CN103436507B - 噬菌体衍生的抗微生物活性剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供减少包括感染在内的微生物菌落生长的方法和组合物，包括治疗性组合物，治疗感染的方法，和鉴定其它这类组合物的方法。

Description

噬菌体衍生的抗微生物活性剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年5月5日提交的美国临时专利申请号60/797,885和2007年3月30日提交的美国临时专利申请号.60/909,340的优先权，此二申请的内容出于所有目的纳入本文作为参考。

发明领域

本发明提供减少微生物菌落生长，包括它们所引起感染的方法和组合物，包括治疗感染的治疗性组合物和方法，以及其它这类组合物的方法。

发明背景

细菌普遍存在，事实上所有适合居住的环境都发现有细菌。它们是普通的，在生态学上多种多样，它们形成罕见的存活生态位(niche)。它们存在于整个环境中，存在于土壤、灰尘、水中和事实上所有的表面上。许多细菌是正常和有益的菌株，从而提供宿主的协同关系。其它细菌则无益，或在有益的同时造成问题。

致病菌可引起人类、其它动物、还有植物的感染性疾病。一些细菌只导致特定宿主患病；其它在许多宿主中造成问题，这取决于该细菌的宿主特异性。细菌引起的疾病象细菌本身那样具有多种多样性，包括食物中毒、蛀牙、炭疽、广泛的感染疾病，甚至某种形式的癌症。这些细菌通常是临床微生物学领域研究的对象。

在自然界中，细菌的特异性病毒，如噬菌体可杀伤细菌。发现自然界的许多噬菌体属于有尾噬菌体(Caudovirales)或″拖尾″噬菌体目。这些病毒一律含有包裹在蛋白质衣壳中的一条双链DNA基因组。噬菌体由三种基本结构组成：头部，通常为对称二十面体，从二十面体头部一个顶点发出的尾结构、和附着在此尾某些部位的4－6条尾纤维。应注意，有尾噬菌体目包括三个普通形态：短尾噬菌体科(短尾噬菌体)、肌噬菌体科(肌噬菌体)和长尾噬菌体科(长尾噬菌体)。严格说，短尾噬菌体不含有在形态上分离的尾部；因此此种尾样结构实际上装配成头部或衣壳装配体的一部分。肌噬菌体和长尾噬菌体中，头、尾和尾纤维具有不同的形态发生途径；实际上所有这三种结构连接在一起形成完整的感染性病毒体。短尾噬菌体中存在头途径和尾纤维途径。然而按照功能观点而言，短尾噬菌体尾样结构与其它二种形态噬菌体的真正尾起到相同的功能。

噬菌体通过感染、复制和裂解宿主细胞而杀死细菌，此过程中释放出多个子代病毒体。某些噬菌体衍生元件也能杀死细菌。例如，许多假单胞菌属(Pseudomonas)菌株能产生脓菌素(pyocin)，这是能杀死其它假单胞菌菌株的蛋白组分。术语“细菌素(bacteriocin)”通常用于描述细菌产生的能杀死其它细菌的化合物；已知各种化学结构的细菌素，从小分子到多肽。然而发现许多脓菌素是“无头有尾”的，即噬菌体可产生尾而无头部或DNA。这些尾样细菌素能通过吸附于细菌，从而在细胞包膜上产生致死性损伤而杀死细菌，虽然它们缺乏DNA而不能复制或裂解宿主。自从最初在假单胞菌中发现脓菌素以来，已在各种其它细菌，包括革兰阳性菌和革兰阴性菌中鉴定到类似的尾样细菌素。参见例如：Nakayama等，(2000)Mol.Microbiol.38:213-31;Traub等，(1996)Zentralbl.Bakteriol.284:124-35;Ito等，(1986)J.Virol.59:103-111;Rocourt(1986)Zentralbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.261:12-28;Shinomiya(1984)J.Virol.49:310-14;Ishii等，(1965)J.Mol.Biol.13:428-431;Daw和Falkiner(1996)Micron.27:467-479;Strauch等，(2001)Appl.Environ.Microbiol.67:5635-5642;和Abdelhamid等，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68:5704-5710。此外，也已报道了噬菌体衍生的其它杀菌元件。例如，有尾噬菌体编码的内溶素(endolysin)是宿主细胞裂解功能的一部分。这些酶能从内部降解宿主细胞壁，导致其裂解并释放子代病毒体。已证明在细菌培养液或悬液中外源性加入噬菌体内溶素能裂解和杀死许多革兰阳性菌。参见例如，Fischetti等，(2005)美国专利申请20050208038描述了采用噬菌体内溶素杀死细菌，还可参见Takac和Blasi(2005)Antimicrob.AgentsandChemother.49:2934-2940。

一些细菌通常是无害的，但当存在某种机会时可变成致病菌，或在引入异常部位或状态后会变成问题菌。缺乏有效免疫系统的人最脆弱，某些细菌能利用易感的体弱宿主提供暂时性环境以增殖和在人群中传播。

统计学上，传染病是主要的医学问题。参见例如Watstein和Jovanovic(2003)StatisticalHandbookonInfectiousDiseases(传染病统计学手册)Greenwood,ISBN:1573563757。在美国，每年有约4－7万人因血流医院(医院产生的)感染而死亡。

过去的半个世纪，抗生素使临床医学产生了变革。自从最初发现抗生现象以来，这类具有非凡的治疗实体的作用机制和开发取得了极大进展。

参见例如，Therrien和Levesque(2000)FEMSMicrobiolRev.24:251-62;Durgess(1999)Chest115(3增刊):19S-23S;Medeiros(1997)Clin.Infect.Dis.24(增订版1):S19-45;Jones(1996)Am.J.Med.100(6A):3S-12S;Ford和Hait(1993)Cytotechnology12:171-212;以及Liu(1992)ComprTher.18:35-42。2002年全世界销售了约320亿美元的抗生素。

广泛出现的抗生素耐药细菌加重了目前的抗微生物治疗对细菌适应的脆弱性。参见例如，Walsh(1992)Antibiotics:Actions,Origins,Resistance(抗生素：作用、来源、耐药性)Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555812546;Cunha(1992)AntibioticEssentials(抗生素基础)，医师出版社(PhysiciansPress),ISBN:1890114413;Amyes(2003)MagicBullets,LostHorizons:TheRiseandFallofAntibiotics“(魔术弹失去了水平：抗生素的出现和衰落)TF出版社(Taylor&Francis),ISBN:0415272033;Axelsen(2001)EssentialsofAntimicrobialPharmacology:AGuidetoFundamentalsforPractice(抗微生物药理学基础：实施基础指南)休玛娜出版社(HumanaPress),ISBN:0896038424;以及Mainous和Pomeroy编(2001)ManagementofAntimicrobialsinInfectiousDiseases:ImpactofAntibioticResistance(感染疾病的抗生素治疗：抗生素耐药的影响)休玛娜出版社,ISBN:0896038211。然而，许多经典抗生素要靶细菌快速复制和生长才有效。

因此，能降低靶细菌生长或存活或限制细菌病原性的改进方法将会有更大的用途。该用途适用于环境的、局部的、地方的或特别是体内寄居。本发明解决了这些和其它有意义的问题。

发明简述

本发明部分依据以下发现：即发现噬菌体编码的细胞壁降解活性物质，如胞壁质-降解(通常称为胞壁溶解性(muralytic))酶(通常是噬菌体裂解宿主细胞功能的核心)也是噬菌体病毒粒的结构组分，帮助菌体进入宿主菌细胞。这些活性物质在本文称为TAME(尾相关的胞壁质降解酶)，具有固有的杀菌活性而不论噬菌体的复制途径。据认为，所有这三种形态的噬菌体颗粒各自含有与尾结构相关的TAME，或以短尾噬菌体为例，含有与头部或衣壳的某小组分相关的TAME。据认为，细胞壁局部降解有利于(噬菌体)DNA的注入过程。本发明描述了一种特定的噬菌体TAME，即ORF56，它是葡萄球菌(staphylococcal)肌噬菌体K的orf56的基因产物。具体说，发现以前认为不是“裂解剂”的纯化ORF56具有杀菌活性。此外，已鉴定到通过截短衍生自ORF56的杀菌多肽。可从类似或相关来源，如类似结构来源和各种进化相异来源的领域筛选杀菌活性物质，以寻找其它具有优选性能的其它杀菌活性物质。这类来源也可以是诱变和筛选具有其它优选性能，如稳定性、杀菌效力、大小、底物特异性等等的起点。最重要的是，发现ORF56的胞壁质降解催化结构域与裂解性葡萄球菌细菌素(溶葡萄球菌素)的非催化性细胞壁结合结构域(CBD)组成的嵌合体具有强效的杀菌活性，比纯化的TAMEORF56或其截短衍生物明显(例如幅度的数量级或多个因数)更有效。这些TAME-CBD嵌合体的杀菌活性比纯化的TAME更有效。然而，在许多有用的制剂混合物中，TAME-CBD嵌合蛋白显示杀菌活性持续有效(如保留酶的稳定性)。提供了据此的纯化蛋白、其编码核酸序列以及抗体。提供了应用所述组合物的方法，包括减少靶细菌生长和存在的方法。

本发明提供了杀伤对细胞壁降解活性敏感的细菌的方法，所述方法包括将选自以下的组合物引入所述细菌的环境中：a)纯化的噬菌体尾部或尾样细菌素的TAME组分；b)噬菌体KORF56TAME或噬菌体phi11,ORF49的推测TAME的细胞壁降解部分；c)含有噬菌体KORF56或噬菌体phi11ORF49的细胞壁降解多肽的基本纯的多肽；或d)基本上由其它噬菌体或尾样细菌素的TAME同源物或其片段组成的药物组合物。来源的例子包括：YP_238566(ORF007(葡萄球菌噬菌体Twort))、YP_406405(gp29(利斯特菌噬菌体P100))、NP_765044(分泌型抗原SsaA-样蛋白(表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)ATCC12228)、YP_164769(orf134(胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)噬菌体LP65))、YP_492702(转运复合体蛋白TraG(金黄色葡萄球菌金黄亚科USA300))、AAA71958(推测的(金黄色葡萄球菌))、NP_765786(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(表皮葡萄球菌ATCC12228))、YP_189676(分泌型抗原前体SsaA-相关蛋白(表皮葡萄球菌RP62A))、YP_189814(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(表皮葡萄球菌RP62A))，其它指定的来源在下文作进一步描述。另一来源是噬菌体phi11ORF49，一种推测的细胞壁水解酶(NP_803302;GeneID:1258067)。

本发明也提供所述方法，其中，所述细菌属于葡萄球菌属，具体是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和有临床意义的其它葡萄球菌；所述环境是体内环境，或在粘膜或其它器官表面，或医学装置或植入物表面；所述引入是局部、全身、胃肠外或通过吸入；可采用另一种抗微生物治疗，包括抗生素或噬菌体衍生产物；或所述杀菌活性对多种细菌菌株和/或多个细菌种具有广泛的靶特异性。

提供各种方法来筛选针对靶细菌的噬菌体-衍生杀菌活性，所述方法包括：将源噬菌体片段化成为分离的片段结构；测定哪个片段保留了对所述靶细菌的结合活性；测试所述片段的杀菌活性；从而鉴定具有所述杀菌活性的结构。这也包括其中就该方法与美国司法部门交流信息所得资料的实施方式。在某些实施方式中，所述靶细菌是革兰阳性菌或所述杀菌活性是胞壁溶解活性。

提供了更多的方法，包括产生杀菌活性变体的方法，所述方法包括诱变特征为显示细胞壁降解活性的多肽的编码基因；筛选具有改进的杀菌活性的变体。也包括将这类方法得到的数据进行信息交流。其它方法包括所述的，但评价改进的杀菌活性，例如不同的底物转换数量；或酶特性对包括温度、盐、pH、水合等反应条件的敏感性的变化。

提供的治疗方法包括治疗动物的细菌感染，所述方法包括给予所述动物一种或多种杀菌多肽，其中至少有二种所述多肽衍生自不同的细胞壁降解基因；此杀菌多肽具有广泛的靶细菌杀伤活性；所述杀菌蛋白施加在细胞外部是“溶解性”的；或所述杀菌活性是胞壁质降解性或溶胞壁活性的，包括具有胞壁质糖苷酶(包括葡糖酰胺酶(glucosamidase)和胞壁酰胺酶(muraminidase))、转糖基酶、溶酶体、酰胺酶或内肽酶活性的蛋白质。

本发明提供对靶细菌具有杀菌活性的ORF56或ORF49多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸残基620-808或SEQIDNO:3的氨基酸残基481-618至少有80%、90%或95%相同性。在一实施方式中，ORF56蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸残基620-808的准确序列，或者ORF49蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸残基481-618的准确序列。在另一实施方式中，本发明提供基本上由ORF56多肽组成的组合物，该多肽对靶细菌具有杀菌活性，其包含的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸残基620-808或与SEQIDNO:3的残基481-618至少有80%、90%或95%的相同性。

在一实施方式中，本发明提供包含对靶细菌具有杀菌活性的ORF56或ORF49多肽的组合物，例如药物组合物、诊断试剂或杀菌组合物，所述多肽包含的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸残基620-808或与SEQIDNO:3的残基481-618至少有80%、90%或95%的相同性。该组合物可包含至少一种具有杀菌活性的其它蛋白质，如噬菌体p68的p16蛋白或Pal-型“分解酶”。该组合物也可包含具有抑菌或杀菌活性的其它成分，如抗生素。

可利用公开的ORF56或ORF49多肽防止靶细菌即葡萄球菌种，特别是甲氧西林耐药葡萄球菌的生长。在另一实施方式中，所述靶细菌是复制缓慢的细菌种，如倍增时间在1－72小时之间或更多时间，如2、4、8、12、20、30、40或50小时的细菌。

例如，可采用公开的ORF56和ORF49多肽，或包含ORF56或ORF49多肽的组合物来酶促降解细菌细胞壁。

在另一方面，本发明提供通过给予对象ORF56和ORF49多肽，或包含ORF56或ORF49多肽的组合物来治疗该对象的细菌感染的方法。所述对象可以是，例如哺乳动物、灵长类动物、人、农业动物、陪伴动物、人、家禽、牛、马、山羊、猫、绵羊、啮齿类动物、狗、猪、鸡、鸭、鹌鹑或鹅。也可用本发明组合物治疗展示动物(showanimal)，如大象、狮、虎、斑马、鲸、海豚和熊。

在各种实施方式中，所述对象是牛，所述细菌感染是牛乳腺炎；所述对象是人，所述细菌感染由甲氧西林耐药葡萄球菌种引起；或所述对象是家禽，所述细菌感染在皮肤或羽毛上。

另一方面，本发明提供检测细菌或鉴定致病菌的方法，该方法通过使细菌接触ORF56或ORF49多肽，检测ORF56或ORF49多肽与细菌的结合情况。在一优选实施方式中，ORF56或ORF49多肽所述可检测标记的。

在一方面，本发明提供使某表面与ORF56或ORF49多肽或包含ORF56或ORF49多肽的组合物接触来消毒该表面的方法。此消毒方法可用于减少或消除表面上的所有细菌，或多种细菌，或特定的细菌种或菌株，如葡萄球菌种。

在一个方面，本发明提供特征在于具有至少一种以下特性的基本纯的或分离的多肽：在至少17个氨基酸的区段上与ORF56的残基1-808、297-808、363-808、603-808、620-808或691-805具有至少约85%的相同性；在至少24个氨基酸的区段上与ORF56的691-805残基具有至少约90%的相同性；或包含与ORF56至少有85%相同性的多个不同区段，所述区段不重叠。其它一些特性包括：例如在至少17个氨基酸上与ORF56的残基691-805具有至少约75%相同性的其它不同区段；显示与ORF56至少有约65%相同性的至少17个氨基酸的其它不同区段；具有全长或天然ORF56的至少30%细胞壁降解活性；对葡萄球菌菌株的胞壁溶解活性至少为ORF56的约50%；另一种功能多肽序列或结构域，例如信号序列；或可检测标记；至少包含ORF56的残基690-769；是全长ORF56；对应于ORF56的1-808、297-808、363-808、Met-603-808或620-808；包含一个CHAP结构域；基本上没有其它噬菌体蛋白质；基本上没有其它蛋白性物质；与另一种抗微生物剂联用，包括抗生素；与药物赋形剂混合；是缓冲液配制的或灭菌组合物；显示选自溶胞壁、葡糖酰胺酶、酰胺酶或内肽酶活性的细菌细胞壁降解活性；显示对多种革兰阳性细菌菌株具有杀菌活性；显示对葡萄球菌细菌菌株具有杀菌活性；或显示对一种或多种所述菌株，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓慢葡萄球菌(S.lentis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)和肉葡萄球菌(S.carnosus)有杀菌活性。

在一方面，本发明提供能表达分离或重组核酸的表达载体，所述核酸编码ORF56或ORF49多肽或本文所述截短的ORF56多肽。本发明还包括含有ORF56表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是，例如用于产生ORF56多肽或核酸的真核或原核细胞。

一方面，本发明提供含有抗体的抗原结合位点的基本纯或分离的ORF56多肽，所述抗体能选择性结合细胞壁成分。可使这种ORF56多肽例如结合于可检测标记，或作为用于评估靶细菌存在并装有使用说明书的试剂盒的一部分提供。

一方面，本发明提供通过使靶细菌的细胞壁接触ORF56或ORF49多肽从而酶促降解所述细胞壁的方法。此方法的步骤可以，例如整合入诊断(方法)来测定细菌的敏感性；导致工作台或家具表面的敏感菌群至少减少约5倍；将ORF56或ORF49多肽引入动物导致在选择的部位或所述动物的敏感菌群至少减少约5倍；将所述多肽给予动物表面或腔室；可以产生接种到个体中的细菌死亡或不能复制的手段；或可用于治疗皮肤、粘膜、尿道、呼吸道、鼻腔、胃肠道或其它细菌感染。在其它实施方式中，敏感菌群的减少是，例如2倍、3倍、4倍、7倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍，或甚至更多。

一方面，本发明提供SEQIDNO:1所示截短的重组ORF56蛋白，其中从ORF56蛋白的氨基末端截断1-620个氨基酸，或其中从ORF56蛋白的羧基末端截断1-3个氨基酸，并且此ORF56蛋白具有细胞壁降解活性。其余的ORF56蛋白可以与SEQIDNO:1中相应的氨基酸序列具有约80%、90%或95%的相同性。

本发明提供显示葡萄球菌菌株胞壁质降解生物活性的基本纯的或重组的多肽，此多肽包含金黄色葡萄球菌感染噬菌体的尾相关胞壁质降解酶(TAME)区段和异源金黄色葡萄球菌细胞壁结合结构域。

在某些优选实施方式中，所述多肽的蛋白质骨架分子量低于约400kDa、低于约250kDa、或低于约100kDa；或所述多肽对金黄色葡萄球菌的胞壁质显示有肽酶、酰胺酶或水解酶活性；或所述多肽来自有尾噬菌体，如肌噬菌体、短尾噬菌体或长尾噬菌体的尾部。在其它实施方式中，所述胞壁质-降解酶区段来自噬菌体KORF56、噬菌体phi11ORF49或MRSA衍生的噬菌体。在其它各种实施方式中，所述细胞壁结合结构域来自葡萄球菌细菌蛋白，如葡萄球菌溶菌素或噬菌体尾蛋白；或包含：细菌SH3区段；ORF56的序列、模仿葡萄球菌溶菌素或噬菌体L54a酰胺酶；或任何细胞壁结合结构域构建物，它们与缺乏该结合结构域功能的可比多肽相比，将所述多肽的胞壁质降解活性提高至少30倍。

