，A)或用GFP转化的植物(B)。箭头指示的是与GFP表达相关的荧光区域(最亮区域)的部位。
图3.吸收在卷烟纸上之后，在紫外显微镜下对来自圆叶茅膏菜植物的粘液的观察——用GFP转化的(A)或对照植物(未经转化的野生植物，B)。箭头指示的是与GFP表达相关的荧光区域(最亮区域)的部位。
图4.在与X-Gluc底物一起温育之后，对来自圆叶茅膏菜植物的叶的观察——用GUS转化的(A)或对照植物。深灰色区域对应于指示X-Gluc底物已经由GUS酶转化的蓝色区域，由此证明在这些区域中GUS酶的存在。
图5.在与X-Gluc底物一起温育之后，在双目显微镜下对来自圆叶茅膏菜植物的叶和毛的观察——用GUS转化的(A和B)或对照植物(未经转化的野生植物，C)。深灰色区域对应于指示X-Gluc底物已经由GUS酶转化的蓝色区域，由此证明在这些区域中GUS酶的存在。
图6.将胶吸收在Whatman纸上，再与X-Gluc底物一起温育之后，对粘性胶滴的观察。A.涂有来自用GUS转化的圆叶茅膏菜的胶滴的纸(上)与涂有来自对照圆叶茅膏菜的纸(未经转化的野生植物，中)或无胶滴的纸(下)的比较。B.放大A中涂有来自用GUS转化的圆叶茅膏菜的胶滴的纸(上)、涂有来自对照圆叶茅膏菜(未经转化的野生植物，中)的纸。C.涂有来自用GUS转化的其它圆叶茅膏菜植物的胶滴的纸。深灰色区域对应于指示X-Gluc底物已经由GUS酶转化的蓝色区域，由此证明在这些区域中GUS酶的存在。
图7.通过检测NPTII基因，对经转化植物的基因组中含有GUS和NPTII基因的表达载体的插入进行的PCR分析。标记：大小标记。1和2：测试的植物。
实施例
实施例1圆叶茅膏菜植物的转化
1.1材料和方法
1.1.1.用GFP或GUS基因转化圆叶茅膏菜植物
如Hirsikorpi等所述，使叶损伤并将它们与根癌农杆菌共培养从而实现T-DNA向植物细胞的转移之后，从叶诱导了茅膏菜属的转化。在我们的情况中，植物的转化使用两种具有不同标记基因的截然不同的质粒构建体进行。
T-DNA包含NPTII基因，该基因编码赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II，还包含：
-来自水母Aequorea victoria的编码绿色荧光蛋白GFP的基因，其在受到紫外光(395nm)激发时发出可见范围的荧光。
-或编码GUS酶(β-葡糖醛酸糖苷酶)的基因，其在X-Gluc底物(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸)的存在下导致蓝色产物的出现。
1.1.1在与X-Gluc底物温育之后观察叶
将X-Gluc母液在X-Gluc缓冲液(100mM Tris HCl，NaCl 50mM，pH 7)中稀释获得1mM的终浓度，并且直接应用于植物部分。其后将此在37℃保持在黑暗中12小时。然后将叶浸泡在乙醇浴中以去除叶绿素，并且更好地显现任何由可能存在的GUS酶引起的蓝色染色。
1.2.1用GFP转化的圆叶茅膏菜植物
1.2.1.1在紫外显微镜下观察叶
在紫外显微镜下观察来自对照和用GFP转化的食肉植物的叶冠檐(leaflimb)。某些用GFP转化的叶显示了明显的荧光区域(图1A和1B，见箭头)，而来自对照植物的叶无荧光显示(图1C)：
在显微镜下的这些观察结果说明所述植物经历过GFP转化并且在叶冠檐中表达了蛋白质。
1.2.1.2在紫外显微镜下观察毛和粘液
然后将对荧光的搜寻定向于对带有分泌昆虫消化酶的腺体的叶上腺毛的观察，和对由这些腺体产生的胶滴或粘液的观察。
关于对照植物，观察的毛大体上无荧光显示(图2A)。尽管如此，某些观察结果确实揭示了对照毛末端存在荧光，但是这远不如在似乎表达所述蛋白质的GFP植物的某些毛中观察到的显著(图2B，见箭头)。
1.2.1.3吸收在卷烟纸上之后在紫外显微镜下观察粘液
