PT2037946E - Atividades antimicrobianas derivadas de fagos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ATIVIDADES ANTIMICROBIANAS DERIVADAS DE FAGOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos e composições para reduzir o crescimento de colónias microbianas, incluindo infeções, e inclui composições terapêuticas, métodos para o tratamento de infeções, e métodos para identificação de tais composições adicionais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As bactérias são ubiquitárias, e são encontradas em virtualmente todos os ambientes habitáveis. Elas são frequentes e diversas ecologicamente, e encontram nichos para sobrevivência pouco usuais e comuns. Elas estão presentes por todo o ambiente, e estão presentes no solo, poeira, água, e em virtualmente todas as superfícies. Muitas são estirpes normais e benéficas, que proporcionam uma relação sinérgica com os hospedeiros. Outras não são tão benéficas, ou causam problemas juntamente com benefícios.

As bactérias patogénicas podem causas doenças infeciosas em seres humanos, em outros animais, e também em plantas. Algumas bactérias apenas podem tornar alguns hospedeiros doentes; outras podem causar problemas numa série de hospedeiros, dependendo da especificidade do hospedeiro das bactérias. As doenças causadas pelas bactérias são quase tão diversificadas como as próprias bactérias e incluem intoxicação alimentar, cáries dentárias, antraz, doenças infeciosas gerais, e mesmo determinadas formas de cancro. Estas são tipicamente o objeto do campo da microbiologia clínica.

As bactérias são mortas na natureza por vírus específicos de bactérias, por exemplo, bacteriófagos, ou fagos. Muitos fagos encontrados na natureza pertencem ao grupo Caudovirales, ou fagos "com cauda". Estes vírus invariavelmente têm um genoma de ADN de cadeia dupla embalado numa cápside proteica. 0 fago consiste de três estruturas fundamentais: a cabeça; que, em geral, tem uma simetria icosaédrica, uma estrutura de cauda que emana a partir de um vértice da cabeça icosaédrica, e 4-6 fibras da cauda ligadas a alguma parte da cauda. Deverá ser notado que a Ordem Caudovirales contém três morfotipos gerais: Podoviridae (podofago), Myoviridae (miofago), e Siphoviridae (sifofago). Estritamente falando, os podofagos não têm uma "cauda" morfogeneticamente separada; ou seja, a estrutura semelhante a uma cauda é, na verdade, montada como parte da montagem da cabeça ou cápside. No miofago e sifofago, existem vias de morfogénese separadas para as cabeças, caudas e fibras da cauda; todos as três são eventualmente unidas para formar um virião infecioso completo. Nos podofagos, existe uma via da cabeça e uma via das fibras da cauda. A partir de uma perspetiva funcional, no entanto, a estrutura semelhante a uma cauda do podofago serve a mesma função que as caudas genuínas dos outros dois morfotipos.

Os fagos matam as células através da infeção, replicação, e depois lise da célula hospedeira, libertando múltiplos viriões de progénie no processo. Determinados elementos derivados de fagos são também capazes de matar células. Por exemplo, muitas estirpes de Pseudomonas produzem piocinas, componentes proteicos que matam outras estirpes de Pseudomonas. Em geral, o termo "bacteriocina" é utilizado para descrever os compostos produzidos por bactérias que matam outras bactérias; bacteriocinas de uma ampla variedade de estruturas químicas, a partir de pequenas moléculas para polipéptidos, são conhecidas. Contudo, muitas das piocinas são encontradas como sendo "caudas sem cabeça", isto é, caudas de fagos produzidas sem cabeças ou ADN. Estas bacteriocinas semelhantes a caudas matam bactérias através da adsorção a elas e causando uma lesão fatal no envelope celular, no entanto, não tendo ADN, não existe replicação ou lise do hospedeiro. Desde a descoberta original das piocinas em Pseudomonas, bacteriocinas semelhantes a caudas similares foram identificadas numa ampla variedade de outras bactérias, incluindo ambas espécies Gram-negativas e Gram-positivas. Veja-se, por exemplo, Nakayama, et al. (2000) Mol. Microbiol. 38:213-31; Traub, et al. (1996) Zentralbl. Bakteriol. 284:124-35; lto, et al. (1986) J. Virol. 59:103-111; Rocourt (1986) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 261:12-28; Shinomiya (1984) J. Virol. 49:310-14; lshii, et al. , (1965) J. Mol. Biol. 13:428-431; Daw e Falkiner (1996) Micron. 27:467-479; Strauch, et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5635-5642; e Abdelhamid, et al. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:5704-5710. Adicionalmente, outros elementos bacterianos derivados a partir de fagos foram descritos. Por exemplo, Caudovirales codificam uma endolisina como parte das funções de lise da célula hospedeira. Estas enzimas degradam a célula hospedeira desde dentro, levando à lise e libertação dos viriões de progénie. As endolisinas fagocitárias adicionadas exogenamente a culturas ou suspensões de bactérias demonstraram ser capazes de lisar e matar um número de bactérias Gram-positivas. Veja-se, por exemplo, Fischetti, et al. (2005) Pedido de Patente US 20050208038 descrevendo a utilização de endolisinas fagocitárias para matar bactérias e Takac e Blasi (2005) Antimicrob. Agents and Chemother. 49:2934-2940.

Outras divulgações que se referem às proteínas fagocitárias incluem Sheehan et al. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 140,23-28; Croux et al. (1993) Mol. Microbiol. 9, 1019-1025; Lopez et al. (2004) Drug Disc. Today 1,469-474; Borysowski et al. (abril de 2006) Exp. Biol. Med. 231, 366-377; Donovan et al. (abril de 2006) Appl. Environ.

Microbiol. 72, 2988-2996; documento WO 2008/001342; Sanzetal. (1996) Eur. J. Biochem. 235.601-605; Kwan et al. (2005) PNAS EUA 102, 5174-5179; Entrada da base de dados Uniprot:Q8CNS6; Bateman et al. (2003) Trends Biochem. Sei. 28,234-237. Documentos US 2005/208038; US 2002/006406; US 2005/214773; US 2002/086020; O' Flaherty (2004) J. Bact. 186, 2862-2871; e Saba et al. (1996) EMBO J. 15,4789-4797.

Determinadas bactérias são normalmente inócuas, mas tornam-se patogénicas após apresentação da oportunidade apropriada, ou tornam-se problemáticas após introdução num local ou situação anormal. Pessoas que não possuem sistemas imunitários eficazes são as mais vulneráveis, e determinadas bactérias utilizam hospedeiros fracos suscetíveis para proporcionar um ambiente temporário para se proliferar e dispersar através da população.

Estatisticamente, as doenças infeciosas são um grande problema médico. Veja-se, por exemplo, Watstein e Jovanovic (2003) Statistical Handbookon infectious Diseases Greenwood, ISBN: 1573563757. Nos Estados Unidos, cerca de 40.000-70.000 mortes resultam de infeções sanguíneas nosocomiais (derivadas dos hospitais) cada ano.

Os antibióticos revolucionaram a medicina clínica ao londo do último meio século. Desde a descoberta original do fenómeno dos antibióticos, o mecanismo de ação e desenvolvimento desta classe de entidades terapêuticas notáveis fez enormes progressos. Veja-se, por exemplo, Therrien e Levesque (2000) FEMS Microbiol Rev. 24:251-62; Durgess (1999) Chest 115(3 Suppl):19S-23S; Medeiros (1997) Clin. Infect. Dis. 24 (Suppl 1) :S19-45; Jones (1996) Am. J. Med. 100 (6A) :3S- 12S; Ford e Hait (1993) Cytotechnology 12:171-212; e Liu (1992) Compr Ther. 18:35-42. Os antibióticos tiveram em 2002, vendas de cerca de 32 biliões de dólares americanos. A aparência generalizada das bactérias resistentes aos antibióticos tem enfatizado a vulnerabilidade dos atuais tratamentos antimicrobianos para adaptação bacteriana. Veja-se, por exemplo, Walsh (1992) Antibiotics: Actions,

Origins, Resistance Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 1555812546; Cunha (1992) Antibiotic Essentials Physicians Press, ISBN: 1890114413; Amyes (2003) Magic Bullets, Lost Horizons: The Rise and Fall of Antibiotics Taylor & Francis, ISBN: 0415272033; Axelsen (2001) Essentials of Antimicrobial Pharmacology: A Guide to Fundamentals for Practice Humana

Press, ISBN: 0896038424; e Mainous e Pomeroy (eds. 2001)

Management of Antimicrobials in Infectious Diseases: Impact of Antibiotic Resistance Humana Press, ISBN: 0896038211.

Contudo, muitos antibióticos clássicos requerem uma replicação ou crescimento rápido das bactérias alvo para serem eficazes.

Assim, métodos melhorados para diminuir o crescimento ou sobrevivência de bactérias alvo ou limitar a patogenicidade bacteriana encontrarão grande utilidade. Esta utilidade pode ser aplicável a colonização ambiental, local, tópica, ou particularmente in vivo. A presente invenção aborda estes e outros problemas significativos. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta que as atividades de degradação da parede celular codificadas por fagos, por exemplo, enzimas degradadoras da mureína (normalmente designadas como "muralíticas"), que são tipicamente o núcleo das funções de lise dos fagos para sair da célula hospedeira, são também encontradas como componentes estruturais do virião de fago e assistem na entrada do fago para dentro da célula hospedeira. Estas atividades, designadas aqui como TAMEs (enzimas degradadoras da mureína associadas à cauda), possuem atividade bactericida intrínseca, independentemente da via replicativa do fago. Acredita-se que cada partícula de fago de todos os três morfotipos, tem uma TAME associada com a estrutura da cauda ou, no caso do podofago, associada como um componente menor da cabeça ou cápside. Acredita-se que a degradação local da parede celular facilita o processo de injeção de ADN. É descrita no presente documento uma TAME de fago particular, ORF56, o produto de orf56 do miovirus K estafilocócico. Em particular, ORF56 purificada, até então não reconhecida como um agente "lítico", foi encontrada como tendo atividade bactericida. Além disso, os polipéptidos bactericidas derivados a partir de ORF56 através de truncagem foram identificados. A atividade bactericida pode ser rastreada a partir de fontes semelhantes ou relacionadas, por exemplo, fontes de estruturas semelhantes e domínios a partir de várias fontes evolucionariamente diversas, para encontrar atividades bactericidas adicionais que possuem propriedades vantajosas. Tais fontes podem também ser pontos de partida para a mutagénese e rastreio de propriedades vantajosas adicionais, por exemplo, estabilidade, eficácia bactericida, tamanho, especificidade de substrato, e semelhantes. De forma mais importante, uma atividade bactericida robusta, significativamente (por exemplo, ordens de magnitude, ou fatores múltiplos) mais eficaz do que aquela encontrada para a ORF56 TAME purificada ou seus derivados de truncagem, é encontrada para um quimera que consiste no domínio catalítico degradador da mureína de ORF56 e o domínio de ligação à parede celular (CBD) não catalítico da bacteriocina estafilocócica lítica, lisostafina. Estas quimeras TAME-CBD são muito mais eficazes em termos da atividade bactericida do que a TAME purificada. Além disso, a proteína quimérica TAME-CBD demonstra persistir num estado eficaz (por exemplo, retém a estabilidade enzimática), em termos de atividades bactericidas, num número de misturas de formulações úteis. Proteínas purificadas nelas baseadas, e sequências de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas são proporcionadas, juntamente com os seus anticorpos. Métodos para utilização das ditas composições são proporcionados, incluindo métodos para reduzir o crescimento ou presença das bactérias alvo. A presente invenção proporciona um polipéptido quimérico que compreende (i) um domínio muralítico (MD) que tem pelo menos 90% de identidade com os aminoácidos 669-808 da SEQ ID NO:l; e (ii) um domínio de ligação celular heterólogo (CBD) que se liga a uma bactéria alvo, o dito polipéptido quimérico tendo atividade bactericida. A invenção também proporciona um polipéptido quimérico que compreende (i) um domínio muralítico (MD) que tem pelo menos 90% de identidade com os aminoácidos 669-808 da SEQ ID NO:l; e (ii) um domínio de ligação à parede celular de S. aureus heterólogo, o dito polipéptido quimérico tendo atividade de degradação de mureína de Staphylococcus. Ácidos nucleicos isolados que codificam polipéptidos da invenção também são proporcionados, tal como são vetores de expressão que compreendem os tais ácidos nucleicos. A invenção proporciona adicionalmente um polipéptido da invenção conforme definido nas reivindicações para utilização num método de tratamento de uma infeção bacteriana num indivíduo em necessidade de tal tratamento. A invenção também proporciona um método in vitro de degradação de uma parede celular de uma bactéria, o método que compreende contactar a parede celular com um polipéptido da invenção conforme definido nas reivindicações. A invenção também proporciona um método para desinfeção de uma superfície, o método que compreende a etapa de contactar a superfície com o polipéptido da invenção conforme definido nas reivindicações. A invenção adicionalmente proporciona métodos, conforme descritos, em que: a bactéria pertence ao género Staphylococcus; e especificamente S. aureus, S. epidermitis e outros estafilococos de significado clínico. Onde a invenção se refere à utilização de polipéptidos num método de tratamento, o tratamento pode ser in vivo ou no ambiente de uma mucosa, ou outra superfície orgânica, ou num dispositivo médico ou implante; os polipéptidos podem ser introduzidos topicamente, sistemicamente, parentericamente, ou através de inalação; outro tratamento antimicrobiano pode ser utilizado, incluindo um antibiótico ou produto derivado de fagos; ou a dita atividade bacteriana pode ter uma especificidade de alvo ampla através de estirpes bacterianas múltiplas e/ou através de espécies bacterianas múltiplas.

Outras proteínas de fago descritas no presente documento incluem: YP_238566 (ORF007 (fago Twort de Staphylococcus)), YP_406405 (gp29 (bacteriófago P100 de Listeria)), NP_765044 (proteína de tipo SsaA de antigénio secretor (Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)), YP_164769 (orfl34 (bacteriófago LP65 Lactobacillus plantarum)), YP_492702 (proteína de complexo de transferência TraG (Staphylococcus aureus subespécie aureus USA300)), AAA71958 (putativa (Staphylococcus aureus)), NP_765786 (N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (Staphylococcus epidermidis ATCC12228)), YP 189676 (proteína relacionada com SsaA precursora de antigénio secretor (Staphylococcus epidermidis RP62A)), YP_189814 (N-acetilmuramoil-L-alanina amidase (Staphylococcus epidermidis RP62A)), e outras fontes designadas adicionalmente descritas abaixo. Outra fonte é o fago phill ORF46, uma hidrolase de parede celular putativa (NP_803302; GenelD:1258067). Vários métodos são descritos no presente documento para rastrear por uma atividade bactericida derivada de fago numa bactéria alvo, o dito método que compreende: fragmentar um fago fonte em fragmentos estruturais separáveis; determinar que fragmentos retêm a afinidade de ligação para a dita bactéria alvo; e testar os ditos fragmentos para a atividade bactericida; identificando assim estruturas que possuem atividade bactericida. Isto também inclui formas de realização em que os dados do método são comunicados a uma jurisdição dos Estados Unidos. Em determinadas formas de realização, a bactéria alvo é uma bactéria Gram-positiva ou a atividade bactericida é uma atividade muralitica.

Mais métodos são descritos no presente documento, incluindo um para gerar atividades bactericidas variantes, o método que compreende mutagenizar um gene que codifica um polipéptido caracterizado como exibindo atividade de degradação da parede celular; e rastrear por variantes com atividade bactericida modificada. A comunicação dos dados a partir de tal método também será englobada. Outros métodos incluem aqueles descritos, mas avaliando a atividade bactericida modificada, por exemplo, número de turnover de substrato diferente; ou uma alteração na sensibilidade das propriedades enzimáticas às condições de reação, incluindo temperatura, sal, pH, hidratação, ou semelhantes. É descrito no presente documento um método para tratar uma infeção bacteriana num animal, o método que compreende a administração ao dito animal de um ou mais polipéptidos bactericidas, em que pelo menos dois dos ditos polipéptidos são derivados a partir de diferentes genes de degradação de parede celular; os polipéptidos bactericidas têm ampla atividade bactericida alvo; as proteínas bactericidas são "líticas" quando aplicadas ao exterior da célula; ou a atividade bactericida é degradadora de mureína, ou muralitica, que inclui proteínas com atividade de mureína glicosidase (incluindo glucosaminidase e muraminidase), transglicosilase, lisozima, amidase ou endopeptidase. É descrito no presente documento um polipéptido ORF56 ou ORF49 que tem atividade bactericida contra uma bactéria alvo e que, no mínimo, inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90% ou 95% de identidade com os resíduos de aminoácidos 620-808 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos 481-618 da SEQ ID NO: 3. Numa forma de realização, a proteína ORF56 inclui a sequência exata de resíduos de aminoácidos 620-808 da SEQ ID NO: 1 ou a proteína ORF49 inclui a sequência exata de resíduos de aminoácidos 481-618 da SEQ ID NO: 3. Numa forma de realização adicional, a invenção proporciona uma composição que consiste essencialmente num polipéptido ORF56 que tem atividade bactericida contra uma bactéria alvo e que, no mínimo, inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90%, ou 95% de identidade com os resíduos de aminoácidos 620-808 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos 481-618 da SEQ ID NO: 3. É descrita no presente documento, por exemplo, uma composição farmacêutica, um reagente de diagnóstico, ou uma composição bactericida, que inclui um polipéptido ORF56 ou ORF49 que tem atividade bactericida contra uma bactéria alvo e que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90%, ou 95% de identidade com, no mínimo, resíduos de aminoácidos 620-808 de SEQ ID NO: 1 ou resíduos 481-618 da SEQ ID NO: 3. A composição pode incluir pelo menos uma proteína com atividade bactericida, por exemplo, uma proteína pl6 do fago p68 ou uma "enzima lítica" do tipo Pal. A composição também pode incluir outros ingredientes com atividade bacteriostática ou bactericida, por exemplo, um antibiótico.

Os polipéptidos ORF56 ou ORF49 podem ser utilizados para impedir o crescimento de uma bactéria alvo que é uma espécie de Staphylococcus, e em particular uma espécie de Staphylococcus resistente à meticilina. Noutra forma de realização, a bactéria alvo é uma espécie bacteriana de replicação lenta, por exemplo, uma bactéria que tem um período de duplicação entre uma e setenta e duas horas, ou mais, por exemplo, cerca de 2, 4, 8, 12, 20, 30, 40 ou 50 horas.

Os polipéptidos ORF56 e ORF49 ou uma composição que inclui um polipéptido ORF56 e ORF49 podem ser utilizados para, por exemplo, degradar enzimaticamente uma parede celular bacteriana. É descrito no presente documento um método para tratar uma infeção bacteriana num indivíduo através da administração de um polipéptido ORF56 e ORF49 ou uma composição que inclui um polipéptido ORF56 e ORF49 ao indivíduo. 0 indivíduo pode ser, por exemplo, um mamífero, um primata, um ser humano, um animal de produção, um animal de companhia, um ser humano, uma espécie de aves de capoeira, uma vaca, um cavalo, uma cabra, um gato, uma ovelha, um roedor, um cão, um porco, uma galinha, um pato, uma perdiz, ou um ganso. Animais de espetáculo, por exemplo, elefantes, leões, tigres, zebras, baleias, golfinhos e ursos também podem ser tratados utilizando as composições da presente invenção.

Em várias formas de realização, o indivíduo é uma vaca e a infeção bacteriana é mastite bovina; o indivíduo é um ser humano e que a infeção bacteriana é causada por uma espécie de Staphylococcus resistente a meticilina; ou o indivíduo é uma espécie de ave de capoeira e a infeção bacteriana é na pele ou penas.

Descreve-se no presente documento um método de deteção de uma bactéria ou de identificação de uma bactéria causadora de doença por contacto da bactéria com um polipéptido ORF56 ou ORF49 e detetar a ligação do polipéptido ORF56 ou ORF49 com a bactéria. Numa forma de realização preferida, o polipéptido ORF56 ou ORF49 é marcado de forma detetável.

Descreve-se no presente documento um método de desinfeção de uma superfície, por contacto da superfície com um polipéptido ORF56 ou ORF49 ou uma composição que inclui um polipéptido ORF56 ou ORF49. 0 método de desinfeção pode ser utilizado para reduzir ou eliminar todas as bactérias na superfície ou uma pluralidade ou uma espécie ou estirpe bacteriana determinada, por exemplo, uma espécie de Staphylococcus.

Descreve-se no presente documento um polipeptídeo substancialmente puro ou isolado, caracterizado por, pelo menos, uma das seguintes propriedades: compreender, pelo menos, cerca de 85% de identidade, em relação a um segmento de pelo menos 17 aminoácidos, com os resíduos 1-808, 297-808, 363-808, 603-808, 620-808 ou 691-805 de ORF56; compreender, pelo menos, cerca de 95% de identidade, em relação a um segmento de pelo menos 24 aminoácidos, com os resíduos 691-805 de ORF56; ou que compreende uma pluralidade de segmentos distintos de pelo menos 85% de identidade com ORF56, segmentos os quais não se sobrepõem. Algumas propriedades adicionais incluem, por exemplo, segmentos adicionais distintos de pelo menos cerca de 75% de identidade em relação a pelo menos 17 aminoácidos, com os resíduos 691-805 de ORF56; segmentos distintos, adicionais de pelo menos 17 aminoácidos que exibem pelo menos cerca de 65% de identidade em relação a ORF56; pelo menos 30% de atividade de degradação da parede celular de ORF56 de comprimento completo ou nativa; uma atividade muralítica numa estirpe bacteriana de Staphylococcus de, pelo menos, cerca de 50% de ORF56; outra sequência ou domínio de polipéptido funcional, por exemplo, uma sequência de sinal; ou um marcador detetável; compreende pelo menos os resíduos 690 a 769 de ORF56; é um ORF56 de comprimento completo; corresponde a 1-808, 297-808, 363-808, Met-603-808 ou 620-808 de ORF56; compreende um domínio CHAP; é substancialmente livre de outras proteínas de fago; é substancialmente livre de outros materiais proteicos; é combinado com um outro agente antimicrobiano, incluindo um antibiótico; é misturado com um excipiente farmacêutico; está numa composição tamponada ou estéril; exibe uma atividade de degradação da parede celular bacteriana selecionada a partir de atividade muralítica, glucosamidase, amidase ou de endopeptidase; apresenta atividade bactericida em várias estirpes de bactérias Gram-positivas; exibe atividade bactericida sobre uma estirpe de bactérias Staphylococcus; ou exibe atividade bactericida sobre uma ou mais estirpes descritas como S. aureus, S. epidermidis, S. lentis, S. simulans e S. carnosus.

Descreve-se no presente documento um vetor de expressão que expressa um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica um polipéptido ORF56 ou ORF49 ou uma truncagem de um polipéptido ORF56 descrito no presente documento. Descreve-se no presente documento uma célula hospedeira que contém o vetor de expressão ORF56. Uma célula hospedeira pode ser, por exemplo, uma célula eucariota ou procariota que é utilizada para produzir um polipéptido ou ácido nucleico ORF56.

Descreve-se no presente documento um polipéptido ORF56 substancialmente puro ou isolado, que tem um local de ligação a antigénio de um anticorpo que se liga seletivamente a um componente da parede celular. Este polipéptido ORF56 pode ser, por exemplo, ligado a um marcador detetável ou fornecido como parte de um kit com instruções que é utilizado para avaliar a presença das bactérias alvo.