在一实施方式中，所述多肽含有SEQIDNO:4。

也提供药物组合物，例如所述多肽是乳膏或凝胶，装在单剂量容器中，例如含有至少10纳克多肽。这类组合物可以是控释制剂；应用于植入物、导管或医学装置中；或是灭菌的或缓冲剂型。

在其它优选实施方式中，所述组合物作用于在鼻腔中发现的葡萄球菌菌株；或引起乳腺炎或感染烧伤或穿剌伤口的葡萄球菌菌株；或是甲氧西林耐药或万可霉素耐药的葡萄球菌菌株。在另一优选实施方式中，用TAME多肽或含TAME多肽的嵌合蛋白浸泡覆盖伤口用的敷料、纱布等以最大程度减少细菌感染的可能。在另一实施方式中，所述伤口是穿剌或烧伤伤口。在还有一实施方式中，带有所述伤口的个体的免疫系统受损，例如HIV感染、器官移植和相关治疗、干细胞或骨髓移植或化所致。也可用TAME多肽或含TAME多肽的嵌合蛋白来处理器官或血液产品，然后移植给受者。

本发明也提供处理细菌培养物的方法，该方法包括使所述培养物接触所述嵌合多肽。通常，这种接触可降低所述培养菌的生长速率至少约5倍；或也可采用另一种抗微生物治疗；或所述方法采用能靶向不同细菌菌株的混合多肽。这种处理优选降低敏感靶细菌的生长速率至少约30%；将多肽以每种靶细菌化学计量为至少约10种多肽给予，或至少约500ng/ml；或连续给予至少给7天。或者，所述培养物包含葡萄球菌菌株(一种革兰阳性菌)，或是感染物，或者所述培养物可包含哺乳动物细胞或组织。

本发明也提供编码所述多肽的核酸，虽然可用蛋白质合成方法来生产此多肽。还提供了包含此核酸的细胞。

本发明也提供衍生自由TAME多肽序列，或含胞壁溶解结构域的TAME区段与另一多肽中构成细胞壁结合结构域(CBD)的区段的融合体的等价或相关多肽。这些嵌合构建物命名为TAME-CBD。例如，基本纯的或重组的多肽显示具有降解革兰阳性菌胞壁质的生物学活性，此多肽含有革兰阳性菌感染噬菌体的修饰的(例如诱变的)尾相关胞壁质降解酶(TAME)区段序列；和/或修饰的(如诱变的)异源革兰阳性菌细胞壁结合结构域。这些例子中，“诱变的”主要指与全长TAME相比，其中完整的TAME蛋白区域被删除，而杀菌或酶活性、蛋白溶解性、和/或蛋白稳定性增强的TAME形式。

附图简述

图1提供了在感染葡萄球菌的噬菌体中鉴定到的TAME保守性结构区域表。鉴定到胞壁溶解结构域(MD)，在此表中称为TAMECD。

发明详述

I.序言

本研究鉴定到先前未曾鉴定过的多肽，即噬菌体KORF56，现已证明它具有杀菌活性。它是某些肌噬菌体中作为病毒体结构组分的一种组分，具有溶解胞壁的活性。其催化位点位于此蛋白的C-末端部分，显示半胱氨酸－组氨酸依赖性氨基水解酶/肽酶(CHAP)结构域。参见例如Rigden等(2003)TrendsBiochem.Sci.28:230-234。虽然在各种基因的N－末端区域发现有CHAP结构域，但只在很少的基因的编码区C－附近区段中发现这种CHAP结构域。本发明的一部分是了解属于噬菌体蛋白特征的“细胞壁降解活性”与将“溶解”功能的降解活性(在人工条件下评估)转变成杀菌功能(在典型的细菌生长环境的非人工条件下评估)的能力之间的关系。这些“降解活性”可能是用于治疗条件的未知杀菌活性的新来源，可能包括胞壁质酰胺酶、葡糖酰胺酶、酰胺酶或内肽酶活性。除在高度人工试验条件下测试噬菌体结构外，在各种示范性的纯化可溶性蛋白构建物中鉴定到、分离和证明了这种活性，从而对靶细胞具有杀菌活性。此外，含有这种活性的重组构建物具有用作抗微生物组合物和制剂的显著优选特性。

类似地，通过其基因结构模式而部分认识到长尾噬菌体phi11具有所述的胞壁质降解活性(TAME)。

本研究证明葡萄球菌噬菌体K的“假定设ORF56”具有溶胞壁活性，此外，这种重组蛋白产物似乎是从91kD编码的“推测”翻译产物加工产生的23kD蛋白。使各种葡萄球菌菌株接触此23kD产物显示有杀菌活性。截短构建物显示其杀菌活性编码在该蛋白翻译产物的C－末端区域。

本研究表明，从ORF56产生的23kD蛋白产物含有CHAP结构域。还有，从此23kD蛋白截短的包含C－附近区域和CHAP结构域的16kD产物也有杀菌活性。根据序列同源性检索，已鉴定到作为杀菌活性物质的潜在替代来源的各种其它类似结构。虽然溶胞壁活性可能不同，但细菌的敏感性范围尚待研究。因此，各种这些新活性可能具有相当广泛的靶抗菌活性。此外，显示这些活性的这些多肽体积小从而使其在体内能有效产生和接触相关的细胞壁靶组分如肽聚糖。

近年来，作为预防和/或治疗细菌感染的一种替代方法，人们重新注意到噬菌体治疗。参见Merril等(2003)Nat.Rev.DrugDiscov.2:489-497；和Sulakvelidze,等(2001)Antimicrob.AgentsChemother.45:649-659。此外，已有人提出噬菌体-编码的内溶素(endolysin)是控制革兰阳性菌引起的感染疾病的有效制剂(Fischetti(2003)Ann.N.Y.Acad.Sci.987:207-214)。一项近年关于噬菌体内溶素的研究论文表明肠球菌(Enterococcus)噬菌体内溶素对肠球菌以外的链球菌和葡萄球菌的作用没有特异性(Yoong等，(2004)J.Bact.186:4808-4812)。

在许多噬菌体类型，包括肌噬菌体、短尾噬菌体和长尾噬菌体种类中发现属于噬菌体组分的这些溶胞壁或细胞壁降解标记。

申请人对这些TAME细胞壁降解活性进行了研究，测试了在适用于术语“溶解”的人造条件下的杀菌活性，发现它们的特异性活性相当低。逐渐明白这种局限性是TAME活性固有的，只能产生极其有限的细胞壁降解生物学作用，这种作用足够让噬菌体DNA注入，但对细胞完整性没有有害作用。具体说，细胞壁的降解速度对细菌生长没有显著影响，发现在大多数情况下不能满足商品化治疗应用。

噬菌体蛋白可能进化成能，可能参与抵抗细胞外，通常是动物体外的恶烈环境，并进化成对宿主靶细胞没有充分杀伤。事实上，在感染过程中，噬菌体的生命周期要求不杀死细菌细胞，另外噬菌体中断生命周期后方才复制。因此，TAME蛋白作为杀菌元件先天不足。

因此，申请人进一步认识到虽然噬菌体尾部酶在进化目的上是帮助其感染过程，但它们未能演化成足以杀死靶宿主细胞的程度。因此，如果要将TAME蛋白用作有效的杀菌剂，需要修饰这种TAME蛋白。本发明提供的诱变和筛选方法适用于鉴定细胞壁降解基序，此基序能将TAME催化结构域引到特定的细菌或细菌的特定位点。用ORF56作为模型，申请人首先认识到可将噬菌体TAME蛋白从边缘性杀菌试剂转变为高效强效杀菌剂，例如通过去除看来是阻止全长TAME多肽具有高效杀菌功能的序列，和/或将其残留的催化结构域与异源性细胞壁结合结构域相融合。如上所述，将这些融合蛋白或嵌合蛋白命名为TAME-CBD。

这些噬菌体TAME蛋白的天然形式的杀菌活性有限。申请人发现连接壁降解结构域的靶基序影响细胞壁底物处催化位点的局部浓度显著增长。例如将作用于天然环境中在细菌表面上天然发现的合适细胞壁结构的TAME蛋白的催化区段与具有相应亲和力并靶向相应细胞壁结构的结合区段联合可设计出特定细菌的嵌合蛋白。将靶向基序连接于噬菌体衍生的细胞壁降解区段可提供许多融合蛋白或双功能构建物，以筛选所需的抑菌、杀菌或细胞壁“溶解”活性。

已选择了其它细胞壁降解酶区段，制备了构建物以说明本发明范围。例如，已采用衍生自噬菌体区段(通常是尾结构)，编码酶活性，如细胞壁降解酶活性。已从各种噬菌体或细菌来源分离了酶活性显示具有类似活性。类似活性也可获自基于噬菌体的结构，例如基于与噬菌体进入宿主(通常是在感染相关过程中)所用的已知活性的序列同源性。通过感染酶的基因组成中鉴定其它序列，例如包含噬菌体尾结合/壁穿透结构的基因盒，在噬菌体基因组中(参见金黄色葡萄球菌噬菌体phi11细胞壁水解酶的ORF49(NP_803302)，其是噬菌体K的ORF56的结构“复本”。其它例子包括金黄色葡萄球菌噬菌体69的ORF004(gi:66395297,YP_239591.1)、噬菌体PhiNM4的细胞壁水解酶(gi:104641981,ABF73289.1)、phiETA2的细胞壁水解酶(gi:122891778,YP_001004324.1)、金黄色葡萄球菌噬菌体85的ORF004(gi:66394874,YP_239746.1)和噬菌体ROSA的ORF004(gi:66395969,YP_240329.1)。这两种结构域或基序也可衍生自前噬菌体或留在细菌基因组中的灭活或不完全噬菌体基因组的“残存噬菌体”。前噬菌体和鉴定它们的方法参见例如Canchaya等.,Microbiol.Mole.Biol.Rev.67:238-276(2003)，此文内容出于所有目的纳入本文作参考。其它活性肽可衍生自脓菌素(杀菌素)或噬菌体的相关结构，其不能象正常噬菌体那样增殖但可作为不完全基因组副产品而产生或维持。因此，可从代表可存活噬菌体的结构中分离这些蛋白或编码序列，或从其衍生。而且，每种这些结构可作为诱变的起始点以优化在所需应用条件下(例如上述的)的活性。

II.尾相关的胞壁质降解酶(TAME)

尾相关的胞壁质降解酶(TAME)定义为在细菌噬菌体颗粒中发现的溶胞壁酶，包括能消化细菌细胞壁(优选革兰阳性菌的)的那些酶，但也适用于能消化革兰阴性菌或其它细菌细胞壁的那些酶。此种活性通常是肽聚糖降解酶活性，可以是一种或多种胞壁酸酶、氨基葡萄糖苷酶、转糖基酶、溶酶体酶、酰胺酶或内肽酶活性。此种酶能降解细胞壁，甚至有“溶解”细胞的特性，但与噬菌体感染过程的正常环境相比，这种溶解特性是在高度人造条件下才有的。优选这种酶衍生自噬菌体结构，短尾噬菌体的尾或尾等同物，或短尾噬菌体的头内蛋白，它们是噬菌体基因组材料从外部环境进入细菌宿主的手段；因为这些蛋白最常见于尾结构中，对于本申请的目的，此类结构通称为TAME蛋白。短尾噬菌体尾等价物的相关TAME蛋白的一个例子是噬菌体T7的gp16蛋白。gp16蛋白是作用于肽聚糖的转糖基酶。gp16蛋白能有助于DNA注入，但它包含在衣壳内，当感染时才被吐出，似乎形成尾的一部分。参见例如，Molineux(1999)TheT7familyofbacteriophages(细菌噬菌体的T7家族)刊于EncyclopediaofMolecularBiology(分子生物学百科全书).CreightonTE,主编，纽约，JWC公司(JohnWiley&Col)，2495-2507页。

靶细菌通常是影响或感染动物，特别是灵长类动物的那些细菌。然而，优选寻求各种抑菌或杀菌应用，以及某些公共卫生问题。所述细菌常为革兰阳性菌类，虽然其它致病菌尚未明确分成某类或其它类型，包括分支杆菌、孢子菌或其它原核生物。致病性或病原性靶细菌是最感兴趣的目标，革兰阳性菌如葡萄球菌种，包括金黄色葡萄球菌，和链球菌种，以及革兰阴性菌。特别重要的革兰阴性靶细菌种包括大肠杆菌属，特别是大肠杆菌；假单胞菌，特别是绿脓杆菌；弯曲杆菌；沙门菌；奈瑟菌；幽门螺杆菌和弧菌。参见例如MerckManual(默克手册)和MerckVeterinaryManual(默克兽医手册)。

本文公开的ORF56多肽可与至少一种其它溶胞壁酶联用来治疗，例如一种或多种细菌菌株所致的感染。示范性的其它溶胞壁酶包括，例如噬菌体p68的蛋白16和Pal-型“溶解”酶。噬菌体p68的蛋白16披露于例如(VybiralD等(2003),FEMsMicrobiolLett.,219,275-283)。Pal-型“溶解”酶披露于例如Fischetti等，(2005)美国专利申请20050208038。

如本文公开的那样，技术人员可通过联合序列分析与测定噬菌体基因组中编码核酸的位置来鉴定TAME蛋白。

III.定义

“细胞壁降解活性”是降解、断裂、分裂或削弱或降低细菌细胞完整性的酶活性。术语“溶解”通常用于指“细胞壁降解”，部分是由于大多数(有某些例外)壁降解催化活性是水解活性。因此所用的许多术语指“溶解”，即使其催化机制不涉及水解。或者某些确定的或人工底物可用于测试“溶解”或抑制活性(以靶细菌群为基础)。噬菌体的“细胞壁溶解活性”通常是指定为基于在人工条件下测试的结构的表征，但这种表征是细菌种、家族、菌属或亚类(可根据敏感性定义)特异性的。因此，″对细胞壁降解活性敏感的细菌″描述细菌的细胞壁因一种或多种特定的细胞壁降解酶活性而遭到降解、破裂、分裂或细胞壁完整性遭到削弱或降低。许多其它“溶解活性”源自宿主菌细胞，在细胞分裂或噬菌体释放中至关重要。在噬菌体上发现了其它噬菌体衍生的细胞壁降解酶活性，在噬菌体感染的各种渗透步骤中起作用，但如果在噬菌体DNA注入细胞前噬菌体杀伤宿主细菌噬菌体复制将在生理学上中断。渗入步骤所用的结构与本发明特别有关是因为这些活性从外部对正常宿主起作用。在优选实施方式中，所述细胞壁降解活性由非穴蛋白(holin)酶和/或非细胞溶素(lysin)酶提供。在其它实施方式中，细胞结合活性由非穴蛋白酶和/或非细胞溶素酶提供。

“细胞结合结构域”或″CBD″通常是一种靶向基序，它能识别细菌的外表面。在革兰阳性菌中，细菌的外表面通常是胞壁层。因此，这些靶标的优选结合区段是细胞表面物质，无论蛋白质、脂质、糖或它们的组合。已知溶菌酶、内溶素等的结合区段是已知的，它们的性质不难通过PubMed或Entrez检索查到。其它能结合细菌的蛋白质包括下述PGRP、TLR、鞭毛蛋白和菌毛蛋白结合物质，以及参与靶标识别的噬菌体尾蛋白。在一优选实施方式中，将CBD与均如本文所述的TAME蛋白或细胞壁降解蛋白融合。在另一优选实施方式中，与TAME蛋白或细胞壁降解蛋白相比，CBD是异源结构域。即CBD蛋白衍生自非TAME蛋白或非细胞壁降解蛋白，或衍生自不同噬菌体、细菌或其它生物的细胞壁结合蛋白。因此，此种异源性CBD结构域可用于引导TAME蛋白到特定的靶细菌，或可用于增加TAME蛋白的靶标范围。

细菌的″环境″可包括体内或体外环境。在采用分离或纯化细菌的某些实施方式中，体外环境通常是处于反应容器中，但可包括对仪器或动物身体或公共卫生设施如水、腐败区域或下水道设施的表面灭菌、常规处理。其它体外环境可能剌激混杂的细菌群，如包括许多紧密聚集的共生或相互作用菌种。进行了许多噬菌体和细菌的培养研究，其中靶宿主菌与噬菌体的比例是人工的和非生理状态的。体内环境优选用细菌感染的宿主生物。体内环境包括器官，如膀胱、肾、肺、皮肤、心脏和血管、胃、肠、肝、脑或脊髓、感觉器官如眼、耳、鼻、舌、胰腺、脾、甲状腺等等。体内环境包括组织，如牙床、神经组织、淋巴组织、腺体组织、血液、精液等等，可反映不同细菌(其存活依赖于它们的相互作用)协同相互作用。正常使用的引入机体的插管、植入装置和监测或治疗装置可能成为感染的来源。体内环境也包括食物，如鱼、肉或植物食品的表面。肉包括，例如牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、鹌鹑肉或其它家禽的肉。植物材料包括蔬菜、水果、或水果和/或蔬菜制成的汁。在某些实施方式中，与细菌污染食品接触的表面可用TAME蛋白或包含TAME蛋白的嵌合蛋白，如ORF56或ORF49处理。

″引入″某组合物到环境中包括给予某化合物或组合物，使细菌与其接触。引入所述化合物或组合物常受到产生或释放它们的活细菌影响。

″细胞壁降解蛋白″是对细胞壁或其组分具有可检测的(如实质性)降解活性的蛋白。″溶解″活性是降解活性的极端形式或结果。示范性的杀菌多肽包括例如ORF56或ORF49产品，其结构相关实体、突变体和变体，和衍生自其或twort,K,G1,或phi11噬菌体的其它相关构建物。特别优选的序列衍生自例如葡萄球菌噬菌体G1的ORF005(参见gi:66394954,YP_240921.1)、葡萄球菌噬菌体Twort的ORF007(参见gi:66391262,YP_238566.1),或衍生自利斯特菌噬菌体P100(参见gi:82547634,YP_406405.1)。通过它们在噬菌体尾部的位置或天然噬菌体、突变型噬菌体残留物(如脓菌素或杀菌素)的靶宿主菌接触位点，或通过前噬菌体序列编码鉴定到类似的降解活性。优选的区段衍生自例如ORF56或ORF49、模仿葡萄球菌的溶葡球菌素(lss)，金黄色葡萄球菌的LytM肽酶、头状葡萄球菌(S.capitis)的ALE1和其它噬菌体尾部的胞壁溶解多肽。

