PL243303B1 - Rekombinowany polipeptyd do zastosowania do leczenia, kompozycje go zawierające oraz jego zastosowania - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest rekombinowany polipeptyd zawierający: (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, a także jego zastosowanie jako lek, środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny i/lub środek przeciwzapalny. Przedmiotem zgłoszenia jest także kompozycja weterynaryjna zawierająca powyższy polipeptyd, oraz kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna zawierająca rekombinowany polipeptyd.

Description

DZIEDZINA WYNALAZKU

Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego polipeptydu zawierającego domenę katalityczną LytM, domenę lizostafiny (znanej również jako lizostafyna) wiążącą ścianę komórkową bakterii i ewentualnie łącznik peptydowy oraz domenę kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej do zastosowania do leczenia choroby i/lub stanu wywołanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus. Opisane jest również wykorzystanie jako środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny in-vitro i/lub środek przeciwzapalny. W szczególności, wynalazek dotyczy rekombinowanego polipeptydu do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego. Wynalazek obejmuje również kompozycję weterynaryjną do zastosowania jako lek do leczenia choroby i/lub stanu wywołanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie sformułowaną do podawania dowymieniowego, w szczególności do stosowania w leczeniu zapalenia gruczołu mlekowego. Wynalazek obejmuje kompozycję kosmetyczną lub pielęgnacyjną zawierającą rekombinowany polipetyd do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi i zwierząt. Wynalazek dotyczy również zastosowania rekombinowanego polipeptydu jako odczynnika diagnostycznego, środka dezynfekującego, czynnika przeciwbakteryjnego, środka aktywnego w kompozycji kosmetycznej, pielęgnacyjnej lub higienicznej u ludzi i zwierząt.

Opisano zastosowanie rekombinowanego polipeptydu do zapobiegania i/lub leczenia chorób dermatologicznych i/lub stanów zapalnych. Ujawniono również rekombinowany polipeptyd w formulacji do podawania miejscowego. Ujawniono również kompozycję weterynaryjną zawierającą rekombinowany polipeptyd. Ujawniona kompozycja weterynaryjna jest przeznaczona do stosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego u zwierzęcia innego niż człowiek. W szczególności ujawniono podawanie do gruczołu sutkowego, szczególnie podawanie dowymieniowe i jego zastosowania w leczeniu zapalenia, zapalenia sutka, szczególnie zapalenia wymienia.

STAN TECHNIKI

Bakterie z rodzaju Staphylococcus (gronkowce) są odpowiedzialne za cały szereg zakażeń u ludzi i zwierząt. Ponadto, wiele gatunków Staphylococcus jest opornych na antybiotyki; szacuje się, że 30-50% ludzi jest nosicielami tych bakterii. Dlatego też pilnie potrzebne jest zapewnienie alternatywnych metod leczenia zakażeń wywołanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus. Chociaż antybiotyki są nadal głównymi środkami terapeutycznymi w leczeniu zakażeń gronkowcowych, często wywołują one wiele skutków ubocznych i dodatkowo przyczyniają się do pojawienia się oporności. Dlatego pilnie potrzebne są nowe, alternatywne i skuteczne metody leczenia zakażeń gronkowcami.

Choroby dermatologiczne i zapalne mogą być powodowane przez różne gatunki bakterii, w tym gronkowce. Mogą występować spontanicznie lub np. w ranie, wrzodzie lub oparzeniu. Zakażone rany mogą stanowić zagrożenie dla życia. Dodatkowo, bakterie tworzące biofilm mogą być obecne w zakażonych ranach lub rany mogą być nimi zakażone wtórnie (Bowler i in., 2001). Szczególnie niebezpieczne są zakażenia szczepami Staphylococcus aureus opornymi na antybiotyki, takimi jak szczepy MRSA (oporne na metycylinę Staphylococcus aureus). Zakażenia gronkowcowe są szczególnie częste w przypadku stopy cukrzycowej, odleżyn i oparzeń.