Descreve-se no presente documento um método de degradar enzimaticamente a parede celular de uma bactéria alvo, através da exposição da referida parede celular a um polipéptido ORF56 ou ORF49. Esta etapa do método pode, por exemplo, ser incorporada num diagnóstico para determinar a sensibilidade bacteriana; resultando numa diminuição de, pelo menos, cerca de 5 vezes na população bacteriana sensível sobre uma superfície de trabalho ou de mobiliário; introduzir o polipéptido ORF56 ou ORF49 num animal e resultar numa diminuição de, pelo menos, cerca de 5 vezes na população bacteriana sensível numa localização selecionada no interior ou sobre o referido animal; administrar o referido polipéptido a uma superfície ou comportamento do animal; ser um meio de geração de bactérias mortas ou incompetentes para a replicação que podem ser inoculadas em um indivíduo; ou ser usado para tratar uma pele, mucosa, trato urinário, trato respiratório, cavidade nasal, trato gastrointestinal, ou outra infeção bacteriana. Noutras formas de realização, a diminuição numa população bacteriana sensível é, por exemplo, uma diminuição de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 7 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou mesmo mais.

Descreve-se no presente documento uma proteína ORF56 truncada recombinante de SEQ ID NO: 1, em que desde 1 a 620 aminoácidos são truncados a partir do terminal amino da proteína ORF56 ou em que desde 1 a 3 aminoácidos são truncados a partir do terminal carboxi da proteína ORF56, e em que a proteína ORF56 tem atividade de degradação da parede celular bacteriana. A proteína ORF56 restante pode ter cerca de 80%, 90% ou 95% de identidade com a sequência de aminoácidos correspondente na SEQ ID NO: 1.

Descreve-se no presente documento um polipéptido substancialmente puro ou recombinante que exibe atividade biológica de degradação da mureína de estirpe de Staphylococcus, o polipéptido que compreende um segmento de enzima degradadora de mureína associada à cauda (TAME) de um fago infetante de S. aureus; e um domínio de ligação à parede celular de S. aureus heterólogo.

Em certos aspetos, o polipéptido possui uma massa molecular da cadeia principal da proteína de menos do que cerca de 400 kDa, cerca de 250 kDa; ou cerca de 100 kDa; ou o polipéptido exibe uma atividade de peptidase, amidase ou de hidrolase de uma mureína de S. aureus; ou o polipéptido é a partir da cauda de um fago de Caudovirales, por exemplo, um fago Myoviridae, Podoviridae, ou fago

Siphoviridae. Noutras formas de realização, o segmento de enzima degradadora de mureína é de fago K ORF56, fago phill ORF49, ou um fago derivado de um MRSA. Em várias outras formas de realização, o domínio de ligação à parede celular é a partir de uma proteína bacteriana de Staphylococcus, por exemplo, uma lisoestafina de Staph ou uma proteína da cauda de fago; ou compreende: um segmento SH3 bacteriano; sequência de ORF56, lisostafina de S. simulans, ou amidase de fago L54a; ou qualquer construção do domínio de ligação à parede celular que aumenta a atividade de degradação da mureína do polipéptido em, pelo menos, 30 vezes, em comparação com um polipéptido comparável que não possui a função do domínio de união.

Num aspeto, o polipéptido compreende a SEQ ID NO: 4.

Também são descritas no presente documento composições farmacêuticas, por exemplo, em que o polipéptido é um creme ou gel, ou está num recipiente de dose única, por exemplo, contendo, pelo menos, 10 nanogramas de polipéptido. Tais composições podem estar numa formulação de libertação controlada; aplicadas a um implante, cateter, ou dispositivo médico; ou estar numa formulação estéril ou tamponada.

Noutras formas de realização preferidas, a composição funciona numa estirpe de Staphylococcus que se encontra num compartimento nasal; ou que causa mastite ou infeta feridas por queimadura ou punção; ou que é resistente à meticilina ou que é resistente à vancomicina. Noutra forma de realização preferida, curativos, gazes ou semelhantes utilizados para cobrir as feridas são impregnados com um polipéptido TAME ou uma proteína quimérica compreendendo um polipéptido TAME para minimizar a probabilidade de infeção bacteriana. Numa forma de realização adicional, a ferida é uma ferida por punção ou queimadura. Ainda noutra forma de realização, o indivíduo com a ferida tem um sistema imunitário comprometido, por exemplo, resultante de infeção por VIH, transplante de órgãos e tratamentos relacionados, transplante de células estaminais ou da medula óssea, ou quimioterapia. Os polipeptídeos TAME e proteínas quiméricas compreendendo um polipéptido TAME também podem ser utilizados para tratar órgãos ou produtos derivados do sangue antes do transplante num recetor.

Descrevem-se no presente documento métodos para o tratamento de uma cultura bacteriana, o método que compreende o contacto da dita cultura com um polipéptido quimérico descrito. Tipicamente, o contacto diminui a taxa de crescimento da dita cultura em, pelo menos, cerca de 5 vezes; ou outra terapêutica antimicrobiana é também utilizada; ou o método utiliza uma mistura de polipéptidos que têm como alvo diferentes estirpes de bactérias. Preferivelmente, o tratamento diminui a taxa de crescimento das bactérias alvo sensíveis em, pelo menos, cerca de 30%; o polipéptido é administrado numa estequiometria de, pelo menos, cerca de dez polipéptidos para cada bactéria alvo, ou, pelo menos, cerca de 500 ng/ml; ou o contacto de administração é continuado durante menos do que cerca de 7 dias. Alternativamente, a cultura compreende uma estirpe de estafilococos, uma bactéria Gram-positiva, ou é uma infeção, ou a cultura pode compreender células ou tecidos de mamífero.

Descreve-se no presente documento um ácido nucleico que codifica os polipéptidos, embora os polipéptidos possam ser produzidos por métodos de síntese de proteínas. E uma célula compreendendo o ácido nucleico é fornecida.

Descrevem-se no presente documento polipéptidos relacionados ou equivalentes derivados a partir de fusões da sequência de polipéptido TAME, ou um segmento da sequência TAME contendo um domínio muralítico, para um segmento de um outro polipéptido que constitui um domínio de ligação à parede celular (CBD). Estas construções quiméricas serão designadas como TAME-CBDs. Por exemplo, um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante exibindo atividade biológica de degradação de mureina de estirpe Gram-positiva, em que o polipéptido compreende uma

sequência modificada, por exemplo, mutagenizada, de um segmento de Enzima degradadora de Mureina Associada à Cauda (TAME) de um fago infetante de Gram-positivas; e/ou um domínio de ligação à parede celular Gram-positiva heterólogo modificado ou, por exemplo, mutagenizado. Nestes casos, "mutagenizado" é essencialmente uma forma da TAME em que as regiões da proteína TAME completa foram eliminadas, com o efeito de aumentar a atividade bactericida ou enzimática, a solubilidade proteica, e/ou a estabilidade proteica, em comparação com a TAME de comprimento completo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 fornece um quadro de domínios TAME conservados identificados nos fagos que infetam bactérias Staphylococcus. Os domínios muralíticos (MD) foram identificados e são referidos como TAME CD no quadro. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução 0 presente estudo identificou uma entidade não identificada até agora, o fago K ORF56, que foi agora demonstrado como exibindo atividade bactericida. É um componente de certos fagos Myoviridae como um componente estrutural do virião com atividade muralítica. 0 sítio catalítico foi localizado na parte C-terminal da proteína, e apresenta um domínio de Aminohidrolase/Peptidase dependente de Cisteína-Histidina (CHAP). Veja-se, por exemplo, Rigden et al., (2003) Trends Biochem. Sei. 28: 230-234. Embora o domínio CHAP seja encontrado nas regiões N-terminais de vários genes, em alguns genes o domínio CHAP é encontrado nos segmentos C-proximais de regiões de codificação. Parte da presente invenção consiste na compreensão de uma relação entre a caracterização de "atividade de degradação da parede celular" atribuída a proteínas de fagos e a capacidade para converter a atividade de degradação a partir de uma função "lítica", que é avaliada sob condições artificiais, numa função bactericida sob condições não artificiais de circunstâncias típicas de crescimento bacteriano. É provável que estas "atividades de degradação" sejam novas fontes de atividades bactericidas não reconhecidas para utilização sob condições terapêuticas, e podem incluir atividades de muraminidase, glucosaminidase, amidase ou endopeptidase. Esta atividade pode ser identificada, isolada, e foi mostrada, em várias construções de proteínas solúveis purificadas exemplificativas, como tendo uma atividade bactericida sobre bactérias alvo, fora do contexto das estruturas de fagos testados sob condições de ensaio altamente artificiais. Além disso, as construções recombinantes que compreendem tais atividades têm propriedades vantajosas significativas como composições e formulações antimicrobianas.

Da mesma forma, o fago phill de Siphoviridae tem uma atividade degradadora da mureina (TAME), reconhecida em parte pelo seu padrão de estrutura génica.

Este estudo mostra que o "ORF56 hipotético" do fago K de Staphylococcus tem atividade muralítica, e além disso, que o produto proteico recombinante parece ser processado numa proteína de 23 kD a partir de um produto de tradução "putativo" codificado de 91 kD. A exposição de várias estirpes de bactérias Staphylococcus ao produto de 23 kD indica atividade bactericida. Construções de truncagem indicam que a atividade bactericida é codificada na região C-proximal do produto de tradução proteico.

Os presentes estudos indicam que um produto proteico de 23 kD o qual é gerado a partir da ORF56 possui um domínio CHAP. Além disso, uma forma truncada de 16kD do produto proteico de 23 kD abrangendo a região C-proximal e o domínio CHAP também é bactericida. Com base em pesquisas de homologia de sequência, várias outras estruturas semelhantes foram identificadas, as quais são fontes alternativas potenciais para atividades bactericidas. Embora possam existir diferentes atividades muraliticas, o âmbito das sensibilidades bacterianas está, no geral, não estudado. Assim, várias destas novas atividades podem ter atividades antibacterianas direcionadas relativamente amplas. Além disso, os pequenos tamanhos dos polipeptideos que exibem estas atividades tornam-nos eficientes para a produção e acessibilidade dentro de um corpo ou para componentes alvo da parede celular relevantes, por exemplo, peptidoglicanos. A terapêutica com fagos recebeu recentemente uma atenção renovada como uma alternativa para a prevenção e/ou tratamento de infeções bacterianas. Veja-se Merril, et al. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2:489-497; e Sulakvelidze, et al. (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45:649-659. Alternativamente, endolisinas codificadas por fagos foram propostas como agentes eficazes para o controlo de doenças infeciosas causadas por bactérias Gram-positivas (Fischetti (2003) Ann. N. Y. Acad. Sei. 987:207-214). Um artigo recente sobre as endolisinas de fagos mostrou a não especificidade das endolisinas de fago de Enterococcus que atuam em Streptococcus e Staphylococcus em vez de Enterococcus (Yoong et al. (2004) J. Bact. 186:4808-4812).

Estes marcadores muraliticos ou de degradação da parede celular atribuídos aos componentes de fagos são encontrados em muitos tipos de fagos, incluindo as classes Myoviridae, Podoviridae e Siphoviridae.

Os requerentes trabalharam com estas atividades de degradação da parede celular de TAME para testar a atividade bactericida sob as condições artificiais aplicadas ao termo entidades de "lise" e descobriram que as suas atividades específicas eram relativamente baixas. Tornou-se aparente que esta limitação era intrínseca para a atividade de TAME, que tem uma função biológica na geração de uma degradação extremamente limitada da parede celular, suficiente para permitir a injeção do ADN de fago, mas não para causar um efeito nocivo sobre a integridade das células. Em particular, a taxa de degradação da parede celular que conduz a um efeito sobre o crescimento bacteriano não foi impressionante, e na maioria das situações verificou-se ser insuficiente para ser para uso terapêutico comercial.

As proteínas de fagos evoluíram provavelmente para suportar o ambiente hostil fora das células, e muitas vezes fora do corpo de um animal, e evoluíram para a morte ineficiente da célula hospedeira alvo. De facto, o ciclo de vida do fago requer que a célula NÃO seja morta no processo de infeção, ou o ciclo de vida do fago seria abortado antes da replicação. Assim, as proteínas TAME são inerentemente ineficientes como elementos bactericidas.

Como tal, os Requerentes reconheceram adicionalmente que, enquanto as enzimas da cauda do fago têm o propósito evolutivo de auxiliar o processo de infeção, elas evoluíram para NÃO serem eficientes a ponto de matarem o hospedeiro alvo. Assim, se as proteínas TAME tivessem de ser úteis como agentes bactericidas eficazes, as proteínas TAME necessitariam uma modificação para fazê-lo. A presente invenção proporciona métodos de mutagénese e de rastreio que podem ser aplicados para identificar motivos de degradação da parede celular que podem direcionar domínios catalíticos TAME para uma bactéria particular ou um sitio particular numa bactéria. Utilizando ORF56 como um modelo, os Requerentes foram os primeiros a reconhecer que as proteínas TAME de fago podem ser convertidas a partir de um agente bactericida marginal num agente bactericida altamente eficiente e robusto, por exemplo, removendo sequências que parecem impedir que o polipeptídeo TAME de comprimento completo apresente uma função bactericida elevada, e/ou fundindo o domínio catalítico restante a um domínio de ligação à parede celular heterólogo. Conforme observado acima, estas fusões, ou quimeras, são aqui designadas como TAME-CBDs.

As formas naturais destas proteínas TAME de fago têm atividades bactericidas limitadas, conforme descrito. Os Requerentes descobriram que um motivo de direcionamento ligado ao domínio de degradação da parede efetuava um aumento dramático na concentração local do sitio catalítico no substrato da parede celular. Proteínas quiméricas para bactérias específicas podem ser concebidas através, por exemplo, da combinação de um segmento catalítico de uma proteína TAME que atua sobre a estrutura da parede celular apropriada conforme encontrada naturalmente na superfície da bactéria no seu contexto natural e da ligação do segmento que tem a afinidade apropriada e é direcionado à estrutura da parede celular apropriada. A ligação de um motivo de direcionamento a um segmento de degradação da parede celular derivado de fago pode proporcionar uma série de construções de fusão ou bifuncionais para o rastreio de atividades bacteriostáticas, bactericidas, ou "líticas" da parede celular.

Segmentos enzimáticos de degradação da parede celular adicionais foram selecionados e construções foram feitas para demonstrar o âmbito da presente invenção. Por exemplo, os segmentos derivados de fagos, tipicamente estruturas da cauda, que codificam atividades enzimáticas, por exemplo, enzimas degradadoras da parede celular, foram utilizados. As atividades enzimáticas foram isoladas a partir de várias fontes bacterianas ou de fagos, e mostraram ter atividades semelhantes. Atividades semelhantes estão disponíveis a partir de estruturas derivadas de fagos, por exemplo, com base na homologia de sequência com as atividades conhecidas utilizadas por fagos para obter acesso ao hospedeiro, tipicamente num processo relacionado com a infeção. Outras podem ser identificadas através da organização de genes de enzimas de infeção, por exemplo, em cassetes que contêm estruturas de penetração da parede/ligação da cauda de fago, em genomas de fagos (veja-se a ORF49 da hidrólase da parede celular do fago phill de S. aureus (NP_803302), que é uma "contraparte" estrutural para a ORF56 no fago K. Outros exemplos incluem ORF004 do fago 69 de S. aureus (gi: 66395297, YP_239591.1), hidrólase da parede celular do fago PhiNM4 (gi: 104641981, ABF73289.1), hidrólase da parede celular de phi ETA2 (gi: 122891778, YP_001004324.1), ORF004 do fago 85 de S. aureus (gi: 66394874, YP_239746.1) e ORF004 do fago ROSA (gi: 66395969, YP_240329.1) . Ambos estes domínios ou motivos também podem ser derivados de genomas de pró-fagos ou "fagos remanescentes" deixados num genoma bacteriano a partir de um genoma de fago inativado ou incompleto. Pró-fagos e métodos para os identificar são divulgados em, por exemplo, Canchaya et al., Microbiol. Mole. Biol. Rev. 67:238-276 (2003), que é incorporado no presente documento como referência para todos os efeitos. Outras atividades podem ser derivadas a partir de piocinas (bacteriocinas) ou estruturas relacionadas com fagos que podem ser incapazes de proliferar como fagos normais, mas são produzidos ou sustentados como subprodutos de genomas incompletos. Assim, proteínas ou sequências de codificação podem ser isoladas a partir de estruturas que representam um fago viável, ou delas derivadas. Além disso, cada uma destas estruturas pode servir como um ponto de partida para a mutagénese para otimizar as atividades sob condições desejadas para o utilização, por exemplo, conforme descrito. II. Enzimas Degradadoras de Mureina Associadas à Cauda (TAMES)

Enzimas Degradadoras de Mureina Associadas à Cauda (TAMES) são definidas como enzimas muralíticas encontradas nas partículas de bacteriófagos e incluem aquelas que irão digerir a parede celular bacteriana, preferivelmente de uma bactéria Gram-positiva, mas que podem também aplicar-se àquelas que podem digerir material de uma bactéria Gram-negativa ou outra bactéria. A atividade será tipicamente uma enzima degradadora de peptidoglicano, e pode ter uma ou mais atividades enzimáticas de neuraminidase, glucosaminidase, transglicosilase, lisozima, amidase ou endopeptidase. A enzima pode ser capaz de degradar a parede celular, e pode ainda ser caracterizada como "lítica" para a célula, mas uma tal caracterização litica é sob condições altamente artificiais, em comparação com o ambiente normal do processo de infeção do fago. Preferivelmente, as enzimas são derivadas a partir de estruturas de fago, caudas ou equivalentes a caudas em podofagos, ou proteínas do interior da cabeça de podofagos, que proporcionam meios para o material genómico do fago entrar num hospedeiro bacteriano a partir do ambiente externo; porque estas proteínas são mais comumente encontradas em estruturas da cauda, para os propósitos deste pedido, toda a classe é denominada as proteínas TAME. Um exemplo de uma proteína TAME associada com um equivalente equivalente de cauda em podofagos é a proteína gpl6 do fago T7. A proteína gpl6 é uma transglicosilase que ataca o peptidoglicano. A proteína gpl6 auxilia na injeção de ADN, mas é contida dentro da cápside e quando ejetada durante a infeção, parece formar parte da cauda. Veja-se, por exemplo, Molineux (1999) The T7 family of bacteriophages. Na Encyclopedia of Molecular Biology. Creighton TE, ed. Nova Iorque, John Wiley & Col, pp. 2495-2507.

As bactérias alvo serão tipicamente aquelas que afetam ou infetam animais, especialmente primatas. Contudo, diversas aplicações bacteriostáticas ou bactericidas seriam vantajosamente perseguidas, assim como certos problemas de saúde pública. As bactérias, muitas vezes, são incluídas na classe de Gram-positivas, apesar de existirem outras bactérias patológicas que não estão claramente categorizadas numa ou outra, incluindo micobactérias, esporos, ou outros procariotas. Alvos bacterianos patogénicos ou patológicos são de maior interesse, tanto estirpes Gram-positivas, por exemplo, espécies de Staphylococcus, incluindo aureus, e espécies de Streptococcus como Gram-negativas. Espécies alvo Gram-negativas particularmente importantes incluem os géneros Escherichia, particularmente coli; Pseudomonas, particularmente aeruginosa; Campylobacter, Salmonella; Neisseria; Helicobacter e Vibrio. Veja-se, por exemplo, o Manual Merck e o Manual Merck de Veterinária.

Os polipéptidos ORF56 divulgados no presente documento podem ser utilizados em combinação com pelo menos uma outra enzima muralitica para, por exemplo, tratar a infeção por uma ou mais estirpes bacterianas. Enzimas muraliticas adicionais exemplificativas incluem, por exemplo, uma proteína 16 do fago p68 e uma enzima "lítica" do tipo Pal. Uma proteína 16 do fago p68 é divulgada em, por exemplo, (Vybiral D et ai. (2003), FEMs Microbiol Lett., 219, 275-283). Enzimas "líticas" do tipo Pal são divulgadas em, por exemplo, Fischetti, et ai. (2005) Pedido de Patente US 20050208038.

Conforme divulgado no presente documento, as proteínas TAME podem ser identificadas pelos peritos através de uma combinação de análise de sequência e determinação da posição do ácido nucleico de codificação num genoma de fago. III. Definições

Uma "atividade de degradação da parede celular" é uma atividade enzimática que degrada, quebra, desintegra, ou diminui ou reduz a integridade de uma célula bacteriana. O termo "lítica" é normalmente usado para significar "degradadora da parede celular", em parte porque a maioria (com algumas exceções) das atividades catalíticas degradadoras da parede são hidrolíticas. Assim, grande parte da terminologia utilizada refere-se a "lítica", mesmo que o mecanismo catalítico não envolva a hidrólise. Alternativamente, a degradação de certos substratos definidos ou artificiais podem ser ensaios úteis para a atividade "lítica" ou estática (numa base populacional para o alvo). "Atividade lítica da parede celular" num contexto de fagos é geralmente uma caracterização atribuída a uma estrutura com base em testes sob condições artificiais, mas tal caracterização pode ser específica para as espécies, famílias, géneros ou subclasses (que podem ser definidos pela sensibilidade) bacterianas. Portanto, uma "bactéria suscetível a uma atividade de degradação da parede celular" descreve uma bactéria cuja parede celular é degradada, quebrada, desintegrada, ou que vê a sua integridade da parede celular diminuída ou reduzido por uma atividade ou atividades degradadoras da parede celular. Muitas outras "atividades líticas" originam-se a partir das células bacterianas hospedeiras e são importantes na divisão celular ou na libertação de fagos. Outras atividades de degradação da parede celular derivadas de fagos são encontradas nos fagos e evoluíram para servir em várias etapas de penetração da infeção por fagos mas seriam fisiologicamente abortivas para a replicação dos fagos se matassem a célula hospedeira antes do ADN de fago ser injetado para dentro da célula. As estruturas úteis nas etapas de penetração são particularmente relevantes para a presente invenção na medida em que estas atividades operar em hospedeiros normais, a partir do exterior. Em formas de realização preferidas, a atividade de degradação da parede celular é fornecida por uma enzima que é uma enzima não holina e/ou que é uma enzima não lisina. Noutras formas de realização, a atividade de ligação à célula é fornecida por uma enzima que é uma enzima não holina e/ou que é uma enzima não lisina.

Uma "domínio de ligação à célula" ou "CBD" é tipicamente um motivo de direcionamento, que reconhece a superfície exterior bacteriana. Em bactérias Gram-positivas, a superfície externa das bactérias é normalmente a camada de mureína. Assim, o segmento de ligação preferido para estes alvos serão as entidades da superfície celular, sejam proteínas, lípidos, açúcares ou uma combinação. Segmentos de ligação de lisozimas e endolisinas conhecidas e semelhantes, são conhecidos e as suas propriedades facilmente encontradas pelas pesquisas no PubMed ou Entrez. Outras proteínas que se ligam a bactérias incluem as PGRPs descritas abaixo, as TLRs, entidades de ligação de flagelo e pili, e as proteínas da cauda de fago envolvidas no reconhecimento do alvo. Numa forma de realização preferida, o CBD está fundido com uma proteína TAME ou com uma proteína degradadora da parede celular, ambas conforme divulgadas no presente documento. Numa forma de realização preferida adicional, o CBD é um domínio heterólogo, em comparação com a proteína TAME ou com a proteína degradadora da parede celular. Isto é, a proteína CBD é derivada a partir de uma proteína não TAME ou uma proteína não degradadora da parede celular, ou é derivada a partir de uma proteína de ligação à parede celular a partir de um fago diferente, uma bactéria ou outro organismo. Assim, os domínios CBD heterólogos podem ser utilizados para dirigir a proteína TAME a bactérias alvo específicas ou podem ser utilizados para aumentar a gama de alvos da proteína TAME.