″ORF56多肽″或其语法变体指葡萄球菌噬菌体K的ORF56编码的杀菌或杀菌活性(与gi|48696445相关的特征结构)。示范性ORF56多肽变体包括该多肽的多态变体、等位基因变体、突变体和种间同源物，它们(1)具有的氨基酸序列优选在一个或多个区域，例如至少约8、12、17、25、33、50、65、80、100、200或更多个氨基酸的区域中与葡萄球菌噬菌体K的ORF56核酸编码氨基酸序列(参见登录号YP_024486)，或与葡萄球菌噬菌体Twort、K或G1的胞壁溶解多肽氨基酸序列有大于约60%的氨基酸序列相同性，即约65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的氨基酸序列相同性；(2)能与用含ORF56活性片段和其保守性修饰变体的氨基酸序列的基本纯的免疫原产生的抗体，如多克隆抗体结合；(3)在严谨杂交条件下能与对应于ORF56多肽的天然编码核酸序列和其保守性修饰变体的反义链特异性杂交；(4)具有的核酸序列优选在至少约25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700个或更多个核苷酸的区域中与ORF56编码核酸或编码其片段的核酸有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，优选大于约96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列相同性。特别优选的区段衍生自CHAP结构域。本发明的核酸和蛋白包括天然或重组分子。全长的ORF56多肽和其N末端截短的片段(小至约16kD)对细胞壁组分通常有降解活性。可按本领域技术人员已知的和本文所述的方法进行细胞壁组分降解活性的试验。在优选实施方式中，ORF56多肽对细菌的各种葡萄球菌菌株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓慢葡萄球菌和肉葡萄球菌具有杀菌活性。类似的比较检测可适用于其它序列如本文所述的ORF49。

在某些实施方式中，可根据所述细胞壁降解多肽的序列用PCR引物扩增编码细胞壁降解多肽的核酸。例如，可用引物扩增编码ORF56多肽变体和其片段，以及可能的细胞壁降解活性候选物的核酸。参见例如Vybiral等，(2003)FEMSMicrobiol.Lett.219:275-283。因此，细胞壁降解多肽和其片段包括根据已鉴定的细胞壁降解多肽的序列通过PCR扩增的核酸编码的多肽。在一优选实施方式中，用所述ORF56或ORF49序列相关引物扩增的核酸编码杀菌或抑菌多肽或其片段。

″噬菌体颗粒组分″指例如噬菌体的头部或尾组分，例如噬菌体K、Twort、G1或phi11的头和尾组分。然而，本发明提供的许多不同类型噬菌体可作为与这种噬菌体组分松散相关的“溶解”活性的来源。参见例如Piuri和Hatfull(2006)ApeptidoglycanhydrolasemotifwithinthemycobacteriophageTM4tapemeasureproteinpromotesefficientinfectionofstationaryphasecells(肌噬菌体TM4带测量蛋白中的肽聚糖水解酶基序促进对静态细胞的有效感染)MolecularMicrobiology62:1569-1585。噬菌体核酸指噬菌体的核酸组分，包括双链和单链核酸，如DNA、RNA或杂交分子。相关序列可见于前噬菌体或不完全的噬菌体基因组中，通常发现整合到细菌宿主的染色体中。尾组分通常可介导噬菌体识别和附着靶宿主菌，其可具有有助于噬菌体组分穿透进入宿主菌细胞壁降解活性。

″GMP条件″指药品生产和质量管理，例如由美国食品药品管理局制定的。欧洲、日本和大多数发达国家制定了类似的规程和制度。

上述“基本纯”的定义中术语“基本上”一般指至少约60%、至少约70%、至少约80%，或较优选至少约90%、还要优选至少约95%纯，不论指蛋白质、核酸或其它结构，或其它类型的分子。

术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，及以类似于天然产生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然氨基酸相同的基础化学结构的化合物，如与氢结合的α碳原子、羧基、氨基和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基砜。这种类似物含有修饰的R基团(如正亮氨酸)，或修饰的肽骨架，但保留了天然氨基酸的基础化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸通用化学结构不同，但以类似于天然氨基酸的方式起作用的化合物。

“蛋白质”、“多肽”、或″肽″指聚合物，其大多数或所有的单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸，或者称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可采用或L-光学异构体，或D-光学异构体。此外，也包括非天然氨基酸，如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本发明也可采用不是基因编码的氨基酸。此外，本发明也采用经过修饰而包含合适结构或反应基团的氨基酸。本发明所用的氨基酸可以是D-或L-异构体或它们的混合物。通常优选L-异构体。此外，本发明也采用其它肽模拟物。综述可参见Weinstein等编(1983)ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins(氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学)MD出版社(MarcelDekker，纽约，第267页。

术语“重组”用于指细胞时，表明细胞能复制异源核酸，或表达异源核酸编码的肽或蛋白质。重组细胞可包含在该细胞的天然形式(非重组细胞)中没有的基因。重组细胞也可含有在该细胞的天然形式中发现的基因，其中所述基因经修饰后重新导入该细胞。此术语也包括其内源核酸经过修饰但没有从细胞中除去的细胞；这种修饰包括通过基因替代、定点突变和相关技术获得的修饰。具体地说，可制备融合序列，例如在所需序列的上游掺入一个上游分泌盒而产生分泌的蛋白产物。

“融合蛋白”指其所含的氨基酸序列是除编码原始或天然全长蛋白质的氨基酸序列或其亚序列以外的、取代的该氨基酸序列或其亚序列，少于和/或不同于该氨基酸序列或其亚序列的蛋白。可将一个以上其它结构域加到本文所述的细胞壁溶解蛋白中，例如表位标签或纯化标签，或多个表位标签或纯化标签。可连接其它结构域，例如其可添加额外的溶解活性(对混合菌落或生物膜的靶细菌或相关细菌)、细菌衣壳降解活性、靶向功能或其可影响生理过程如血管渗透性。或者，可连接能在不同多肽之间导致物理亲和力的结构域以产生多链聚合的复合物。

术语“核酸”指脱氧核糖核酸、核糖核酸或单链或双链形式混合聚合物，除非另有限制，包括能以类似于天然核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有指出或文中另有说明，特定的核酸序列包括其互补序列。

“重组表达盒”或简写为“表达盒”是重组或合成产生的一种核酸构建物，其中的核酸元件能影响结构基因在与这种序列相容的宿主中的表达。表达盒通常至少包括启动子和/或转录终止信号。重组表达盒通常包括要转录的核酸(如编码所需多肽的核酸)和启动子。也可采用实现表达必须的或有帮助的其它因子，例如本文所述的。在某些实施方式中，表达盒也可包含编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列引导表达的蛋白质从宿主细胞分泌。表达盒也可包含转录终止信号、增强子和能影响基因表达的其它核酸序列。在某些实施方式中，在宿主菌细胞中表达时对细胞壁有溶解活性的重组表达盒编码的氨基酸序列。

本文所用的“异源序列”或“异源核酸”是源自特定宿主细胞的外来来源的序列或核酸，或如果是同一来源，则对其原始形式作了修饰。可通过，例如用限制性酶处理DNA以产生能操作性连接启动子的DNA片段来修饰此异源序列。也采用定点诱变等技术来修饰异源序列。

术语“分离的”指实质上或基本上没有干扰酶活性成分的材料。对于本发明的糖、蛋白质或核酸，术语“分离的”指实质上或基本上没有其天然状态中所见正常伴随它们的物质。用银染色凝胶条带强度或测定纯度的其它方法测量到本发明的分离的糖、蛋白质或核酸的纯度一般是至少约80%纯，通常至少约90%，优选至少约95%。纯度或均质性可用本领域熟知的许多方法测定。例如，可用聚丙烯凝胶电泳分辩样品中的蛋白质或核酸，然后染色观察该蛋白质或核酸。对于某些目的，可能需要蛋白质或核酸的高分辨率，可以采用，例如HPLC或类似方法来纯化。

术语“操作性相连”指核酸表达调控序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达调控序列影响与第二序列相对应的核酸的转录和/或翻译。

就二个或多个核酸或蛋白质序列而言，术语“相同”或“相同性百分比”指当比较或比对最大对应性时，采用序列比较算法之一或通过目视检查测定到这二个或多个序列或亚序列是相同的或含有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。

就二种核酸或蛋白质而言，短语“基本上相同”指当比较或比对最大对应性时，采用以下的序列比较算法之一或通过目视检查测定到这二条或多条序列或亚序列在相对应的区段中至少有大于约60%的核酸或氨基酸序列相同性，即65%、70%、75%、80%、85%、90%，优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸或氨基酸残基相同性。优选在对应于长度至少约13、15、17、23、27、31、35、40、50个或更多个氨基酸残基的序列区域上，更优选在至少约100残基的区域上存在基本相同性，最优选这些序列在至少约150个残基上是基本相同的。优选更长的对应核酸长度，虽然要考虑密码子简并性。在一最优选的实施方式中，所述序列在编码区全长上基本相同。

对于序列比较，通常将一个序列用作参比序列与测试序列比较。当采用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如需要，指定亚序列座标，指定序列算法程序参数。然后序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分比。

可采用例如Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85:2444的类似性检索；采用计算机执行的这些和相关的算法(威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup(遗传学计算机组)，575ScienceDr.，麦迪逊，威斯康星州)；或目测检查(一般可参见CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物学方法)，Ausubel等编.，CurrentProtocols(最新方法)，格林出版合伙公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)和约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc)的合资企业.(1995和增刊)(Ausubel))进行序列的最佳比对。

适合测定序列相同性百分比和序列相似性的算法例子有BLAST和BLAST2.0算法，分别参见Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel等，(1977)NucleicAcidsRes.25:3389-3402。公众可从国家生物技术信息中心网站(ncbi.nlm.nih.gov/)或类似来源获得实施BLAST分析的软件。此算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短“词”来鉴定高评分序列对(HSP)，该“词“与数据库序列中相同长度的“词”比对时匹配或满足某些正域值T。T称为毗邻词评分域值(Altschul等，同上)。这些最初的毗邻词命中(hit)可作为种子来启动检索以发现含有它们的更长HSP。然后将词命中沿各序列的二个方向尽量远地延伸以增加累积比对评分。对于核苷酸序列，可采用参数M(一对匹配残基的奖分，总是>0)和N(错配残基的罚分，总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，可利用评分矩阵计算出累积评分。当出现：累积比对评分从其达到的最大值跌落数量X；累积评分因累积了一个或多个负分残基比对而到零或以下；或到达任一序列的末端时，词命中向二方向的延伸终止。BLAST算法的参数W、T和X决定了此算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认词长(W)为11、预期值(E)为10、M=5、N=-4和比较二条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认词长(W)为3、预期值(E)为10、和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA89:10915)。

除了计算序列相同性百分比外，BLAST算法也能执行二条序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测定方法是最小秩和概率(P(N))，其提供二条核苷酸或氨基酸序列之间随机匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中最小秩和概率小于0.1，更优选小于0.01，最优选小于0.001，则认为此核酸与参比序列相似。

二条核酸序列或蛋白基本上相同的另一指标是：第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质能进行免疫交叉反应，如下文所述。因此，如果二个多肽的差别仅在于保守性取代，那么第一种蛋白质通常与第二种蛋白质基本相同。二种核酸序列基本相同的另一指标是这二种分子能在严谨条件下相互杂交，如下文所述。

短语“特异性杂交”指在某序列存在于复杂的混合(如总细胞)DNA或RNA中时，某分子在严谨条件下只与该特定的核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。

术语“严谨条件”指探针能与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖的，在不同环境中不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。在确定的离子强度和pH条件下，严谨条件一般选择比特定序列的解链温度(Tm)低约15℃。此Tm是(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶序列互补的探针有50%与该靶序列杂交达到平衡时的温度。(由于在Tm时靶序列通常过量存在，平衡时只有50%的探针被占据)。通常严谨条件是盐浓度低于约1.0M钠离子，典型的是约0.01－1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0－8.3，短探针(10－15个核苷酸)的温度至少约30℃，长探针(50全核苷酸以上)的温度至少约60℃。也可通过加入去稳定试剂如甲酰胺来实现严谨条件。对于选择性和特异性杂交，阳性信号通常应是背景的至少二倍，优选背景杂交的10倍。示范性严谨条件如下：50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS，42℃培育，或5xSSC、1%SDS，65℃培育，65℃用0.2xSSC和0.1%SDS洗涤。对于PCR，通常在温度约36℃作低严谨性扩增，虽然退火温度要根据引物长度在约32-48℃之间变化。对于高严谨PCR扩增，通常温度为约62℃，虽然高严谨退火温度范围为约50℃至约65℃，这取决于引物长度和特异性。高和低严谨性扩增的典型循环条件包括：90-95℃变性30-120秒，退火持续30-120秒，约72℃延伸1－2分钟。低和高严谨性扩增反应和方法和指南可参见例如Innis等，(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR方案：方法和应用指南)学术出版社(AcademicPress)，纽约。

当用短语“特异性结合蛋白”或“与其特异性免疫反应”述及抗体时，指测定蛋白和其它生物物质的异质群体中是否存在该蛋白的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，特定抗体能优先结合特定的蛋白质，而与样品中存在的其它蛋白的结合量不明显。在这种条件下特异性结合某蛋白要求选择对该特定蛋白具有特异性的抗体。可采用多种免疫试验来选择能与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规采用固相ELISA免疫试验来选择能与某蛋白发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual(抗体，实验室手册)，冷泉港出版社，纽约中描述的免疫试验方法和条件可用于测定特异性免疫反应。

特定多核苷酸序列的“保守性修饰变体”指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些多核苷酸，或如果该多核苷酸不编码氨基酸序列，则指基本相同的序列。因为基因密码的简并性，任一给定的蛋白质可由许多功能上相同的核酸编码。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在密码子编码精氨酸的每个位置，该密码子可用所述的另一种相应密码子代替，而不会改变编码的蛋白质。这类核酸差异是“沉默变异”，是“保守性修饰变异”的一种。除另有说明外，本文所述编码蛋白质的每种多核苷酸序列，也描述了可能的沉默变异。技术人员知道可用标准技术修饰核酸中的每个密码子(除了AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和UGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码蛋白质的各核酸的“沉默变异”通常隐含在各所述序列中。

技术人员知道许多氨基酸可取代蛋白质中的另一种氨基酸而不影响此蛋白质的功能，例如，保守性取代可能是蛋白质，如公开的细胞壁溶解蛋白的保守性修饰变体的基础。下文给出了保守性氨基酸取代的不完全名单。以下8组各含有通常可互相保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton(1984)Proteins)。

另外，技术人员知道，如果改变导致用化学上相似的氨基酸取代某氨基酸，则编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常不到5%，更典型不到1%)的各取代、删除或添加是有效的“保守性修饰变异”。本领域熟知提供功能类似氨基酸的保守性取代表。

技术人员知道蛋白质的许多保守性变异，如细胞壁溶解蛋白，编码蛋白质的核酸产生基本上相同的产物。例如，由于遗传密码的简并性，“沉默取代”(如不会导致所编码蛋白改变的核酸序列取代)是编码某氨基酸的各核酸序列的隐含特征。如本文所述，宜优化所述序列在用于产生细胞壁溶解蛋白的宿主细胞(如酵母菌、人等)中的表达。类似地，“保守性氨基酸取代”是氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被性质高度相似的不同氨基酸取代，不难鉴定为高度类似于特定氨基酸序列，或高度类似于编码氨基酸的特定核酸序列。任何一种特定序列的这种保守性取代变异是本发明的特征。也可参见Creighton(1984)Proteins(蛋白质),WHF公司(W.H.FreemanandCompany)。此外，编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或小百分比例的氨基酸的各种取代、删除或添加通常也是“保守性修饰变异”。

本发明的实施包括构建重组核酸和在宿主细胞，优选宿主菌细胞中表达基因。对特定宿主要采用优化的密码子选择。本领域知道可用分子克隆技术达到此目的。适合构建重组核酸和表达载体的各种克隆及体外扩增方法是技术人员熟知的。足以指导技术人员进行许多克隆实验的这类技术和指导的例子可见Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques(分子克隆技术指南)，MethodsinEnzymology(酶学方法)”152卷，学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(Berger)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物学方法)Ausubel等编，CurrentProtocols(最新方案)，格林出版合伙公司和约翰威利父子公司合资企业(1999增刊)(Ausubel)。表达重组多肽的合适宿主细胞是本领域技术人员已知的，包括例如，原核细胞如大肠杆菌，和真核细胞，包括昆虫、哺乳动物和真菌细胞(如黑曲霉菌(Aspergillusniger))。

足以指导技术人员实施体外扩增方法的方案的例子包括：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Q　-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术，可参见Berger、Sambrook和Ausubel的有关著作，以及Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(PCR方案：方法与应用指南)(Innis等编)学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(1990)(Innis)；Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94;(Kwoh等，(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:1173;Guatelli等(1990)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA87:1874;Lomel等，(1989)J.Clin.Chem.35:1826;Landegren等(1988)Science241:1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;以及Barringer等，(1990)Gene89:117。体外克隆扩增核酸改进方法的描述可参见Wallace等的美国专利号5,426,039。

IV.商业应用

可立即明白所述的酶活性有多种用途。一种重要的应用是抗菌处理正常使用时可能遭污染的物品。可用这些物质处理可能危害公众健康的被靶细菌污染的部位、设备、环境等。感兴趣的部位包括有可能对付含靶细菌的材料的公共卫生设施。这类材料包括废物，如液体、固体或空气。废水处理设施可整合这些酶活性物质以消除靶细菌流出，不论是直接利用酶处理还是通过释放产生酶的细胞。可将其加到固体废物地点以最大程度减少靶细菌暴发。相反，食品制备区域或设备必须定期清洁，本发明提供了有效消除靶细菌的组合物和手段。受污染的医疗和其它公共环境可批准类似手段来尽可能减少靶微生物的生长和传播。可将这些方法用于需要灭菌消除靶细菌的环境，包括重症护理室的空气过滤系统。

另一种应用包括用于兽医和医学领域。检测是否存在特定细菌或鉴定特定靶细菌的方法可利用选择性试剂对菌群或培养菌的作用。清洁制剂，包括动物或宠物的洗涤品中优选包含抑菌或杀菌活性物质。

可用ORF56和相关多肽治疗，例如人或动物的细菌感染。这些多肽可预防给药或可给予已接触细菌感染的对象。在优选实施方式中，采用ORF56多肽来治疗复制缓慢细菌引起的感染，因为其杀伤机制不依赖于宿主细胞的复制。许多抗菌制剂如抗生素对付复制细菌最有用。复制缓慢的细菌的倍增时间例如约为1-72小时、1-48小时、1-24小时、1-12小时、1-6小时、1-3小时或1-2小时。

在一优选实施方式中，用这些蛋白治疗受各葡萄球菌种感染的人或其它哺乳动物。在另一优选实施方式中，用ORF56或ORF49蛋白治疗受甲氧西林耐药性葡萄球菌种感染的人或其它动物。

V.给药

给药途径和剂量视感染菌株、部位和感染程度(如局部或全身感染)及所治疗对象而不同。给药途径包括但不限于：口服、肺部递送的气溶胶或其它装置、鼻喷雾、静脉内(IV)、肌肉内、腹膜内、鞘内、眼内、阴道内、直肠内、局部给药，腰椎穿剌、鞘内、和直接应用于脑和/或脑膜。采用赋形剂作为运载体递送治疗剂是本领域技术人员知道的。例如，可采用冻干形式的酶在给药前溶解后IV注射。考虑的给药剂量范围是感染宿主中每个细菌约0.03、0.1、0.3、1、10、30、100、300、1000、3000、10000更多个酶分子。取决于此蛋白质的大小，其本身可串联结合或是多亚基形式(二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等等)，或可与一种或多种其它实体，如特异性不同的酶或片段组合，剂量可以是每千克体重每天约100万至约10兆个分子，优选每千克体重每天约1兆个分子，可以是每千克体重每天约10E6杀伤单位至约10E13杀伤单位。