Staphylococcus jest również jednym z czynników powodujących zapalenie wymion u krów mlecznych zwana mastitis (ang. mastitis). Mastitis jest uporczywą reakcją zapalną gruczołu mlekowego i tkanki wymienia i jest główną endemiczną chorobą bydła mlecznego, prowadzącą do rocznych strat w Europie przekraczających 1 miliard euro. Zapalenie wymienia powstaje, gdy leukocyty są uwalniane do gruczołu mlekowego, jako odpowiedź immunologiczna na inwazję bakteryjną kanału strzykowego przez różne bakterie. Tkanki wydzielające mleko i przewody gruczołów mlecznych są uszkadzane przez toksyny uwalniane przez bakterie. Opublikowano dane, z których wynika, że ponad połowa bakterii wyizolowanych z wymion to Staphylococcus (Malinowski i Smulski, 2007). S. aureus jest odpowiedzialny zarówno za ostre kliniczne, jak i subkliniczne formy zapalenia gruczołu mlekowego, a szczególnie za zakażenia przewlekłe. W przypadkach ostrego i przewlekłego zapalenia wymienia, zwłaszcza wywołanego przez S. aureus, standardową metodą leczenia jest podanie antybiotyków.

Zakażone krowy są nosicielami patogennych bakterii, dlatego kilka zakażonych krów w stadzie może tworzyć trwały rezerwuar dla przyszłych ognisk zakażeń gronkowcowych. Zwłaszcza S. aureus jest szybko przenoszony pomiędzy zwierzętami. Zapalenie wymienia stanowi również poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Zakażenia bakteryjne mleka i jego produktów mogą powodować zatrucie pokarmowe u ludzi je spożywających.

Jednym ze sposobów zwalczania zapalenia wymienia jest stosowanie enzymów bakteriolitycznych. Chociaż ostatnio testowano różne enzymy bakteriolityczne i ich chimeryczne wersje, żadne z nich nie wykazało zadowalającej aktywności enzymatycznej w surowym mleku krowim (Verbree i in., 2018). Zostały opisane chimery złożone z domeny katalitycznej LytM i domeny wiążącej ścianę komórkową z lizostafiny (Osipovitch i Griswold 2015, Jagielska, Chojnacka i in. 2016), nie mają one jednak aktywności w mleku i surowicy. Właściwość ta jest bardzo rzadka i nie może być przewidziana na podstawie właściwości poszczególnych domen wchodzących w skład chimery. Chociaż przetestowano wiele lizyn fagowych i enzymów chimerycznych nawet te, które wykazały aktywność w warunkach fizjologicznych i pasteryzowanym mleku, nie eliminowały gronkowców z surowego mleka (Verbree, Datwyler i in. 2018) (Rodriguez-Rubio, Martinez i in. 2013).

Z publikacji WO2007/130655 znany jest chimerowy polipeptyd TAME, który obejmuje domenę lizującą ścianę komórkową oraz domenę wiążącą ścianę komórkową, tym niemniej przedstawiona w sekwencji 9 chimera w świetle dostępnych informacji nie może wykazywać aktywności biologicznej, gdyż nie obejmuje aminokwasów koordynujących cynk w centrum aktywnym niezbędnych do aktywności enzymu LytM.

Chimery przedstawione w tej publikacji nie wykazują aktywności przeciw Staphylococcus, w szczególności Staphylococcus aureus w warunkach fizjologicznych jakim jest mleko pełne i nie są w stanie działać jako lek, środek przeciwbakteryjny i/lub środek przeciwzapalny, który zapobiega lub leczy choroby dermatologiczne i/lub zapalne szczególnie wywołane przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, w szczególności Staphylococcus aureus, szczególnie u zwierzęcia cierpiącego na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonego rozwojem takiego zapalenia.

STRESZCZENIE WYNALAZKU

Rekombinowany polipeptyd i kompozycja weterynaryjna według niniejszego wynalazku różnią się od standardowych antybiotyków swoją specyficznością i aktywnością wobec szczepów Staphylococcus. Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że rekombinowany polipeptyd według wynalazku jest wysoce aktywny w surowym mleku krowim, korzystnie w surowym nierozcieńczonym mleku i w surowicy. Ponadto, zaobserwowano nieoczekiwanie szybką i skuteczną aktywność bakteriolityczną przeciwko szczepom Staphylococcus. Jest to cenna właściwość biorąc pod uwagę skuteczność zapewnioną przez polipeptyd według wynalazku i zawierające go kompozycje farmaceutyczne. W przeciwieństwie do większości antybiotyków, rekombinowany polipeptyd według wynalazku nie wymaga aktywności metabolicznej bakterii ani wzrostu bakterii, aby był efektywny, gdyż działa bakteriolitycznie już w momencie kontaktu ze ścianą komórkową bakterii. Ta właściwość sprawia, że kompozycje zawierające rekombinowany polipeptyd, szczególnie kompozycja weterynaryjna według niniejszego wynalazku nadaje się do szybkiego obniżania liczby bakterii u zakażonych gospodarzy. Twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że dzięki powyższym właściwościom rekombinowany polipeptyd i zawierające go kompozycje, szczególnie kompozycja weterynaryjna mogą również rozwiązać problem oporności na antybiotyki w zakażeniach gronkowcowych. Ponadto twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że rekombinowany polipeptyd według wynalazku jest wysoce specyficzny dla gatunków Staphylococcus i rzadko powoduje lizę bakterii nie docelowych, niebędących przedmiotem zwalczania, w tym bakterii komensalnych, co potencjalnie zmniejsza skutki uboczne.