Um "ambiente" de uma bactéria pode incluir um ambiente in vitro ou in vivo. Ambientes in vitro são normalmente encontrados num recipiente de reação, em algumas formas de realização utilizando bactérias isoladas ou purificadas, mas podem incluir a esterilização da superfície, tratamento geral de equipamento ou de espaços de animais, ou instalações de saúde pública, tais como instalações de água, sépticas ou de esgotos. Outras condições in vitro podem simular populações de espécies mistas, por exemplo, que incluem uma série de espécies em simbiose ou interação em estreita proximidade. Muito do estudo sobre fagos e bacteriano é realizado em culturas nas quais as razões de hospedeiro alvo e fago são artificiais e não fisiológicas. Um ambiente in vivo é, de preferência, num organismo hospedeiro infetado pela bactéria. Ambientes in vivo incluem órgãos, como bexiga, rim, pulmão, pele, coração e vasos sanguíneos, estômago, intestino, fígado, cérebro ou medula espinhal, órgãos sensoriais, tais como olhos, ouvidos, nariz, língua, pâncreas, baço, tiroide, etc. Ambientes in vivo incluem tecidos, tais como gengivas, tecido nervoso, tecido linfático, tecido glandular, sangue, expetoração, etc., e podem refletir interações cooperativas de espécies diferentes cuja sobrevivência pode depender das suas interações em conjunto. Cateteres, implantes e dispositivos de monitorização ou tratamento que são introduzidos no corpo podem ser fontes de infeção sob a utilização normal. Ambientes in vivo também incluem a superfície dos alimentos, por exemplo, peixe, carne, ou materiais vegetais. Carnes incluem, por exemplo, carne de vaca, carne de porco, galinha, peru, codorniz, ou outras aves de capoeira. Materiais vegetais incluem vegetais, frutas ou sumos feitos a partir de frutas e/ou vegetais. Em algumas formas de realização, superfícies que tenham entrado em contato com um produto alimentar infetado por uma bactéria são tratadas com uma proteína TAME ou uma proteína quimérica compreendendo uma proteína TAME, por exemplo, ORF56 ou ORF49. A "introdução" de uma composição num ambiente inclui a administração de um composto ou composição, e o contacto da bactéria com os tais. A introdução do referido composto ou composição pode muitas vezes ser realizada por bactérias vivas que podem produzir ou libertar os tais.

Uma "proteína degradadora da parede celular" é uma proteína que tem atividade degradadora detetável, por exemplo, substancial, da parede celular ou componentes da mesma. A atividade "lítica" pode ser uma forma extrema ou resultado da atividade degradadora. Polipéptidos bactericidas exemplificativos incluem, por exemplo, produtos de ORF56 ou ORF49, entidades estruturalmente relacionadas, mutantes e variantes dos mesmos, e outras construções relacionadas derivadas a partir dos mesmos, ou a partir dos fagos twort, K, G1 ou phll. Sequências particularmente preferidas são derivadas, por exemplo, a partir de ORF005 do fago G1 de Staph (veja-se gi:66394954, YP_240921.1) , a partir de ORF007 do fago Twort de Staph (veja-se gi:66391262, YP_238566.1), ou a partir do fago P100 de Listeria (veja-se gi:82547634, YP_406405.1). Atividades degradadoras semelhantes serão identificadas pela sua localização nas caudas de fagos ou pontos de contacto dos hospedeiros alvo do fago natural, remanescentes de fagos mutados (por exemplo, piocinas ou bacteriocinas), ou codificadas por sequências de pró-fago. Segmentos preferidos são derivados, por exemplo, a partir de ORF56 ou ORF49, lisostafina (lss) de S. simulans, peptidase LytM de S. aureus, ALEI de S. capitis, e outros polipéptidos muralíticos da cauda de fago.

Um "polipéptido ORF56" ou variante gramatical do mesmo, refere-se a uma atividade bacteriostática ou bactericida codificada pelo ORF56 do fago K de Staphylococcus (caracteristicas estruturais associadas são relacionados com gi|48696445) . Exemplos de polipéptidos ORF56 variantes incluem variantes polimórficas de polipéptidos, alelos, mutantes e homólogos entre espécies que: (1) têm uma sequência de aminoácidos que tem mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferência, cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, em relação a uma ou mais regiões, por exemplo, de pelo menos cerca de 8, 12, 17, 25, 33, 50, 65, 80, 100, 200, ou mais aminoácidos, com uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico ORF56 do fago K de Staphylococcus, veja-se, por exemplo, o Número de Acesso YP_024486, ou com uma sequência de aminoácidos de um polipéptido muralitico a partir do fago Twort, K, ou G1 de Staph; (2) ligam-se aos anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais, criados contra um imunogénio substancialmente purificado, que compreende uma sequência de aminoácidos de um fragmento ativo de ORF56, e variantes modificadas de forma conservadora dos mesmos; (3) hibridizam especificamente sob condições de hibridização rigorosas, com uma cadeia antisentido correspondente a uma sequência natural de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido ORF56, e variantes modificadas de forma conservadora do mesmo; (4) têm uma sequência de ácidos nucleicos que tem mais do que cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, de preferência, mais do que cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência de nucleótidos, de preferência em relação a uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, etc., ou mais nucleótidos, com o ácido nucleico que codifica a ORF56 ou um ácido nucleico que codifica um fragmento da mesma. Segmentos particularmente preferidos são derivados a partir do dominio CHAP. Os ácidos nucleicos e proteínas da invenção incluem tanto as moléculas naturais como recombinantes. O polipéptido ORF56 de comprimento completo e fragmentos truncados de terminal N do mesmo, tão pequenos como cerca de 16 kD, tipicamente, têm uma atividade de degradação nos componentes da parede celular. Ensaios para a atividade de degradação de componentes da parede celular podem ser realizados de acordo com métodos conhecidos dos peritos na especialidade, e conforme descritos no presente documento. Em formas de realização preferidas, o polipeptídeo ORF56 tem atividade bactericida contra várias estirpes bacterianas de Staphylococcus, incluindo as espécies aureus, epidermidis, lentis e carnosus. Medidas análogas de comparação podem ser aplicáveis a outras sequências, por exemplo, ORF49, descrita no presente documento.

Os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de degradação da parede celular podem, em algumas formas de realização, ser amplificados utilizando iniciadores de PCR baseados na sequência de polipéptidos de degradação da parede celular descritos. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam variantes do polipéptido ORF56 e fragmentos do mesmo, bem como, prováveis candidatos de atividade de degradação da parede, podem ser amplificados utilizando os iniciadores. Veja-se, por exemplo, Vybiral, et al., (2003) FEMS Microbiol. Lett. 219: 275-283. Assim, os polipéptidos de degradação da parede celular e fragmentos dos mesmos incluem polipéptidos que são codificados pelos ácidos nucleicos que são amplificados por PCR com base na sequência dos polipéptidos de degradação da parede celular identificados. Numa forma de realização preferida, um polipéptido bactericida ou bacteriostático ou fragmento do mesmo é codificado por um ácido nucleico que é amplificado pelos iniciadores relevantes para as sequências ORF56 ou ORF49 descritas.

Um "componente de partículas de fago" refere-se a, por exemplo, um componente de cabeça ou cauda de um fago, por exemplo, fagos K, Twort, G1 ou phill. No entanto, a invenção proporciona que muitos tipos diferentes de fagos possam ser fontes de atividade "lítica" livremente atribuída aos componentes do fago. Veja-se, por exemplo, Piuri e Hatfull (2006) "A peptidoglycan hydrolase motif within the mycobacteriophage TM4 tape measure protein promotes efficient infection of stationary phase cells" Molecular Microbiology 62:1569 - 1585. Um ácido nucleico de fago refere-se a um componente de um ácido nucleico de um fago e inclui ácidos nucleicos de cadeia simples e dupla, por exemplo, ADN, ARN ou moléculas híbridas. Sequências relacionadas podem ser encontradas em pró-fagos ou genomas de fagos incompletos, encontrados normalmente integrados no cromossoma do hospedeiro bacteriano. Os componentes da cauda normalmente fazem a mediação do reconhecimento e da ligação do fago ao hospedeiro alvo e podem possuir atividades de degradação da parede celular que ajudam na penetração dos componentes do fago no hospedeiro. "Condições de BPF" referem-se a boas práticas de fabrico, conforme definidas pela Food and Drug Administration do Governo dos Estados Unidos. Práticas e regulamentos análogos existem na Europa, Japão e na maioria dos países desenvolvidos. 0 termo "substancialmente", nas definições anteriores de "substancialmente puro" significa, geralmente, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, ou mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% puro, quer sejam proteínas, ácidos nucleicos ou outras moléculas estruturais ou outras classes de moléculas. O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de um modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são os codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogo de aminoácido refere-se a um composto que tem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, por exemplo, um carbono α está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfónio de metilmetionina. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas que conservam uma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Mimético de aminoácido refere-se a um composto químico que possui uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma forma semelhante a um aminoácido de ocorrência natural. "Proteína", "polipéptido" ou "péptido" refere-se a um polímero em que a maioria ou todos os monómeros são aminoácidos e estão unidos através de ligações amida, alternativamente referido como um polipéptido. Quando os aminoácidos são α-aminoácidos, tanto o isómero ótico L ou o isómero ótico D podem ser utilizados. Adicionalmente, aminoácidos não naturais, por exemplo β-alanina, fenilglicina e homoarginina, estão também incluídos. Na presente invenção também se podem utilizar os aminoácidos que não são codificados por um gene. Além disso, os aminoácidos que tenham sido modificados para incluir uma estrutura adequada ou grupos reativos podem também ser utilizados na invenção. Os aminoácidos utilizados na presente invenção podem ser os isómeros D ou L ou misturas dos mesmos. Os isómeros L são geralmente preferidos. Além disso, outros peptidomiméticos também são úteis na presente invenção. Para uma revisão geral, veja-se, Spatola, em Weinstein, et al. (eds., 1983) CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, Marcel Dekker, Nova Iorque, p. 267. 0 termo "recombinante" quando utilizado em referência a uma célula indica que a célula replica um ácido nucleico heterólogo, ou expressa um péptido ou uma proteína codificada por um ácido nucleico heterólogo. As células recombinantes podem conter genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula. As células recombinantes também podem conter genes que se encontram na forma nativa da célula, em que os genes são modificados e reintroduzidos na célula através de meios artificiais. 0 termo abrange também células que contêm um ácido nucleico endógeno à célula que foi modificada sem remoção do ácido nucleico da célula; tais modificações incluem aquelas obtidas por substituição de genes, mutação especifica de sitio e técnicas relacionadas. Em particular, podem-se gerar fusões de sequências, por exemplo, incorporando uma cassete de secreção a montante da sequência desejada para produzir o produto proteico secretado.

Uma "proteína de fusão" refere-se a uma proteína que compreende sequências de aminoácidos que são, adicionalmente a, em vez de, menos do que e/ou diferentes das sequências de aminoácidos que codificam a proteína original ou nativa de comprimento completo ou subsequências da mesma. Mais do que um domínio adicional pode ser adicionado a uma proteína litica de parede celular, tal como descrito no presente documento, por exemplo, um marcador de epítopo ou marcador de purificação, ou múltiplos marcadores de epítopos ou marcadores de purificação. Domínios adicionais podem ser ligados, por exemplo, os quais podem adicionar atividades líticas adicionais (no alvo ou organismos associados de uma colónia de mista ou biofilme), atividades de degradação da cápsula bacteriana, funções de direcionamento, ou os quais afetam os processos fisiológicos, por exemplo, a permeabilidade vascular. Alternativamente, os domínios podem ser associados para resultar na afinidade física entre diferentes polipéptidos para produzir complexos poliméricos de multicadeia. 0 termo "ácido nucleico" refere-se a um desoxirribonucleótido, ribonucleótido ou polímero misto sob a forma de cadeia simples ou dupla, e a menos que de outro modo limitado, engloba análogos conhecidos de nucleótidos naturais que hibridizam com os ácidos nucleicos de um modo semelhante aos nucleótidos que ocorrem naturalmente. A menos que de outra forma especificado ou indicado pelo contexto, uma sequência de ácido nucleico particular inclui a sequência complementar da mesma.

Uma "cassete de expressão recombinante" ou simplesmente uma "cassete de expressão" é uma construção de ácido nucleico gerada de forma recombinante ou sintética, com elementos de ácidos nucleicos que são capazes de afetar a expressão de um gene estrutural em hospedeiros compatíveis com tais sequências. As cassetes de expressão incluem tipicamente pelo menos promotores e/ou sinais de terminação de transcrição. Tipicamente, a cassete de expressão recombinante inclui um ácido nucleico a ser transcrito (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipéptido desejado), e um promotor. Fatores adicionais necessários ou úteis para efetuar a expressão podem também ser utilizados, por exemplo, conforme descrito no presento documento. Em certas formas de realização, uma cassete de expressão também pode incluir sequências de nucleótidos que codificam uma sequência de sinal que dirige a secreção de uma proteína expressa a partir da célula hospedeira. Os sinais de terminação da transcrição, potenciadores, e outras sequências de ácidos nucleicos que influenciam a expressão dos genes podem também ser incluídos numa cassete de expressão. Em certas formas de realização, uma cassete de expressão recombinante que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende uma atividade lítica numa parede celular é expressa numa célula hospedeira bacteriana.

Uma "sequência heteróloga" ou um "ácido nucleico heterólogo", conforme utilizado no presente documento, é um que se origina a partir de uma fonte externa para a célula hospedeira particular ou, se a partir da mesma fonte, é modificado a partir da sua forma original. A modificação da sequência heteróloga pode ocorrer, por exemplo, tratando o ADN com uma enzima de restrição para gerar um fragmento de ADN que é capaz de ser operativamente ligado ao promotor. Técnicas como mutagénese dirigida ao sitio são também úteis para a modificação de uma sequência heteróloga. 0 termo "isolado" refere-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que interferem com a atividade de uma enzima. Para um sacarideo, proteína ou ácido nucleico da presente invenção, o termo "isolado" refere-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material conforme encontrado no seu estado nativo. Normalmente, um sacarideo, proteína ou ácido nucleico isolado da invenção tem uma pureza de pelo menos cerca de 80%, geralmente pelo menos cerca de 90%, e preferivelmente pelo menos cerca de 95%, conforme medido pela intensidade de banda sobre um gel corado com prata ou outro método para determinar a pureza. A pureza ou homogeneidade pode ser indicada por um número de meios bem conhecido na técnica. Por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico numa amostra pode ser resolvido por eletroforese em gel de poliacrilamida e, em seguida, a proteína ou ácido nucleico pode ser visualizado por coloração. Para certos fins, pode ser necessária a alta resolução da proteína ou do ácido nucleico e, por exemplo, HPLC ou um meio semelhante para purificação pode ser utilizado. O termo "operativamente ligado" refere-se à ligação funcional entre uma sequência de controlo da expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, sequência de sinal, ou arranjo dos sítios de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico em que a sequência de controlo da expressão afeta a transcrição e/ou a tradução do ácido nucleico correspondente à segunda sequência.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade" no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou proteínas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou de nucleótidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, conforme medido utilizando um dos algoritmos de comparação de sequências ou por inspeção visual. A frase "substancialmente idênticos" no contexto de dois ácidos nucleicos ou proteínas refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm, no segmento correto, identidade de sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos de, pelo menos, mais do que cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferivelmente uma identidade de sequência de ácido nucleico ou de resíduo de aminoácidos de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, conforme medido utilizando um seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspeção visual. De um modo preferido, existe identidade substancial em relação a uma região das sequências correspondentes em, pelo menos, cerca de 13, 15, 17, 23, 27, 31, 35, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente em relação a uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais preferivelmente as sequências são substancialmente idênticas em relação a pelo menos cerca de 150 resíduos. Pretendem-se comprimentos de ácidos nucleicos correspondentes maiores, embora possa ser considerada a redundância de codões. Numa forma de realização mais preferida, as sequências são substancialmente idênticas em relação ao comprimento total das regiões de codificação.

Para comparar sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de referência e de teste são introduzidas num computador, as coordenadas de subsequências são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Em seguida, o algoritmo de comparação de sequências calcula a percentagem de identidade de sequência com a(s) sequência (s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. 0 alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, através do método de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'1. Acad. Sei. EUA 85:2444, através de implementações computadorizadas destes algoritmos e outros associados (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou através de inspeção visual (veja-se geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (1995 e suplementos) (Ausubel)).

Exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol 215:403-410 e Altschuel, et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respetivamente. Software para a realização de análises de BLAST está acessível ao público através do National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov/) ou fontes semelhantes. Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de sequências de alta pontuação (HSPs), identificando curtas "palavras" de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T limiar de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é o limiar da pontuação da palavra vizinha (Altschul et al., Supra). Estas coincidências iniciais de palavras vizinhas atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-as. Então, a palavra corresponde a estender em ambos os sentidos ao longo de cada sequência de tudo a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências de nucleótido, os parâmetros M (pontuação de recompensa por um par de resíduos correspondentes; sempre> 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos que não se correspondem; sempre <0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de classificação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo cai pela quantidade X do seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza por padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza por padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Nat'l Acad. Sei. EUA 89:10915) .

Além de calcular a percentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja-se, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 90:5873-5787). Uma medida da semelhança fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma numa comparação entre o ácido nucleico teste com o ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,1, mais preferentemente menos que cerca de 0,01, e o mais preferentemente menos que cerca de 0,001,

Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou proteínas são substancialmente idênticas é que a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico tem reatividade cruzada imunológica com a proteína codificada pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Por conseguinte, normalmente, uma proteína é substancialmente idêntica a uma segunda proteína quando, por exemplo, os dois péptidos diferem apenas em substituições conservadoras. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridam uma com a outra sob condições de restringência, conforme descrito abaixo. A frase "hibridizando especificamente com" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula apenas com uma sequência de nucleótidos particular, sob condições de restringência quando essa sequência está presente numa mistura complexa (por exemplo, celular total) de ADN ou ARN. O termo "condições de restringência" refere-se a condições sob as quais uma sonda hibridizará com a sua subsequência alvo, mas não com outras sequências. As condições de restringência são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridizam especificamente a temperaturas mais elevadas. Geralmente, as condições de restringência são selecionadas para serem cerca de 15 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob uma força iónica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) na qual 50% das sondas complementares com a sequência alvo hibridizam com a sequência alvo em equilíbrio. (Como as sequências alvo estão geralmente presentes em excesso, à Tm 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Tipicamente, as condições de restringência serão aquelas em que a concentração salina é inferior a uma concentração de iões Na de cerca de 1,0 M, tipicamente concentração de iões Na (ou de outros sais) de cerca de 0,01 a 1,0 M a um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleótidos) . As condições de restringência podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é tipicamente de pelo menos duas vezes a hibridização inicial, preferivelmente 10 vezes a hibridização inicial. Exemplos de condições de hibridação de restringência podem ser conforme se segue: formamida a 50%, 5x SSC e SDS a 1%, incubando a 42 °C, ou 5x SSC, SDS a 1%, incubando a 65 °C com lavagem em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36 °C é típica para a amplificação de baixa restringência, embora as temperaturas de hibridização possam variar entre cerca de 32-48 °C, dependendo do comprimento do iniciador. Para a amplificação por PCR de alta restringência, é típica uma temperatura de cerca de 62 °C, embora temperaturas de hibridização de alta restringência possam variar desde cerca de 50 °C até cerca de 65 °C, dependendo do comprimento e especificidade do iniciador. Condições de ciclo típicas para as amplificações de alta e baixa restringência incluem uma fase de desnaturação de 90-95 °C durante 30-120 segundos, uma etapa de hibridização com 30-120 segundos de duração e uma fase de extensão de aproximadamente 72 °C durante 1-2 min. Protocolos e orientações para as reações de amplificação de restringência alta e baixa estão disponíveis, por exemplo, em Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Nova Iorque.

As frases "liga-se especificamente a uma proteína" ou "é especificamente imunorreativo com", quando se refere a um anticorpo refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína na presença de uma população heterogénea de proteínas e outros produtos biológicos. Portanto, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados ligam-se preferivelmente a uma proteína particular e não se ligam numa quantidade significativa a outras proteínas presentes na amostra. A ligação específica a uma proteína sob tais condições requer um anticorpo que é selecionado pela sua especificidade para uma proteína particular. Podem ser utilizados vários formatos de imunoensaio para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios de ELISA de fase sólida são rotineiramente utilizados para selecionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreativos com uma proteína. Veja-se Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque, para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser utilizados para determinar imunorreatividade especifica. "Variações modificadas de forma conservadora" de uma sequência polinucleotídica particular, refere-se àqueles polinucleótidos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou substancialmente idênticas, ou quando o polinucleótido não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Tendo em conta a degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer dada proteína. Por exemplo, os codões CGU, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG todos codificam o aminoácido arginina. Assim, em cada posição em que uma arginina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado e convertido num dos outros codões correspondentes descritos sem alterar a proteína codificada. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de "variações modificadas de forma conservadora". Cada sequência de polinucleótidos descrita no presente documento, que codifica uma proteína também descreve possíveis variações silenciosas, exceto quando indicado em contrário. Um perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único codão para a metionina, e UGG, que geralmente é o único codão para o triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica através de técnicas convencionais. Por conseguinte, cada "variação silenciosa" de um ácido nucleico que codifica uma proteína está tipicamente implícita em cada sequência descrita.

Os peritos reconhecerão que muitos aminoácidos podem ser substituídos por outro numa proteína sem afetar a função da proteína, por exemplo uma substituição conservadora pode ser a base de uma variante modificada de forma conservadora de uma proteína, tal como as proteínas líticas da parede celular divulgadas. Segue-se uma lista incompleta de substituições de aminoácidos conservadoras. Cada um dos oito grupos seguintes contém aminoácidos que são tipicamente substituições conservadoras entre si: 1)

Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4)

Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (1), leucina (L) , metionina (M) , Valina (V) , Alanina (A) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) , cisteína (C) ; e 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (veja- se, por exemplo, Creighton (1984) Proteins) .

Além disso, um perito reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos (tipicamente menos de 5%, mais tipicamente menos de 1%) numa sequência codificada são "variações modificadas de forma conservadora" eficazes em que as alterações resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Quadros de substituições conservadoras que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidos na técnica.

Um perito na especialidade apreciará que muitas variações conservadoras de proteínas, por exemplo, proteínas líticas da parede celular e ácidos nucleicos que codificam proteínas dão produtos essencialmente idênticos. Por exemplo, devido à degenerescência do código genético, "substituições silenciosas" (por exemplo, substituições de uma sequência de ácido nucleico que não resultam numa alteração numa proteína codificada) são uma característica implícita de cada sequência de ácido nucleico que codifica um aminoácido. Conforme descrito no presente documento, as sequências são, de preferência, otimizadas para a expressão numa célula hospedeira particular utilizada para produzir proteínas líticas da parede celular (por exemplo, de leveduras, de ser humano e semelhantes) . Do mesmo modo, "substituições de aminoácidos conservadoras", num ou poucos aminoácidos numa sequência de aminoácidos são substituídas por diferentes aminoácidos com propriedades altamente semelhantes, são também prontamente identificados como sendo altamente semelhantes a uma sequência de aminoácidos particular ou a uma sequência de ácidos nucleicos específica que codifica um aminoácido. Tais variações substituídas de forma conservadora de qualquer sequência particular são uma característica da presente invenção. Veja-se também, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and

Company. Além disso, as substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou excluem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos numa sequência codificada também são geralmente "variações modificadas de forma conservadora". A prática da presente invenção pode envolver a construção de ácidos nucleicos recombinantes e a expressão de genes em células hospedeiras, preferivelmente células hospedeiras bacterianas. A utilização de codões otimizada para um hospedeiro específico, será muitas vezes aplicável. Técnicas de clonagem molecular para atingir estes fins são conhecidas na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e de amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes, tais como vetores de expressão é bem conhecida para os peritos na especialidade. Exemplos dessas técnicas e instruções suficientes para orientar os peritos através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enrymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. , eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1999) (Ausubel). Células hospedeiras adequadas para a expressão dos polipéptidos recombinantes são conhecidas para os peritos na especialidade e incluem, por exemplo, células procariotas, tais como E. coli, e células eucariotas incluindo células de fungos, mamíferos e insetos (por exemplo Aspergillus niger) .