评价杀伤力的方法类似于技术人员评价完整复制性噬菌体所用的方法，例如噬斑形成单位或pfu，虽然测定杀伤单位滴定后细菌存活数来评价杀伤单位更好。然而，用杀伤定量测定更为清楚，因为非复制性噬菌体不能在菌苔上形成噬斑。故常规采用连续稀释方法代替标准的pfu来评价“杀伤”单位量。使细菌培养液的连续稀释液接触此杀伤组合物可定量测定杀伤单位。或者，比较细菌总数与活菌落单位可确定哪部分细菌实际存活，提示哪部分对该杀伤构建物敏感。对人工或专门制备底物的活性的其它测量方法常可用作对杀伤单位测量的替代方法。

通常给予治疗剂直到成功消除了致病菌，虽可采用广谱制剂，同时测定对感染菌株的具体诊断。因此本发明考虑了本发明组合物的单剂型(singledosageform)和多剂型(multipledosageform)，以及实施缓释方式递送这种单剂型和多剂型的方法。

对于肺部或其它粘膜表面的气溶胶给药，可将治疗组合物掺入专门设计用于给药的气溶胶制剂中。本领域对气溶胶知之甚多，本发明不限于任何具体制剂。气溶胶的一个例子是先林葆雅公司(Schering-Plough)生产的Proventil吸入器，它所含的推进剂是三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷和油酸。其它实施方式包括专门设计通过对象或病人的鼻腔和鼻窦给药的吸入器。如果需要可根据治疗用的具体组合物调节推进剂和乳化剂的浓度。每次气溶胶治疗给予的酶杀伤单位数量通常在约10E6-10E13杀伤单位范围内，优选约10E12个杀伤单位。

评价杀伤力的方法常类似于作用于完整复制型噬菌体所用的许多方法。具体地说，杀伤定量测定更困难，因为非复制型噬菌体在细菌上不形成噬斑。故需要用连续稀释方法来评价“杀伤”单位的量，其实施类似于标准的pfu(噬斑形成单位)，但不能利用菌苔上发生的杀伤或扩增。使细菌培养液的连续稀释液接触此杀伤组合物可定量测定杀伤单位。或者，比较细菌总数与活菌落单位可确定哪部分细菌实际存活，提示哪部分对该杀伤构建物敏感。评价静态活性的其它方法包括胞内成分(无论是天然的或载入的)的释放，或对对应于天然细胞壁结构的已确定或制备的底物的酶活性。

通常，所述杀伤将减少细菌的复制能力至少约3倍，可能影响其复制约10、30、100、300倍至许多数量级。然而，即使减慢细菌复制而不杀死它们也具有显著疗效或商业价值。优选的基因灭活效力是0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4、5、6、7、8、或更高对数单位。

VI.制剂

本发明也考虑了以药学上可接受的赋形剂提供的本发明的含至少一种细胞壁降解酶，如胞壁酸酶的药物组合物。因此，本发明的制剂和药物组合物包括含有以下的制剂：对细菌具有特异性的分离的酶区段；是作用于相同或典型细菌宿主的二种、三种、五种、十种、或二十种或更多种酶的混合物；和作用于不同细菌或同一细菌不同菌株的二种、三种、五种、十种、或二十种或更多种酶的混合物，例如能共同抑制金黄色葡萄球菌的多种菌株生长的酶的混合物。本发明的组合物可以此方式配制而满足病人的需要。所述化合物或组合物通常是灭菌的或接近无菌的。

本文中，″治疗有效剂量″指给予后能产生抑菌，或优选杀菌效果的剂量。其精确量取决于治疗目的，本领域技术人员采用已知技术可确定。参见例如Ansel等人，“PharmaceuticalDosageFormsandDrugDelivery(药物的剂型和药物递送)”；Lieberman(1992)“PharmaceuticalDosageForms(药物剂型(1-3卷)、Dekker,ISBN0824770846、082476918X、0824712692、0824716981；Lloyd(1999)TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(药物组合的艺术、科学和技术)；和Pickar(1999)“DosageCalculations.(剂量计算)”。如本领域所知，必须(根据)蛋白质降解、全身与局部的药物递送、新蛋白酶合成的速率，以及病人的体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、菌落中的细菌成分谱系、病况的严重性作出调整，本领域技术人员对此可用某些实验来测定。

本领域熟知各种药学上可接受的赋形剂。本文所用的“药学上可接受的赋形剂”包括当与组合物的活性成分混合时，能维持该成分的生物学活性而不会引起对象免疫系统的破坏作用的物质。这类物质包括稳定剂、防腐剂、盐或糖的复合物或晶体等等。

示范性的药物运载体包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。例子包括但不限于：标准的药物赋形剂，如磷酸缓冲盐水、水、乳液如油/水乳液，和各种类型的湿润剂。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄榄油和可注射有机脂如油酸乙脂。水性运载体包括：水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外运载体包括：氯化钠溶液、林格葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠液、乳酸林格液或非挥发油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格葡萄糖的那些)等等。在其它实施方式中，将此组合物掺入到固相基质，包括缓释颗粒、玻璃珠、绷带、眼睛插片和局部应用形式。

也可用本领域熟知的方法冻干本发明的含酶组合物，例如随后按本发明所述重建和使用。

还有令人感兴趣的是脂质体递送制剂，和微胶囊化酶(包含糖晶体)的制剂。可用熟知的常规方法配制包含这种赋形剂的组合物(参见，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)，13章，14版，马克出版公司(MackPublishingCol)，伊斯顿市(Easton)，宾夕法尼州18042，美国)。

通常可制备各种形式的药物组合物，例如颗粒、片剂、丸剂、栓剂、胶囊(如适用于口服)、微珠、微球、脂质体、悬液、药膏、洗剂等。可采用适合口服和局部应用的药学级有机或无机运载体制备包含治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物和动物油及脂肪。制剂可掺入稳定剂、湿润剂和乳化剂、盐以改变渗透压或缓冲剂以确保合适的pH值。

此药物组合物可包含除“溶解”酶外的其它组分。此外，此药物组合物可一种以上的活性成分，如二种以上、三种以上、五种以上、十种以上不同的酶，这些不同的酶对同一种细菌、不同种细菌或相伴细菌具有特异性。例如，此药物组合物可包含多种(如至少二种以上)明确的细胞壁降解酶，其中组合物中至少两种酶具有不同的细菌特异性。以这种方式，此治疗组合物可适用于治疗不同细菌的混合感染，或可以是一种能选择性作用于特定环境常见的各种类型感染的组合物。例如，可通过选择衍生自特异性不同的各种噬菌体的不同组壁降解性或“溶解”酶组成这种选择性，其包含至少一种对怀疑存在于感染(例如，感染部位中)中的不同细菌或关键细菌(如特定菌株等)有效的成分。如上所述，可与其它药物，如常规的抗微生物剂一起给予此壁降解性酶。在某些实施方式中，可能需要在同一制剂中给予此种酶和抗生素。

VII.方法

实施本发明的某些方面包括普通临床微生物学的熟知方法、处理细菌噬菌体的常规方法、和普通生物学基础、原理和方法。这类方法的参考文献列于下文中，出于所有目的均纳入本文作参考。

A.普通临床微生物学

普通微生物学是研究微生物的科学。参见例如Sonenshein等，(2002出版)“枯草芽孢杆菌及其最近亲属：从基因到细胞(BacillusSubtilisandItsClosestRelatives:FromGenestoCells)”Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555812058;Alexander和Strete(2001)的“微生物学：实验室图片册(Microbiology:APhotographicAtlasfortheLaboratory)”Benjamin/Cummings,ISBN:0805327320;Cann(2001)“分子病毒学原理(PrinciplesofMolecularVirology)”(CD-ROM书籍，第3版),ISBN:0121585336;Garrity(2005出版)“系统细菌学手册(Bergey′sManualofSystematicBacteriology)”(2卷，第2版)普莱纳姆公司(Plenum),ISBN:0387950400;Salyers和Whitt(2001)“细菌的致病机理：分子方法(BacterialPathogenesis:AMolecularApproach)”(第2版)Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:155581171X;Tierno(2001)“病菌的机密生活：微生物猎手的观察和教训(TheSecretLifeofGerms:ObservationsandLessonsfromaMicrobeHunter)”袋星公司(PocketStar),ISBN:0743421876;Block(2000出版)“消毒、灭菌和防腐(Disinfection,Sterilization,andPreservation)”(第5版)LWW出版公司(LippincottWilliams&WilkinsPubl.),ISBN:0683307401;Cullimore(2000)“细菌鉴定的实用图册(PracticalAtlasforBacterialIdentification)”LewisPub.,ISBN:1566703921;Madigan等(2000)“微生物的布鲁克生物学(BrockBiologyofMicroorganisms)”(第9版)PH公司(PrenticeHall),ASIN:0130819220;Maier等(2000出版)“环境微生物学(EnvironmentalMicrobiology)”AcademicPr.,ISBN:0124975704;Tortora等(2000)“微生物学，引言(Microbiology:AnIntroduction)”包括微生物学Place(TM)的网址,学生指导(StudentTutorial)CD-ROM,T和细菌IDCD-ROM(第7版),Benjamin/Cummings,ISBN0805375546;Demain等(1999出版)“工业微生物学和生物技术手册(ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology)”(第2版)Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555811280;Flint等(1999出版)“病毒学、分子生物学、病理学和控制的原理(PrinciplesofVirology:MolecularBiology,Pathogenesis,andControl)”Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555811272;Murray等式(1999出版)“临床微生物学手册(ManualofClinicalMicrobiology)”(第7版)Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555811264;Burlage等(1998出版)“微生物生态学技术(TechniquesinMicrobialEcology)”牛津大学出版社ISBN:0195092236;Forbes等(1998)“Bailey&Scott′s诊断微生物学)”(第10版)Mosby,ASIN:0815125356;Schaechter等(1998出版)“微生物致病机制(MechanismsofMicrobialDisease)”(第3版)LWW公司,ISBN:0683076051;Tomes(1998)“细菌、男人、女人和微生物在美国人生命中的准则(TheGospelofGerms:Men,Women,andtheMicrobeinAmericanLife)”HarvardUniv.Pr.,ISBN:0674357078;Snyder和Champness(1997)“细菌的分子学(MolecularGeneticsofBacteria)”Amer.Soc.Microbiol.,ISBN:1555811027;Karlen(1996)“男人和细菌：历史和现代的疾病和瘟疫(MANANDMICROBES:DiseaseandPlaguesinHistoryandModernTimes)”TouchstoneBooks,ISBN:0684822709;以及Bergey(1994出版)“决定性细菌学手册(Bergey′sManualofDeterminativeBacteriology)”(第9版)LWW公司,ISBN:0683006037。

B.处理细菌噬菌体的通用方法

处理细菌噬菌体的方法是熟知的，例如参见Snustad和Dean(2002)“细菌病毒的遗传学实验(GeneticsExperimentswithBacterialViruses)”Freeman;O′Brien和Aitken(2002出版)“抗体的噬菌体展示：方法和方案(Display:MethodsandProtocols)”休玛纳公司;Ring和Blair(eds.2000)“遗传工程产生的病毒(GeneticallyEngineeredViruses)”BIOSSci.Pub.;Adolf(1995出版)“分子遗传学方法：病毒基因技术(MethodsinMolecularGenetics:ViralGeneTechniques)”第6卷,Elsevier;Adolf(1995出版)“分子遗传学方法：病毒基因技术(MethodsinMolecularGenetics:ViralGeneTechniques)”第7卷,Elsevier;以及Hoban和Rott(1988出版)“细菌病毒系统分子生物学(Molec.Biol.ofBacterialVirusSystems)”(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyNo.136)S-V公司(Springer-Verlag)。

C.生物技术、原理和方法的通用基础

生物技术、原理和方法的通用基础的描述可参见例如Alberts等(2002)“细胞的分子生物学(MolecularBiologyoftheCell)”(第4版)GarlandISBN:0815332181;Lodish,等.(1999)“分子细胞生物学(MolecularCellBiology)”(第4版)Freeman,ISBN:071673706X;Janeway等(2001出版)“免疫学(Immunobiology)(第5版)Garland,ISBN:081533642X;Flint等(1999出版)“病毒学、分子生物学、病理学和控制的原理(PrinciplesofVirology:MolecularBiology,Pathogenesis,andControl)”Am.Soc.Microbiol.,ISBN:1555811272;Nelson等(2000)“生物化学原理(LehningerPrinciplesofBiochemistry)”(第3版)Worth,ISBN:1572599316;Freshney(2000)“动物细胞的培养：基本技术手册(CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique)”(第4版)Wiley-Liss;ISBN:0471348899;Arias和Stewart(2002)“动物发育的原理(MolecularPrinciplesofAnimalDevelopment,)”牛津大学出版社，ISBN:0198792840;Griffiths,等(2000)“遗传分析的引言(AnIntroductiontoGeneticAnalysis)”(第7版)Freeman,ISBN:071673771X;Kierszenbaum(2001)“历史和细胞生物学(HistologyandCellBiology,)”Mosby,ISBN:0323016391;Weaver(2001)“分子生物学(MolecularBiology)”(第2版)McGraw-Hill,ISBN:0072345179;Barker(1998)AttheBench:ALaboratoryNavigatorCSHLaboratory,ISBN:0879695234;Branden和Tooze(1999)“引入蛋白质结构中(IntroductiontoProteinStructure)”(第2版),GarlandPublishing;ISBN:0815323050;Sambrook和Russell(2001)“分子克隆：实验室手册”(第3卷.,第3d版),CSHLab.Press,ISBN:0879695773;以及Scopes(1994)“蛋白质纯化：原理和实践(ProteinPurification:PrinciplesandPractice)”(第3版)SpringerVerlag,ISBN:0387940723。

D.诱变：位点特异性、随机、改组

根据本文提供的结构和功能说明，可分离得到或产生产优化了优选特征的同源物或变体。因此，可通过结构同源性或评价特征性基因构成基序中发现的实体而发现噬菌体穿透功能的催化性区段。可检测通常见于特定基因排列中的噬菌体尾基因和相应排列中的其它基序有无细胞壁降解活性。这些基序也可作为筛选结构变体的起始点，例如诱变这种结构并筛检它们是否具有所需特性，如更广的底物特异性。采用的标准诱变方法可参见例如Johnson-Boaz等，(1994)Mol.Microbiol.13:495-504;美国专利6,506,602、6,518,065、6,521,453、6,579,678、和它们所引用的参考文献。

类似地可鉴定结合区段，可筛检优势或特异性靶基序中能与它们相互作用的结合结构域。这些靶基序的许多可能是含有在各种潜在靶菌株上发现的结构的高表达蛋白质、糖类或脂质。虽然已知许多蛋白质能结合细胞壁，但二个家族包括在昆虫到哺乳动物的物种中发现的肽聚糖识别蛋白(PGRP，参见例如Dziarski和Gupta(2006)“肽聚糖识别蛋白(PGRPs)(Thepeptidoglycanrecognitionproteins(PGRPs))”GenomeBiol.7:232,PMID:16930467;Dziarski和Gupta(2006)“哺乳动物的PGRP:一种新的抗菌蛋白质(MammalianPGRPs:novelantibacterialproteins)”CellMicrobiol.8:1059-69,PMID:16819960;Lu等，(2006)“肽聚糖识别蛋白是一种新类型的人杀菌蛋白(Peptidoglycanrecognitionproteinsareanewclassofhumanbactericidalproteins)”J.Biol.Chem.281:5895-5907;Dziarski(2004)“肽聚糖识别蛋白(PGRPs)(Peptidoglycanrecognitionproteins(PGRPs)”Mol.Immunol.40:877-886,PMID:14698226;Guan等，(2004)“人肽聚糖识别蛋白Ia的C-末端肽聚糖结合结构域的晶体结构(CrystalstructureoftheC-terminalpeptidoglycan-bindingdomainofhumanpeptidoglycanrecognitionproteinIa)”J.Biol.Chem.279:31873-882;Liu等(2001)“肽聚糖识别蛋白：四种人先天免疫模式识别分子的新家族(PeptidoglycanRecognitionProteins:anovelfamilyoffourhumaninnateimmunitypatternrecognitionmolecules)”J.Biol.Chem.276:34686-694;和Werner等，(2000)“黑腹果蝇的肽聚糖识别蛋白家族(AfamilyofpeptidoglycanrecognitionproteinsinthefruitflyDrosophilamelanogaster)”Proc.Nat’lAcad.Sci.USA97:13772-777)。在这些蛋白C-末端发现有一个约60个氨基酸的保守区段，利用PubMed或序列检索可发现其它区段。能结合细菌的另一组蛋白是toll-样受体(TLR)，特别是能直接检测细菌LPS的TLR4；能结合细菌脂蛋白、肽聚糖和酵母菌酵母多糖(zymosan)的TLR2；能结合双链RNA的TLR3以及能识别鞭毛蛋白(细菌鞭毛上的蛋白)的TLR5。在细菌细胞外部发现的菌毛结构可能是结合的蛋白靶标的另一种结构。诱变可能拓宽结合的选择性或提高区段或整个结构的稳定性，而删除策略可消除外部区段。

革兰阳性细菌细胞壁组分可能与革兰阴性菌细胞壁组分相同，或可能与其它分枝杆菌或孢子菌相同。然而，革兰阴性菌可能有一层额外的壁，其作用是对抗噬菌体入侵的额外屏障。噬菌体或其它细菌的其它活性可能联合作用以穿透更为复杂的革兰阴性菌细胞壁结构。具休地说，一种构建物中的多个催化区段可提供多种活性，在功能上协同作用，或当与另一种治疗剂如抗生素或抗微生物剂联用时提供协同作用。.