Ujawniono zatem rekombinowane polipeptydy oraz kompozycje je obejmujące do zastosowania jako odczynnik diagnostyczny, środek dezynfekujący, środek antyseptyczny, lek, środek przeciwbakteryjny i/lub środek przeciwzapalny, który zapobiega lub leczy choroby dermatologiczne i/lub zapalne, czynnik przeciwbakteryjny jak i środek aktywny w kompozycjach kosmetycznych, pielęgnacyjnych lub higienicznych dla ludzi i zwierząt. W szczególności wynalazcy stwierdzili, że rekombinowane polipeptydy są skuteczne w leczeniu zapalenia wymienia u przeżuwaczy, w szczególności krów mlecznych. Dane doświadczalne przedstawione poniżej dowodzą, że rekombinowany polipeptyd jest skuteczny w leczeniu zapalenia wymienia u przeżuwaczy poprzez skuteczne wiązanie z powierzchnią zewnętrzną bakterii z rodzaju Staphylococcus, w szczególności Staphylococcus aureus, doprowadzając do lizy komórek bakteryjnych, a tym samym eliminując bakterie.

Jeden aspekt wynalazku dotyczy rekombinowanego polipeptydu zawierającego (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec

Staphylococcus aureus i w którym aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1; (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności; i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii; (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu wybraną z SEQ ID NO: 9-19; do zastosowania do leczenia choroby i/lub stanu wywołanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przez Staphylococcus aureus.

W korzystnym rekombinowanym polipeptydzie do ww. zastosowania domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

W korzystnym rekombinowanym polipeptydzie do ww. zastosowania domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

W korzystnym rekombinowanym polipeptydzie do ww. zastosowania łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

W korzystnym rekombinowanym polipeptydzie do ww. zastosowania choroba i/lub stan jest wybrany z grupy obejmującej trądzik, pryszcze, zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry, infekcje i/lub uszkodzenia błony śluzowej lub skóry, rany, stopę cukrzycową, wrzody, oparzenia, zapalenia gruczołu mlekowego, zapalenie wymienia, zapalenia oka, zapalenia ucha, zapalenia gardła, zapalenia zatok, zapalenia genitaliów.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera jest formułowany do podawania miejscowego, korzystnie w postaci kremu, lotionu, roztworu, maści, żelu, pianki, plastra przezskórnego, proszku, pasty, zawiesiny, taśmy, podkładki, wacika, opatrunku na rany lub kompresu.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera jest formułowany do dostarczania dosutkowego/dostrzykowego.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera jest dostarczany do sutka lub strzyku, korzystnie przez infuzję, płukanie lub zanurzanie.

Korzystny rekombinowany polipeptyd do ww. zastosowania zawiera jest dostarczany samicy człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek cierpiącego na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonego rozwojem zapalenia gruczołu mlekowego, korzystnie przeżuwacza, korzystniej krowy mlecznej.

Ujawniono stosowanie rekombinowanego polipeptydu w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób dermatologicznych i/lub stanu zapalnego, w chorobie dermatologicznej i/lub stanie zapalnym, który obejmuje obecność bakterii Gram-dodatniej, korzystnie bakterii z rodzaju Staphylococcus, najkorzystniej staphylococcus aureus.