为了观察可能存在于胶滴中的GFP蛋白，裁出卷烟纸的小方块，扫过对照和GFP植物的叶并且将胶吸收至纸上。
在紫外显微镜下观察从GFP植物吸收了粘液滴的纸：其具有荧光点(图3A，见箭头)。对照纸无显示(图3B)。此观察结果说明来自用GFP转化的植物的胶滴表达并含有所述蛋白质。
1.2.2用GUS转化的圆叶茅膏菜植物
1.2.2.1与X-Gluc底物一起温育之后观察叶
为了验证所述植物确实得到了转化，将来自两株推定为经转化的植物的叶和对照叶与X-Gluc底物一起温育。
与对照叶(图4B)相比，推定的GUS叶显示了显著的蓝色区域(图4A，见深灰色区域)。因此鉴于在底物存在下形成的这种蓝色产物的出现，推论GUS酶在所述推定为经转化的植物中存在并且有活性。应该注意叶没有整体变色，某些区域保持白色。对照叶在它们受过损伤或从植物分离叶时进行过切割处显示了蓝色区域，但是冠檐没有染色(图4B)。
1.2.2.2与X-Gluc底物一起温育之后使用双目显微镜观察叶
温育之后，在双目显微镜下观察这些对照和GUS叶，从而看到或精确定位蓝染色。
用GUS转化的植物的叶(图5A和5B)仅在毛的下部显示了染色(见深灰色染色)。毛的末端，即胶形成的部位，没有变色。来自对照植物的叶的毛没有染色(图5C)。
1.2.2.3将胶吸收至Whatman纸上再与X-Gluc底物一起温育之后观察胶滴
对于GFP植物，这次用Whatman纸来吸收来自GUS和对照植物的胶滴(用纸扫过胶滴以尽可能多地吸收)。然后将这些纸片置于缓冲液和X-Gluc底物中在37℃温育12小时。温育1小时之后，已经可以看见染色。在温育12小时之后拍照(图6)。
具有来自GUS叶的胶滴的纸(图6A上，和图6B左)在吸收了胶的部位具有蓝色染色(见深灰色区域)。具有来自对照叶的胶滴的纸(图6A中，和图6B右)无染色显示，无胶的纸也无染色(图6A下)。因此GUS酶在来自用GUS转化的植物的叶的粘液滴中表达并存在，但是在来自对照植物的叶的粘液滴中不存在。
对17株用GUS转化的植物重复了这些实验，在与X-Gluc底物一起温育之后，通过叶的蓝色染色证明了所述转化。在这17株用GUS转化的植物中，14株具有含GUS酶的小滴(具有蓝点的纸)。仅3株显然经转化的植物似乎不表达预期存在于小滴中的蛋白质。因此这些结果指出，至少在大多数的情况下，用GUS转化的植物表达GUS酶并且GUS酶存在于诱捕器的粘液滴中。
此外，在Whatman纸上可见不同强度和数量的蓝色，说明特定的经转化的植物表达并分泌或多或少的GUS酶至叶的粘液中。为了确认这点，对来自GUS植物单片叶的小滴进行了测试：取先前已经测试过的来自5株GUS植物的5片叶，并且将来自每片叶的小滴分别吸收至Whatman纸上。至今获得的结果确认用GUS转化的植物表达并分泌或多或少的GUS蛋白至粘液滴中。
1.2.2.4PCR分析经转化植物的基因组中表达载体的插入
将植物使用存在于相同T-DNA片段上的2个基因转化：GUS基因和卡那霉素抗性基因(NPTII)，NPTII允许通过向培养基添加抗生素的植物选择。事实上，如果植物已经并入了卡那霉素抗性基因，那么它在含有卡那霉素的培养基中存活，而未经转化的植物则死亡，从而选择经转化的植物。
GUS和NPTII基因二者同时整合入植物的基因组。因此NPTII基因在植物基因组中的存在说明GUS基因在植物基因组中的存在，证明了植物的转化。
出于涉及PCR的技术原因，在2株酶测试已经指出存在GUS基因的植物中，通过PCR扩增NPTII基因的片段来检测植物基因组中NPTII基因的存在。
结果在图7中给出，所述结果显示在这2株植物中通过PCR扩增了NPTII基因，由此证明包括GUS和NPTII基因的表达载体插入了植物的基因组中。
1.3结论
上述结果清楚地指出可以生成经遗传修饰的食肉植物，其中插入了感兴趣的蛋白质的基因，并且可以简单地从植物分泌的诱捕器消化分泌物收获(此处为从胶收获)感兴趣的蛋白质。