Exemplos de protocolos suficientes para orientar peritos na especialidade através de métodos in vitro de amplificação, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da ligase (LCR) , amplificação de Qp-replicase e outras técnicas mediadas pela ARN polimerase são encontrados em Berger, Sambrook, e Ausubel, bem como Mullis et al. (1987) Pedido de Patente US N.° 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim e Levinson (1 de outubro de 1990) C&EN 36-47; The Jornal Of NIHResearch (1991) 3:81-94; (Kwoh, et al. (1989) Proc Natl Acad Sei. EUA 86:1173; Guatelli, et al. (1990) Proc Natl Acad Sei EUA 87:1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren, et al. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990), Biotechnology 8:291-294; Wu e Wallace (1989) Gene 4:560; e Barringer, et al. (1990)

Gene 89:117. Métodos melhorados para clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro estão descritos em Wallace, et al., Patente US N.° 5.426.039. IV. Aplicações Comerciais Várias aplicações das atividades enzimáticas descritas podem ser imediatamente reconhecidas. Uma aplicação importante é um tratamento antibacteriano de artigos que podem ser contaminados com a utilização normal. Locais, equipamentos, ambientes ou semelhantes em que as bactérias alvo podem representar riscos para a saúde pública podem ser tratados utilizando tais entidades. Os locais de interesse incluem as unidades de saúde públicas, onde existe um propósito ou oportunidade para lidar com materiais que contenham bactérias alvo. Estes materiais podem incluir produtos residuais, por exemplo, líquidos, sólidos ou ar. Estações de tratamento de águas residuais podem incorporá-las para remover o alvo do efluente, quer por tratamento com as entidades enzimáticas diretamente ou por libertação de células produtoras das mesmas. Depósitos de resíduos sólidos podem introduzi-las para minimizar a possibilidade de surtos de hospedeiros alvo. Por outro lado, as áreas ou equipamentos de preparação de comida devem ser limpos regularmente e a invenção proporciona composições e meios para eliminar eficazmente as bactérias alvo. Ambientes médicos e outros ambientes públicos sujeitos à contaminação podem exigir meios semelhantes para minimizar o crescimento e propagação de microrganismos alvo. Os métodos podem ser utilizados em contextos em que a eliminação por esterilização das bactérias alvo é desejada, incluindo os sistemas de filtração do ar para uma unidade de cuidados intensivos.

Aplicações alternativas incluem a utilização no contexto veterinário ou médico. Meios para determinar a presença de bactérias particulares ou para identificar alvos específicos podem utilizar o efeito de agentes seletivos sobre a população ou cultura. Pode ser desejável incluir atividades bactericidas ou bacteriostáticas em agentes de limpeza, incluindo a lavagem de animais e animais de estimação. A ORF56 e polipéptidos relacionados podem ser utilizados para tratar infeções bacterianas de, por exemplo, seres humanos ou animais. Estes polipeptídeos podem ser administrados profilaticamente ou podem ser administrados a um indivíduo que tenha contraído uma infeção bacteriana. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos ORF56 são usados para tratar infeções causadas por bactérias que se replicam lentamente uma vez que o mecanismo de morte não é dependente da replicação da célula hospedeira. Muitos agentes antibacterianos, por exemplo, antibióticos, são mais úteis contra a replicação bacteriana. Bactérias que se reproduzem lentamente têm tempos de duplicação de, por exemplo, cerca de 1-72 horas, 1-48 horas, 1-24 horas, 1-12 horas, 1-6 horas, 1-3 dias ou 1-2 dias.

Numa forma de realização preferida, estas proteínas são utilizadas para tratar seres humanos ou outros animais infetados com uma espécie de Staphylococcus. Numa outra forma de realização preferida, as proteínas ORF56 ou ORF49 são utilizadas para tratar seres humanos ou outros animais que estão infetados com espécies de Staphylococcus resistentes à meticilina. V. Administração A via de administração e a dosagem variará com a(s) estirpe (s) de bactérias infeciosas, o local e extensão da infeção (por exemplo, local ou sistémica) e o indivíduo a ser tratado. As vias de administração incluem, mas não estão limitadas a: oral, aerossol ou outro dispositivo para distribuição aos pulmões, pulverização nasal, intravenosa (iv), intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraocular, vaginal, rectal, tópica, por punção lombar, intratecal e aplicação diretamente no cérebro e/ou nas meninges. Os excipientes que podem ser utilizados como um veículo para a distribuição da terapêutica serão aparentes para os peritos na especialidade. Por exemplo, a enzima pode estar na forma liofilizada e ser dissolvida imediatamente antes da administração através de injeção IV. Está contemplado que a dosagem de administração está no intervalo de cerca de 0,03, 0, 1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1.000, 3.000, 10.000 ou mais moléculas de enzima por bactéria na infeção do hospedeiro. Dependendo do tamanho da proteína, a qual pode estar associada em tandem ou na forma de múltiplas subunidades (dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero e semelhantes) ou em combinação com uma ou mais entidades, por exemplo, enzimas ou fragmentos de especificidade diferente, a dose pode ser de cerca de 1 milhão até cerca de 10 triliões/por kg/por dia, e preferivelmente de cerca de 1 trilião/por kg/por dia, e pode ser desde cerca de 10E6 unidades de destruição/kg/dia a cerca de 10E13 unidades de destruição/kg/dia.

Os métodos para avaliar a capacidade de destruição podem ser semelhantes aos métodos utilizados pelos peritos para avaliar a replicação do fago intacto, por exemplo, unidades formadoras de placas ou ufp, embora as unidades de destruição possam ser melhor avaliadas através da determinação do número de bactérias sobreviventes após a titulação de unidades de destruição. A quantificação da destruição é mais distinta, no entanto, porque o fago não replicante não formará placas sobre os mantos bacterianos. Assim, os métodos de diluição em série para avaliar a quantidade de unidades de "destruição" são convenientemente utilizados em vez de ufp padrão. As diluições em série de culturas bacterianas expostas às composições de destruição podem quantificar as unidades de destruição. Como alternativa, comparando as contagens bacterianas totais com unidades de colónias viáveis pode-se estabelecer qual é a fração de bactérias que é realmente viável e, por implicação, que fração foi suscetível às construções de destruição. Outras medidas da atividade em substratos artificiais ou substratos especialmente preparados podem normalmente ser utilizadas como medições alternativas de unidades de destruição. 0(s) agente(s) terapêutico(s) são normalmente administrados até ser alcançada a eliminação bem sucedida das bactérias patogénicas, embora formulações de amplo espectro possam ser utilizadas enquanto o diagnóstico específico da estirpe infetante está a ser determinado. Portanto, a invenção contempla formas de dosagem unitárias, bem como várias formas de dosagem das composições da invenção bem como métodos para obter meios de libertação sustentada para distribuição das tais formas de dosagem única ou múltipla.

No que diz respeito à administração em aerossol aos pulmões ou outras superfícies mucosas, a composição terapêutica é incorporada numa formulação de aerossol especificamente concebida para administração. Muitos de tais aerossóis são conhecidos na técnica e a presente invenção não está limitada a qualquer formulação particular. Um exemplo de um tal aerossol é o inalador de Proventil fabricado pela Schering-Plough, o propulsor do qual contém tricloromonofluorometano, diclorodifluorometano e ácido oleico. Outras formas de realização incluem inaladores que são concebidos para a administração às passagens nasais e aos seios de um indivíduo ou paciente. As concentrações dos ingredientes do propulsor e emulsionantes são ajustadas, se necessário, com base na composição específica a ser utilizada no tratamento. 0 número de unidades de destruição enzimáticas a serem administradas através de tratamento por aerossol estará tipicamente no intervalo de cerca de 10E6 até 10E13 unidades de destruição, e preferivelmente cerca de 10E12 unidades de destruição. Métodos de avaliação da capacidade de destruição, são muitas vezes semelhantes a muitos métodos utilizados no trabalho com fagos replicantes intactos. Em particular, a quantificação da destruição é mais difícil, uma vez que o fago não replicante não formará placas em bactérias. Assim, os métodos de diluição em série para avaliar a quantidade de unidades de "destruição" serão realizados de forma semelhante a uma ufp padrão (unidades formadoras de placas), mas não é possível utilizar a destruição e a amplificação que ocorre num manto bacteriano. As diluições em série de culturas bacterianas expostas às composições de destruição podem quantificar unidades de destruição. Como alternativa, comparando as contagens bacterianas totais com unidades de colónias viáveis pode estabelecer qual é a fração de bactérias que é realmente viável e, por implicação, que fração foi suscetível às construções de destruição. Outros meios para a avaliação da atividade de estase podem incluir a libertação de conteúdos intracelulares, sejam naturais ou carregados, ou a atividade enzimática em substratos preparados ou definidos que correspondem a estruturas das paredes celulares naturais.

Normalmente, a destruição irá diminuir a replicação bacteriana em, pelo menos, cerca de 3 vezes e poderá afetá-la em, pelo menos, cerca de 10, 20, 100, 300, etc, até muitas ordens de magnitude. No entanto, mesmo a desaceleração da taxa de replicação bacteriana sem destruição pode ter um valor comercial e terapêutico significativo. Eficiências de inativação genética preferidas podem ser de 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3, 5, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais unidades de log. VI. Formulações São descritas no presente documento composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma enzima de degradação da parede, por exemplo, muramidase, da invenção, fornecida num excipiente farmaceuticamente aceitável. As formulações e composições farmacêuticas contemplam assim formulações que compreendem um segmento enzimático isolado para uma bactéria específica; uma mistura de duas, três, cinco, dez, ou vinte ou mais enzimas que afetam o mesmo ou o típico hospedeiro bacteriano; e uma mistura de dois, três, cinco, dez ou vinte ou mais enzimas que afetam bactérias diferentes ou estirpes diferentes da mesma bactéria, por exemplo, uma mistura cocktail de enzimas que em conjunto inibem o crescimento de várias estirpes de Staphylococcus aureus. Assim, as composições podem ser adaptadas às necessidades do paciente. Os compostos ou as composições irão tipicamente ser praticamente estéreis ou estéreis .

Por "dose terapeuticamente eficaz" entende-se no presente documento, uma dose que produz os efeitos, bacteriostáticos ou preferivelmente bactericidas, para os quais é administrada. A dose exata irá depender da finalidade do tratamento e será determinada por um perito na especialidade utilizando técnicas conhecidas. Veja-se, por exemplo, Ansel, et al. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Lieberman (1992) Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1 - 3), Dekker, ISBN 0824770846, 0824769 1 8X, 0824712692, 0824716981; Lloyd (1999) The Art, Science and 31 Technology of Pharmaceutical Compounding; e Pickar (1999) Dosage Calculations. Como é conhecido na técnica, podem ser necessários ajustes da degradação de proteínas, administração sistémica contra localizada e taxa de síntese de novas protéases, bem como da idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, momento de administração, interação com fármacos, espectro dos componentes bacterianos na colónia e da gravidade da condição e serão determinados com alguma experimentação realizada pelos peritos na especialidade. Vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Conforme utilizando no presente documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui um material que, quando combinado com um ingrediente ativo de uma composição, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e sem causar reações perturbadoras com o sistema imunitário do indivíduo. Estes podem incluir estabilizantes, conservantes, complexos de sal ou de açúcar ou cristais e semelhantes.

Portadores farmacêuticos exemplificativos incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, excipientes farmacêuticos convencionais, tais como solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões, tais como emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes humectantes. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etilo. Os portadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem restabelecedores de fluidos e nutrientes e restabelecedores de eletrólitos, (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Noutras formas de realização, as composições serão incorporadas em matrizes sólidas, incluindo partículas de libertação lenta, esferas de vidro, ligaduras, inserções oculares e formas tópicas.

Uma composição compreendendo uma enzima descrita no presente documento também pode ser liofilizada utilizando meios bem conhecidos na técnica, por exemplo, para a reconstituição e utilização subsequente.

Também de interesse são as formulações para a distribuição lipossómica, e formulações que compreendem enzimas microencapsuladas, incluindo os cristais de açúcar. As composições que compreendem tais excipientes são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Capitulo 43, 14a Ed., Mack Publishing Col, Easton PA 18042, EUA) .

Em geral, as composições farmacêuticas podem ser preparadas em várias formas, tais como grânulos, comprimidos, pílulas, supositórios, cápsulas (por exemplo adaptadas para administração por via oral), micropérolas, microesferas, lipossomas, suspensões, pomadas, loções e semelhantes. Portadores e/ou diluentes orgânicos ou inorgânicos de grau farmacêutico adequados para utilização oral e tópica podem ser utilizados para formar composições que compreendem os compostos terapeuticamente ativos. Os diluentes conhecidos na técnica incluem meios aquosos, óleos vegetais e animais e gorduras. As formulações podem incluir agentes estabilizantes, humectantes e emulsionantes, sais para variar a pressão osmótica ou tampões para assegurar um valor de pH adequado. A composição farmacêutica pode compreender outros componentes além da enzima "lítica". Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem compreender mais do que um ingrediente ativo, por exemplo, duas ou mais, três ou mais, cinco ou mais, ou dez ou mais enzimas diferentes, onde as diferentes enzimas podem ser especificas para as mesmas bactérias, para bactérias diferentes ou acompanhantes. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter múltiplas (por exemplo, pelo menos, duas ou mais) enzimas de degradação da parede definidas, em que pelo menos duas das enzimas na composição têm especificidade bacteriana diferente. Assim, a composição terapêutica pode ser adaptada para tratar uma infeção mista de diferentes bactérias, ou pode ser uma composição selecionada para ser eficaz contra vários tipos de infeções comumente encontradas num ambiente institucional particular. Uma combinação selecionada pode resultar, por exemplo, da seleção de diferentes grupos de entidades "líticas" ou de degradação da parede derivadas a partir de vários bacteriófagos de especificidade diferente de modo a conter pelo menos um componente eficaz contra bactérias diferentes ou criticas (por exemplo, estirpe, espécie, etc.) suspeitas de estarem presentes na infeção (por exemplo, no local infetado). Conforme observado acima, a enzima de degradação da parede pode ser administrada em conjunto com outros agentes, tais como um agente antimicrobiano convencional. Em algumas formas de realização, pode ser desejável administrar a enzima e antibiótico dentro da mesma formulação. VII. Metodologia

Alguns aspetos da prática da presente invenção envolve métodos bem conhecidos na microbiologia clinica geral, métodos gerais para manipular bacteriófagos e fundamentos gerais de biotecnologia, princípios e métodos. A. Microbiologia clínica geral A microbiologia é o estudo dos microrganismos. Veja-se, por exemplo, Sonenshein, et ai. (eds. 2002) Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells

Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 1555812058; Alexander e Strete (2001) Microbiology: A Photographic Atlas for the

Laboratory Benjamin/Cummings, ISBN: 0805327320; Cann (2001) Principles of Molecular Virology (Book with CD-ROM; 3a ed.), ISBN: 0121585336; Garrity (ed. 2005) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2 vol. 2a ed.) Plenum, ISBN: 0387950400; Salyersand Whitt (2001) Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (2a ed.) Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 155581171X; Tierno (2001) The Secret Life of Germs: Observations and Lessons fi-om a Microbe Hunter Pocket Star, ISBN: 0743421876; Block (ed. 2000) Disinfection,

Sterilization, and Preservation (5a ed.) Lippincott Williams & Wilkins Publ., ISBN: 0683307401; Cullimore (2000) Practical AtIasforBacterial Identification Lewis Pub., ISBN: 1566703921; Madigan, et al., (2000) Brock

Biology of Microorganisms (9a ed.) Prentice Hall, ASIN: 0130819220; Maier, et al., (eds. 2000) Environmental Microbiology Academic Pr., ISBN: 0124975704; Tortora, et al. (2000) Microbiology: An Introduction including

Microbiology Place(TM) Website, Student Tutorial CD-ROM, and Bacteria ID CD-ROM (7a ed.), Benjamin/Cummings, ISBN 0805375546; Demain, et al. (eds. 1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (2a ed.) Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 1555811280;. Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 1555811272; Murray, et al., (ed. 1999) Manual of Clinical Microbiology (7a ed.) Amer. Soc. Microbial., ISBN: 1555811264; Burlage, et al., (eds. 1998) Techniques in Microbial Ecology Oxford Univ. Pr., ISBN: 0195092236; Forbes, et al., (1998) Bailey &

Scott's Diagnostic Microbiology (10a ed.) Mosby, ASIN: 0815125356; Schaechter, et al., (ed. 1998) Mechanism of Microbial Disease (3a ed.) Lippincott, Williams & Wilkins, ISBN: 0683076051; Tomes (1998) The Gospel of Germs: Men,

Women, and the Microbe in American Life Harvard Univ. Pr., ISBN: 0674357078; Snyderand Champness (1997) Molecular

Genetics of Bacteria Amer. Soc. Microbiol. ISBN: 1555811027; Karlen (1996) MAN AND MICROBES: Disease and

Plagues in History and Modern Times Touchstone Books, ISBN: 0684822709; e Bergey (ed. 1994) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9a ed.) Lippincott, Williams & Wilkins, ISBN: 0683006037. B. Métodos gerais para a manipulação de bacteridfagos

Os métodos gerais para a manipulação de bacteriófagos são bem conhecidos, veja-se, por exemplo, Snustad and Dean (2002) Genetics Experiments with Bacterial Viruses Freeman; O'Brien and Aitken (eds. 2002) Antibody Phage Display: Methods and Protocols Humana; Ring e Blair (eds. 2000) Genetically Engineered Viruses BIOS Sei. Pub.; Adolf (ed. 1995) Methods in Molecular Genetics: Viral Gene Techniques vol. 6, Elsevier; Adolf (ed. 1995) Methods in Molecular Genetics: Viral Gene Techniques vol. 7, Elsevier; e Hoban e Rott (eds. 1988) Molec. Biol, of Bacterial Virus Systems (Current Topics in Microbiology and Immunology No. 136) Springer-Verlag. C. Fundamentos gerais de biotecnologia, princípios e métodos

Os fundamentos gerais de biotecnologia, princípios e métodos descrevem-se em, por exemplo, Alberts, et ai. (2002) Molecular Biology of the Cell (4a ed.) Garland ISBN: 0815332181; Lodish, et al. (1999) Molecular Cell Biology (4a ed.) Freeman, ISBN: 071673706X; Janeway, et al. (eds. 2001) Immunobiology (5a ed.) Garland, ISBN: 081533642X;

Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology: Molecular

Biology, Pathogenesis, e Control Amer. Soc. Microbiol., ISBN: 1555811272; Nelson, et al. (2000) Lehninger

Principles of Biochemistry (3a ed.) Worth, ISBN: 1572599316; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A

Manual of Basic Technique (4a ed.) Wiley-Liss; ISBN: 0471348899; Arias e Stewart (2002) Molecular Principles of

Animal Development, Oxford University Press, ISBN: 0198792840; Griffiths, et al. (2000) An Introduction to Genetic Analysis (7a ed.) Freeman, ISBN: 071673771X; Kierszenbaum (2001) Histology and Cell Biology, Mosby, ISBN: 0323016391; Weaver (2001) Molecular Biology (2a ed.) McGraw-Hill, ISBN: 0072345179; Barker (1998) At the Bench: A Laboratory Navigator CSH Laboratory, ISBN: 0879695234; Branden e Tooze (1999) Introduction to Protein Structure (2a ed.), Garland Publishing; ISBN: 0,815323050; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3° vol., 3a ed.), CSH Lab. Press, ISBN: 0879695773; e Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice (3a ed.) Springer Verlag, ISBN: 0387940723. D. Mutagénese; especifica de sítio, aleatória, embaralhamento

Com base nas descrições estruturais e funcionais fornecidas no presente documento, podem ser isolados ou gerados homólogos ou variantes que podem otimizar caracteristicas preferidas. Assim, segmentos catalíticos adicionais de funções de penetração fagos podem ser encontrados através de homologia estrutural, ou através da avaliação das entidades encontradas em motivos de organização génicos caracteristicos. Os genes da cauda de fagos são normalmente encontrados em arranjos génicos particulares, e outras entidades encontradas nos arranjos correspondentes podem ser testadas para uma função de degradação da parede. Estes também podem servir como os pontos de partida para o rastreio de variantes das estruturas, por exemplo, mutagenizando tais estruturas e rastreando por aquelas que possuem as características desejadas, por exemplo, uma especificidade de substrato mais ampla. Podem-se utilizar métodos de mutagénese padrão, veja-se, por exemplo, Johnson-Boaz, et al., (1994) Mol. Microbiol. 13:495-504; Patentes US 6.506.602, 6.518.065, 6.521.453, 6.579.678, e referências citadas por elas ou nelas contidas.

Os segmentos de ligação podem-se identificar de forma semelhante e, motivos alvo prevalentes ou específicos podem ser rastreados para os domínios de ligação que interagem especificamente com eles. Muitos destes alvos podem estruturas que contêm proteínas, hidratos de carbono ou lípidos de expressão elevada encontradas nas diversas estirpes alvo potenciais. Enquanto são conhecidas muitas proteínas que se ligam às paredes celulares, duas famílias incluem as proteínas de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs, veja-se, por exemplo, Dziarski e Gupta (2006) "The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs)" Genome Biol. 7:232, PMID: 16930467; Dziarski e Gupta (2006) "Mammalian PGRPs: novel antibacterial proteins" Cell Microbiol. 8:1059-69, PMID: 16819960; Lu, et al., (2006) "Peptidoglycan recognition proteins are a new class of human bactericidal proteins" J. Biol. Chem. 281:5895-5907; Dziarski (2004) "Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs)" Mol. Immunol. 40:877-886, PMID: 14698226; Guan, et al., (2004) "Crystal structure of the C-terminal peptidoglycan-binding domain of human peptidoglycan recognition protein la" J. Biol. Chem. 279:31873-882; Liu, et al. (2001) "Peptidoglycan Recognition Proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules" J. Biol. Chem. 276:34686-694; e Werner, et al., (2000) "A family of peptidoglycan recognition proteins in the fruit fly Drosophila melanogaster" Proc. Nat'l Acad. Sei. EUA 97:13772-777) encontrados em espécies de insetos a mamíferos. Existe um segmento conservado de aproximadamente 160 aminoácidos encontrado no terminal C destas proteínas e outros podem ser encontrados através de pesquisas de sequência ou PubMed. Um outro grupo de proteínas que se ligam às bactérias são os recetores do tipo toll (TLR), em particular, TLR4 que deteta diretamente LPS bacteriano; TLR2 que se liga às lipoproteínas bacterianas, pept idoglicano e zimosan de levedura; TLR3 que se liga a ARN de cadeia dupla; e TLR5 que reconhece a flagelina, a proteína dos flagelos bacterianos. As estruturas de pili encontradas na parte de fora da célula bacteriana podem ser uma outra estrutura à qual as proteínas se direcionam para a ligação. A mutagénese pode ampliar a seletividade de ligação ou aumentar a estabilidade dos segmentos ou de toda a construção, as estratégias de deleção podem eliminar segmentos externos.

Os componentes da parede celular das bactérias Gram-positivas podem ser partilhados com componentes da parede celular de bactérias Gram-negativas ou, possivelmente, com outras micobactérias ou esporos. No entanto, podem haver camadas adicionais da parede em bactérias Gram-negativas, que também podem servir como barreiras adicionais ao acesso de fagos. Outras atividades derivadas de fago ou de outros podem ser combinadas para penetrar as estruturas mais complexas da parede celular de bactérias Gram-negativas. Em particular, múltiplos segmentos catalíticos podem fornecer múltiplas atividades catalíticas que podem funcionar de forma sinérgica, dentro de uma única construção, ou que podem proporcionar um efeito sinérgico quando combinadas com outros agentes terapêuticos, por exemplo, antibióticos ou antimicrobianos.