靶向部分能提高催化片段的局部浓度，但长度适当的接头也增加局部的胞壁降解作用。因此，可利用与靶标和催化性基序相容的长度适当的接头，从而提高催化穿透活性，进而导致抑制或杀伤靶细菌。

本发明部分的概念进步是认识到所选择的噬菌体常在不适宜的生物学条件下在细胞外存活。因此，这种结构可能特别结实和牢固而能耐受可能灭活噬菌体的环境条件。能在不适宜环境，例如温度、盐、氧化或极端反应、高压等极端环境中存活的细菌可能具有特别适合在细胞外存活的噬菌体。这些噬菌体结实，能耐受那些极端环境，使它们可能比含有没以经历类似选择的蛋白质的噬菌体更易存活。衍生自那些来源的多肽各种纯化过程、贮存和药理学条件下可能更稳定。本发明另一方面内容来自于TAME结构的目的是识别和结合靶细菌而非要快速杀死该细胞这一假设。因此，TAME进化成不要求在商业可行的应用条件下能非常有效地杀死细菌。测试检测ORF56构建物能否增强边缘商业上有前途的杀菌活性。事实上，将多肽缺失和加入结合结构域组合将该活性提高到对商业应用有吸引力的水平。连接细胞壁靶向部分可提高细胞壁降解活性部位的局部底物浓度，删除天然TAME的序列有可能删除了噬菌体在细胞中复制前限制其杀菌速度以防杀死宿主菌的某些特征。这些特征普遍存在，因此，噬菌体可作为收集和筛选这些用途的所需特性的起点。

E.筛选

可设计筛选方法评价突变体或新的候选功能区段。可筛选纯化的噬菌体颗粒制品在噬菌体结构中是否存在这种基因产物。结合检测可采用细菌粗制培养物、分离的细菌细胞壁组分、肽聚糖制品、合成的底物或纯化的试剂来检测亲和力和靶细菌上的靶标结合数。可设计穿透或胞壁降解试验以评价的是靶菌株细胞壁的完整性，菌苔抑制试验、培养物活力检测、对细胞壁制品或其它底物(如结合基序所述的)的活性、或催化作用细胞壁组分(如糖、氨基酸、聚合物)的释放。通过可溶性N-乙酰已糖胺的释放检测酰胺酶活性(例如修饰的Morgan-Elson反应)，或用DNFB试验检测游离氨基来检测内肽酶活性(丙-甘内肽酶检测L-丙氨酸，甘-甘内肽酶检测L-甘氨酸)，所有这三种试验参见Petit等，(1966)“用链球菌G的特异性内肽酶研究细菌细胞壁肽聚糖中的肽交联(Peptidecross-linksinbacterialcellwallpeptidoglycansstudiedwithspecificendopeptidasesfromStreptomycesalbusG)”Biochemistry5:2764-76;PMID:5968582。甘-甘内肽酶活性也可用N-乙酰已糖甘氨酸(乙酰基-Gly6)释放的游离氨基检测。参见Kline等，(1994)“用已糖甘氨酸底物检测溶葡萄球菌素的比色微量滴定板试验(Acolorimetricmicrotiterplateassayforlysostaphinusingahexaglycinesubstrate)”Anal.Biochem.217:329-331;PMID:8203764。

可检测接头的性质来比较特定接头对结合或催化的作用，或比较片段的不同取向。可筛选多组靶标中作用于较广或较窄靶细菌谱的催化性片段，可包括可能具有相同细胞壁组分的其它细菌，如分枝杆菌或孢子菌。这可应用于有关葡萄球菌的更广泛组，例如包括：肉葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌和缓慢葡萄球菌分离物。可设计诸方案来筛选更多候选多肽或变体。

测试细胞壁降解活性的一种方法是用温和的洗涤剂或变性剂处理噬菌体，使之释放结构相关的蛋白质。进一步检测这些蛋白质对宿主菌的胞壁降解或“溶解”活性。另一种方法是检查对噬菌体耐受宿主菌的从外部(fromwithout)细胞壁降解或“溶解”活性(LO)。第三种评估噬菌体结构组分相关的胞壁降解或“溶解”活性的方法是进行Zymogram试验，例如，在加入了高压灭菌的宿主菌细胞的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳纯化的噬菌体制品。原位复性凝胶上的蛋白条带，然后使其作用于细胞壁组分从而产生清晰的“溶解”区带，而其余的凝胶被亚甲基兰染成兰色。参见例如Lepeuple等，(1998)“用复性聚丙烯酰电泳分析自溶性乳酸乳球菌属AM2菌株的细菌溶解酶：前噬菌体-编码酶的鉴定(Analysisofthebacteriolyticenzymesoftheautolyticlactococcuslactissubsp.cremorisstrainAM2byrenaturingpolyacrylamidegelelectrophoresis:identificationofaprophage-encodedenzyme)”Appl.Environ.Microbiol.64:4142-428,PMID:9797258。观察此清晰区带，洗脱区带中的蛋白条带，例如通过N-末端测序或质谱确定其身份。然后分离编码此蛋白的ORF。

VIII.分离编码细胞壁降解性或结合多肽的核酸

已鉴定到编码上述细胞壁“溶解”或结合蛋白，如葡萄球菌噬菌体K、Twort、G1或phi11的核酸，及其保守性修饰变体。它们编码的细胞壁“溶解”蛋白具有细胞壁降解活性，编码鉴定的CHAP结构域的那些基础候选对象，特别是CHAP结构域是C(末端)附近的那些。其它来源包括噬菌体的尾-样结构(如脓菌素或缺陷型噬菌体-样颗粒)，或具有特征性“溶解”活性元件的基因组序列，如显示具有这些结构的特征性基因组成的(参见例如Rybchin(1984)“细菌噬菌体phi80的遗传学—综述(Geneticsofbacteriophagephi80--areview)”Gene27:3-11;PMID:6232171)。

编码细胞壁“溶解”多肽的核酸例子也与本发明核酸实施方式相关。本领域技术人员知道获得这种核酸的方法。可用体外方法，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、转录扩增系统(TAS)、或自身连续的序列复制系统(theself-sustainedsequencereplicationsystem，SSR)克隆或扩增合适的核酸(如cDNA、基因组序列或亚序列(探针))。除了合成方法外，本领域技术人员熟知各种克隆和体外扩增方法。这些技术及其说明的例子足以指导技术人员进行许多克隆试验，可参见Berger和Kimmel,“GuidetoMolecularCloningTechniques(分子克隆技术指南)”，刊于MethodsinEnzymology(酶学方法)152学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(Berger);Sambrook等.(1989)“MolecularCloning-ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)”(第2版)1-3卷,冷泉港实验室,冷泉港出版社,纽约；Sambrook等;“最新分子生物学方法”；Ausubel等编,格林出版合伙公司和约翰威利父子公司合资企业(1999增刊)(Ausubel);Cashion等,美国专利号5,017,478和Carr,欧洲专利号.0,246,864。

可采用上述适当方法制备编码细胞壁降解多肽的DNA，包括例如用限制性酶克隆和切割相应序列。在一优选实施方式中，用常规克隆方法分离得到编码细胞壁降解多肽的核酸。可利用登录号YP_024486提供的细胞壁降解多肽的核苷酸序列来制备能与总RNA样品中编码该多肽的基因，或编码细胞壁降解蛋白的mRNA特异性杂交的探针(如在Southern或Northern印迹中)。一旦鉴定到编码细胞壁“溶解”蛋白的靶核酸，可用本领域技术人员已知的标准方法分离(参见例如Sambrook等.(1989)“分子克隆：实验室手册”(第2版)1-3卷,冷泉港实验室;Berger和Kimmel(1987)“分子克隆技术指南”刊载于“酶学方法”152卷；圣迭戈：学术出版社公司或Ausubel等(1987)“现代分子生物学方法”格林出版和威利交叉科学公司(GreenePublishingandWiley-Interscience),纽约)。此外，可用限制性酶切割分离的核酸以产生编码全长细胞壁降解多肽的核酸或其亚序列，如含有编码至少细胞壁降解多肽的催化结构域亚序列的亚序列。然后可将这些编码细胞壁降解多肽的限制性酶切片段或其亚序列连接在一起以产生编码细胞壁降解多肽的核酸。

可用类似方法产生相应的细胞壁结合片段或片段之间的接头。可鉴定到对靶细菌上优势表面特征性有亲和力的结合区段，包括例如：噬菌体K的ORF56、模仿葡萄球菌的溶葡萄球菌素、L54a酰胺酶、噬菌体phi11的酰胺酶、金黄色葡萄球菌的溶葡萄球菌素同源物ALE-1(见GI:3287732)、金黄色葡萄球菌NCTC8325自溶素中发现的细菌SH3结构域区段(见YP_500516)、金黄色葡萄球菌的JH9N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶家族2(见ZP_01242312、金黄色葡萄球菌的Mu50酰胺酶(见NP_371437)、金黄色葡萄球菌RF122噬菌体-相关的酰胺酶(见YP_417165)、金黄色葡萄球菌肽聚糖水解酶(见AAA26662)、金黄色葡萄球菌溶血JCSC1435N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰酶(见YP_254248)、模仿葡萄球菌的蛋白产物CAA29494、细菌肽聚糖识别蛋白(PGRP或PGLYRP，从昆虫到哺乳动物中发现的能结合革兰阳性菌或革兰阴性菌肽聚糖(PGN)的高度保守性蛋白大家族)，或其它相关序列，如因基因盒中的序列或位置而具有同源性的序列。已表征了各种细菌的细胞壁，在例如PubMed中常报导与其结合的蛋白质。此种结合性蛋白质常具有Sarc同源性3结构域(SH3)真核细胞的对应物。可采用长度和性能适当的接头区段连接结合与催化结构域。参见例如Bae等，(2005)“隐藏Markov模型中蛋白相互作用区域接头的预测(PredictionofproteininterdomainlinkerregionsbyahiddenMarkovmodel)”Bioinformatics21:2264-2270;以及George和Heringa(2003)“蛋白结构域接头的分析：它们的类型和在蛋白折叠中的作用(Ananalysisofproteindomainlinkers:theirclassificationandroleinproteinfolding)”ProteinEngineering15:871-879。

通过测定表达产物可表征编码相应多肽的核酸或其亚序列。可采用根据表达多肽的物理、化学或免疫学性质的检测结果的试验。例如，可根据核酸编码的多肽降解或消化细菌细胞的能力来鉴定细胞壁降解多肽，如本文所述。

也可化学合成编码所需多肽的核酸或其亚序列。合适的方法包括Narang等(1979)Meth.Enzymol.68:90-99所述的磷酸三酯法；Brown等(1979)Meth.Enzymol.68:109-151所述的磷酸二酯法；Beaucage,等(1981)Tetra.Lett.22:1859-1862二乙基磷酸亚胺法，和美国专利号4,458,066所述的固相支持物法。化学合成产生的是单链寡核苷酸。可通过与互补序列杂交，或用此单链作为模板通过DNA聚合酶使之聚合而转变为双链。技术人员知道虽然化学合成DNA常限于约100个碱基的序列，但可将较短序列连接获得较长的序列。

可用DNA扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)克隆编码所需多肽的核酸或其亚序列。因此，例如，用含有一个限制性酶位点(如NdeI)的有义引物，和含另一个限制性酶位点(如HindIII)的反义引物，以PCR扩增此核酸或亚序列。这将产生编码所需多肽或亚序列并含有末端限制性酶位点的核酸。然后不难将这种核酸连接入含有编码第二种分子并具有合适的相应性酶切位点的核酸的载体中。合适的PCR引物可由本领域技术人员利用GenBank提供的或从其它来源获得的序列信息来确定。也可通过定点诱变将相应的限制性酶切位点加入到编码细胞壁降解多肽或其多肽亚序列的核酸中。按照标准方法，用相应的限制性内切酶切割含细胞壁降解多肽编码核苷酸序列或亚序列的质粒，然后连接入适当的载体中进行扩增和/或表达。足以指导技术人员进行体外扩增方法的技术例子参见Berger、Sambrook和Ausubel，以及Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202;PCR方案：方法与应用指南(Innis等编)学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(1990)(Innis);Arnheim和Levinson(October1,1990)C&EN36-47;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94;(Kwoh等(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:1173;Guatelli等(1990)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA87:1874;Lomell等(1989)J.Clin.Chem.35:1826;Landegren等(1988)Science241:1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;以及Barringe等.(1990)Gene89:117。

可根据所鉴定的多肽序列用PCR引物扩增编码细胞壁降解多肽的某些核酸。

可将例如特定核酸表达的重组细胞壁降解多肽的其它物理性能与已知所需多肽的特性作比较，以提供鉴定合适的序列或结构域，如作为细菌特异性、结合特异性和/或催化活性决定因素的细胞壁降解蛋白的另一种方法。或者，可突变推测的细胞壁降解多肽编码核酸或重组细胞壁“溶解”多肽的基因，检测未突变的、天然或对照细胞壁降解多肽的正常增强的细菌“溶解”变异来确定其作为细胞壁降解多肽的作用，或特定序列或结构域的作用。技术人员知道可用分子生物学技术(如PCR)操作编码多肽的核酸以促进本发明细胞壁降解多肽的突变或修饰。诱变或基因改组技术可应用于本文所述的功能片段，包括与嵌合构建物相容的细胞壁降解活性、胞壁结合特性或接头特性。

可用标准方法来突变或修饰多肽并如本文所述检测它们的活性，例如受体底物活性和/或催化活性，来鉴定新鉴定的细胞壁降解多肽的功能结构域。可利用不同细胞壁降解蛋白的功能结构域序列来构建编码或组合一种或多种细胞壁降解多肽的功能结构域的核酸。然后可检测这些多活性融合多肽的杀菌或抑菌活性。可以根据与鉴定的“溶解”活性的同源性鉴定相关序列，并筛选对相应底物的活性。在噬菌体结构上发现的用于附着和穿透靶细菌壁结构，例如盒结构的多肽的特征性噬菌体基因结构可能鉴定到具有用于从外部攻击细胞壁的结合和/或杀菌或抑菌活性的新序列。具体例子包括前噬菌体序列，包括功能性噬菌体基因组的不完全遗留物，或脓菌素样结构，包括衍生自噬菌体-样基因区段的序列，如细菌DNA中保留的噬菌体缺失或突变基因遗留物。

在克隆细胞壁降解多肽编码核酸的示范性方法中，比对所克隆多肽的已知核酸或氨基酸序列以测定它们之间序列相同性的程度。利用这种信息鉴定和选择能赋予或调节细胞壁降解多肽活性，如细菌靶向或结合特异性，和/或基于感兴趣多肽之间序列相同性程度的降解或“溶解”活性的结构域。例如，可利用在感兴趣细胞壁降解多肽之间具有序列相同性的结构域，和与已知活性相关的结构域来构建包含此结构域与其它结构域并具有该结构域相关活性(如细菌或结合特异性和/或细胞壁降解活性)的多肽。可用类似的策略来分离能结合细胞壁结构的细菌SH3结构域、肽聚糖识别蛋白(PGRP)、噬菌体尾“溶解”多肽、或隔开这些结构域的相连接头。

IX.在宿主细胞中表达所需多肽

本发明的细胞壁降解蛋白或其它蛋白可在不同的宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、其它细菌宿主和酵母菌。宿主细胞优选微生物，例如，酵母菌细胞、细菌细胞或丝状真菌细胞。合适宿主细胞的例子包括，例如，固氮菌属(Azotobactersp.)(如棕色固氮菌(A.vinelandii))；假单胞菌属(Pseudomonassp)、根瘤菌(Rhizobiumsp.)；欧文菌属(Erwiniasp)；大肠杆菌属(如大肠杆菌)、芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)；变形菌(Proteus)；沙门菌(Salmonella)；沙雷菌(Serratia)：志贺杆菌(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)；透明颤菌属(Vitreoscilla)；副球菌(Paracoccus)和克雷伯菌属(Klebsiellasp)和其它许多细菌。所述细菌细胞可以是几种菌属之一，包括酵母菌(Saccharomyces)(如酿酒酵母菌(S.cerevisiae))、假丝酵母菌(Candida)(如产朊假丝酵母菌(C.utilis)、近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)、克鲁斯假丝酵母菌(C.krusei)、生香假丝酵母菌(C.versatilis)、解脂假丝酵母菌(C.lipolytica)、涎沫假丝酵母菌(C.zeylanoides)、季也蒙假丝酵母菌(C.guilliermondii)、白色念珠菌(C.albicans)和土生假丝酵母菌(C.humicola)；毕赤酵母(Pichia)(如粉状毕赤酵母(P.farinosa)和奥默毕赤酵母菌(P.ohmeri))；球拟酵母属(Torulopsis)(如白球拟酵母菌(T.candida)、圆球拟酵母菌(T.sphaerica)、胶膜醋酸球拟酵母菌(T.xylinus)、麦角固醇球拟酵母菌(T.famata)和易变球拟酵母菌(T.versatilis))；德巴利酵母属(Debaryomyces)(如类球形德巴利酵母(D.subglobosus)、D.cantarellii、球形德巴利酵母(D.globosus)、汉逊德巴利酵母(Dhanseni)和D.japonicus)；接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)(如鲁氏接合酵母菌(Z.rouxii)和子囊酵母菌(Z.bailii))；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus))；汉逊酵母属(Hansenula)(如异常汉逊酵母(H.anomala)和杰丁汉逊酵母(H.jadinii))以及酒香酵母菌(Brettanomyces)(如郎比可酒香酵母(B.lambicus)和异酒香酵母菌(B.anomalus))。有用的细胞例子包括但不限于：大肠杆菌、肠杆菌(Enterobacter)、固氮菌、欧文菌、克鲁伯酵母菌、芽胞杆菌、假单胞菌、变形杆菌和沙门菌。

细胞壁降解多肽一旦在宿主细胞中表达，可用其防止相应细菌的生长。在一优选区实施方式中，利用ORF56多肽降低金黄色葡萄球菌或其它相似葡萄球菌生长。可产生组合这些片段的融合构建物，包括含多种细胞壁降解活性酶，包括肽酶和酰胺酶催化活性(它们能切断gly-gly和gly-ala连接键)，或组合了活性(片段)与结合细胞壁结构的靶向区段的融合蛋白。降解活性的组合能协同作用而更好地发挥抑菌或杀菌功能。可加入接头以在结合靶部位附近提供大体积的高局部浓度催化位点。

通常，将编码细胞壁降解多肽的多核苷酸放在在所需宿主细胞中具有功能的启动子控制下。根据具体用途，在本发明的表达载体中可采用各种熟知的示范性启动子。通常，根据启动子在所述细胞中有活性来选择启动子。任选也可包含其它表达控制序列，如核糖体结合位点、转录终止位点等等。包含一种或多种这些调控序列的构建物称为“表达盒”。因此，本发明提供的表达盒中掺入了编码例如组合了催化片段与结合片段的融合蛋白的核酸从而在所需宿主细胞中高水平表达。

通过克隆在宿主细胞中表达的基因常可获得适合用于特定宿主细胞中的表达调控序列。本文定义的常规使用的原核调控序列包括启动转录的启动子，任选含有操纵子及核糖体结合位点，包括以下常规使用的启动子，如β-内乳酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change等，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等(1980)NucleicAcidsRes.8:4057)、tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA80:21-25)以及λ-驱动的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等，(1981)Nature292:128)。具体的启动子系统对本发明而言不是关键，可采用在原核细胞中具有功能的许多可得到的启动子。各种实施例中采用了细菌噬菌体T7启动子。

为了在大肠杆菌以外的原核细胞中表达细胞壁降解多肽，要采用在特定原核细菌生产中具有功能的启动子。这种启动子可获自从这些细菌中已克隆的基因，或可采用异源启动子。例如，杂交trp-lac启动子在除大肠杆菌以外的杆菌中具有功能。

本发明的表达盒中常规包含核糖体结合点(RBS)。大肠杆菌中示范性RBS由长3-9个核苷酸的核苷酸序列组成，其位于起始密码子上游3-11个核苷酸(Shine和Dalgarno(1975)Nature254:34;Steitz刊于Goldberger(1979编)“生物学调节和发育：基因表达(Biologicalregulationanddevelopment:Geneexpression)”(第1卷,349页)普莱纳姆出版社，纽约)。