Ujawniono stosowanie rekombinowanego polipeptydu w chorobie dermatologicznej i/lub stanie zapalnym, które są wybrane z grupy obejmującej trądzik, pryszcze, zapalenie skóry, korzystnie atopowe zapalenie skóry, infekcje i/lub uszkodzenia błony śluzowej lub skóry, rany, stopę cukrzycową, wrzody, oparzenia i zapalenie gruczołu mlekowego, zapalenie wymienia, oka, ucha, gardła, zatok lub genitaliów.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd korzystnie wykazuje aktywność bakteriolityczną w surowym mleku i/lub surowicy, przy czym surowe mleko jest korzystnie surowym mlekiem krowim i w którym surowica jest korzystnie surowicą bydlęcą lub ludzką.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd korzystnie jest formułowany do dostarczania dosutkowego/dostrzykowego.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd korzystnie jest dostarczany do sutka lub strzyku, korzystnie przez infuzję, płukanie lub zanurzanie.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd korzystnie jest dostarczany do samicy człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek cierpiącego na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonego rozwojem zapalenia gruczołu mlekowego, korzystnie przeżuwacza, korzystniej krowy mlecznej.

Ujawniono, że zwykle rekombinowany polipeptyd stosuje się do zapobiegania i/lub leczenia choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego.

Ujawniono, że w niektórych przykładach wykonania choroby dermatologiczne i/lub zapalne obejmują obecność bakterii Gram-dodatniej, korzystnie bakterii z rodzaju Staphylococcus, najkorzystniej Staphylococcus aureus.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd jest stosowany w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego, przy czym choroba dermatologiczna jest wybrana z grupy obejmującej trądzik, pryszcze, zapalenie skóry, korzystnie atopowe zapalenie skóry, infekcje i/lub urazy błony śluzowej skóry, ran, stopy cukrzycowej, owrzodzeń, oparzeń i zapalenia gruczołu mlekowego, wymienia, oka, ucha, gardła, zatok lub genitaliów.

Ujawniono, że rekombinowany polipeptyd wykazuje aktywność bakteriolityczną w surowym mleku i/lub surowicy, przy czym surowe mleko jest korzystnie surowym mlekiem krowim, i przy czym surowica jest korzystnie surowicą bydlęcą lub ludzką. Zatem rekombinowany polipeptyd według wynalazku korzystnie jest kontaktowany z bakteriami, które mają być usunięte z mleka, najkorzystniej z surowego mleka lub z surowicy lub krwi.

W niektórych przykładach wykonania rekombinowany polipeptyd według niniejszego wynalazku można formułować do podawania miejscowego. Korzystnie preparat ma postać kremu, roztworu, maści, żelu, pianki, plastra przezskórnego, proszku, pasty, nalewki, taśmy, podkładki, gazika, opatrunku na rany lub kompresu.

W niektórych przykładach wykonania rekombinowany polipeptyd jest formułowany do dostarczania dosutkowego.

W niektórych wykonaniach rekombinowany polipeptyd jest dostarczany do sutka lub strzyku, korzystnie przez infuzję, płukanie lub zanurzanie.

Korzystne przykłady wykonania dotyczą dostarczania rekombinowanego polipeptydu do samicy, człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek, cierpiącego na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonego rozwojem takiego zapalenia, korzystnie zwierzęcia będącego przeżuwaczem, korzystniej krowy mlecznej.

Inny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji weterynaryjnej zawierającej rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w której aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący katalityczną domenę LytM i domenę lizostafiny wiążącą ściany bakterii, (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19; oraz (v) farmaceutycznie lub weterynaryjnie dopuszczalną substancję pomocniczą; do zastosowania w leczeniu choroby i/lub stanu spowodowanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przeciwko Staphylococcus aureus.

W korzystnej kompozycji weterynaryjnej do ww. zastosowania w rekombinowanym peptydzie domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

W korzystnej kompozycji weterynaryjnej do ww. zastosowania w rekombinowanym peptydzie domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

W korzystnej kompozycji weterynaryjnej do ww. zastosowania w rekombinowanym peptydzie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

W korzystnej kompozycji weterynaryjnej do ww. zastosowania rekombinowany peptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

W korzystnej kompozycji weterynaryjnej do ww. zastosowania rekombinowany peptyd, zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

Kompozycja weterynaryjna do ww. zastosowania przeznaczona jest korzystnie do leczenia choroby i/lub stanu wybranego z grupy obejmującej zapalenie skóry, urazy i/lub infekcje błony śluzowej lub skóry, rany, wrzody, zapalenie gruczołu mlekowego, zapalenie oka, zapalenie ucha, zapalenie gardła, zapalenie zatok, zapalenie narządów płciowych.