Uma fração de direcionamento pode aumentar uma concentração local de um fragmento catalítico, mas um ligante de comprimento apropriado também pode aumentar localmente o número de eventos de degradação da parede. Portanto, ligantes compatíveis com o alvo e motivos catalíticos ou de comprimento adequado podem ser úteis e aumentar a atividade de penetração catalítica levando à estase ou à destruição das bactérias alvo.

Parte do avanço conceptual da invenção é o reconhecimento de que os fagos foram selecionados para sobreviver fora das células, muitas vezes, em condições biologicamente hostis. Portanto, é provável que as estruturas sejam particularmente robustas e fortes e resistentes às condições ambientais que, de outra forma, poderiam inativar um fago. É provável que as bactérias que vivem em ambientes hostis, por exemplo, ambientes de temperatura extrema, sal, extremos reativos ou de oxidação, pressão elevada, e outros tenham fagos que estão particularmente adaptados para sobreviver fora das células. Consequentemente, estes serão fortes, resistentes a esses extremos e suscetíveis de sobreviver mais facilmente do que as proteínas que não tenham sido submetidas a uma seleção semelhante. E é provável que os polipéptidos derivados destas fontes sejam mais estáveis em vários processos de purificação, armazenamento e condições farmacológicas de utilização. Ainda outro aspeto da invenção é derivado de um pressuposto de que o propósito das estruturas TAME é o de reconhecerem e ligarem-se às bactérias alvo, mas não o de destruírem a célula rapidamente. Portanto, as TAME evoluíram para não serem muito eficazes na destruição sob condições de utilização comercialmente viáveis. As construções ORF56 foram testadas para ver se a atividade bactericida comercialmente viável marginal poderia ser aumentada. De facto, uma combinação de deleção de polipeptídeos e a ligação de uma função de ligação aumentou a atividade para o nível mais atrativos de viabilidade comercial. A ligação a uma fração de direcionamento para a parede celular pode aumentar a concentração local do substrato no local ativo da degradação da parede celular e a deleção de sequência da TAME natural pode eliminar algumas das funcionalidades que podem ser adotadas para limitar a taxa bactericida para impedir a destruição do hospedeiro antes que o fago se possa replicar dentro da célula. E estas características são encontradas ubiquitariamente, tal como são os fagos, como pontos de partida para a recolha e rastreio das propriedades desejadas para estas utilizações. E. Rastreio Métodos de rastreio para avaliar mutantes ou novos segmentos funcionais candidatos podem ser concebidos. Uma preparação purificada das partículas de fago poderia ser submetido a rastreio para a presença de tais produtos de genes na estrutura do fago. A ligação pode utilizar culturas bacterianas brutas, componentes da parede celular bacteriana isolados, preparações de peptidoglicano, substratos sintéticos, ou reagentes purificados para determinar a afinidade e número de ligações alvo nas células alvo. Ensaios de penetração ou de degradação da parede podem ser concebidos, para avaliar a integridade das paredes celulares das estirpes alvo, ensaios de inibição do manto, testes de viabilidade de culturas, atividade sobre as preparações de parede celular ou outros substratos (por exemplo, conforme descrito para motivos de ligação) ou a libertação de componentes (por exemplo, açúcares, aminoácidos, polímeros) da parede celular após ação catalítica. A atividade da amidase pode ser medida pela libertação de N-acetilhexosaminas solúveis (por exemplo, reação de Morgan-Elson modificada) ou atividade da endopeptidase pelo ensaio de grupos amino livres (L-alanina para ala-gly endopeptídases, L-glicina para gly_gly endopeptidases) utilizando um ensaio DNFB), todos estes três ensaios com base em Petit, et al. (1966) "Peptide cross-links in bacterial cell wall peptidoglycans studied with specific endopeptidases from Streptomyces albus G" Biochemistry 5:2764-76; MID: 5968582. A atividade de gly-

gly endopeptidase também pode ser medida como a libertação de grupos amino livres a partir de hexaglicina N-acetilada (acetil-Gly6), veja-se Kline, et al., (1994) "A colorimetric microtiter plate assay for lysostaphin using a hexaglycine substrate" Anal. Biochem. 217:329-331; PMID: 8203764.

As características do ligante podem ser testadas para comparar os efeitos sobre a ligação ou a catálise de ligantes específicos ou para comparar as várias orientações dos fragmentos. Painéis de alvos podem ser rastreados para fragmentos catalíticos que atuam sobre um espectro mais amplo ou mais estreito de bactérias alvo, e podem incluir outros micróbios que podem partilhar componentes da parede celular, por exemplo, micobactérias ou esporos. Isto pode fazer uso de painéis mais amplos de estirpes de Staphylococcus relacionadas, por exemplo, incluindo isolados de carnosus, epidermidis, simulans e lentis. Podem ser concebidas estratégias que permitem o rastreio de um número maior de candidatos ou variantes.

Um método para testar uma atividade de degradação da parede celular é tratar o fago com detergentes suaves ou desnaturantes para libertar proteínas estruturalmente associadas. Estas proteínas são adicionalmente testadas para determinar a atividade de degradação da parede ou "lítica" em células bacterianas. Outro método consiste em verificar a atividade de degradação da parede celular ou a lise desde sem (LO) num hospedeiro bacteriano resistente a fagos. Um terceiro método para avaliar a atividade de degradação da parede ou "lítica" associada com um componente estrutural de fago consiste em realizar ensaios de zimograma, por exemplo, onde uma preparação de fagos pura é submetida a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida incorporando células bacterianas hospedeiras autoclavadas. As proteínas nos géis são deixadas a renaturar in situ e, em seguida, agir sobre os componentes da parede celular resultando em claras zonas "líticas" quando o resto do gel é corado de azul com corante de azul-de-metileno. Veja-se, por exemplo, Lepeuple, et ai., (1998) "Analysis of the bacteriolytic enzymes of the autolytic lactococcus lactis subsp. cremoris strain AM2 by renaturing polyacrylamide gel electrophoresis: identification of a prophage-encoded enzyme". Appl. Environ. Microbiol. 64: 4142-428, PMID: 9797258. As zonas claras são visualizadas e a banda de proteína das zonas eluídas e a identidade são determinadas utilizando, por exemplo, sequenciação N-terminal ou através de espectrometria de massa. Pode-se depois isolar as ORFs que codificam as proteínas. VIII. Isolamento de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos de degradação da parede celular ou de ligação Foram identificados ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação ou "líticas" da parede celular descritas acima, por exemplo fagos K, Twort, Gl, phill de Staph e variantes modificadas de forma conservadora dessas sequências. As proteínas "líticas" da parede celular codificadas têm atividade de degradação da parede celular, e aquelas que codificam os domínios CHAP identificados são candidatos principais, especialmente aquelas em que os domínios CHAP estão em C proximal. Fontes alternativas incluem estruturas semelhantes à cauda dos fagos (por exemplo, piocinas ou partículas de tipo fago defeituosas) ou sequências genómicas que possuem características particulares de elementos que contêm atividade "lítica", por exemplo, que exibem a organização génica característica de tais estruturas (veja-se, por exemplo, Rybchin (1984) "

Genetics of bacteriophage phi 80—a review" Gene 27:3 - 11; PMID: 6232171).

Exemplos de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos "líticos" da parede celular também são relevantes para as formas de realização de ácidos nucleicos da invenção. Os peritos na especialidade reconhecerão métodos de obtenção de tais ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos adequados (por exemplo, ADNc, genómicos, ou subsequências (sondas)) podem ser clonados ou amplificados por métodos in vitro tais como por reacção em cadeia da polimerase (PCR), reacção em cadeia da ligase (LCR), sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS) ou o sistema de replicação de sequência auto-sustentado (SSR) . Além das metodologias de síntese, os peritos na especialidade estão bem cientes de uma ampla variedade de métodos de clonagem e de amplificação in vitro. Exemplos destas técnicas e instruções suficientes para orientar os peritos na especialidade através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, (Sambrook, et al.), (2a ed.); Current

Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1994 suplemento) (Ausubel); Cashion et al. , documento de Patente US número 5.017.478; e Carr, Patente Europeia N.° 0.246.864.

Um ADN que codifica um polipéptido de degradação da parede celular pode ser preparado por um método adequado descrito acima, incluindo, por exemplo, a clonagem e a restrição de sequências adequadas com enzimas de restrição. Numa forma de realização preferida, os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de degradação da parede celular são isolados por métodos de clonagem de rotina. Uma sequência de nucleótidos de um polipéptido de degradação da parede celular, tal como proporcionada, por exemplo, no Número de Acesso YP_024486, pode ser utilizada para proporcionar sondas que hibridizam especificamente com um gene que codifica o polipéptido; ou com um ARNm que codifica uma proteína de degradação da parede celular numa amostra de ARN total (por exemplo, num Southern ou Northern blot). Uma vez que o ácido nucleico alvo que codifica uma proteína "lítica" da parede celular é identificado, ele pode ser isolado de acordo com métodos padrão conhecidos pelos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed, Vols 1-3) Cold Spring Harbor Laboratory; Berger e Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc; ou Ausubel, et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque). Além disso, os ácidos nucleicos isolados podem ser clivados com enzimas de restrição para criar ácidos nucleicos que codificam o polipéptido de degradação da parede celular de comprimento completo, ou subsequências do mesmo, por exemplo, contendo subsequências que codificam pelo menos uma subsequência de um domínio catalítico de um polipéptido de degradação da parede celular. Estes fragmentos de enzimas de restrição, que codificam um polipéptido de degradação da parede celular ou subsequências do mesmo, podem ser depois ligados, por exemplo, para produzir um ácido nucleico que codifica um polipéptido de degradação da parede celular.

Podem ser usados métodos semelhantes para gerar fragmentos de ligação à parede celular adequados ou ligantes entre os fragmentos. Segmentos de ligação com afinidade para características de superfície prevalentes nas bactérias alvo podem ser identificado e incluem aqueles, por exemplo, do fago K ORF56, lisostafina de S. simulans. L54a amidase, amidase do fago phill, análogo de lisostafina de S. aureus ALE -1 (veja-se GI:3287732); segmentos do domínio SH3 bacteriano encontrados em Staph. aureus NCTC 8325 autolisina (veja-se YP_500516) JH9 N-acetilmuramoil-L-alanina amidase da família 2 de Staph, aureus (veja-se ZP_01242312), Mu50 amidase de Staph. aureus (veja-se NP_371437), amidase relacionada com o fago RF122 de Staph, aureus (veja-se YP_417165), peptidoglicano hidrolase de Staph. aureus (veja-se AAA26662), JCSC1435 N-acetilmuramoil-L-alanina amidase de Staph. haemolyticus (veja-se YP_254248), o produto proteico CAA29494 de Staph, simulans, proteínas de reconhecimento do peptidoglicano bacteriano (PGRP ou PGLYRP, uma grande família de proteínas altamente conservadas encontradas desde os insectos aos mamíferos que se ligam ao peptidoglicano bacteriano (PGN) de bactérias gram-positivas e gram-negativas) e outras sequências relacionadas, por exemplo homólogos por sequência ou localização em cassetes de genes. As paredes celulares bacterianas de várias espécies foram caracterizadas, e as proteínas que se ligam a elas são frequentemente relatadas, por exemplo, em PubMed. Muitas vezes, as proteínas de ligação terão homólogos procariotas dos domínios de homologia 3 de Sare (SH3) . Os segmentos ligantes de comprimentos e propriedades adequados podem ser utilizados para conectar domínios de ligação e domínios catalíticos. Veja-se, por exemplo, Bae, et al. (2005) "Prediction of protein interdomain linker regions by a hidden Markov model" Bioinformatics 21:2264 - 2270; e George e Heringa (2003) "An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding" Protein Engineering 15:871 - 879.

Um ácido nucleico que codifica um polipéptido adequado ou uma subsequência do mesmo, pode ser caracterizado através de ensaio do produto expresso. Ensaios baseados na deteção das propriedades imunológicas, físicas ou químicas do polipéptido expresso, podem ser utilizados. Por exemplo, pode-se identificar um polipéptido de degradação da parede celular através da capacidade de um polipéptido codificado pelo ácido nucleico para degradar ou digerir as células bacterianas, por exemplo, conforme descrito no presente documento.

Da mesma forma, um ácido nucleico que codifica um polipéptido desejado ou uma subsequência do mesmo, pode ser quimicamente sintetizado. Métodos adequados incluem o método de fosfotriéster de Narang, et al. (1979) Meth.

Enzymol. 68:90-99; o método de fosfodiéster de Brown, et ai. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; o método de dietilfosforamidite de Beaucage, et al. (1981) Tetra. Lett. 22:1859-1862; e o método em suporte sólido do documento de Patente US N.° 4.458.066. A síntese química produz um oligonucleótido de cadeia única. Este pode ser convertido em ADN de cadeia dupla por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma ADN polimerase utilizando a cadeia única como um modelo. Um perito reconhece que enquanto a síntese química de ADN é muitas vezes limitada a sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.

Os ácidos nucleicos que codificam um polipéptido desejado, ou subsequências do mesmo, podem ser clonados utilizando métodos de amplificação de ADN tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Assim, por exemplo, a sequência ou subsequência de ácido nucleico é amplificada por PCR utilizando um iniciador de sentido direto contendo um local de enzima de restrição (por exemplo, Ndel) e um iniciador de sentido inverso contendo outro local de enzima de restrição (por exemplo, HindIII). Isto produzirá um ácido nucleico que codifica o polipéptido ou subsequência pretendidos e que tem locais de enzimas de restrição terminais. Este ácido nucleico pode então ser facilmente ligado num vetor contendo um ácido nucleico que codifica a segunda molécula e com os locais correspondentes de enzimas de restrição apropriados. Um perito na especialidade pode determinar os iniciadores de PCR apropriados utilizando a informação da sequência fornecida em GenBank ou outras fontes. Sítios apropriados de enzimas de restrição também podem ser adicionados ao ácido nucleico que codifica o polipéptido de degradação da parede celular ou uma subsequência polipeptídica do mesmo por mutagénese dirigida ao sítio. O plasmídeo que contém uma sequência ou subsequência de nucleótidos que codifica o polipéptido que degrada a parede celular é clivado com a endonuclease de restrição apropriada e depois ligado num vetor apropriado para amplificação e/ou expressão de acordo com métodos padrão. Exemplos de técnicas suficientes para orientar peritos na especialidade através de métodos de amplificação in vitro são encontrados em Berger, Sambrook e Ausubel, bem como Mullis et ai. (1987) documento de Patente US N.° 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and

Applications (Innis, et ai. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim e Levinson (1 de outubro, 1990) C&EN 36 - 47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81 94; (Kwoh, et ai. (1989) Proc. Nat' 1 Acad. Sei. EUA 86:1173; Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 87:1874; Lomell, et al. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren, et al., (1988) Science 241:1077 - 1080; Van

Brunt (1990) Biotechnology 8:291 - 294; Wu e Wallace (1989)

Gene 4: 560; e Barringer, et al. (1990) Gene 89:117.

Alguns ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de degradação da parede celular podem ser amplificados utilizando iniciadores de PCR baseados na sequência dos polipéptidos identificados.

Outras propriedades físicas, por exemplo, de um polipéptido recombinante de degradação da parede celular expresso a partir de um ácido nucleico particular podem ser comparadas com propriedades de polipeptídeos desejados conhecidos para fornecer outro método de identificação de sequências ou domínios adequados, por exemplo, das proteínas de degradação da parede celular que são determinantes da especificidade bacteriana, especificidade de ligação e/ou atividade catalítica. Como alternativa, um possível polipéptido de degradação da parede celular que codifica ácido nucleico ou um gene do polipéptido "lítico" da parede celular recombinante podem ser mutados, e o seu papel como um polipéptido de degradação da parede celular, ou o papel de sequências particulares ou domínios estabelecidos através da deteção de uma variação na "lise" bacteriana normalmente potenciada pelo polipéptido de degradação da parede celular não mutado, de ocorrência natural ou de controlo. Os peritos na especialidade reconhecerão que a mutação ou modificação dos polipéptidos de degradação da parede celular da presente invenção pode ser facilitada por técnicas de biologia molecular para manipular os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos, por exemplo, PCR. Outras técnicas de mutagénese ou de embaralhamento de genes podem ser aplicadas a fragmentos funcionais descritos no presente documento, incluindo atividades de degradação da parede, propriedades de ligação à parede, ou característica de ligante compatíveis com construções quiméricas.

Os domínios funcionais dos polipéptidos de degradação da parede celular recentemente identificados podem ser identificados usando métodos convencionais para mutar ou modificar os polipéptidos e analisá-los para determinar as atividades, tais como a atividade do substrato aceitador e/ou atividade catalítica, conforme descrito no presente documento. As sequências dos domínios funcionais das várias proteínas de degradação da parede celular podem ser utilizados para construir os ácidos nucleicos que codificam ou combinam domínios funcionais de um ou mais polipéptidos de degradação da parede celular. Estas fusões de atividades múltiplas de polipéptidos podem ser testadas para determinar uma atividade bacteriostática ou bactericida desejada. Sequências relacionadas com base na homologia para identificar as atividades "líticas" podem ser identificadas e rastreadas para a atividade em substratos adequados. As características da organização génica dos fagos típicas dos polipéptidos encontrados em estruturas de fagos utilizadas para ligar-se e penetrar nas estruturas da parede celular alvo; por exemplo, estruturas de cassetes, podem identificar novas sequências que podem possuir atividades de ligação e/ou bactericidas ou bacteriostáticas úteis no ataque à parede a partir do exterior. Exemplos particulares podem incluir sequências de pró-fago, incluindo remanescentes de genomas de fago incompletos funcionais ou estruturas do tipo piocina, incluindo partículas derivadas de segmentos genéticos de tipo fago, por exemplo, remanescentes genéticos de fagos restantes no ADN de uma bactéria.

Numa abordagem exemplar à clonagem de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de degradação da parede celular, as sequências de ácidos nucleicos ou aminoácido conhecidas de polipéptidos clonados são alinhadas e comparadas para determinar a quantidade de identidade de sequência entre elas. Esta informação pode ser utilizada para identificar e selecionar domínios polipeptídicos que conferem ou modulam as atividades de polipéptidos de degradação da parede celular, por exemplo, direcionar a especificidade bacteriana ou de ligação e/ou a atividade de degradação ou "lítica" com base na quantidade de identidade de sequência entre os entre os polipéptidos de interesse. Por exemplo, os domínios que têm identidade de sequência entre os polipéptidos de degradação da parede celular de interesse e que estão associados com uma atividade conhecida, podem ser utilizados para construir polipéptidos que contenham este domínio e outros domínios, e que tenham a atividade associada com aquele domínio (por exemplo, especificidade bacteriana ou de ligação e/ou atividade de degradação da parede). Podem aplicar-se estratégias semelhantes para isolar os domínios SH3 bacterianos que se ligam às estruturas da parede celular, proteínas de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs), polipéptidos "líticos" de cauda de fago ou a ligantes para espaçamento entre domínios. IX. Expressão de polipéptidos desejados em células hospedeiras

As proteínas de degradação da parede celular, ou outras, da invenção podem-se expressar em diversas células hospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, e levaduras. As células hospedeiras são, preferivelmente, microrganismos, tais como, por exemplo, células de levadura, células bacterianas, ou células fúngicas filamentosas. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem, por exemplo, Azotobacter sp. (por exemplo, A. vinelandii) , Pseudomonas sp., Rhizobium sp.,

Erwinia sp., Escherichia sp. (por exemplo, E. coli),

Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Klebsiella sp., entre muitos outros. As células podem ser de qualquer de vários géneros, incluindo Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) , Candida (por exemplo, C. utilis, C. parapsilosis, C. krusei, C. versatilis, C. lipolytica, C. zeylanoides, C. guilliermondii, C. albicans, e C. humicola), Pichia (por exemplo, P. farinosa e P. ohmeri), Torulopsis (por exemplo, T. Candida, T. sphaerica, T. xylinus, T. famata, e T. versatilis), Debaryomyces (por exemplo, D. subglobosus, D. cantarellii, D. globosus, D. hansenii, e D. japonicus), Zygosaccharomyces (por exemplo, Z. rouxii e Z. bailii), Kluyveromyces (por exemplo, K. marxianus), Hansenula (por exemplo, H. anómala e H. jadinii) , e Brettanomyces (por exemplo, B. lambicus e B. anomalus) . Exemplos de bactérias úteis incluem, entre outros, Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Klebsielia, Bacillus, Pseudomonas, Proteus e Salmonella.

Uma vez expressos numa célula hospedeira, os polipéptidos de degradação da parede celular podem ser utilizados para impedir o crescimento de bactérias apropriadas. Numa forma de realização preferida, um polipéptido ORF56 é utilizado para reduzir o crescimento de uma bactéria Staphylococcus. Numa forma de realização preferida adicional, a proteína é utilizada para diminuir o crescimento de uma bactéria S. aureus, ou outras espécies de Staphylococcus semelhantes. Construções de fusão que combinam tais fragmentos podem ser geradas, incluindo proteínas de fusão que compreendem uma pluralidade de atividades de degradação da parede, incluindo tanto atividades catalíticas de peptidase como de amidase (que podem clivar ligações gly-gly e gly-ala), ou que combinam a atividade com um segmento de direcionamento que se liga às estruturas celulares da parede. Combinações de atividades de degradação podem atuar de forma sinérgica para efetuar melhor atividade bactericida e bacteriostática. Um ligante pode ser incorporado para proporcionar volume adicional aos sítios catalíticos de concentração local elevada perto do alvo de ligação.

Tipicamente, um polinucleótido que codifica os polipéptidos de degradação da parede celular é colocado sob o controlo de um promotor que é funcional na célula hospedeira desejada. Uma variedade de promotores extremamente variada é bem conhecida, e pode ser utilizada em vetores de expressão da invenção, dependendo da aplicação particular. Vulgarmente, o promotor selecionado depende da célula na qual o promotor deve ser ativo. Outras sequências de controlo da expressão tais como sítios de ligação de ribossomas, sítios de terminação da transcrição e semelhantes também são opcionalmente incluídos. Construções que incluem uma ou mais destas sequências de controlo são designados "cassetes de expressão". Consequentemente, a invenção proporciona cassetes de expressão dentro das quais, os ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão, por exemplo que combinam um fragmento catalítico com um fragmento de ligação, são incorporados para expressão de nível elevado dentro da célula hospedeira desejada.

Sequências de controlo da expressão que são adequadas para utilização numa célula hospedeira particular são normalmente obtidas através de clonagem de um gene que é expresso naquela célula. Sequências de controlo procariotas frequentemente utilizadas, que são definidas no presente documento como incluindo promotores para a iniciação da transcrição, opcionalmente com um operados, juntamente com sequências de sitio de ligação a ribossomas, incluem promotores frequentemente utilizados como os sistemas promotores de beta-lactamase (penicilase) e lactose (lac) (Change, et al. (1977) Nature 198:1056), o sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057), o promotor tac (DeBoer, et al. (1983) Proc. Nat'l Acad. Sei. EUA 80:21-25); e o promotor PL derivado de lambda e o sitio de ligação ao ribossoma no gene N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128) . O sistema promotor particular é tipicamente não critico para a invenção, muitos promotores disponíveis que funcionam em procariotas podem ser utilizados. Em vários exemplos utiliza-se um promotor do bacteriófago T7.

Para a expressão de polipéptidos que degradam a parede celular em células procariotas distintas em E. coli, utiliza-se como um promotor que funciona nas espécies procariotas concretas de produção. Tais promotores podem ser obtidos a partir de genes que foram clonados a partir das espécies, ou podem ser utilizados promotores heterólogos. Por exemplo, o promotor híbrido trp-lac funciona em Bacillus em adição a E. coli.