为在酵母菌中表达蛋白质，便利的启动子应包含GAL1-10(Johnson和Davies(1984)Mol.Cell.Biol.4:1440-1448)、ADH2(Russell等(1983)J.Biol.Chem.258:2674-2682)、PHO5(EMBOJ.(1982)6:675-680)和MFα(Herskowitz和Oshima(1982)，见Strathern等编：“酵母菌的分子生物学(TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces)”冷泉港实验室,冷泉港,纽约,第181-209页)。酵母菌所用的另一种合适启动子是ADH2/GAPDH杂交启动子，见Cousens等，(1987)Gene61:265-275(1987)中的描述。对于丝状真菌，例如黑曲霉真菌菌株(McKnight等的美国专利号4,935,349)，有用的启动子例子包括衍生自黑曲霉酵解基因的启动子，如ADH3启动子(McKnight等，(1985)EMBOJ.4:2093-2099)和tpiA启动子。合适的终止子的例子是ADH3终止子(McKnight等)。

组成型或调节型启动子均可用于本发明。优选调节启动子，因为宿主细胞可生长至高密度然后诱导表达融合蛋白。高水平表达的异源多肽在某些情况下减慢了细菌生长。可诱导性启动子是在改变培养环境或发育因素，如改变温度、pH、厌氧或需氧条件、光照、转录因子和化学物时能导致基因表达水平改变的启动子。这类启动子本文称为“可诱导”启动子，可控制所需多肽表达的时间。对于大肠杆菌和其它细菌宿主细胞，本领域技术人员也知道可诱导启动子。这些启动子例如包括lac启动子、细菌噬菌体λPL启动子、杂交trp-lac启动子(Amann等，(1983)Gene25:167;deBoer等，.(1983)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA80:21)以及细菌噬菌体T7启动子(Studier等(1986)J.Mol.Biol.;Tabor等，(1985)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1074-78)。这些启动子及其应用的讨论参见Sambrook等(同上)。

包含操作性连接于基因表达调控信号的感兴趣多核苷酸的构建物称为“表达盒”，置于合适的宿主菌细胞中时驱动该多核苷酸表达。常将编码本发明融合蛋白的表达盒置于表达载体中，将该载体引入宿主细胞。除表达盒外，所述载体通常包含能使该载体在一种或多种选择的宿主细胞中独立复制的核酸序列。这种序列通常是能使载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，包含复制或自发复制序列的起点。许多细菌的这种序列是熟知的。例如，质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰阴性菌。或者，此种载体可整合入宿主细胞基因组成分中随细胞DNA的复制而复制。

构建多核苷酸构建物通常要求采用能在细菌中复制的载体。可购得商品化的纯化细菌质粒的各种试剂盒(参见例如法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech)的EasyPrepJ、FlexiPrepJ；斯特拉特基因公司(Stratagene)的StrataCleanJ；和恰根公司的QIAexpress表达系统(Qiagen))。然后可进一步操作分离和纯化的质粒产生其它质粒，并用于转染细胞。也可在链球菌或杆菌中克隆。

常将可选择性标记掺入用于表达本发明多核苷酸的表达载体中。这些基因能编码基因产物，例如转化的宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必须的多肽。未被含有此选择基因的载体转化的宿主细胞在此种培养基中不能存活。典型的选择基因编码能赋予抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、卡拉霉素、氯霉素或四环素耐药性的多肽。或者，可选择标记编码补充自身的营养缺陷型或提供不能从复合培养基中获得的关键营养成分的蛋白质，如杆菌的编码D-丙氨酸内旋酶的基因。通常，所述载休包含在，例如大肠杆菌或其它细胞中具有功能的一种选择标记，先复制该载体再将其引入宿主细胞。本领域技术人员知道许多可选择标记，其描述可见Sambrook等(同上)。

构建包含一种或多种上述组分的合适载体可采用以上引用参考文献中描述的标准连接技术。将分离的质粒或DNA片段切割、定制(tailor)并重新连接成所需形式以产生所要的质粒。为验证构建的质粒中的序列正确，可用标准技术，如限制性内切酶消化和/或用已知方法测序来分析该质粒。本领域知道可用分子克隆技术实现这些目的。技术人员熟知适合于构建重组核酸的各种克隆和体外扩增方法。足以指导技术人员进行许多克隆实验的这些技术和说明的例子可参见Berger和Kimmel,“分子克隆技术指南”，刊于“酶学方法”152学术出版社公司,圣迭戈,加利福尼亚州(Berger);和“最新分子生物学方法”；Ausubel等编,格林出版合伙公司和约翰威利父子公司合资企业(1999增刊)(Ausubel)。

本领域熟知适合用作构建本发明表达载体的起始材料的各种常用载体。对于在细菌中克隆，常用载体包括pBR322衍生的载体，如pBLUESCRIPT^TM和λ-噬菌体衍生载体。在酵母菌中，载体包括酵母菌整合质粒(如YIp5)和酵母菌复制质粒(YRp系列质粒)以及pGPD-2。可采用各种正常可购得的质粒，包括pSV2、pBC12BI和p91023以及裂解病毒载体(如牛痘病毒、腺病毒和杆状病毒)、游离型病毒载体(如牛乳头瘤病毒)和逆转录病毒载体(如小鼠逆转录病毒)实现在哺乳动物细胞中表达。

将表达载体引入所选宿主细胞的方法通常是标准方法，如本领域技术人员知道的方法。例如，通过氯化钙转化将表达载体引入原核细胞，包括大肠杆菌中，通过磷酸钙处理或电穿孔转化入真核细胞中。其它转化方法也适合。

可利用翻译偶连增强表达。该方案利用衍生自翻译系统的天然高表达基因的上游短开放读框，其安置在启动子下游，随后是核糖体结合位点、几个氨基酸密码子后是终止子。在终止密码子之前是第二核糖体结合位点，终止密码子后是启动翻译的起始密码子。此系统解决了RNA二级结构问题，得以有效启动翻译。见Squires等，(1988)J.Biol.Chem.263:16297-16302。

本发明的各种多肽可在胞内表达，或从细胞分泌。胞内表达常导致高产率。如果需要，通过进行折叠过程可提高可溶的活性融合多肽的表达量。(参见例如，Sambrook等，同上，Marston等，(1984)Bio/Technology2:800；Schoner等，(1985)Bio/Technology3:151)。在所需的多肽才细胞中分泌到周质或分泌到胞外介质中的实施方式中，所述DNA序列常连接于可切割的信号肽序列。此信号序列指引融合多肽经细胞膜易位。用于大肠杆菌中含有启动子信号序列单元的合适载体的例子是pTA1529，其具有大肠杆菌的phoA启动子和信号序列(参见例如Sambrook等，同上；Oka等，(1985)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:7212;Talmadge等，(1980)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA77:3988;Takahara等，(1985)J.Biol.Chem.260:2670)。在另一实施方式中，使此整合多肽融合于A蛋白或牛血清白蛋白(BSA)的亚序列，例如可促进其纯化、分泌或稳定性。亲和方法，例如利用结合片段的靶标可能适合。

也可将本发明的细胞壁降解多肽进一步连接于其它细菌多肽区段，如靶向片段。此法常导致高产率，因为正常的原核调控序列指导转录和翻译。在大肠杆菌中，常利用lacZ融合体表达异源蛋白质。合适的载体不难得到，例如pUR、pEX、和pMR100系列(参见例如Sambrook等，同上)。对于某些应用，纯化后可能需要切割融合多肽的外部序列。这可用本领域已知的几种方法实施，包括用溴化氢、蛋白酶、或因子Xa切割(见例如Sambrook等，同上；Itakura等，(1977)Science198:1056;Goeddel等，(1979)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA76:106;Nagai等，(1984)Nature309:810;Sung等，(1986)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:561)。可经工程改造将切割位点加入融合多肽基因的所需切割位点。

通过在一个表达载体中安置多个转录盒，或在克隆策略中对各表达载体采用不同的选择标记可在一个宿主细胞中表达一种以上重组多肽。

从大肠杆菌获得保持其N-末端完整性的重组蛋白的合适系统描述于Miller等，(1989)Biotechnology7:698-704。此系统中，感兴趣基因产生为C-末端融合于含有肽酶切割位点的酵母菌遍在蛋白基因的前76残基。在此二部分的连接处切割产生具有完整的真实N-末端残基的蛋白质。

X.纯化所需多肽

本发明的多肽可表达为胞内蛋白，或从细胞分泌的蛋白，在本发明方法中可采用此形式。例如，可在本发明方法中使用含有表达的胞内多肽或分泌多肽的细胞粗提物。

或者，可按照本领域标准方法纯化此多肽，包括：硫酸铵沉淀、亲和层析、柱层析、凝胶电泳等。(可参见Scopes(1982)“蛋白质纯化(ProteinPurification)”S-V公司,纽约;Deutscher(1990)酶学方法(MethodsinEnzymology)(第182卷)“蛋白纯化指南(GuidetoProteinPurification)”学术出版社公司，纽约)。因为至少衍生自噬菌体蛋白的降解片段因稳定而选择，纯化可利用此特性使污染物变性。基本纯的组合物优选至少有约92、95、98至99%或更高的均一性。可将此纯化的多肽用作免疫原来产生抗体，在免疫选择性纯化方法中可使用此抗体。

为促进本发明多肽的纯化，编码它们的核酸也可包含有亲和结合试剂可用的表位或“标签”，例如纯化标签的编码序列。合适表位的例子包括myc和V-5报道基因；可商品化购得的用于重组产生含有这些表位的融合多肽的表达载体(如加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(InvitrogenCarlsbadCA)的载体pcDNA3.1/Myc-His和pcDNA3.1/V5-His适合在哺乳动物中表达)。本领域技术人员知道适合连接标签与本发明多肽的其它表达载体，以及相应的检测系统，几种可商品化购得(如FLAG，新泽西州罗切斯特市柯达公司(Kodak,RochesterNY))。合适标签的另一个例子是聚组氨酸序列，它能够结合金属螯合亲和配体。通常采用六个毗连的组氨酸，虽然可采用少于或多于六个。可用作聚组氨酸标签的结合部分的合适金属螯合亲和配体包含腈基-三-乙酸(NTA)(Hochuli“用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白(Purificationofrecombinantproteinswithmetalchelatingadsorbents)”，刊于Setlow编(1990)“基因工程:原理和方法(GeneticEngineering:PrinciplesandMethods,)普莱纳姆出版社,纽约；可商品化购自加利福尼亚州圣塔克拉里塔市的恰根公司(SantaClarita，CA))。纯化标签也包含甘露糖结合结构域和淀粉结合结构域。纯化甘露糖结合结构域蛋白的方法是本领域技术人员知道的。

本领域技术人员知道适合用作标签的其它半抗原，例如，可见“荧光探针和化学物研究手册(HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals)”(第6版)分子探针公司(MolecularProbes,Inc.)，尤金，俄勒冈州)。例如二硝基苯酚(DNP)、地高辛、巴比妥钠(参见例如美国专利号5,414,085)，几种类型的荧光团可用作半抗原，如这些化合物的衍生物。已有将半抗原和其它部分连接于蛋白质和其它分子的商品化试剂盒。例如，如果所述半抗原包括硫醇，可利用异质双功能接头如SMCC将所述标签连接于捕获试剂上的赖氨酸残基。

技术人员明白，可对所述多肽的催化或功能结构域进行某种修饰而不破坏它们的生物学活性。作出某些修饰有利于将催化结构域克隆、表达或掺入融合多肽中。这种修饰是本领域技术人员熟知的，包括例如在编码催化结构域的多核苷酸二末端之一加入密码子，如在氨基末端加入甲硫氨酸以提供起始位点，或将额外的氨基酸(如聚组氨酸)置于二末端之一从而产生方便定位的限制性酶位点或终止密码子或纯化序列。

必须注意，在本文和随附的权利要求书中，单数形式”一种”和“该”包括其复数形式，除非另有明确说明。因此，例如，述及“一种细菌噬菌体”包括多个这种细菌噬菌体；述及“一种宿主细菌”包括一个或多个宿主细菌及本领域技术人员知道的等价词，等等。

提供本文讨论的出版物只是因为它们的发表在本文之前。本文并不承认本发明因在先发明而不具资格在这些出版物之前。另外，提供的出版日期可能与真实出版日期不同，这需要独立核实。引用的文献全文纳入本文作为参考。

如同每份出版物或专利申请专门而单独地纳入用作参考一样，本说明书引用的所有出版物和专利申请纳入本文作参考。

虽然出于清楚理解的目的上文已借助说明和实例描述了本发明的某些细节，但本领域普通技术人员不难明白借鉴本发明的教导可作出某些改变和改进，而不脱离随附权利要求书的思路和范围。

实施例

I.全长ORF56

登录号YP_024486报道了在葡萄球菌噬菌体K中发现的推定ORF56。根据此报告，可从合适的噬菌体来源用PCR扩增全长的噬菌体KORF56。采用的基因特异性引物是：正向引物含NdeI位点，反向引物含XhoI位点，将该PCR产物作为NdeI-XhoI插入物克隆到pET21a载体中处于T7启动子控制下。此克隆标记为pGMB617，含有对应于预计产物1-808位氨基酸的编码区序列(SEQIDNO:1)，应产生约91kDa的蛋白质。

A.CHAP结构域

描述登录号YP_024486的报道鉴定了描述为半胱氨酸-组氨酸依赖性氨基水解酶/肽酶结构域(CHAP)的结构域。参见例如Rigden等.(2003)TrendsBiochem.Sci.28:230-234。知道某些基因包含溶解活性CHAP结构域，和位于此编码多肽N附近区域的结构域。CHAP结构域位于推定ORF56的C附近区域，应对应于指定的氨基酸690-805。

B.降解产物

然而，产生和纯化后，经PAGE观察存在实质量的约50kDa和约为23kDa的蛋白产物。这些蛋白看来代表了最初表达的91kDa蛋白的稳定降解产物。

II.葡萄球菌靶细菌

首先测试纯化的蛋白构建物对金黄色葡萄球菌分离株的CFU(菌落形成单位)的降低情况。再测试某些构建物对表皮葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、肉葡萄球菌分离株的CFU的降低情况。看来与许多噬菌体的感染选择性相比，所观察到的溶解活性的菌株特异性较差。因此，有可能本文所述的溶解活性也具有多种菌株特异性，甚至更宽跨越许多菌属或对其它功能和结构类型的细菌，如所有革兰阳性菌，甚至包括某些或所有革兰阴性菌。此外，此溶解活性对于革兰阳性与革兰阴性菌之间的共同结构特征可能是通用的。例如，革兰阴性内部细菌细胞壁(Gram-negativeinnerbacterialcellwall)可能与革兰阳性菌细胞壁有某些特征相同。

III.截短构建物

描述为假设ORF56的区域包含唯一的内部PstI位点，利用此位点不难产生一构建物，该构建物可提供约57kD的SEQIDNO:1氨基酸297-808的蛋白质C末端区域。从上述全长ORF56克隆切下编码读框的C末端部分的PstI-HindIII片段。将PstI-HindIII片段克隆到pRSETA载体中产生pRSETA-57kDa(pGMB599)ORF56克隆构建物。将从其切下的NdeI-HindIII片段作为NdeI-HindIII克隆到pET21a载体中产生pGMB612。这个克隆表达57kDa蛋白(预期的)及约50kDa和约23kDa的蛋白。出乎意料的是，这些较小的蛋白明显是大小与构建物表达的全长91kDa蛋白大致相同的稳定的降解产物。

构建DNA序列产生对应于SEQIDNO:1大致氨基酸363-808的推定ORF56区域的50kDaC末端部分。利用合适是特异性引物产生PCR扩增产物。该PCR产物在正向引物中含NdeI位点，在反向引物中含XhoI位点，将得到的NdeI-XhoI片段克隆到pET21a载体中以掺入NdeI-XhoI插入物。此产物标记为pGDC060/061。此构建物表达50kDa蛋白(预期的)和约23kDa蛋白。出乎意料的是，这些较小的蛋白明显仍是大小与全长91kDaORF56蛋白和截短的57kDaORF56蛋白构建物观察到的大致相同的稳定的降解ORF56产物。

制作DNA构建物以产生对应于约Met-(氨基酸603至808)的ORF56蛋白的23kDaC末端部分。编码23kDaC末端区的ORF56的DNA序列经PCR扩增，从而在正向引物中引入ATG起始密码子。将此PCR产物作为NdeI-XhoI片段克隆到pET21a中产生标记为pGDC070的构建物。此构建物表达的蛋白在SDSPAGE中约为27kDa，另一种蛋白约为23kDa。4℃贮存，这二种形式收缩成一条约23kDa的条带。

制作DNA构建物以产生约对应于氨基酸620至808的ORF56蛋白的19kDaC末端片段。用特异性引物扩增与其对应的DNA序列，然后作为NdeI-XhoI插入物克隆到pET21a中。产生的构建物命名为pGDC089。此构建物表达的蛋白在SDSPAGE中约为21kDa，与上述构建物观察到的稳定降解产物大致相同。

这些不同的构建物提示，91kDa全长蛋白质产物在所用条件下不是特别稳定。出现了二种相当稳定的降解产物，第一种是50kDa蛋白，另一是23kDa蛋白。降解是来自快速外蛋白酶(exoprotease)还是内蛋白酶(endoprotease)的活性，或是二者的组合尚不清楚。然而，似乎确实是不同的构建物降解成稳定的23kDa截短ORF56蛋白。

IV.纯化蛋白的抗微生物活性

利用测定金黄色葡萄球菌培养物CFU(菌落形成单位)降低的试验检测各种ORF56截短物和/或降解产物的溶解活性。在所有情况下，ORF56的截短或降解产物均显示明显能够减少溶液中的金黄色葡萄球菌CFU，提示这些构建物和稳定的降解产物都保留了对细胞壁的溶解活性。所有这些构建物的共同特征是C末端区域包含CHAP结构域。

V.待检测溶解活性的含CHAP结构域的候选同源基因

ORF56杀菌活性与C-末端CHAP结构域相关。因此，可用BLAST检索鉴定测序噬菌体基因组中其它的“溶解”活性。这些“溶解”区段的其它有用来源包括参与噬菌体基因组穿透进入宿主的组分，如衍生自噬菌体用于附着靶宿主的尾或结合组分，或衍生自前噬菌体或脓菌素样结构。此外，所谓的“溶解”活性可以鉴定在噬菌体尾基因盒的编码区段中，例如根据特征性基因组成。

利用CHAP结构域或其它特征作了研究。具体地说，CHAP结构域处于ORF的C-末端区域的那些基因更可能与此活性相关。特别感兴趣的是金黄色葡萄球菌噬菌体K、Twort、和G1的含CHAP结构域的蛋白。

VI.嵌合构建物

制备了将作用于靶葡萄球菌菌株细胞壁的催化片段与结合细胞表面物质的靶向片段的许多融合构建物。此结合部分能选择性定位在合适靶细菌的表面，催化活性则作用于附近的底物位点。可掺入接头以拓宽底物可接近的区域(活性位点浓度高的区域)。可利用能识别高度可接近、高表达的或选择性细胞表面标记的不同结合部分。在宿主细菌衍生的蛋白中可发现包含革兰阴性菌细胞壁标记结合区段，在革兰阴性菌用于控制细胞壁结构的蛋白中可发现类似革兰阴性菌细胞壁结合区段。宿主的特异性噬菌体也应包含能识别和结合它们各自宿主细胞壁的多肽。低等到高等真核细胞来源的肽聚糖识别蛋白(PGRP)和与特定细菌细胞壁具有结合亲和力的其它结合蛋白(优选生理条件和形式)合适的结合活性片段的来源。在某些情况下，可采用多个不同的部分。选择的接头应能让其它片段适当折叠但不会相互干扰，同时能提供相应底物附近的局部催化剂浓度升高的范围。催化片段能靶向优选的底物，多个片段可靶向靶细菌上发现的不同连接键。