Kompozycja weterynaryjna korzystnie jest formułowana do podawania dosutkowego.

Kompozycja weterynaryjna do ww. zastosowania przeznaczona jest korzystnie do zastosowania w leczeniu zapalenia gruczołu mlekowego u przeżuwaczy.

Ujawniono, że kompozycja weterynaryjna przeznaczona jest korzystnie do stosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego.

Ujawniono, że kompozycja weterynaryjna korzystnie stosowana jest w chorobie dermatologicznej i/lub stanie zapalnym, który jest wybrany z grupy obejmującej zapalenie skóry, urazy i/lub infekcje błony śluzowej lub skóry, rany, wrzody, zapalenie gruczołu mlekowego, zapalenie oka, ucha, gardła, zatok lub narządów płciowych.

Ujawniono przykłady wykonania dotyczą kompozycji weterynaryjnej do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego.

Ujawniono korzystne wykonania dotyczące kompozycji weterynaryjnej, w której choroba dermatologiczna i/lub stan zapalny są wybrane z grupy obejmującej zapalenie skóry, urazy i/lub infekcje błony śluzowej lub skóry, rany, wrzody i zapalenie wymienia, oka, ucha, gardła, zatoki lub narządów płciowych.

Ujawniono wykonanie kompozycji weterynaryjnej, przeznaczonej do podawania domięśniowego.

W jeszcze innym ujawnieniu kompozycja weterynaryjna jest przeznaczona do zastosowania w leczeniu zapalenia wymienia u przeżuwaczy.

Ujawniono, że korzystnie, weterynaryjna lub inna kompozycja farmaceutyczna zawierająca rekombinowany polipeptyd według wynalazku kontaktuje się z bakteriami, które mają być usunięte z mleka, najkorzystniej z surowego mleka lub z surowicy lub krwi.

Wynalazek dotyczy również zastosowania rekombinowanego polipeptydu zawierającego (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w którym aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19; jako środek dezynfekujący, in-vitro czynnik przeciwbakteryjny, in-vitro środek aktywny w kompozycji kosmetycznej, pielęgnacyjnej lub higienicznej dla ludzi lub zwierząt przeciw bakteriom z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przeciwko Staphylococcus aureus.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu że łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

W korzystnym zastosowaniu rekom binowanego polipeptydu polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu polipeptyd jest stosowany jako środek dezynfekujący stosowany jest do dezynfekcji powierzchni, urządzeń, sprzętów, mebli, podłóg, szczególnie w szpitalach, gabinetach lekarskich i dentystycznych, kuchniach i łazienkach.

W korzystnym zastosowaniu rekombinowanego polipeptydu gdy polipeptyd jest stosowany jako in-vitro czynnik przeciwbakteryjny stosowany jest jako in-vitro czynnik przeciwbakteryjny w mleku, surowicy, korzystnie w mleku pełnym.

Ujawniono zastosowanie rekombinowanego polipeptydu jako odczynnik diagnostyczny stosowany jest do diagnostyki Staphylococcus, korzystnie Staphylococcus aureus.

Ujawniono zastosowanie rekombinowanego polipeptydu do dezynfekcji powierzchni, urządzeń, i sprzętów, mebli, podłóg, szczególnie w szpitalach, gabinetach lekarskich i dentystycznych, kuchniach i łazienkach, szczególnie do dezynfekcji powierzchni z Staphylococcus, korzystnie Staphylococcus aureus.

Ujawniono zastosowanie rekombinowanego polipeptydu jako czynnik przeciwbakteryjny stosowany jest przeciw Staphylococcus, korzystnie Staphylococcus aureus.

Ujawniono korzystne zastosowanie rekombinowanego polipeptydu gdy jest on stosowany jako czynnik przeciwbakteryjny w mleku, surowicy, korzystnie w mleku pełnym.

Ujawniono korzystne zastosowanie rekombinowanego polipeptydu gdy polipeptyd jest stosowany jako czynnik, środek aktywny w kompozycji kosmetycznej, pielęgnacyjnej lub higienicznej dla ludzi lub zwierząt stosowany jako środek aktywny przeciw Staphylococcus, korzystnie Staphylococcus aureus.