此外，对所用两种感兴趣的蛋白质(GUS和GFP)进行的测试指出，尽管存在消化酶，但是获得的蛋白质是功能性的。
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Claims (14)
1.用于产生至少一种蛋白质的方法，包括栽培选自茅膏菜属食肉植物，其特征在于所述植物经过通过农杆菌属、生物弹射、电穿孔、或显微注射的转化的遗传修饰以表达所述一种或多种蛋白质，并且从所述食肉植物诱捕器的消化分泌物收集所述一种或多种蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述一种或多种蛋白质在植物细胞中表达并且由所述植物的天然蛋白天然分泌系统分泌。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述蛋白质选自用于兽医学或人类使用的药用产品、美容剂、植物药理剂、诊断剂、营养剂或实验室试剂。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于对所述植物施以化学和任选地机械刺激，模拟猎物的捕获，并且诱导通过所述植物产生蛋白质并将它们分泌至诱捕器中的系统的活化。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于将所述植物在缺乏任何化学和/或机械刺激的条件下培养，所述化学和/或机械刺激模拟猎物的捕获并且诱导通过所述植物产生蛋白质并将它们分泌至诱捕器中的系统的活化。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于该方法进一步包括抑制由所述食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于至少一种所述合成受到抑制的消化酶是蛋白酶。
8.根据权利要求6的方法，其特征在于抑制由所述食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成是通过选自以下的遗传技术来进行的：从所述植物的基因组缺失至少一个消化酶基因，通过沉默关闭至少一个消化酶基因的转录，和/或异位表达至少一个消化酶抑制剂基因。
9.根据权利要求6的方法，其特征在于抑制由所述食肉植物进行的一种或多种消化酶的合成是如下进行的：通过直接向诱捕器的消化液添加抑制所述一种或多种消化酶的溶液，或通过调控消化液的pH和/或温度条件。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于所述蛋白质包含肽信号序列，该序列允许所述蛋白质转运至内质网中。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于所述食肉植物经进一步的遗传修饰以表达至少一个包括至少一个SNARE型结构域的基因。
12.根据权利要求1的方法，其特征在于所述蛋白质通过从诱捕器收获胶来获得，所述收获通过浸泡、喷雾或清洗所述植物，通过将所述植物的胶吸取或吸收至织物，或通过直接收集胶来进行。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于将所述植物栽培在刚性系统上，该系统允许对一组植物进行操作、翻转并且使它们的气生部分浸泡在溶液中。
14.根据权利要求12的方法，其特征在于将所述植物栽培在用不透水材料覆盖的斜面上，通过喷雾和/或清洗植物的气生部分从诱捕器收获胶，并且在斜面底部收集获得的溶液。
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Granted publication date: 20121107 Termination date: 20160829 |