具体地说，为寻址革兰阳性菌靶标，结合片段优选来源于能识别细菌生理“展示”的胞外细胞壁的蛋白质。因此，识别革兰阴性菌细胞壁的蛋白质包括能识别这些感染物质的免疫系统组分。细胞壁降解结构域的合适来源是能感染革兰阴性宿主的噬菌体尾结构。同样，对于革兰阳性菌，结合结构域可衍生自革兰阳性感染噬菌体的尾结构，或对于革兰阴性菌，衍生自PGRP。细胞壁降解活性可衍生自感染革兰阴性宿主的尾结构。就分支杆菌、孢子菌或其它原核生物或相关生物的细胞壁结构相同的程度而言，也可用这些物质调节它们的生长。

此外，由于感染特定宿主的噬菌体选择过程，靶向生活在极端条件中、嗜热、嗜盐、高度氧化或反应条件、极端pH、高度蛋白溶解环境等中的宿主的噬菌体是有用的催化或结合片段的特别感兴趣的来源。接触细胞外部极端环境的蛋白质(倾向于进入)应具有高度演化的特征，从而能在相对安全的胞内环境之外存活。因此，选择结构域的结构特征对不适宜条件的稳定性从而能提供稳定性更好的产物。这种产物应具有良好的贮存性能，选择具有良好的药理学保存和储存期的产物，并可提供简单的纯化分离手段。

制备的构建物包含ORF56序列的各种区段(见GeneID2948023,YP_024486,YP_024486.1);其中16KDa片段对应于氨基酸669-808;19KDa片段对应于氨基酸629-808;13KDa片段对应于氨基酸691-808；ORF56结合片段对应于氨基酸629-690。葡萄球菌溶葡萄球素(lss;AAB53783)区段包含的结合区段对应于氨基酸395-493;催化(lys-lys切割)片段对应于氨基酸248-394。L54a酰胺酶(AAW38858;YP_185281)结合片段对应于氨基酸76-484。LytM肽酶(L77194;AAV62278.1)催化片段对应于氨基酸223-322。噬菌体phi11的酰胺酶(NP_803306;AAL82281;参见AF424781.1的40893-42365)片段对应于氨基酸391-490。这些构建物由T7启动子驱动。

制备了许多融合构建物：构建物1含有序列Met-(16KDaORF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素结合片段)，其产生的蛋白质称为嵌合体128(SEQIDNO:4)。构建物2含有序列(19KDaORF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素结合片段)。构建物3含有序列(13KDaORF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素结合片段)。构建物4含有序列(16KDaORF56催化片段)-Leu-Glu-(L54a酰胺酶结合片段)。构建物5含有序列Met-(LytM肽酶催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素结合片段)。构建物6含有序列Met-(溶葡萄球菌素催化片段)-(ORF56结合片段)。构建物7含有序列(LytM肽酶催化片段)-构建物1，它含有二个催化结构域(LytM肽酶，ORF56)。构建物8含有序列Met-16KDaORF56催化片段-Leu-Glu-(phi11酰胺酶结合片段)。同样，可采用其它来源的其它催化或结合片段，或可产生它们的变体并优化所需特征。

在相应宿主中产生构建物1，宿主裂解包括超声步骤。类似方法适用于其它构建物。通过硫酸铵(20-50%)沉淀、Q-500柱层析(pH7.5)、CM纤维素层析(pH6.0)，用200mMNaCl洗脱和凝胶过滤纯化粗制的裂解液。用银染色估计此产品的纯度>98%。

VII.活性检测

用一组30个类型不同的金黄色葡萄球菌菌株(选择spa、Agr或Mec类型，包括MLST和甲氧西林耐药性)测试构建物1产品，嵌合体128。嵌合体128对这些测试菌株均有活性，观察到点样1.5微克蛋白有菌苔抑制。利用约1E8CFU的MRSA菌株B911，50微克全长ORF56蛋白使CFU降低约2log单位，而1.5微克嵌合体128将CFU降低约5log单位(10,000倍)。35℃，在含1%BSA的MuellerHinton肉汤中以5E5细胞/ml培育各种代表性金黄色葡萄球菌菌株(见Kusuma和Kokai-Kun(2005)“检测不同金黄色葡萄球菌菌株对溶葡萄球菌素敏感性的四种方法比较(ComparisonoffourmethodsfordetermininglysostaphinsusceptibilityofvariousstrainsofStaphylococcusaureus)”Antimicrob.AgentsChemother.49:3256-263;PMID:16048934)，菌落静置16小时。嵌合体128的最低抑制浓度(MIC)约为1-10微克/ml。测试金黄色葡萄球菌COL株中首次接触嵌合体128的存活菌，发现存活菌再次接触此蛋白时敏感。测试金黄色葡萄球菌菌株B911的溶葡萄球菌素耐受变体显示99.9%的细胞对1.5微克嵌合体128敏感。

4℃，嵌合体128在Tris缓冲液中稳定至少一个月，室温(约25℃)稳定约四周，37℃约一天。某些凝胶和液体制剂的稳定期更长。

用菌苔抑制试验、酶谱试验、菌落形成单位(CFU)降低试验检测了其它嵌合构建物。菌苔抑制试验是定性试验，其中将测试蛋白点在细菌菌苔上，检测生长抑制区。杀菌活性对应于菌苔抑制区；没有活性则对应于无可见的抑制区。酶谱试验也是定性试验，其中用高压灭菌的靶细菌细胞浸渍SDS-PAGE凝胶，对噬菌体制品作凝胶电泳。使凝胶上的蛋白质原位复性然后作用于细胞壁组分，用亚甲基兰染料染色凝胶后产生清晰的“溶解”区。参见例如Lepeupl等，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64:4142-428,PMID:9797258。活性对应于深兰色背景所衬托的可见清晰区。CFU降低试验是定量试验，其中用杀伤百分比衡量活性。将培养的细菌与嵌合蛋白混合后接种在LB培养基上。活性对应于细胞数至少减少99.9%。无活性对应于细胞数不减少。每次试验设置合适的阳性和阴性对照。许多嵌合蛋白的结果见表1。许多含ORF56胞壁溶解结构域，也称为催化结构域(CD)的TAME-CBD蛋白证明有活性。含溶葡萄球菌素CD和ORF56结合结构域的TAME-CBD蛋白也具有杀菌活性。

表1

TAME保守结构域的鉴定

我们开发了鉴定有尾噬菌体基因组中TAME基因的全面方案。我们根据各TAME中存在的与细菌细胞壁结合相关的保守结构域(CD)、结合结构域(CBD)、或降解、胞壁溶解结构域(MD)来寻找候选TAME基因。图1是我们采用以下检索关键词串通过网站ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml检索NCBICDD(保守性结构域数据库)得到的这类结构域的示范性名单：溶液酶体或内溶素或溶液素或胞壁酸酶或胞壁酰胺酶或氨基葡萄糖苷酶或胞壁素或肽聚糖或细胞壁或溶解或酰胺酶或转糖基酶或自溶素或水解酶。技术人员知道可采用不同的检索术语实施各种检索方案。也可检索其它数据库。

然后手工检查检索到的产物与细菌细胞壁结合，维持和降解的相关性。与细菌胞壁结合功能(细胞结合结构域简写为CBD)或降解功能(胞壁溶解结构域简写为MD)相关的保守性结构域的非限制性名单见下文。任何一种以下所列的保守结构域可与本发明的杀菌嵌合TAME-CBD蛋白联用。

pfam05382:酰胺酶_5:细菌噬菌体肽聚糖水解酶。已证明此家族的至少一个成员，来自肺炎球菌噬菌体Dp-1的Pal蛋白是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。根据此酶和其它肺炎球菌肽聚糖水解酶的已知模型结构，其活性位点应在N-末端结构域，而其C-末端结构域能结合细胞壁磷壁酸的胆碱残基。此家族看来与pfam00877.[pfam05382|68934]MD相关。

pfam01510:酰胺酶_2:N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。此家族包括具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的锌酰胺酶EC:3.5.1.28。此酶的结构域切断细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酰基与L-氨基酸之间(偏爱D-乳酰基-L-Ala)的酰胺键。已知噬菌体T7的这种结构，其显示有二个保守性组氨酸是锌结合区[pfam01510|65318].MD。

pfam01520:酰胺酶_3:N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。此酶的结构域切断细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酰基与L-氨基酸之间的酰胺键[pfam01520|65327].MD。

pfam00912:转糖基:转糖基酶。此青霉素结合蛋白是分别由N-和C-末端的转糖基酶和转肽酶组成的双功能蛋白。转糖基酶结构域催化胞壁质聚糖链的聚合。[pfam00912|64762].MD。

cd00737:内溶素_自溶素:分别在病毒和细菌中发现了内溶素和自溶素。真细菌的双链DNA噬菌体能联用内溶素或胞壁溶解酶与穿孔素(hollin)(小的膜蛋白)来降解细菌细胞壁中的肽聚糖。类似地，细菌产生的内溶素有利于其细胞壁异质聚合物肽聚糖的生物合成和细胞分裂。内溶素和自溶素酶均能切割肽聚糖的乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β1,4-糖苷键[cd00737|29561].MD。

pfam07486:水解酶_2:细胞壁水解酶。这些酶涉及细胞壁水解，大多广泛分布于枯草芽孢杆菌中。例如枯草芽孢杆菌SCLE、孢子菌的皮层(cortex-)溶解酶在孢子形成期间表达为无活性形式，然后沉积在细胞外皮层中。发芽期间此酶被激活而水解皮层。部分多余的细胞壁水解酶cwlJ执行类似的作用。这些酶可以是酰胺酶或肽酶[pfam07486|70935].MD。

pfam05257:CHAP结构域。此结构域对应于酰胺酶功能。许多这些蛋白参与细菌的细胞壁代谢。此结构域见于双功能大肠杆菌酶的N-末端，其功能是谷胱甘肽亚精胺(glutathionylspermidine)酰胺酶EC:3.5.1.78.[pfam05257|68816]MD，ORF56提供CHAP结构域的一个例子。

pfam03562:MltA:MltA特异性插入结构域。此种β屏障结构域见于插入MltA(胞壁质降解转糖基酶)中。此结构域可能参与肽聚糖结合。[pfam03562|67195].MD。

pfam01471:PG_结合_1:推定的肽聚糖结合结构域。此结构域包含三个α螺旋。此结构域见于参与细菌细胞壁降解的各种酶的N或C末端。此结构域可能具有通用的肽聚糖结合功能。此家族见于基质酶催化结构域的N-末端。[pfam01471|65280]CBD

pfam08823:PG_结合_2:推定的肽聚糖结合结构域。此家族可能是肽聚糖结合结构域.[pfam08823|72246]CBD。

pfam06737:转糖基酶:转糖基酶样结构域。此蛋白家族很可能起着转糖基酶作用，其与pfam00062和pfam01464相关。其它家族与此家族不大匹配，包括已知的活性位点残基[pfam06737|70216].MD。

pfam06267:DUF1028:功能未知的家族(DUF1028)。功能未知的细菌和古(细菌)蛋白家族。某些成员与C-末端肽聚糖结合结构域相关，可能参与肽聚糖代谢[pfam06267|69772].CBD和MD。

pfam01476:LysM:LysM结构域。此LysM(溶素基序)结构域长约40个残基。见于参与细菌细胞壁降解的各种酶中。此结构域具有通用的肽聚糖结合功能。已知此结构域的结构。[pfam01476|65285].CBD

smart00701:PGRP:与细菌噬菌体T3溶菌酶同源的动物肽聚糖识别蛋白。已证明该细菌噬菌体分子(但不是其蛾同源物)具有N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶活性。此家族的一成员Tag7是细胞因子[smart00701|47970].CBD

COG2951:MltB:膜结合的溶胞壁质转糖基酶B[细胞包膜生物发生，外膜][COG2951|32773].MD

COG2821:MltA:膜结合的溶胞壁质转糖基酶B[细胞包膜生物发生，外膜][COG2821|32649].MD

COG0741:MltE:可溶性溶胞壁质转糖基酶和相关的调节蛋白(某些含有LysM/侵染素结构域)[细胞包膜生物发生，外膜][COG0741|31084].MD

cd00736:细菌噬菌体_λ_溶菌酶：细菌噬菌体λ的溶菌酶象其它溶菌酶一样，能水解N-乙酰胞壁酸(MurNAc)与N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之间的β-1,4-糖苷键。但不象其它溶菌酶，细菌噬菌体λ在切割肽聚糖后不产生还原端，而是利用同一MurNAc残基的6-OH以产生1,6-脱水胞壁酸末端残基，因此是溶解性转糖基酶。通过大肠杆菌的溶解性转糖基酶的作用在细菌肽聚糖中形成同样的1,6-脱水键。然而它们的结构不同[cd00736|29560].MD

cd00118:LysM:溶素结构域，见于参与细菌细胞壁降解的各种酶中。此结构域具有通用的肽聚糖结合功能[cd00118|29017].CBD

pfam08230:Cpl-7:Cpl-7溶菌酶C-末端结构域。此结构域最初见于肺炎链球菌噬菌体Cp-7编码的Cpl-7溶菌酶的C-末端部分[pfam08230|71664]CBD和MD

pfam03411:肽酶_M74:青霉素不敏感的胞壁质内肽酶[pfam03411|67049]22:pfam01473CW_结合_1:推定的细胞壁结合重复。这些重复的特征是保守的芳族残基和甘氨酸，见于许多蛋白的多重串联拷贝中。CW重复长20个氨基酸残基。葡萄球菌噬菌体CP-1溶菌酶中的这些重复序列可能负责特异性识别含胆碱的细胞壁。类似但更长的重复见于口腔链球菌的葡糖基转移酶和聚糖结合蛋白中，显示其参与葡聚糖结合以及肠膜样明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的相关葡聚糖蔗糖酶。艰难梭菌(Clostridiumdifficile)和其它梭菌的毒素中也有此重复，虽然其配体还不清楚。[pfam01473|65282]CBD

pfam01464:SLT:转糖基酶SLT结构域。此家族是pfam00062的远亲。成员见于噬菌体的II型、III型和IV型分泌系统(综述).[pfam01464|65274].MD

pfam00062:Lys:C-型溶菌酶/α-乳清蛋白家族。α-乳清蛋白是乳糖合酶的调节亚基，能将半乳糖转移酶对N-乙酰葡糖胺的特异性改变为对葡萄糖特异。C-型溶菌酶是分泌的细菌溶解酶，能切割细菌细胞壁的肽聚糖。其结构是多个结构域、混合性α与β折叠，含四个保守的二硫键[pfam00062|63951].MD

COG5632:COG5632:N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶[细胞包膜生物发生，外膜][COG5632|35191MD

COG5479:COG5479:未表征的可能参与肽聚糖生物合成的蛋白[细胞包膜生物发生，外膜][COG5479|35038].CBD和MD

COG4623:COG4623:预计的可溶溶解性转糖基酶，与ABC-型氨基酸结合蛋白融合[细胞包膜生物发生，外膜][COG4623|34243].CBD和MD

COG3863:COG3863:细胞壁相关水解的未表征的远亲[COG3863|33653].CBD和MD

COG3773:SleB:参与孢子菌发芽的细胞壁水解酶[细胞包膜生物发生，外膜][COG3773|33568].CBD和MD

COG3770:MepA:胞壁质内肽酶[细胞包膜生物发生，外膜][COG3770|33565].MD

COG3409:COG3409:包含推定的肽聚糖结合结构域的蛋白[细胞包膜生物发生，外膜][COG3409|33215].CBD

COG3023:ampD:N-乙酰基-脱水胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶[细胞包膜生物发生，外膜][COG3023|32839].MD

COG2247:LytB:推定的细胞壁结合结构域[细胞包膜生物发生，外膜][COG2247|32428].CBD

COG1215:COG1215:糖基转移酶，可能参与细胞壁生物合成[细胞包膜生物发生，外膜][COG1215|31408].CBD

COG0860:AmiC:N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶[细胞包膜生物发生，外膜][COG0860|31201].MD

COG0791:Spr:细胞壁相关水解酶(侵染素相关蛋白)[细胞包膜生物发生，外膜][COG0791|31134].MD

cd02848:壳多糖酶_N_末端：壳多糖酶N-末端结构域。壳多糖酶能水解丰富的天然生物聚合物几丁质，产生较小的几丁-寡糖。几丁质由通过β-1,4-糖苷键连接的多个N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)残基组成，是真菌细胞壁和节肢动物外骨骼的重要结构元件。根据水解几丁质的模式，将壳多糖酶分类为随机、内切或外切壳多糖酶，根据序列标准，壳多糖酶属于葡糖基水解酶家族18和19。壳多糖酶的N-末端可能与免疫球蛋白和/或III型纤连蛋白超家族有关。这些结构域在N-末端或C-末端连接于不同类型催化结构域，可能参与同质二聚/四聚/十二聚体相互作用。此家族成员包括α淀粉酶家族、唾液酸酶、半乳糖氧化酶、纤维素酶、纤维素透明质酸溶液酶、壳二糖酶和壳多糖酶[cd02848|30335].MD

cd02847:壳二糖酶_C_末端：壳二糖酶C-末端结构域。壳二糖酶(AKAN-乙酰氨基葡萄糖苷酶)能消化作为真菌细胞壁和节肢动物外骨骼的重要结构元件的几丁质中N-乙酰葡糖胺(NAG)寡聚物的β-1,4-糖苷键。认为它是通过酸碱反应机制加工，其中一个蛋白的羧酸盐起着催化酸的作用，而亲核基团是在底物辅助反应中保留异头构型的糖的极性乙酰胺基。壳二糖的C-末端可与免疫球蛋白和/或III型纤连蛋白超家族有关。这些结构域在N-末端或C-末端连接于不同类型的催化结构域，可能参与同质二聚/四聚/十二聚体相互作用。此家族成员包括α淀粉酶家族、唾液酸酶、半乳糖氧化酶、纤维素酶、纤维素透明质酸溶液酶、壳二糖酶和壳多糖酶[cd02847|30334].MD

cd00735:细菌噬菌体_T4-样_溶菌酶：细菌噬菌体T4-样溶菌酶能水解真核细胞壁肽聚糖异质聚合物中N-乙酰胞壁酸(MurNAc)与N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之间的β-1,4-糖苷键。成员包括各种细菌噬菌体(T4、RB49、RB69、Aeh1)以及网柄菌属(Dictyostelium).[cd00735|29559].MD

cd00254:LT_GEWL:溶解性转糖基酶(LT)和鹅蛋白溶菌酶(GEWL)结构域。成员包括细菌中的可溶性和不溶的膜结合LT，细菌噬菌体λ的LT以及真核“鹅型”溶菌酶(GEWL)。LT能催化切断N-乙酰胞壁酸(MurNAc)与N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之间的β-1,4-糖苷键。如“鹅型”溶菌酶那样。然而除此之外，它们也能与同一胞壁酸残基的C6羟基形成新的糖苷键。[cd00254|29556].MD

cd00119:LYZ1:C-型溶菌酶(1,4-β-N-乙酰胞壁酰胺酶LYZ)和α-乳清蛋白(乳糖合酶B蛋白，LA)。它们进化关系较近，四级结构类似，然而它们的功能完全不同。这些溶菌酶具有基本的溶菌功能；能水解原核细胞壁的肽聚糖和转糖基作用。LA是在哺乳期间专门表达在乳腺中钙结合金属蛋白。LA是乳糖合酶的调节亚基。LA能结合乳糖合酶、半乳糖转移酶的催化组分，改变此糖基转移酶的底物接受特异性，促进乳糖的生物合成[cd00119|29018].MD

smart00047:LYZ2:溶菌酶亚家族2；这些真细菌酶是真细胞溶菌酶的远亲[smart00047|47396].MD

pfam02016:肽酶_S66:LD-羧基肽酶。胞壁酰-四肽羧基肽酶能水解肽聚糖四肽部分中的氨基二羧酸(di-basicaminoacid)与C-末端D-丙氨酸之间的肽键。切割L-与D-氨基酸之间的连接键。此活性在胞壁质再循环中起作用。此家族也包括小菌素(microcin)c7自身免疫力蛋白。此家族对应于Merops家族S66.[pfam02016|65774].MD

pfam02324:葡糖基_水解酶_70:糖基水解酶家族70。此家族成员属于糖基水解酶家族70。糖转移酶或蔗糖6-糖基转移酶(GTF-S)能催化蔗糖的D-吡喃葡萄糖单元转移到受体分子上，EC:2.4.1.5。此家族大致对应于此酶的N-末端催化结构域。此家族成员也包含推定的细胞壁结合结构域pfam01473，其对应于C-末端聚糖结合结构域[pfam02324|66049].MD

pfam06347:SH3_4:细菌SH3结构域。此家族由几种功能未知的假设细菌蛋白组成。它们都由SH3-样结构域构成[pfam06347|69844].CBD

pfam08239:SH3_3:细菌SH3结构域[pfam08239|71673].CBD

pfam08460:SH3_5:细菌SH3结构域[pfam08460|71889].CBD

COG4991:COG4991:包含细菌SH3结构域同源物的未表征的蛋白质[COG4991|34596].CBD

COG3103:COG3103:SH3结构域蛋白[信号转导机制][COG3103|32917].CBD

smart00287:SH3b:细菌SH3结构域同源物;[smart00287|47616].CBD

pfam01551:肽酶_M23:肽酶家族M23。此家族的成员是特异性广泛的锌金属蛋白酶。肽酶家族M23包括在此家族中，它们是Gly-Gly内肽酶。肽酶家族M23也是内肽酶。此家族还包括某些细菌脂蛋白，已证明没有蛋白溶解活性。此家族也包括白细胞产生的趋化因子2(LECT2)蛋白。LECT2是认为与肝细胞生长有关的肝特异性蛋白，虽然其确切的功能未知[pfam01551|65358].MD