Um sítio de ligação a ribossoma (RBS) está convenientemente incluído nas cassetes de expressão da invenção. Um RBS exemplificativo em E. coli consiste numa sequência de nucleótidos com 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine and Dalgarno (1975) Nature 254:34; Steitz in Goldberger (ed. 1979) Biological regulation and development: Gene expression (vol. I, p. 349) Plenum Publishing, NI).

Para a expressão de proteínas em leveduras, promotores convenientes incluem GALl-10 (Johnson e Davies (1984) Mol. Cell. Biol. 4:1440-1448) ADH2 (Russell, et al., (1983) J. Mol. Chem. 258:2674-2682), PH05 (EMBD J. (1982) 6:675-680), e MFa (Flerskowitz and Oshima (1982) em Strathern, et al. , (eds.) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Cold Spring Flarbor Lab., Cold Spring Harbor, N.I. pp. 181-209) . Outro promotor adequado para utilização em leveduras é o promotor híbrido ADH2/GAPDH conforme descrito em Cousens, et al. (1987) Gene 61:265-275 (1987) . Para fungos filamentosos tais como, por exemplo, estirpes do fungo Aspergillus (McKnight, et al., documento de Patente US N.° 4.935.349), exemplos de promotores úteis incluem aqueles derivados dos genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tais como o promotor ADH3 (McKnight, et al. (1985) EMBO J. 4:2093-2099) e o promotor tpiA. Um exemplo de um terminador adequado é o terminador ADH3 (McKnight, et al.).

Na presente invenção podem ser utilizados promotores constitutivos ou regulados. Promotores regulados podem ser vantajosos porque as células hospedeiras podem ser cultivadas a densidades elevadas antes que a expressão das proteínas de fusão seja induzida. Uma expressão de nível elevado de polipéptidos heterólogos atrasa o crescimento celular em algumas situações. Um promotor induzível é um promotor que dirige a expressão de um gene em que o nível de expressão é alterável por fatores ambientais ou de desenvolvimento, tais como, por exemplo, temperatura, pH, condições anaeróbicas ou aeróbicas, luz, fatores de transcrição e produtos químicos. Tais promotores são referidos no presente documento como promotores "induzíveis", que permitem controlar o momento de expressão do polipeptídeo pretendido. Para E. coli e outras células hospedeiras bacterianas, os peritos na especialidade conhecem os promotores induzíveis. Estes incluem, por exemplo, o promotor lac, o promotor PL do bacteriófago lambda, o promotor híbrido trp-lac (Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc Nat'1 Acad Sei EUA 80:21), e o promotor do bacteriófago T7 (Studier, et al. (1986) J. Mol Biol.; Tabor et al. (1985) Proc Nat'1 Acad Sei. EUA 82:1074-1078). Estes promotores e a sua utilização são discutidos em Sambrook, et al., supra.

Uma construção que inclui um polinucleótido de interesse operativamente ligado a sinais de controlo de expressão génica que, quando colocada numa célula hospedeira apropriada, dirige a expressão do polinucleótido é designada uma "cassete de expressão". As cassetes de expressão que codificam as proteínas de fusão da invenção são muitas vezes colocadas em vetores de expressão para introdução na célula hospedeira. Os vetores incluem tipicamente, em adição a uma cassete de expressão, uma sequência de ácidos nucleicos que permite ao vetor replicar-se independentemente em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. De um modo geral, esta sequência é uma que permite ao vetor replicar-se independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas. Alternativamente, o vetor pode replicar-se por ser integrado no complemento genómico da célula hospedeira e sendo replicado à medida que a célula sofre replicação do ADN. O fabrico de construções polinucleótidicas geralmente requer a utilização de vetores capazes de se replicarem em bactérias. Uma pletora de kits disponíveis comercialmente para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias (veja-se, por exemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, ambos de

Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, de Stratagene; e QIAexpress Expression System, Qiagen). Os plasmideos isolados e purificados podem então ser ainda mais manipulados para produzir outros plasmideos, e utilizados para transfectar células. A clonagem em Streptomyces ou Bacillus também é possível.

Os marcadores selecionáveis são geralmente incorporados nos vetores de expressão utilizados para expressar os polinucleótidos da invenção. Estes genes podem codificar um produto génico, tal como um polipéptido, necessário para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas num meio de cultura seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não sobreviverão no meio de cultura. Genes de seleção típicos codificam polipéptidos que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alternativamente, os marcadores selecionáveis podem codificar proteínas que complementam deficiências auxotróficas ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilli. Muitas vezes, o vetor terá um marcador selecionável que é funcional em, por exemplo, E. coli, ou outras células nas quais o vetor é replicado antes da introdução na célula hospedeira. Um número de marcadores selecionáveis são conhecidos para os peritos na especialidade e são descritos em, por exemplo, Sambrook, et al., supra. A construção de vetores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas de ligação padrão conforme descrito nas referências citadas acima. Os plasmideos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, adaptados e religados na forma desejada para gerar os plasmideos necessários. Para confirmar as sequências corretas nos plasmideos construídos, os plasmideos podem ser analisados por meio de técnicas convencionais, tais como por técnicas de digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciação de acordo com os métodos conhecidos. Técnicas de clonagem molecular para atingir estes fins são conhecidas na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e de amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidos para os peritos na especialidade. Exemplos destas técnicas e instruções suficientes para orientar peritos através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enrymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. , eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Suplemento) (Ausubel).

Uma variedade de vetores comuns adequados para utilização como materiais de iniciação para a construção dos vetores de expressão da presente invenção são bem conhecidos na técnica. Para a clonagem em bactérias, vetores comuns incluem vetores derivados de pBR322, tais como pBLUESCRJPT™ e vetores derivados do fago λ. Em leveduras, os vetores incluem lasmídeos de Integração de Leveduras (por exemplo, YIp5) e plasmídeos de Replicação de Levedura (os plasmídeos da série YRp) e pGPDD-2. A expressão em células de mamíferos pode ser conseguida utilizando uma variedade de plasmídeos comumente disponíveis, incluindo pSV2, pBC12BI e p91023, assim como vetores de vírus líticos (por exemplo, vírus vaccinia, adenovirus e baculovirus), vetores de vírus epissomais (por exemplo, vírus do papiloma de bovinos) e vetores retrovirais (por exemplo, retrovirus murinos).

Os métodos para introduzir os vetores de expressão numa célula hospedeira selecionada são tipicamente convencionais, e tais métodos são conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células procarióticas, incluindo E. coli, por transformação com cloreto de cálcio, e em células eucarióticas por tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação. Também são adequados outros métodos de transformação. 0 acoplamento da tradução pode ser utilizado para potenciar a expressão. A estratégia utiliza uma fase de leitura aberta curta a montante derivada a partir de um gene altamente expresso nativo ao sistema de tradução, que é colocado a jusante do promotor e um sitio de ligação ao ribossoma seguido após alguns codões de aminoácidos por um codão de terminação. Imediatamente antes do codão de terminação está um segundo sitio de ligação ao ribossoma e após o codão de terminação está um codão de iniciação para a iniciação da tradução. 0 sistema dissolve a estrutura secundária no ARN, permitindo uma eficiente iniciação da tradução. Veja-se Squires et al. (1988) J. Biol Chem 263:16297-16302.

Os vários polipéptidos da invenção podem ser expressos intracelularmente ou podem ser secretados a partir da célula. A expressão intracelular resulta muitas vezes em rendimentos elevados. Se necessário, a quantidade de polipéptido de fusão solúvel e ativo pode ser aumentada através da realização de procedimentos de redobragem (veja-se, por exemplo, Sambrook, et al. , supra; Marston et al. (1984) Bio/Technology 2:800; Schoner et ai. (1985) Bio/Technology 3:151) . Em formas de realização em que o polipéptido desejado é secretado a partir da célula, quer para o periplasma ou para o meio extracelular, a sequência de ADN está frequentemente ligada a uma sequência de péptido de sinal clivável. A sequência de sinal dirige a translocação do polipéptido de fusão através da membrana celular. Um exemplo de um vetor adequado para utilização em E. coli que contém uma unidade de sequência de sinal-promotor é pTA1529 que tem o promotor phoA de E. coli e a sequência de sinal (veja-se, por exemplo, Sambrook, et al., supra, Oka, et al. (1985) Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 82:7212; Talmadge et al. (1980) Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 77:3988; Takahara et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2670) . Numa outra forma de realização, os polipéptidos de fusão são fundidos a uma subsequência da proteína A ou albumina sérica bovina (BSA), por exemplo, para facilitar a purificação, secreção ou estabilidade. Métodos de afinidade, por exemplo, utilizando o alvo do fragmento de ligação podem ser apropriados.

Os polipéptidos de degradação da parede celular da presente invenção também podem ser ainda ligados a outros segmentos de polipéptidos bacterianos, por exemplo, fragmentos de direcionamento. Esta abordagem resulta frequentemente em elevados rendimentos, porque as sequências de controlo procarióticas normais direcionam a transcrição e a tradução. Em E. coli, as fusões lacZ são frequentemente utilizadas para expressar proteínas heterólogas. Os vetores adequados estão prontamente disponíveis, tais como as séries pUR, pEX e pMRlOO (veja-se Sambrook, et al. , supra) . Para certas aplicações, pode ser desejável clivar a sequência externa do polipéptido de fusão após a purificação. Isto pode ser conseguido por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica, incluindo a clivagem por brometo de cianogénio, uma protease, ou pelo Fator Xa (veja-se, por exemplo, Sambrook et al. , supra; Itakura, et al. (1977) Science 198:1056; Goeddel, et al. (1979) Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 76:106; Nagai et al. (1984) Nature 309:810; Sung et al. (1986) Proc. Nat'1 Acad. Sei. EUA 83:561) . Os sítios de clivagem podem ser modificados no gene para o polipéptido de fusão no ponto de clivagem desejado.

Mais do que um polipéptido recombinante pode ser expresso numa única célula hospedeira através da colocação de cassetes de transcrição múltiplas num único vetor de expressão, ou através da utilização de diferentes marcadores selecionáveis para cada um dos vetores de expressão que são utilizados na estratégia de clonagem.

Um sistema adequado para a obtenção de proteínas recombinantes a partir de E. coli que mantém a integridade dos seus terminais N foi descrito por Miller, et al. (1989) Biotechnology 7:698-704. Neste sistema, o gene de interesse é produzido como uma fusão C-terminal aos primeiros 76 resíduos do gene da ubiquitina de levedura contendo um sítio de clivagem de peptidase. A clivagem na junção das duas frações resulta na produção de uma proteína com um resíduo N-terminal autêntico intacto. X. Purificação de polipéptidos desejados

Os polipéptidos da presente invenção podem ser expressos como proteínas intracelulares ou como proteínas que são secretadas a partir da célula, e podem ser utilizados nesta forma, nos métodos da presente invenção. Por exemplo, um extrato celular bruto contendo os polipéptidos intracelulares expressos ou secretados pode ser utilizado nos métodos da presente invenção.

Alternativamente, os polipéptidos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (veja-se, geralmente, Scopes (1982) Protein Purification Springer-Verlag, Nova Iorque; Deutscher (1990) Methods in Enzymology (vol. 182) Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. Nova Iorque). Uma vez que os segmentos de degradação, pelo menos, derivam a partir de proteínas de fagos selecionadas de acordo com a estabilidade, a purificação pode fazer uso dessas propriedades para desnaturar materiais contaminantes. As composições substancialmente puras de pelo menos cerca de 70, 75, 80, 85, 90% de homogeneidade são preferidas, e cerca de 92, 95, 98 a 99% ou mais de homogeneidade são ainda mais preferidas. Os polipéptidos purificados, também podem ser utilizados, por exemplo, como imunogénios para produzir anticorpos, que podem ser utilizados em métodos de purificação de imunoseleção.

Para facilitar a purificação dos polipéptidos da invenção, os ácidos nucleicos que os codificam também podem incluir uma sequência de codificação para um epitopo ou "marcador" para o qual um reagente de ligação de afinidade está disponível, por exemplo, um marcador de purificação. Exemplos de epítopos adequados incluem os genes repórter myc e V-5; os vetores de expressão úteis para a produção recombinante de polipéptidos de fusão possuindo estes epítopos estão comercialmente disponíveis (por exemplo, os vetores pcDNA3.1/Myc-His e pcDNA3.1/V5-His a partir de Invitrogen (Carlsbad CA) são adequados para vetores de expressão em células de mamífero). Os vetores de expressão adicionais adequados para a ligação de um marcador aos polipéptidos da invenção e os correspondentes sistemas de deteção são conhecidos para os peritos na especialidade e vários estão comercialmente disponíveis (por exemplo, FLAG, Kodak, Rochester NY) . Outro exemplo de um marcador apropriado é uma sequência de polihistidina, que é capaz de se ligar a ligandos de afinidade de quelato de metal. Normalmente seis histidinas adjacentes são utilizadas, embora se possam utilizar mais ou menos do que seis. Ligandos de afinidade de quelatos metálicos apropriados que podem servir como a fração de ligação para um marcador de polihistidina incluem ácido acético de nitrilo-tri-acético (NTA) (Hochuli "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" em Setlow (ed. 1990) Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, NY; comercialmente disponíveis a partir de Qiagen (Santa Clarita, CA)). Marcadores de purificação também incluem domínios de ligação a maltose e domínios de ligação a amido. A purificação de proteínas de domínio de ligação a maltose é bem conhecida pelos peritos na especialidade.

Outros haptenos que são adequados para utilização como marcadores são conhecidos pelos peritos na especialidade e estão descritos, por exemplo, no Handbook of Fluorescent Probes e Research Chemicals (6a ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR) . Por exemplo, dinitrofenol (DNP), digoxigenina, barbitúricos (veja-se, por exemplo, documento de Patente US N.° 5.414.085), e vários tipos de fluoróforos são úteis como haptenos, tal como são os derivados destes compostos. Kits estão comercialmente disponíveis para a ligação de haptenos e outras frações a proteínas e outras moléculas. Por exemplo, quando o hapteno inclui um tiol, um ligante heterobifuncional tal como SMCC pode ser utilizado para ligar o marcador a resíduos de lisina presentes no reagente de captura.

Um perito reconhecerá que certas modificações podem ser feitas nos domínios catalíticos ou funcionais do polipéptido, sem diminuir a sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação do domínio catalítico num polipéptido de fusão. Tais modificações são bem conhecidas pelos peritos na técnica e incluem, por exemplo, a adição de codões em qualquer dos terminais do polinucleótido que codifica o domínio catalítico, por exemplo, uma metionina adicionada ao terminal amino para proporcionar um local de iniciação, ou aminoácidos adicionais (por exemplo, poli His) colocados em ambos os terminais para criar sítios de enzimas de restrição convenientemente localizados ou codões de terminação ou sequências de purificação.

Note-se que, tal como utilizado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um bacteriófago" inclui uma pluralidade de tais bacteriófago e a referência a uma "bactéria hospedeira" inclui referência a uma ou mais bactérias hospedeiras e equivalentes das mesmas, conhecidos pelos peritos na especialidade, e assim por diante.

As publicações discutidas no presente documento são fornecidos somente para a sua divulgação, antes da data de depósito do presente pedido. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não está autorizada a antecipar tal publicação por virtude de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação que podem necessitar de ser confirmadas independentemente. As citações são incorporadas no presente documento como referência na sua totalidade.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será prontamente evidente para um perito na especialidade, à luz dos ensinamentos da presente invenção, que certas alterações e modificações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espirito ou âmbito das reivindicações anexas.

EXEMPLOS I. ORF56 de comprimento completo 0 Número de Acesso YP_024486 relatou uma ORF56 putativa encontrada num fago K de Staphylococcus. Com base neste relatório, uma ORF56 de fago K de comprimento completo foi amplificada por PCR a partir de uma fonte apropriada de fago. Usando iniciadores específicos de gene com um sítio Ndel no iniciador direto e Xhol no iniciador inverso, este produto de PCR foi clonado num vetor pET21 sob um promotor T7 como um inserto de Ndel-Xhol. Este clone foi chamado pGMB617 e continha a região de codificação correspondente aos aminoácidos 1 a 808 do produto esperado (SEQ ID N0:1), que deve produzir um produto de proteína de cerca de 91 kDa.

A. Domínio CHAP 0 relatório descrevendo o Número de Acesso YP_024486 identificou um domínio descrito como uma

Aminohidrolase/Peptidase (CHAP) dependente de Cisteína-Histidina (CHAP). Veja-se, por exemplo, Rigden et al. (2003) Trends Biochem. Sei. 28:230-234. Certos genes reconhecidos como contendo atividades liticas possuem domínios CHAP, normalmente com o domínio na região N proximal dos polipéptidos codificados. O domínio CHAP está na região C proximal da ORF56 putativa e deve corresponder aos aminoácidos designados a partir desde cerca dos aminoácidos 690 a 805. B. produto de degradação

No entanto, após produção e purificação, os produtos de proteína de aproximadamente 50 kDa e aproximadamente 23 kDa estavam presentes em quantidades substanciais, conforme observado por PAGE. Estes pareciam representar os produtos de degradação estáveis da proteína original expressa de 91 kDa. II. Espécies alvo de Staphylococcus

Construções de proteínas purificadas foram inicialmente testadas para determinar a redução de UFC (unidades formadoras de colónias) num isolado de Staphylococcus aureus. Certas construções foram ainda testadas para determinar a redução em UFC em isolados de S. epidermidis, S. lentis e S. carnosus. Parece que as atividades liticas observadas aqui são menos específicas de estirpe do que muitas seletividades de infeção de fagos. Portanto, é provável que a utilização das atividades liticas descritas no presente documento também exibirá várias especificidades de estirpe e pode mesmo ser alargada através de diversos géneros ou outras classes funcionais ou estruturais de bactérias, por exemplo, todos os organismos

Gram-positivos, ou mesmo incluindo algumas ou todas as bactérias Gram-negativas. Além disso, as atividades liticas, também podem ser genéricas para caracteristicas estruturais comuns entre as classes de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Por exemplo, algumas das caracteristicas das paredes celulares internas de bactérias Gram-negativas podem ser partilhadas com as paredes celulares Gram-positivas. III. Construções de Truncagem A região descrita como ORF56 hipotética tem um único sitio PstI interno cuja utilização poderia facilmente gerar uma construção que proporcionaria cerca de 57 kDa de região C-terminal da proteína desde aproximadamente o aminoácido 297 a 808 da SEQ ID NO:l. A partir do clone ORF56 de comprimento completo descrito acima, um fragmento de Pstl-HindlII que codifica a porção do terminal C da fase de leitura foi excisado. O fragmento de PstI-HindIII foi clonado num vetor pRSETA gerando a construção do clone pRSETA-57 kDa (PGMB 599) ORF6. Deste um fragmento Ndel-HindlII foi excisado que foi clonado num vetor pET21a como um Ndel-HindIII para gerar pGMB612. Este clone expressou a proteína de 57 kDa (esperado) e as proteínas de cerca de 50 kDa e de cerca de 23 kDa. As proteínas menores são inesperadamente, aparentemente produtos de degradação estáveis de aproximadamente o mesmo tamanho da construção que expressa a proteína de comprimento completo de 91 kDa.

Uma sequência de ADN foi construída para produzir uma porção C-terminal de 50 kDa da região putativa ORF56 correspondente a aproximadamente os aminoácidos 363 a 808 da SEQ ID NO:l. Um produto de PCR amplificado foi gerado utilizando iniciadores específicos adequados. O produto de PCR teve um sítio Ndel no iniciador direto e um sítio Xhol no iniciador inverso, e o fragmento Ndel-Xhol resultante foi clonado no vetor pET21a para a incorporação de um inserto Ndel-Xhol. Este produto foi designado pGDC060/061.

Esta construção expressa uma proteína de 50 kDa (como previsto) e uma proteína de cerca de 23 kDa. Mais uma vez, a proteína mais pequena é, inesperadamente, aparentemente uma proteína ORF56 degradada estável de aproximadamente o mesmo tamanho que o observado para as construções da proteína ORF56 de comprimento completo de 91 kDa e a proteína ORF56 truncada de 57 kDa.

Uma construção de ADN foi gerada para produzir a porção terminal C de 23 kDa da proteína ORF56 correspondendo a aproximadamente Met-(aminoácidos 603 a 808) . A sequência de ADN da ORF56 que codifica 23 kDa da região C-terminal foi amplificada por PCR através da introdução de um codão de iniciação ATG no iniciador direto. O produto de PCR foi clonado em pET21a como um fragmento de Ndel-Xhol para produzir uma construção designada pGDC070. Esta construção expressou proteínas que correm a cerca de 27 kDa em SDS-PAGE e outra proteína que corre a cerca de 23 kDa. No armazenamento a 4 °C, as duas formas colapsam numa única banda de cerca de 23 kDa.

Uma construção de ADN foi gerada para produzir um fragmento C-terminal de 19 kDa da proteína ORF56 correspondendo a aproximadamente os aminoácidos 620 a 808. A sequência de ADN correspondente à mesma foi amplificada utilizando iniciadores específicos e clonada em pET21a como um inserto Ndel-Xhol. A construção resultante foi designada pGDC089. Esta construção expressou uma única proteína que correu em SDS-PAGE a cerca de 21 kDa, aproximadamente o mesmo que o produto de degradação estável observado nas construções descritas acima.

Estas várias construções sugerem que o produto de proteína de comprimento total de 91 kDa não é particularmente estável sob as condições utilizadas. Dois produtos de degradação razoavelmente estáveis aparecem, primeiro uma proteína de 50 kDa, e em seguida, uma proteína de 23 kDa. A degradação, seja por uma atividade de exoprotease rápida, por uma atividade de uma endoprotease ou uma combinação de ambas é ainda pouco clara. No entanto, parece que as diferentes construções são degradadas numa uma proteína ORF56 estável truncada de 23 kDa. IV. Atividade antimicrobiana das proteínas purificadas

Os vários produtos de degradação e/ou truncagens de ORF56 foram testados para a atividade lítica através de um ensaio que determina a redução de UFC (unidades formadoras de colónias) de culturas bacterianas de Staphylococcus aureus. Em todos os casos, as truncagens de ORF ou os produtos de degradação exibiram uma capacidade significativa para reduzir UFC de S. aureus em solução, o que sugere que todas as construções e produtos de degradação estáveis retêm a atividade lítica sob as paredes celulares. A característica estrutural comum de todas as construções é a região C-terminal, incluindo o domínio CHAP . V. Genes homólogos com domínios CHAP candidatos para serem testados para a sua atividade lítica A atividade bactericida de ORF56 correlacionou-se com o domínio CHAP de C-terminal. Por isso, foi utilizada uma pesquisa BLAST para identificar atividades "líticas" adicionais em genomas de fagos sequenciados. Outras fontes úteis destes segmentos "líticos" incluem componentes envolvidos na penetração do genoma do fago nos hospedeiros, por exemplo, derivados a partir de caudas ou componentes de ligação utilizados pelos fagos para se ligarem a hospedeiros alvo ou de pró-fagos ou estruturas do tipo piocina. Adicionalmente, as chamadas atividades "líticas" podem ser identificadas como estando em segmentos de codificação para cassetes de caudas de fagos, por exemplo, com base na organização génica característica.