Wynalazek dotyczy również kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi lub zwierząt która zawiera rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w której aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1; (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii; (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19; (v) co najmniej jeden nośnik dopuszczony w zastosowaniach kosmetycznych, pielęgnacyjnych, higienicznych u ludzi lub zwierząt;

przy czym kompozycja jest przeznaczona do zewnętrznego stosowania, i przy czym rekombinowany polipeptyd jest stosowany w kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej dla ograniczenia występowania lub usunięcia bakterii z rodzaju Staphylococcus, korzystniej Staphylococcus aureus.

Korzystna jest kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna, w której w rekombinowanym polipeptydzie domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

Korzystna jest kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna, w której w rekombinowanym polipeptydzie domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

Korzystna jest kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna, w której w rekombinowanym polipeptydzie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3. ‘

Korzystna jest kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna, w której rekombinowany polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

Korzystna jest kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna, w której w rekombinowany polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

Ujawniono, że kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna korzystnie jest stosowana w celu ograniczenia występowania lub usunięcia bakterii z rodzaju Staphylococcus, najkorzystniej Staphylococcus aureus.

Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są również niniejszym włączone jako referencje.

OPIS FIGUR RYSUNKU

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

FIG. 1: A) Schematyczne przedstawienie organizacji domen w Chimerach A i B. Liczby w polach reprezentują pozycje aminokwasów w białkach pełnej długości według UniProt (https://www.uni- prot.org/). LytMCD oznacza domenę katalityczną LytM (UniProt 033599), a LssCWT oznacza domenę lizostafiny wiążącą/rozpoznającą ścianę komórkową (Lss; UniProt P10547); B) przedstawia sekwencję aminokwasową i nukleotydową Chimery A, odpowiednio; C) przedstawia sekwencję aminokwasową i nukleotydową Chimery B, odpowiednio. Oznaczenia w B i C, odpowiednio, podkreślone - sekwencje z wektora, jasno szare tło - domena CD z LytM, ciemno szare tło - domena CWT z Lss, bez zaznaczenia - linker (łącznik); D) schemat budowy chimery A połączonej z sekwencją sygnalną na C końcu: Chimera A (LytM CD + LSS linker + LSS CWT) + C - terminal CPP oraz przykładowe sekwencje takich chimer; E) schemat budowy chimery B połączonej z sekwencją sygnalną na N końcu: N-terminal CPP + Chimera B (LSS CWT + LSS linker + LytM CD), sekwencje sygnalne dołączone na końcu N mogą być przykładowo sekwencjami przedstawionymi w Tabeli 1.

FIG. 2: Porównanie aktywności litycznej Chimer A i B wykazuje porównywalną skuteczność tych dwóch enzymów.

FIG. 3: Aktywność Chimery A w mleku UHT (przetwarzanie w wysokiej temperaturze, obróbka ultra-cieplna lub ultra pasteryzacja) w 37°C. Test zabijania bakterii w mleku z dodatkiem 103 CFU/ml komórek S. aureus (szczep NCTC 8325-4) w obecności 36 nM, 53 nM, 100 nM, 360 nM i 4000 nM Chimery A. Próbki inkubowano w 37°C przez 24 godziny. Kontrolę negatywną przeprowadzono bez dodatku enzymu. Doświadczenie przeprowadzono dwukrotnie (średnia ± SD).

FIG. 4: 103 CFU/ml S. aureus (szczep NCTC 8325-4) zaszczepiono w pełnym mleku UHT (A) i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Chimera A spowodowała całkowitą eliminację bakterii z pełnego mleka UHT (B).

FIG. 5: Aktywność Chimery A w mleku pełnym UHT w 4°C (A) i 22°C (B). Komórki S. aureus (szczep NCTC 8325-4; 106 CFU/ml) inkubowano z 100 nM Chimery A przez 24 godziny. Kontrola negatywna nie zawierała enzymu chimerycznego. Eksperyment przeprowadzono trzy razy.

FIG. 6: Aktywność Chimery A w surowym mleku bydlęcym (nierozcieńczonym). A) Test eliminowania bakterii z mleka z dodatkiem 10³ CFU/ml komórek S. aureus (szczep NCTC 8325-4) w obecności 36 nM lub 100 nM Chimery A. Próbki inkubowano w 37°C przez 3 godziny; B) Test eliminowania bakterii z mleka z dodatkiem 10⁶ CFU/ml komórek S. aureus (szczep NCTC 8325-4) 100 nM Chimery A. Próbki inkubowano w 22°C przez 24 godziny, pobierając próbki do oceny liczby bakterii w czasie 0, po dwóch godzinach i na zakończenie eksperymentu. W obydwu doświadczeniach kontrola negatywna nie zawierała Chimery A. Doświadczenia przeprowadzono dwukrotnie (średnia ± SD).