扫描噬菌体基因组中TAME候选物的方法

目前的方法是手工检查各噬菌体的基因组，虽然将来可采用CDD进行自动扫描[NCBI中的保守性结构域数据库；或其等价库]。逐步的过程见下表，用葡萄球菌噬菌体11作为例子。

1.在合适的数据库[例如Genbank噬菌体基因组数据库(ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/phg.html)]中鉴定噬菌体基因组中。选择其参比号(NC编号在屏幕右边；噬菌体11为NC_004615).[此说明是依据使用迄今为止的此数据库；随着观/感设计(look/feeldesign)的演化，此说明变成“示范性”]

2.从基因组观察窗口选择蛋白编码特征[或其功能等价物](此例中为53种蛋白质)。打开列出所有预测的基因组蛋白产物的窗口，与全部预测的蛋白质名单。此例中，所述基因产物已被广泛注释；然而，此法不需要预先注释，而是自动鉴定潜在的ORF。

3.下一步是检查各预测蛋白质产物中是否存在一种上述CD[保守结构域；即细胞结合结构域或胞壁质溶解结构域]。开始此种手工检查时应用预测的最大蛋白质并沿大小清单向下处理。以噬菌体11为例[例如]，最大的ORF是phi11_45，预计其包含636个氨基酸。最简单的方法是选择7个数字基因身份(digitGeneID)。这获得ORF的概况，包括显示其在噬菌体基因组中定位的ORF图象展示。通过选择此图象展示，显示下拉式菜单。如果Orf中有任何CD，一种选择是保守性结构域。通过选择此选项，将以图象形式展示此ORF以及在其序列中检测到的CD身份和定位。以phi11_45为例，没检测到CD。对下一种预测最大的蛋白质重复此方法；此例中是phi11_44，633氨基酸。此ORF中有二个CD，但二者都不属于图1所示名单中。此例中，下一个ORF是phi11_49。此ORF最后产生两个CD，CHAP和Lyz2，二者见图1。理想地，对所有大于150个氨基酸的蛋白均应重复此过程。总之，第二ORF将在图1中至少命中一次。以phi11为例，发现ORFphi11_53包含有CHAP、Ami2和SH3_5结构域。

分析了整个预测ORF的清单后，共鉴定到二个ORF：TAME和溶解性内溶素。用几种标准选择此TAME。首先，TAME通常是含有图1所列CD的最大ORF。以噬菌体11为例，TAME是phi11_49，大于内溶素phi11_53(酰胺酶)。第二，如果鉴定到噬菌体尾蛋白则可利用其构型标准。TAME分组为含尾基因。以噬菌体11为例，TAME基因phi11_49在同一条(+)链中毗连于尾纤维蛋白基因phi11_50，位于尾基因的下游，包含带(tape)测量基因phi11_42。此内溶素(此例是酰胺酶；phi11_53)常常毗连或靠近穴蛋白(此例为phi11_52)。

目前葡萄球菌噬菌体中的TAME

将此法应用于图1中可得的葡萄球菌噬菌体。此图中列出了各细菌噬菌体的候选TAME(最右列是它们的GI编号)；在各噬菌体相关的行中，列出了用来鉴定TAME的CD。

一旦鉴定到细胞结合结构域和胞壁质溶解结构域，技术人员可利用本说明书中的内容和标准分子生物学技术产生TAME-CBD蛋白。可用本文所述的试验，如菌苔抑制试验、酶谱试验、菌落形成单位(CFU)降低试验检测大量TAME-CBD蛋白的杀菌功能。

在公开可用的数据库中披露了许多噬菌体基因组。技术人员可将对可用于嵌合性TAME-CBD蛋白中的葡萄球菌噬菌体的保守结构域CBD和MD的鉴定延伸至鉴定感染其它细菌的噬菌体，如感染链球菌和炭疽杆菌(Anthrax)菌株的噬菌体的保守性结构域CBD和MD。

非正式序列表

SEQIDNO:1

1:YP_024486.报道，假设的蛋白质...[gi:48696445]:

1mrrirrpkvrieivtddntftlrfedtrdyngdefgakllgfqtknsmeddssvfqinma

61gdtywdklvmandiirifitpnddpndkegkqerliqvgmvsqvskvgsygndqtqfrit

121gqsfvkpfmkfglgviqevqavlpevgwlidgdgdnevkftgssahevmtgiirrfipym

181kynytektyntidnyldyddlsswdefekltevsaftnfdgslkqlmdmvtarpfnelff

241knsektpgkaqlvlrktpfnptewraldmikvptedfieedvgksdvetysiftatpagm

301lkelngdvfskpqfhpeltdrygytkfeveniylstksgsatedsdssgddngtergtys

361kimkdlsnygrdniskgidkytsklsskyknlkkaqakkiiekfvkegkvtekeyekitg

421nkvddeltsdnrpkltkdklksilkekfktqddfnnskkkkkaktdalkelttkyrfgnk

481thattlldeyikykgeppndeafdkylkaiegvsnvatdtgsdasdsplvmfsrmlfnwy

541hgnpnfyagdiivlgdpkydlgkrlfiedkqrgdtwefyiesvehkfdykqgyyttvgvt

601rglkdailedgkgsphrfaglwnqssdfmgglmgedtskelkekgvaekqssgdkdggsd

661sggaqdggsldslkkyngklpkhdpsfvqpgnrhykyqctwyaynrrgqlgipvplwgda

721adwiggakgagygvgrtpkqgacviwqrgvqggspqyghvafvekvldggkkifisehny

781atpngygtrtidmssaigknaqfiydkk

SEQIDNO:2

此区段中的ORF似乎从58185至60611:

58021ctggagacattatcggaggaagaattagagaagttctagatagtaacatggatatctttg

58081caaatgaacataagagaagttattagtaattttgtattgacacaagagtagtatcatagt

58141atactactcttatacatataaaaaataaaaggaagtatgtgtat

58185atgcgtagaataagaa

58201gacctaaggtaagaatagaaatagttacagatgataatacatttacattgagatttgaag

58261atacacgagactataatggtgatgagtttggagctaaacttttaggattccaaactaaaa

58321actctatggaagatgatagttcagttttccaaataaatatggcaggagatacttattggg

58381ataagctagttatggctaatgatatcataagaatatttattacacctaatgatgacccta

58441acgataaagaaggaaaacaagaacgacttatccaggtaggtatggtttctcaagtatcaa

58501aagtaggtagttacggtaatgaccaaactcaatttagaataacaggtcaatcttttgtaa

58561aaccttttatgaaatttggattaggcgttattcaggaagttcaagctgtattacctgaag

58621taggttggcttattgatggtgatggagataatgaagtaaaatttactggtagctcagctc

58681atgaagtaatgactggtattatacgtagatttataccttatatgaaatataactatactg

58741aaaaaacatataatacaattgataactatcttgattatgatgatttaagtagttgggatg

58801agtttgaaaaacttacagaagtttcagcctttactaattttgatgggtcattaaaacagt

58861taatggatatggtaacagctagaccttttaatgagttattcttcaaaaattcagaaaaaa

58921cacctggaaaggctcaacttgtattaagaaagaccccttttaatcctactgagtggagag

58981ctttagatatgattaaagtacctactgaggattttatagaagaggatgtaggtaaaagtg

59041atgtagagacatattctatatttacagcaacacctgcaggtatgttgaaagagcttaacg

59101gtgatgtattttctaaaccacaattccaccctgaattaactgatagatatggttatacta

59161aatttgaagtagaaaatatttatcttagtacaaaatcaggttcagctactgaggattcag

59221attcttcaggtgatgataatggcacagaacgaggaacttattctaaaattatgaaagatt

59281taagtaactatggaagagataatatatctaaaggtatagataagtatacaagtaaattat

59341cttcaaaatataaaaacttaaaaaaagcccaagctaaaaaaattatagagaagtttgtta

59401aagaaggaaaagtaacagaaaaagaatatgaaaaaataacaggtaataaggtagatgatg

59461aattaacatcagataacagaccgaagttgacaaaagataaattaaagagtatactaaaag

59521agaagtttaaaacacaagatgattttaataattctaagaaaaagaaaaaagctaagacag

59581atgcacttaaagaattgacaactaaatatcgttttggtaataaaacacatgctacaactt

59641tattagatgaatatattaaatataaaggagagccacctaacgatgaggcttttgataaat

59701atcttaaagctattgaaggtgttagtaatgtagctacagacacaggttcagatgcaagtg

59761atagccctttagttatgttttctagaatgctatttaattggtatcatggtaaccctaact

59821tctatgcaggagatattattgttttaggagaccctaagtatgacctaggtaaaagattat

59881ttattgaagataagcaacgaggagacacttgggagttctatattgaatctgtagaacata

59941aattcgattataaacaggggtattatacaactgtaggagtaactagaggtttaaaagacg

60001ctattctagaagatggtaaaggtagtccgcatagatttgcaggattatggaatcaatcat

60061cagacttcatgggaggtcttatgggtgaagatacttctaaagaacttaaagaaaaaggtg

60121tagcagagaaacaaagtagtggagataaagatggtggttctgatagtggtggagctcaag

60181atggtggctctttagattcacttaaaaaatataacggcaaacttcctaagcatgacccaa

60241gttttgttcaacctggtaaccgacattataagtatcagtgtacatggtatgcttataata

60301gaagaggtcaattaggcatacctgtgcctttatggggggacgccgccgactggataggtg

60361gtgctaaaggagcaggttatggtgtaggtagaacacctaaacaaggtgcttgtgttatat

60421ggcaaagaggagttcaaggaggtagcccacaatatggtcacgtagcgtttgtagagaaag

60481tattagatggaggtaaaaaaatatttatctctgaacataactatgctacccctaatggat

60541atggtactagaacgatagatatgagttcagccataggtaagaatgcacaattcatttacg

60601ataagaaataa

60612aggaggatagtctatggcaacagataaagaagctaaagatgttattgat

60661aaatttatagacaatgtatttaattttgatgtacttacaaaagaaagaataaaagaaaaa

60721gatgaagaaattaaaaaaataactacagatgatatgtatgaaaaggttgtgtatatacga

60781ccttatgttggagtaatacaaagccttaaccctcagcatgttcagtatgaatcattttct

60841aataatggttatgatatagaggcagaattaagtttcaggaaagtaagttatttagttgat

60901aaagggtctatacctacagattctttatctactttaacagttcatttagtagaacgaaat

60961caagaactattaatagattactttgatgagatacaagatgtgttgtatggagaatatatg

61021gaagaagaatatgtatttgatgaagatgtaccattaagtacgatactagcattagactta

SEQIDNO:3

NP_803302(噬菌体phi11的ORF49)

1mglpnpknrkptasevvewalyiaknkiaidvpgsgmgaqcwdlpnylldkywgfrtwgn

61adamaqksnyrgrdfkiirntkdfvpqpgdwgvwtggwaghvnivvgpctkdywygvdqn

121wytnnatgsppykikhsyhdgpgggvkyfvrppyhpdkttpapkpeddsddneknnkkvp

181iwkdvttikytissqevnypeyiyhfivegnrrlekpkgimirnaqtmssveslynsrkk

241ykqdveyphfyvdrhniwaprravfevpnepdyividvcedysasknefifneihamvva

301vdmmakyeiplsienlkvddsiwrsmlehvnwnmidngvppkdkyealekallnifknre

361kllnsitkptvtksrikvmvdnknadianvrdssptanngsaskqpqiitetspytfkqa

421ldkqmargnpkksnawgwanatraqtssamnvkriwesntqcyqmlnlgkyqgvsvsaln

481kilkgkgtlnnqgkafaeackkhnineiyliahaflesgygtsnfangkdgvynyfgiga

541ydnnpnyamtfarnkgwtspakaimggasfvrkdyinkgqntlyrirwnpknpathqyat

601aiewcqhqastiaklykqiglkgiyftrdkyk

SEQIDNO:4

嵌合体128

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAY

NRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQG

ACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHN

YATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWK

TNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLK

AGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWN

KSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:5

融合于16kDaORF56C-末端的溶葡萄球菌素BD

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:6

融合于19kDaORF56C-末端的溶葡萄球菌素BD

MGGLMMGEDTSKELKEKGVAEKQSSGDKDGGSDSGGAQDGGSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:7

融合13kDaCHAP结构域ORF56的C-末端的溶葡萄球菌素BD

GNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:8

融合于16kDaORF56C-末端的噬菌体L54a酰胺酶BD

MAQDGGSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLEKTSAKNQKNPPVPAGYTLDKNNVPYKKEQGNYTVANVKGNNVRDGYSTNSRITGVLPNNTTITYDGAYCINGYRWITYIANSGQRRYIATGEVDKAGNRISSFGKFSTI

SEQIDNO:9

在C-末端融合于溶葡萄球菌素BD的LytM肽酶结构域

MPENSPVYSLTDGTVVQAGWSNYGGGNQVTIKEANSNNYQWYMHNNRLTVSAGDKVKAGDQIAYSGSTGNSTAPHVHFQRMSGGIGNQYAVDPTSYLQSRLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:10

融合于ORF56结合结构域的溶葡萄球菌素的催化结构域

MAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVMGGLMMGEDTSKELKEKGVAEKQSSGDKDGGSDSGGAQDGGSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQP

SEQIDNO:11

LytM肽酶-16kDaORF56-溶葡萄球菌素BD融合物

MPENSPVYSLTDGTVVQAGWSNYGGGNQVTIKEANSNNYQWYMHNNRLTVSAGDKVKAGDQIAYSGSTGNSTAPHVHFQRMSGGIGNQYAVDPTSYLQSRMSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK

SEQIDNO:12

16kDaORF56-phi11酰胺酶BD

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLEPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS

Claims (22)

1.一种嵌合型尾相关溶胞壁酶多肽即嵌合型TAME多肽，其特征在于，所述嵌合型TAME多肽包含：

来自TAME的溶胞壁结构域，和

结合靶细菌的异源细胞结合结构域，

其中所述靶细菌与所述嵌合型TAME多肽接触后显示生长减慢或不生长，

其中所述嵌合型多肽的序列选自下组：

SEQIDNO:8的2-257号氨基酸；

SEQIDNO:10的2-211号氨基酸；和

SEQIDNO:11的2-340号氨基酸。

2.一种嵌合型尾相关溶胞壁酶多肽即嵌合型TAME多肽，其特征在于，所述嵌合型TAME多肽包含：

来自TAME的溶胞壁结构域，和

结合靶细菌的异源细胞结合结构域，

其中所述靶细菌与所述嵌合型TAME多肽接触后显示生长减慢或不生长，

其中所述嵌合型多肽的序列选自下组：

SEQIDNO:8的1-257号氨基酸；

SEQIDNO:10的1-211号氨基酸；

SEQIDNO:11的1-340号氨基酸。

3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述靶细菌是甲氧西林耐药葡萄球菌。

4.由SEQIDNO:8的2-146和149-257号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

5.如权利要求4所述的多肽，其由SEQIDNO:8的2-257号氨基酸组成。

6.由SEQIDNO:8的1-146和149-257号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

7.如权利要求6所述的多肽，其由SEQIDNO:8的1-257号氨基酸组成。

8.由SEQIDNO:10的2-148和149-211号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

9.如权利要求8所述的多肽，其由SEQIDNO:10的2-211号氨基酸组成。

10.由SEQIDNO:10的1-148和149-211号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

11.如权利要求10所述的多肽，其由SEQIDNO:10的1-211号氨基酸组成。

12.由SEQIDNO:11的2-100，102-241和244-340号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

13.如权利要求12所述的多肽，其由SEQIDNO:11的2-340号氨基酸组成。

14.由SEQIDNO:11的1-100，102-241和244-340号氨基酸组成的多肽，可选由接头连接。

15.如权利要求14所述的多肽，其由SEQIDNO:11的2-340号氨基酸组成。

16.一种酶促降解细菌细胞壁的方法，该方法包括使细胞壁接触权利要求1-15中任一项所述的多肽。

17.权利要求1-15中任一项所述的多肽在药物生产中的用途，所述药物用于治疗需要这种治疗的对象中的细菌感染。

18.权利要求1-15中任一项所述的多肽在制备消毒剂中的用途。

19.一种编码权利要求1-15中任一项所述多肽的分离核酸。

20.一种与权利要求19所述核酸互补的分离的核酸探针。

21.一种包含权利要求19所述核酸的表达载体。

22.一种包含权利要求21所述表达载体的细胞。