As pesquisas são realizadas utilizando o domínio CHAP ou outras características. Em particular, aqueles genes em que o domínio CHAP está na região C-terminal da ORF têm mais probabilidade de serem relevantes para esta atividade. De particular interesse são as proteínas que contêm o domínio CHAP dos fagos K, Twort e G1 estafilocócicos. VI. Construções quiméricas

Uma série de construções de fusão foram realizadas ligando um fragmento catalítico que atuam sobre a parede celular de estirpes estafilocócicas alvo com um fragmento de direcionamento que se liga a uma entidade da superfície celular. A fração de ligação proporciona a localização seletiva na superfície da bactéria alvo apropriada, e a atividade catalítica atua em sítios de substrato próximos. Um ligante pode ser incorporado, permitindo uma região mais ampla de acessibilidade do substrato (região de alta concentração do sítio ativo). Podem utilizar-se diferentes frações de ligação que reconhecem marcadores da superfície celular bacteriana altamente acessíveis, altamente expressos ou seletivos. Podem ser encontrados segmentos de ligação marcadores da parede celular de Gram-negativas a partir de proteínas derivadas de bactérias hospedeiras, e segmentos de ligação marcadores da parede de Gram-negativas semelhantes podem ser encontrados a partir de proteínas por elas utilizadas para controlar a estrutura da parede celular. Fagos específicos para os hospedeiros devem também ter polipéptidos da cauda que reconhecem e se ligam à sua respetiva parede da célula hospedeira. As proteínas de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs) de fontes que vão desde eucariotas inferiores a superiores e outras proteínas de ligação que se ligam com afinidade às paredes celulares bacterianas específicas e, de preferência sob condições e forma fisiológica, serão fontes para fragmentos de atividade de ligação apropriados. Em algumas circunstâncias, uma pluralidade de diferentes frações podem ser utilizadas. Os ligantes podem ser selecionados pela sua capacidade de permitir que os outros fragmentos sejam corretamente dobrados, sem interferência, proporcionando um suporte para aumentar a concentração catalítica local perto de substratos apropriados. Os fragmentos catalíticos podem ser dirigidos aos substratos preferidos, e uma pluralidade de fragmentos podem dirigir-se a diferentes ligações encontradas nas bactérias alvo.

Em particular, na abordagem a alvos Gram-positivos, os segmentos de ligação originar-se-iam, de preferência, a partir de proteínas que reconhecem a parede celular extracelular como "exibida" fisiologicamente pelas bactérias. Assim, as proteínas que reconhecem paredes celulares de Gram-negativas podem incluir componentes do sistema imunitário que reconhecem estes agentes infeciosos. Uma fonte adequada para os domínios de degradação da parede celular serão estruturas da cauda de fagos que infetam hospedeiros Gram-negativos. Da mesma forma, para bactérias Gram-positivas, os domínios de ligação podem ser derivados a partir das estruturas da cauda de fagos que infetam Gram-positivas ou de PGRPs para bactérias Gram-negativas. As atividades de degradação da parede podem ser derivadas a partir de estruturas da cauda que infetam hospedeiros Gram-negativos. Na medida em que micobactérias, esporos ou outros procariotas ou organismos relacionados partilham a estrutura da parede celular, estes reagentes podem ser úteis para a modulação do seu crescimento.

Adicionalmente, devido ao processo de seleção para fagos que infetam hospedeiros particulares, os fagos que têm como alvo os hospedeiros que vivem em condições extremas, termófilos, halófilos, condições de espécies de grande oxidação ou reativas, pH extremos, ambientes altamente proteolíticos e semelhantes, são fontes especialmente interessantes para fragmentos de ligação ou catalíticos úteis. As proteínas que estão expostas ao ambiente externo no exterior da célula (desejando entrar) devem apresentar características muito evoluídas para sobreviver fora do ambiente intracelular relativamente seguro. Como tal, esta estabilidade a condições adversas selecionará características estruturais do domínio que proporcionarão uma grande estabilidade do produto. E o produto deve também apresentar boas propriedades de armazenamento, pode ser selecionado de acordo com a sobrevivência e a vida farmacológica, e pode fornecer meios simples para a purificação e isolamento.

As construções foram feitas compreendendo vários segmentos da sequência de ORF56 (veja-se GenelD 2948023, YP_024486, YP_024486.1) ; o fragmento de 16 kDa correspondente a aminoácidos 669-808; fragmento de 19 kDa correspondente aos aminoácidos 629-808; fragmento de 13 kDa correspondente aos aminoácidos 691-808; e fragmento de ligação de ORF56 correspondente aos aminoácidos 629-690. Os segmentos de lisostafina de Staphylococcus (lss; AAB53783) incluem o fragmento de ligação correspondente aos aminoácidos 395-493; e o fragmento catalítico (clivagem lys-lys) correspondente aos aminoácidos 248-394. Um fragmento de ligação de L54a amidase (AAW38858; YP_185281) corresponde aos aminoácidos 376-484. Um fragmento catalítico de LytM peptidase (L77194; AAV62278.1) correspondente aos aminoácidos 223-322. Um fragmento de fago phill amidase (NP_803306, AAL82281; veja-se 40893-42365 de AF424781.1) corresponde aos aminoácidos 391-490. As construções foram dirigidas por um promotor T7.

Uma série de construções de fusão foram feitas: a construção 1 tem a sequência Met-(fragmento catalítico ORF56 de 16 kDa)-Leu-Glu (fragmento de ligação de lisostafina) e o produto de proteína resultante é referido como quimera 128 (SEQ ID NO: 4) . A construção 2 tem a sequência (fragmento catalítico ORF56 de 19 kDa)-Leu-Glu (fragmento de ligação de lisostafina). A construção 3 tem a sequência (fragmento catalítico ORF56 de 13 kDa)-Leu-Glu (fragmento de ligação de lisostafina). A construção 4 tem a sequência (fragmento catalítico ORF56 de 16 kDa)-Leu-Glu (fragmento de ligação de L54a amidase) . A construção 5 tem a sequência Met-(fragmento catalítico de LytM peptidase)-Leu-Glu (fragmento de ligação de lisostafina). A construção 6 tem a sequência Met-(fragmento catalítico de lisostafina) -(fragmento de ligação ORF56). A construção 7 tem a sequência (fragmento catalítico de LytM peptidase)-construção 1, que tem dois domínios catalíticos (peptidase LytM, ORF56). A construção 8 tem a sequência Met-fragmento catalítico ORF56 de 16 kDa-Leu-Glu-(fragmento de ligação de phill amidase). Do mesmo modo, outros fragmentos catalíticos ou de ligação de outras fontes podem ser utilizados, ou variantes destes podem ser gerados e otimizados para características desejadas. A construção 1 foi produzida no hospedeiro apropriado, e o hospedeiro lisado incluindo uma etapa de sonicação. Métodos semelhantes são aplicados para as outras construções. 0 lisado em bruto foi purificado por precipitação com sulfato de amónio (20-50%), cromatografia em coluna de Q-500 (pH 7,5), cromatografia de celulose CM (pH 6,0), utilizando NaCl a 200 mM para eluição, e filtração em gel. O produto foi estimado como sendo >98% puro através de coloração com prata. VII. Testagem da atividade O produto de construção 1, quimera 128, foi testado num painel de 30 estirpes de Staphylococcus aureus distintamente tipificadas, selecionadas para os tipos spa, Agr ou Mec e incluindo MLST e resistência à meticilina. A quimera 128 foi ativa nestas estirpes testadas e a inibição do manto foi observada com manchas de 1,5 microgramas de proteína. Utilizando uma estirpe MRSA B911 a cerca de 1E8 UFC, a proteína ORF56 de comprimento completo a 50 microgramas diminuiu as UFC em cerca de 2 unidades log, enquanto a quimera 128 a 1,5 microgramas diminuiu as UFC em cerca de 5 unidades log (10.000 vezes). Em várias estirpes representativas de Staph, aureus a 5E5 células/ml em caldo de Mueller Hinton contendo BSA a 1% (veja-se Kusuma e Kokai-Kun (2005) "Comparison of four methods for determining lysostaphin susceptibility of various strains of Staphylococcus aureus" Antimicrob. Agents Chemother. 49:3256 - 263; PMID: 16048934) incubadas a 35 °C, as colónias foram estáticas durante 16 horas. A concentração inibitória mínima (CIM) para a quimera 128 foi de cerca de 1-10 microgramas/ml. A testagem dos sobreviventes da estirpe COL de S. aureus a uma primeira exposição com a quimera 128 foi analisada e constatou-se que os sobreviventes eram sensíveis à proteína na re-exposição. A testagem de uma variante resistente à lisostafina da estirpe B911 de S. aureus mostrou que 99,9% das células eram suscetíveis a 1,5 microgramas de proteína de quimera 128 . A quimera 128 é estável em tampão Tris a 4 °C durante pelo menos um mês, cerca de 4 semanas à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), e cerca de 1 dia a 37 °C. Certas formulações líquidas e em gel tinham durações de estabilidade muito mais longas.

Construções de quimera adicionais foram testadas quanto à atividade utilizando ensaios de inibição do manto, ensaios de zimograma, e ensaios de redução de unidades formadoras de colónias (UFC). Um ensaio de inibição do manto é um ensaio qualitativo em que as proteínas de teste são manchadas num manto de bactérias e as zonas de inibição do crescimento são medidas. A atividade bactericida corresponde a uma zona de inibição sobre o manto; nenhuma atividade corresponde a uma área sem inibição visível. Um ensaio de zimograma é também um ensaio qualitativo em que um gel de SDS-PAGE está impregnado com células bacterianas alvo autoclavadas e uma preparação de fagos é submetida a eletroforese através do gel. As proteínas nos géis foram deixadas a renaturar in situ e, em seguida, atuam sobre os componentes da parede celular, dando resultado a zonas "líticas" claras após coloração do gel com o corante azul-de-metileno. Veja-se, por exemplo, Lepeuple, et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64:4142-428, PMID: 9797258. A atividade corresponde a áreas visíveis claras contra um fundo azul-escuro. 0 ensaio de redução de UFC é um ensaio quantitativo em que a atividade é medida pela percentagem de destruição. As culturas bacterianas são misturadas com as proteínas de quimera e colocadas em placas em meio LB A atividade corresponde à redução no número de células em, pelo menos, 99,9%. A ausência de atividade corresponde à não redução no número de células. Em cada ensaio controlos positivos e negativos adequados são realizados. Os resultados de uma série de proteínas quiméricas são mostradas no Quadro 1. A atividade foi demonstrada para uma série de proteínas TAME-CBD que compreendiam um domínio muralítico ORF56, também referido como um domínio catalítico (CD) . Uma proteína TAME-CBD compreendendo CD de lisostafina e um domínio de ligação ORF56 também teve atividade bactericida.

Identificação de domínios conservados TAME

Os inventores desenvolveram uma estratégia compreensiva para identificar genes TAME em genomas de fagos Caudovirales. Para pesguisar por genes TAME candidatos, os inventores basearam-se na presença em cada TAME, de um domínio conservado (CD) associado com a ligação à parede celular bacteriana, um domínio de ligação (CDB) ou degradação, domínio muralítico (MD). A Figura 1 é uma lista exemplar de tais domínios gue foram gerados a partir de uma pesquisa no NCBI CDD (Conserved Domain Database) no seu web site ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml, utilizando a seguinte série de palavras-chave de pesquisa: "lisozima OU endolisina OU lisina OU muramidase OU muraminidase OU glucosaminidase OU mureína OU peptidoglicano OU parede celular OU lise OU amidase OU transglicosilase OU autolisina OU hidrolase". Os peritos reconhecerão que uma variedade de estratégias de pesquisa utilizando diferentes termos de pesquisa poderão ser realizadas. Outras bases de dados podem também ser pesquisadas. 0 produto da pesquisa foi depois inspecionado manualmente para a relevância para a ligação à parede celular bacteriana, manutenção ou degradação. Segue-se uma lista não limitante de Domínios Conservados associados com a função de ligação à parede celular bacteriana (abreviada CBD para o domínio de ligação à célula) ou função de degradação (abreviada MD para o domínio muralítico). Qualquer dos domínios conservados listados abaixo podem ser utilizados em qualquer combinação para gerar uma proteína TAME-CBD quimérica da invenção.

pfam05382: Amidase_5: hidrolase do peptidoglicano bacteriófago. Pelo menos um dos membros desta família, a proteína Pal do bacteriófago pneumocócico Dp-1 revelou-se uma N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. De acordo com a estrutura modular conhecida desta e de outras hidrolases do peptidoglicano do sistema pneumocócico, o sítio ativo deve residir no domínio N-terminal enquanto o domínio C-terminal se liga aos resíduos de colina dos ácidos teicoicos da parede celular. Esta família parece estar relacionada com pfam00877. [pfam05382|68934] . MD

pfam01510: Amidase_2: N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. Esta família inclui amidases de zinco que têm atividade de N-acetilmuramoil-L-alanina amidase EC:3.5.1.28. Este domínio enzimático cliva a ligação amida entre N- acetilmuramoil e aminoácidos L nas paredes bacterianas (preferivelmente: D-lactil-L-Ala). A estrutura é conhecida para a estrutura do bacteriófago T7 e mostra que duas das histidinas conservadas são de ligação ao zinco. [pfam01510|65318]. MD

pfam01520: Amidase_3: N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. Este domínio enzimático cliva a ligação amida entre N-acetilmuramoil e aminoácidos L nas paredes celulares bacterianas. [pfam01520|65327]. MD

pfam00912: Transgli: transglicosilase. As proteínas de ligação à penicilina são proteínas bifuncionais que consistem em transglicosilase e transpeptidase no terminal N e C, respetivamente. 0 domínio de transglicosilase catalisa a polimerização de cadeias de glicano de mureína. [pfamO0912|64762]. MD

cd00737: endolisina_autolisina: As endolisinas e autolisinas são encontradas em vírus e bactérias, respetivamente. Os fagos de ADNds de eubactérias utilizam endolisinas ou enzimas muralíticas juntamente com holina, uma pequena proteína de membrana, para degradar o peptidoglicano encontrado nas paredes celulares das bactérias. Da mesma forma, as bactérias produzem autolisinas para facilitar a biossíntese do seu peptidoglicano heteropolímero da parede celular e a divisão celular. Ambas as enzimas autolisina e endolisina clivam ligações beta-1,4-glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglucosamina do peptidoglicano. [cd00737129561]. MD

pfam07486: Hidrolase_2: Hidrolase da Parede Celular Estas enzimas foram implicadas na hidrólise da parede celular, mais extensivamente em Bacillus subtilis. Por exemplo Bacillus subtilis SCLE, a enzima litica do cortéx dos esporos é expressa durante a esporulação como uma forma inativa e, depois, depositada sobre o cortéx exterior da célula. Durante a germinação, a enzima é ativada e hidrolisa o cortéx. Uma função semelhante é levada a cabo pela hidrolase da parede celular parcialmente redundante cwlJ. Estas enzimas podem ser amidases ou peptidases. [pfam07486|70935]. MD

pfam05257: Domínio CHAP. Este domínio corresponde a uma função de amidase. Muitas destas proteínas estão envolvidas no metabolismo da parede celular das bactérias. Este domínio é encontrado no terminal N de uma enzima bifuncional de Escherichia coli, onde funciona como uma glutationilespermidina amidase EC:3.5.1.78. [pfam05257|68816] ORF56 fornece um exemplo de um domínio CHAP. MD pfam03562: MltA: domínio inserção de específico MltA. Este domínio de barril beta é encontrado inserido no MltA, uma enzima transglicosilase de degradação da mureína. Este

domínio pode estar envolvido na ligação ao peptidoglicano. [Pfam03562|67195] . MD pfam01471: PG_ligação_l: domínio de ligação ao

peptidoglicano putativo. Este domínio é composto por três hélices alfa. Este domínio é encontrado no terminal N ou C de várias enzimas envolvidas na degradação da parede celular bacteriana. Este domínio pode ter uma função de ligação ao peptidoglicano geral. Esta família é encontrada N-terminal ao domínio catalítico de matrixinas. [pfam01471|65280] CBD pfam08823: PG_ligação_2: domínio de ligação ao

peptidoglicano putativo. Esta família pode ser um domínio de ligação ao peptidoglicano. [pfam08823|72246] CBD pfam06737: Transglicosilase: domínio de tipo de

transglicosilase. Esta família de proteínas é suscetível de atuar como enzimas transglicosilase relacionadas como pfam00062 e pfam01464. Estas outras famílias são fracamente correspondidas por esta família e incluem os conhecidos resíduos de sítio ativo, [pfamO6737|70216]. MD pfam06267: DUF1028: Família de função desconhecida (DUF1028). Família de proteínas bacterianas e de arqueobactérias com função desconhecida. Alguns membros estão associados com um domínio de ligação de peptidoglicano no terminal C e podem estar envolvidos no metabolismo de peptidoglicano. [pfamO6267|69772]. CBD e MD pfam01476: LysM: domínio LysM. O domínio LysM (motivo de lisina) tem cerca de 40 resíduos de comprimento. É encontrado numa variedade de enzimas envolvidas na degradação da parede celular. Este domínio pode ter uma função de ligação ao peptidoglicano geral. A estrutura deste domínio é conhecida.

[pfamO1476|65285]. CBD smart00701: PGRP: Proteínas de reconhecimento do peptidoglicano animais homólogas à lisozima do Bacteriófago T3. A molécula de bacteriófago, mas não o seu homólogo na traça, mostrou ter atividade de N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. Um membro desta família, Tag7, é uma citocina.

[smart00701|47970]. CBD COG2951: MItB: Transglicosilase B de mureína lítica

ligada à membrana [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG2951132773], MD COG2821: MItA: Transglicosilase de mureína lítica

ligada à membrana [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG2821132649], MD COG0741: MItE: Transglicosilase de mureína lítica

solúvel e proteínas reguladoras relacionadas (algumas contêm domínios LysM/invasina) [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG0741|31084], MD cd00736: Lisozima do bacteriófago lambda: A lisozima do bacteriófago lambda hidrolisa a ligação beta-1,4-glicosídica entre o ácido N-acetilmurâmico (MurNAc) e N-acetilglucosamina (GlcNAc, tal como fazem outras lisozimas. Mas ao contrário de outras lisozimas, o bacteriófago lamda não produz uma extremidade redutora após a clivagem do peptidoglicano, mas em vez disso, utiliza a 6-OH do mesmo resíduo MurNAc para produzir um resíduo terminal de ácido 1,6-anidromurâmico e é, portanto, uma transglicosilase lítica. Uma ligação 1,6-anidro idêntica é formada em peptidoglicanos bacterianos através da ação das transglicosilases líticas da E. coli. Contudo, elas diferem estruturalmente.

[cd00736|29560], MD cd00118: LysM: domínio de lisina, encontrado numa variedade de enzimas envolvidas na degradação da parede celular. Este domínio pode ter uma função de ligação ao peptidoglicano geral.

[cdOOl18129017]. CBD pfam08230: CpI-7: lisozima CpI-7 de domínio C- terminal. Este domínio foi originalmente encontrado na fração C-terminal da lisozima Cpl codificada pelo bacteriófago de Streptococcus pneumoniae Cp-7.

[pfamO8230 I 71664] CBD e MD pfam03411: Peptidase_M74: Endopeptidase de mureína insensível à penicilina.

[pfam03411167049] 22: pfam01473 CW_ligação_l: Repetição putativa de ligação à parede celular. Estas repetições são caracterizadas por resíduos aromáticos conservados e glicinas são encontradas em múltiplas cópias em tandem numa série de proteínas. A repetição CW tem 20 resíduos de aminoácidos de comprimento. Estas repetições na lisozima do fago CP-1 de Streptococcus pode ser responsável pelo reconhecimento específico de paredes celulares contendo colina. Repetições semelhantes mas mais compridas são encontradas na glucosiltransferases e proteínas de ligação ao glucano de streptococcus orais e demonstram estar envolvidas na ligação de glucanos bem como nas dextranosacarases relacionadas de Leuconostoc mesenteroides. As repetições também ocorrem em toxinas de Clostridium difficile e outros clostrídios, embora os ligandos nem sempre sejam conhecidos.

[pfam01473|65282] CBD pfam01464: SLT: Domínio SLT de transglicosilase. Esta família está distantemente relacionada com pfam00062. Membros são encontrados em fagos, sistemas de secreção de tipo II, tipo III e tipo IV (revistos em).

[pfam01464|65274]. MD pfam00062: Lys: família de lisozima de tipo C/alfa- lactalbumina. Alfa-lactalbumina é a subunidade reguladora da lactose sintase, alterando a especificidade do substrato da galactosiltransferase de N-acetilglucosamina para glucose. As lisozimas de tipo C são enzimas bacteriolíticas secretadas que clivam o peptidoglicano das paredes celulares bacterianas. A estrutura é um multidomínio, dobra mista alfa e beta, contendo quatro ligações de dissulfito conservadas.

[pfamOΟ Ο 62 I 63951] . MD

COG5632: COG5632: N-acetilmuramoil-L-alanina amidase [Biogénese de envelope celular, membrana externa] [COG5632I 35191 MD

COG5479: COG5479: Proteína não caracterizada potencialmente envolvida na biosíntese de peptidoglicano [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG5479|35038]. CBD e MD

COG4623: COG4623: Transglicosilase litica solúvel prevista fundida a uma proteína de ligação de aminoácido de tipo ABC [Biogénese de envelope celular, membrana externa] [COG4623|34243]. CBD e MD

COG3863: COG3863: Parente afastado não caracterizado de hidrolases associadas à parede celular [COG3863|33653]. CBD e MD

COG3773: SleB: Hidrolases da parede celular envolvidas na germinação de esporos [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG3773133568]. CBD e MD

COG3770: MepA: Mureína endopeptidase [Biogénese de envelope celular, membrana externa] [COG3770|33565]. MD

COG3409: COG3409: proteína que contém o domínio de ligação putativo ao peptidoglicano [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG3409|33215]. CBD

COG3023: ampD: N-acetil-anidromuramoil-L-alanina amidase [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG3023|32839]. MD

COG2247: LytB: domínio de ligação putativo à parede celular [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG2247|32428]. CBD

COG1215: COG1215: Glicosiltransferases provavelmente envolvidos na biogénese da parede celular [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG1215|31408]. CBD

COG0860: AmiC: N-acetilmuramoil-L-alanina amidase [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG0860|31201]. MD

COG0791: Spr: hidrolases associados com a parede celular (proteínas associadas com a invasão) [Biogénese do envelope celular, membrana externa] [COG0791|31134]. MD

cd02848: Quitinase_N_term: domínio quitinase em N-terminal. As quitinases hidrolisam o abundante biopolímero natural quitina, produzindo quito-oligossacarídeos menores. A quitina consiste em múltiplos resíduos de N-acetil-D-glucosamina (NAG) ligados por ligações beta-1,4 glicosídicas e é um dos principais elementos estruturais da parede celular de fungos e exoesqueletos de artrópodes. Com base no modo de hidrólise de quitina, as quitinases são classificadas como aleatórias, endo e exo quitinases e com base em critérios de sequência, as quitinases pertencem às famílias 18 e 19 de glicosil hidrolases. 0 N-terminal da quitinase pode estar relacionado com a superfamília de imunoglobulinas e/ou fibronectina tipo III. Estes domínios estão associados a diferentes tipos de domínios catalíticos, no terminal N ou C e podem estar envolvidos em interações homodiméricas/tetraméricas/dodecaméricas. Os membros desta família incluem membros da família de alfa-amilase, sialidase, galactose oxidase, celulase, celulose, hialuronato liase, quitinase e quitobiase. [cd02848|30335] . MD cd02847: Quitobiase_C_term: domínio quitobiase no C-terminal. A quitobiase (também conhecida como N-acetilglucosaminidase) digere as ligações beta-1,4 glicosídicas dos oligómeros de N-acetilglucosamina (NAG) encontrados na quitina, um elemento estrutural principal da parede celular de fungos e exoesqueletos de artrópodes. Acredita-se passar por um mecanismo de reação ácido-base, em que um carboxilato de proteína atua como um ácido catalítico, enquanto o nucleófilo é o grupo acetamido polar do açúcar numa reação assistida por substrato com retenção da configuração anomérica. O C-terminal da quitobiase pode estar relacionado com as superfamílias de imunoglobulinas

e/ou fibronectina tipo III. Estes domínios estão associados a diferentes tipos de domínios catalíticos, no terminal N ou C e podem estar envolvidos em interações homodiméricas/tetraméricas/dodecaméricas. Os membros desta família incluem membros da família de alfa-amilase, sialidase, galactose oxidase, celulase, celulose, hialuronato liase, quitinase e quitobiase. [cd02847|30334]. MD

cd00735: lisozima tipo bacteriófago T4: O tipo de tipo bacteriófago T4 hidrolisam ligações beta-1,4-glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico (MurNAc) e a N-acetilglucosamina (GlcNAc) em heteropolímeros de peptidoglicano das paredes celulares procariotas. Os membros incluem vários bacteriófagos (T 4, RB49, RB69, Aehl), bem como Dictyostelium. [cd00735|29559]. MD

cd00254: LT_GEWL: transglicosilase lítica (LT) e domínio de lisozima de clara de ovo de ganso (GEWL) . Os membros incluem as LTs ligados à membrana solúveis e insolúveis em bactérias, as LTs no bacteriófago lambda, bem como as lisozimas eucariótica de "tipo de ganso" (GEWL). As LTs catalisam a clivagem das ligações beta-1,4-glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico (MurNAc) e N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), tal como fazem as lisozimas de "tipo de ganso". No entanto, além disso, também formam uma nova ligação glicosídica com o grupo hidroxilo C6 do mesmo resíduo de ácido murâmico. [cd00254|29556] . MD cd00119: LYZ1: Lisozima de tipo C (1,4-beta-N-acetilmuramidase, LYZ) e alfa-lactalbumina (proteína B de lactose sintase, LA) . Possuem uma estreita relação evolutiva e uma estrutura terciária semelhante, no entanto, funcionalmente são muito diferentes. As lisozimas têm principalmente uma função bacteriolítica; a hidrólise de peptidoglicano das paredes celulares procariotas e transglicosilação. LA é uma metaloproteína de ligação ao cálcio que é exclusivamente expressa na glândula mamária durante a lactação. LA é a subunidade reguladora da enzima lactose sintase. A associação de LA com o componente catalítico da lactose sintetase, galactosiltransferase, altera a especificidade de substrato aceitador desta glicosiltransferase, facilitando a biossíntese de lactose.

[cdO011912 9018]. MD

smart00047: LYZ2: Subfamília 2 de lisozima; enzimas eubacterianas distantemente relacionadas com lisozimas eucarióticas. [smart00047|47396]. MD

pfam02016: Peptidase_S66: LD-carboxipeptidase. A muramoil-tetrapéptido carboxipeptidase hidrolisa uma ligação peptídica entre um aminoácido dibásico e a D-alanina no terminal C na fração de tetrapéptido no peptidoglicano. Isto cliva a ligação entre um aminoácido L e D. A função desta atividade é na reciclagem da mureína. Esta família inclui também a proteína de autoimunidade c7 microcina. Esta família corresponde à família Merops S66. [pfam02016|65774] . MD

pfam02324: Glico_hidro_70: família hidrolase glicosil 70. Os membros desta família pertencem à família 70 de glicosil hidrólases glicosiltransferases ou sacarose 6-glicosiltransferases (GTF-S) catalisam a transferência de unidades de D-glucopiramnosil a partir da sacarose para moléculas recetoras, EC:2.4.1.5. Esta família corresponde aproximadamente ao domínio catalítico N-terminal da enzima. Os membros desta família, também contêm o domínio putativo de ligação à parede celular pfam01473, que corresponde ao domínio de ligação ao glucano no terminal C. [pfam02324|66049]. MD

pfam06347: SH3_4: domínio SH3 bacteriano. Esta família é composta por várias proteínas bacterianas hipotéticas de função desconhecida. Estas são compostas por domínios SH3 tipo. [pfamO6347|69844]. CBD

pfam08239: SH3_3: domínio SH3 bacteriano. [pfam08239|71673]. CBD pfam08460: SH3_5: domínio SH3 bacteriano.

[pfam08460171.889]. CBD COG4991: COG4991: proteína não caracterizada com urn

homólogo do domínio SH3 bacteriano [COG4991|34596]. CBD

COG3103: COG3103: proteína do domínio SH3 [mecanismos de transdução de sinal] [COG3103|32917]. CBD smart00287: SH3b: homólogo do domínio SH3 bacteriano;

[Smart00287|47616]. CBD pfam01551: Peptidasa_M23: Família Peptidase M23. Os membros desta família são metalopeptidases de zinco com um número de especificidades. A família de peptidases M23 está incluída nesta família, são endopeptidases Gly-Gly. A família de peptidases M23 também são endopeptidases. Esta família também inclui algumas lipoproteínas bacterianas para as quais não foi demostrada qualquer atividade proteolítica. Esta família inclui também proteínas

quimiotaxina 2 derivadas de leucócitos (2) LECT2. LECT2 é uma proteína específica do fígado que se acredita estar relacionada com o crescimento de hepatócitos, embora a função exata desta proteína seja desconhecida. [pfam01551|65.358]. MD

Método de varrimento de genomas de fagos para candidatos a TAME

Atualmente, o processo é realizado por inspeção manual de cada genoma de fago, mas o varrimento automatizado pode ser implementado por CDD [Conserved Domain Database em NCBI; ou equivalente] no futuro. 0 processo passo a passo listado abaixo, utilizando o fago 11 de Stapholycoccus como um exemplo. 1. Identificar um genoma de fagos em [banco de dados apropriado, por exemplo] base de dados GenBank Phage Genomes (ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/phg.html). Selecionar o seu número de referência (número NC do lado direito do ecrã, para o fago 11 é NC_004615) . [Esta descrição é baseada na utilização desta base de dados, na presente data; à medida que a o desenho de vista/sensação evolui, esta descrição torna-se então em "exemplar"] 2. A partir da janela geral do Genoma (Genome Overview), selecione a função Codificação de Proteína (Protein Coding) [ou seu equivalente funcional] (neste caso, 53 proteínas). Abre-se uma janela que lista todos os produtos de proteínas previstos do genoma, com a lista completa das proteínas previstas. Neste caso, os produtos génicos foram extensivamente anotados; No entanto, este método não necessita de uma anotação anterior, além da identificação automática de ORFs potenciais. 3. 0 próximo passo consiste em analisar cada produto de proteína previsto para a presença de um dos domínios CD [Domínios Conservados; isto é, um domínio de ligação às células ou um domínio muralitico] listado acima. Este exame manual deve começar com a maior proteína prevista e percorrer de forma decrescente a lista de tamanhos. No caso do fago 11 [por exemplo], a ORF maior é phill_45, prevista como abrangendo 636 aminoácidos. 0 procedimento mais simples consiste em selecionar o Gene ID de 7 dígitos. Isto leva a uma Visão Geral da ORF, que inclui uma exibição gráfica da ORF mostrando a sua localização no genoma do fago. Ao selecionar esta exibição gráfica, um menu pendente será exibido. Se existirem CDs na ORF, uma das opções será Domínios Conservados. Ao selecionar esta opção, a ORF será exibida graficamente com a identidade e a posição dos CDs detetados na sua sequência. No caso do exemplo de phill_45, nenhum CD é detetado. Este processo é repetido para o próximo produto de proteína previsto maior; neste caso, seria Phill_44, em 633 aminoácidos. Existem dois CDs presentes nesta ORF, mas nenhum pertence à lista mostrada na Figura 1. No exemplo, a seguinte ORF é Phill_49 ORF. Esta ORF resulta ter dois CDs, CHAP e Lyz2, ambos presentes na Figura 1. Idealmente, o processo deve ser repetido para todas as ORF de mais de 150 aminoácidos. Geralmente, uma segunda ORF produz, pelo menos, uma coincidência na Figura 1. No caso de phill, verifica-se que a ORF phill_53 tem os domínios CHAP, AMI2 e SH3_5.

Depois de analisar a lista completa de ORFs previstas, em geral, foram identificadas duas ORFs: a endolisina lítica e TAME. Vários são os critérios utilizados para selecionar a TAME. Em primeiro lugar, uma TAME será normalmente a ORF maior contendo um CD listado na Figura 1. No exemplo do fago 11, a TAME é phill_49, que é maior do que a endolisina, phill_53 (amidase). Um segundo critério de confirmação pode estar disponível se as proteínas da cauda de fago foram identificadas. A TAME será agrupada com os genes da cauda. No caso do fago 11, o gene TAME, phill_49, é adjacente ao gene da cauda da fibra, Phill_50, na mesma ( + ) cadeia do ADN, e a jusante de outros genes da cauda, incluindo o gene de medida da longitude da cauda, phill_42. A endolisina (neste caso, amidase; phill_53), é normalmente adjacente a ou próxima à holina (neste caso, phill_52). TAMEs em fagos estafilocócicos atuais A aplicação deste procedimento para os fagos estafilocócicos atualmente disponíveis gerou a Figura 1. Nesta figura, o candidato TAME é listado (com o seu número de GI na coluna afastada da direita) para cada bacteriófago; na linha correspondente a cada fago, os CDs utilizados para identificar a TAME são listados.

Uma vez que os domínios muralíticos e domínios de ligação às células são identificados, os peritos podem, usando a divulgação desta memória descritiva e técnicas de biologia molecular padrão, gerar proteínas TAME-CBD. A função bactericida de muitas proteínas TAME-CBD podem ser analisados utilizando os ensaios descritos no presente documento, por exemplo, ensaios de inibição do manto, ensaios de zimograma, e ensaios de redução das unidades formadoras de colónias (UFC).

Muitos genomas de fago são divulgados em bases de dados disponíveis publicamente. A identificação de domínios conservados de fagos estafilocócicos, tanto CDB como MD, que podem ser utilizados nas proteínas quiméricas TAME-CBD podem ser estendidos pelos peritos para identificar domínios conservados, tanto MD e CDB, a partir de fagos que infetam outras bactérias, por exemplo, fagos que infetam estirpes de bactérias Streptococcus e Anthrax. LISTAGEM INFORMAL DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 1: YP_024489. Relatórios prot. hipotética ... (gi : 4869645) : 1 mrrirrpkvr ieivtddntf tlrfedtrdy ngdefgakll gfqtknsmed dssvfqinma 61 gdtywdklvm andiirifit pnddpndkeg kqerliqvgm vsqvskvgsy gndqtqfrit 121 gqsfvkpfmk fglgviqevq avlpevgwli dgdgdnevkf tgssahevrat glirrfipym 181 kynytektyn tidnyldydd lsswdefekl tevsaftnfd gslkqlmdrav tarpfnelff 241 knsektpgka qlvlxktpfn ptewraldmi kvptedfiee dvgkadvety siftatpagm 301 lkelngdvfs kpqfhpeltd rygytkfeve niylstksgs atedsdssgd dngtergtys 361 kimkdlsnyg rdnlskgidk yfcsklsskyk nlkkaqakki iekfvkegkv tekeyekitg 421 «kvddeltsd nrpkltkdkl ksilkekfkt qddfnnskkk kkaktdalke lttkyrfgnk 481 thattlldey ikykgeppnd eafdkylkai egvsnvatdt gsdasdsplv mfsrmlfnwy 541 hgnpnfyagd iivlgdpkyd lgkrlfiedk qrgdtwefyi esvehkfdyk qgyyttvgvt 601 rglkdailed gkgsphrfag lwnqssdfmg glmgedtske lkekgvaekq ssgdkdggsd 661 sggaqdggsl dslkkyngkl pkhdpsfvqp gnrhykyqct wyaynrrgql gipvplwgda 721 adwiggakga gygvgrtpkq gacviwqxgv qggspqyghv afvekvldgg kkifisehny 781 atpngygtrt idmssaigkn aqfiydkk SEQ ID NO:2

Da qual a ORF parece ir desde 58185 a 60611 dentro do segmento: 58021 ctggagacat tatcggagga agaattagag aagttctaga tagtaacatg gatatctttg 58081 caaatgaaca taagagaagt tattagtaat tttgtattga cacaagagta gtatcatagt 58141 atactactct tatacatata aaaaataaaa ggaagtatgt gtat 58185 atgcgt agaataagaa 58201 gacctaaggt aagaatagaa atagttacag atgataatac atttacattg agatttgaag 58261 atacacgaga ctataatggt gatgagtttg gagctaaact tttaggattc caaactaaaa 58321 actctatgga agatgatagt tcagttttcc aaataaatat ggcaggagat acttattggg 58381 ataagctagt tatggctaat gatatcataa gaatatttat tacacctaat gatgacccta 58441 acgataaaga aggaaaacaa gaacgactta tccaggtagg tatggtttct caagtatcaa 58501 aagtaggtag ttacggtaat gaccaaactc aatttagaat aacaggtcaa tcttttgtaa 58561 aaccttttat gaaatttgga ttaggcgtta ttcaggaagt tcaagctgta ttacctgaag 58621 taggttggct tattgatggt gatggagata atgaagtaaa atttactggt agctcagctc 58681 atgaagtaat gactggtatt atacgtagat ttatacctta tatgaaatat aactatactg 58741 aaaaaacata taatacaatt gataactatc ttgattatga tgatttaagt agttgggatg 58801 agtttgaaaa acttacagaa gtttcagcct ttactaattt tgatgggtca ttaaaacagt 58861 taatggatat ggtaacagct agacctttta atgagttatt cttcaaaaat tcagaaaaaa 58921 cacctggaaa ggctcaactt gtattaagaa agaccccttt taatcctact gagtggagag 58981 ctttagatat gattaaagta cctactgagg attttataga agaggatgta ggtaaaagtg 59041 atgtagagac atattctata tttacagcaa cacctgcagg tatgttgaaa gagcttaacg 59101 gtgatgtatt ttctaaacca caattccacc ctgaattaac tgatagatat ggttatacta 59161 aatttgaagt agaaaatatt tatcttagta caaaatcagg ttcagctact gaggattcag 59221 attcttcagg tgatgataat ggcacagaac gaggaactta ttctaaaatt atgaaagatt 59281 taagtaacta tggaagagat aatatatcta aaggtataga taagtataca agtaaattat 59341 cttcaaaata taaaaactta aaaaaagccc aagctaaaaa aattatagag aagtttgtta 59401 aagaaggaaa agtaacagaa aaagaatatg aaaaaataac aggtaataag gtagatgatg 59461 aattaacatc agataacaga ccgaagttga caaaagataa attaaagagt atactaaaag 59521 agaagtttaa aacacaagat gattttaata attctaagaa aaagaaaaaa gctaagacag 59581 atgcacttaa agaattgaca actaaatatc gttttggtaa taaaacacat gctacaactt 59641 tattagatga atatattaaa tataaaggag agccacctaa cgatgaggct tttgataaat 59701 atcttaaagc tattgaaggt gttagtaatg tagctacaga cacaggttca gatgcaagtg 59761 atagcccttt agCtatgttt tctagaatgc tatttaattg gtatcatggt aaccctaact 59821 tctatgcagg agatattatt gttttaggag accctaagta tgacctaggt aaaagattat 59881 ttattgaaga taagcaacga ggagacactt gggagttcta tattgaatct gtagaacata 59941 aattcgatta taaacagggg tattatacaa ctgtaggagt aactagaggt ttaaaagacg 60001 ctattctaga agatggtaaa ggtagtccgc atagatttgc aggatcatgg aatcaatcat 60061 cagacttcat gggaggtctt atgggtgaag atacttctaa agaacttaaa gaaaaaggtg 60121 tagcagagaa acaaagtagt ggagataaag atggtggttc tgatagtggt ggagctcaag 60181 atggtggctc tttagattca cttaaaaaat ataacggcaa acttcctaag catgacccaa 60241 gttttgttca acctggtaac cgacattata agtatcagtg tacatggtat gcttataata 60301 gaagaggtca attaggcata cctgtgcctt tatgggggga cgccgccgac tggataggtg 60361 gtgctaaagg agcaggttat ggtgtaggta gaacacctaa acaaggtgct tgtgttatat 60421 ggcaaagagg agttcaagga ggtagcccac aatatggtca cgtagcgttt gtagagaaag 60481 tattagatgg aggtaaaaaa atatttatct ctgaacataa ctatgctacc cctaatggat 60541 atggtactag aacgatagat atgagttcag ccataggtaa gaatgcacaa ttcatttacg 60601 ataagaaata a 60612 aggaggata gtctatggca acagataaag aagctaaaga tgttattgat 60661 aaatttatag acaatgtatt taattttgat gtacttacaa aagaaagaat aaaagaaaaa 60721 gatgaagaaa ttaaaaaaat aactacagat gatatgtatg aaaaggttgt gtatatacga 60781 ccttatgttg gagtaataca aagccttaac cctcagcatg ttcagtatga atcattttct 60841 aataatggtt atgatataga ggcagaatta agtttcagga aagtaagtta tttagttgat 60901 aaagggtcta tacctacaga ttctttatct actttaacag ttcatttagt agaacgaaat 60961 caagaactat taatagatta ctttgatgag atacaagatg tgttgtatgg agaatatatg 61021 gaagaagaat atgtatttga tgaagatgta ccattaagta cgatactagc attagactta SEQ ID NO :3 NP_803303 (ORF49 do fago phill) 1 mglpnpknrk ptasewewa lyiaknkiai dvpgsgmgaq cwdlpnylld kywgfrtwgn 61 adamaqksny rgrdfkiirn tkdfvpqpgd wgvwtggwag hvniwgpct kdywygvdqn 121 wytnnatgsp pykikhsyhd gpgggvkyfv rppyhpdktt papkpeddsd dneknnkkvp 181 iwkdvttiky tissqevnyp eyiyhfiveg nrrlekpkgi mirnaqtmss veslynsrkk 241 ykqdveyphf yvdrhniwap rravfevpne pdyividvce dysasknefi fneihamwa 301 vdmmakyeip lsienlkvdd siwrsmlehv nwnmidngvp pkdkyealek allnifknre 361 kllnsitkpt vtkarikvmv dnknadianv rdssptanng saskqpqiit etspytfkqa 421 ldkqmargnp kksnawgwan atraqtssam nvkriwesnt qcyqmlnlgk yqgvsvsaln 481 kilkgkgtln nqgkafaeac kkhnineiyl iahaflesgy gtsnfangkd gvynyfgiga 541 ydnnpnyarat farnkgwtsp akaimggasf vrkdyinkgq ntlyrirwnp knpathqyat 601 aiewcqhqas tiaklykqig lkgiyftrdk yk SEQ ID NO :4 Quimera 128

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAY

NRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQG

ACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHN

YATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWK

TNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLK agqtihydevmkqdghvwvgytgnsgqriylpvrtwn

KSTNTLGVLWGTIK SEQ ID NO :5 BD de Lisostafina fundido com o terminal C de ORF56 de 16 kDa

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKY QCTWYAYNRR GQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQ RGVQGGSPQYGHVAFVEKVLD GGKKIFISEHNYATPNGYGT RTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKY GTLYKSES ASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDG HVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK SEQ ID NO:6 BD de Lisostafina fundido com o terminal C de ORF56 de 19 kDa

MGGLMMGEDTSKELREKGVAEKQSSGDKDGGSDSGGAQDG

GSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRR

GQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQ

RGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGT

RTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKY GTLYKSES

ASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDG

HVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK SEQ ID NO :7 BD de Lisostafina fundido com o terminal C de ORF56 do dominio CHAP de 13 kDa

GNRH YK YQCT W Y A YNRRGQLGIP VPLWGD A AD WIGG AKG

AGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDG

GKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLET

PNTGWKTNKYGTLYKSES ASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSG

VLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWN

KSTNTLGVLWGTIK SEQ ID NO :8 BD de L54a amidase do fago fundido com o terminal C de ORF56 de 6 kDa

MAQDGGSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWY

AYNRRGQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGA

CVIWQRGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATP

NGYGTRTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLEKTSAKNQKNPPVPA

GYTLDKNNVPYKKEQGNYTVANVKGNNVRDGYSTNSRITG

VLPNNTTITYDGAYCINGYRWITYIANSGQRRYIATGEVDKA

GNRISSFGKFSTI SEQ ID NO:9

Dominio de LytM peptidase fundido com o ND de lisostafina no terminal C

MPENSPVYSLTDGTVVQAGWSNYGGGNQVTIKEANSNNYQWYMHNNRLTVSAGD KVKAGDQIAYSGSTGNSTAPHVHFQRMSGGIGNQYAVDPTSYLQSR L E T P N T G WKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQ SGVLKA GQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLP VRTWNKSTN TLG VLWGTIK SEQ ID NO :10 0 dominio catalítico de lisostafina fundido com o dominio de ligação de ORF56

MAATHEHSAQWLNNYKKGY GY GPYPLGIN GGMHY GVDFF

MNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQW

YMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRM

VNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVMGGLMMGEDTSK

ELKEKGVAEKQSSGDKDGGSDSGGAQDGGSLDSLKKYNGK

LPKHDP SFVQP SEQ ID NO :11

Fusão de LytM peptidase-0RF56 de 16 kDa-BD de lisostafina

MPENSPVYSLTDGTWQAGWSNYGGGNQVTIKEANSNNYQWYMHNNRLTVSAGD

KVKAGDQIAYSGSTGNSTAPHVHFQRMSGGIGNQYAVDPTSYLQSRM SLDSLK

KYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRRGQLGIPV

PLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQRGVQGG

SPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGTRTIDMSS

AIGKNAQFIYDKKLETPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNT

DIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGY

TGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK SEQ ID NO:12

Orf56 de 16 KdA-BD de amidase de phill

MSLDSLKKYNGKLPKHDPSFVQPGNRHYKYQCTWYAYNRR

GQLGIPVPLWGDAADWIGGAKGAGYGVGRTPKQGACVIWQ

RGVQGGSPQYGHVAFVEKVLDGGKKIFISEHNYATPNGYGT

RTIDMSSAIGKNAQFIYDKKLE

PVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTE

VMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 20050208038 A, Fischetti [0005] [0058] • WO 2008001342 A [0006] • US 2005208038 A [0006] • US 2002006406 A [0006] • US 2005214773 A [0006] • US 2002086020 A [0006] • US 4683202 A, Mullis [0094] [0131] • US 5426039 A, Wallace [0094] • US 6506602 B [0117] • US 6518065 B [0117] • US 6521453 B [0117] • US 6579678 B [0117] • US 5017478 A, Cashion [0126] • EP 0246864 A [0126] • US 4458066 A [0130] • US 4935349 A, McKnight [0142] • US 5414085 A [0158]

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Lisboa, 11 de Maio de 2015

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido quimérico que compreende (i) um domínio muralítico (MD) que tem uma identidade de pelo menos 90% com os aminoácidos 669-808 da SEQ ID NO:l; e (i) um domínio heterólogo de ligação à célula (CBD) que se liga a uma bactéria alvo, o dito polipéptido quimérico tendo atividade bactericida.
2. 2. O polipéptido quimérico da reivindicação 1, em que o dito polipéptido compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:4-6 e 8.
3. 3. O polipéptido quimérico da reivindicação 2, em que o dito polipéptido compreende a SEQ ID NO:4.
4. 4. Um polipéptido quimérico que compreende (i) um domínio muralítico (MD) que tem uma identidade de pelo menos 90% com os aminoácidos 669-808 da SEQ ID NO:l; e (ii) um domínio heterólogo de ligação à parede celular de S. aureus, o dito polipéptido quimérico tendo atividade de degradação da mureína de Staphylococcus.
5. 5. O polipeptídeo quimérico da reivindicação 1 ou 4, em que o MD compreende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com os aminoácidos 629-808 da SEQ ID NO:l.
6. 6. Um ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico da reivindicação 6.
8. 8. 0 polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para utilização num método de tratamento de uma infeção bacteriana num indivíduo que necessite tal tratamento.
9. 9. Um método in vitro de degradar uma parede celular de uma bactéria, o método compreendendo contactar a parede celular com o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
10. 10. Um método não terapêutico de desinfeção de uma superfície, o método que compreende a etapa de contactar a superfície com o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. 11. O polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o MD compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com os aminoácidos 669-808 da SEQ ID NO:l.
12. 12. O polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o MD compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com aminoácidos 629-808 da SEQ ID NO:l. Lisboa, 11 de Maio de 2015