FIG. 7: 10³ CFU/ml komórek S. aureus (szczep NCTC 8325-4) inokulowano do surowego, nierozcieńczonego mleka krowiego i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C z dodatkiem lub bez dodatku chimery A. Ocena liczby komórek gronkowcowych w zaszczepionych próbkach mleka przed traktowaniem enzymem (A), po 1 godzinie inkubacji z Chimerą A (B), po 1 godzinie inkubacji bez Chimery A (C).

FIG. 8: Liczba komórek somatycznych zmierzona w próbkach mleka przed i po 7 dniach leczenia Chimerą A.

FIG. 9: Aktywność bakteriobójcza Chimery A w obecności płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Aktywność 100 nM Chimery A oszacowano jako zmniejszenie zmętnienia zawiesiny komórek bakteryjnych w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej.

Fig. 10. Przyrównanie sekwencji aminokwasowej Chimery A oraz chimery znanej ze stanu techniki. Na szaro zaznaczono aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym, niezbędne do integralności i aktywności enzymu.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Poniższe wyjaśnienia i definicje ogólne odnoszą się do umieszczonych w dalszej części wniosku opisów korzystnych przykładów wykonań wynalazku.

Niniejszy wynalazek, jak to zilustrowano poniżej, może być odpowiednio wykonany przy braku jakiegoś z elementu lub elementów, ograniczenia lub ograniczeń, nie ujawnionych tutaj konkretnie.

Niniejszy wynalazek zostanie opisany w odniesieniu do konkretnych przykładów wykonania i w odniesieniu do określonych figur rysunku, ale wynalazek nie jest do nich ograniczony, i jest ograniczony tylko przez zastrzeżenia.

Gdy termin „zawierający” czy „obejmujący” jest używany w niniejszym opisie i zastrzeżeniach, i nie wyklucza innych elementów. Dla celów niniejszego wynalazku termin „składający się z” jest uważany za korzystny przykład wykonania terminu „zawierający” „obejmujący”. Jeśli poniżej zdefiniowano grupę, która zawiera co najmniej pewną liczbę przykładów wykonania, należy to również rozumieć jako ujawnienie grupy, która korzystnie składa się tylko z tych przykładów wykonania.

Określenia „około” lub „w przybliżeniu” w kontekście niniejszego wynalazku oznaczają przedział dokładności, który specjalista z dziedziny zrozumie, jako wystarczający by nadal zapewnić efekt techniczny danej cechy. Termin typowo oznacza odchylenie od wskazanej wartości liczbowej ± 10%, korzystnie zaś ± 5%.

Terminy techniczne są używane zgodnie z ich typowym znaczeniem. Jeśli użyte jest specyficzne znaczenie, znaczenie zostanie szczegółowo opisane w odniesieniu do kontekstu, w którym został użyty dany termin.

Ujawniono rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM, zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, zawierającej sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą co najmniej 80% identyczności z nią, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii do zastosowania jako odczynnik diagnostyczny, środek dezynfekujący, środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny i/lub środek przeciwzapalny.

W jednym przykładzie wykonania rekombinowany polipeptyd zawiera (i) domenę katalityczną LytM, zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80%, 85%, 9o%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ściany komórkowe bakterii, zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, do zastosowania jako odczynnik diagnostyczny, środek dezynfekujący, środek antyseptyczny, środek przeciwbakteryjny i/lub środek przeciwzapalny.

Stosowany tu termin „rekombinowany” odnosi się do białka, które jest wytwarzane w komórce gospodarza, która jest genetycznie zmodyfikowana w celu ekspresji białka. Gospodarz może być pochodzenia wirusowego, ssaczego, owadziego, drożdżowego, bakteryjnego, algowego. Typowo, komórki gospodarza hoduje się w hodowli komórkowej standardowymi procedurami, a następnie białko uzyskuje się z hodowli komórkowej, i opcjonalnie, dalej oczyszcza, standardowymi technikami, takimi jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa czy sączenie molekularne.

W niniejszym ujawnieniu komórką gospodarza jest korzystnie komórka E. coli lub komórka Pichia pastoris, najkorzystniej komórka E. coli.

Termin „polipeptyd”, peptyd lub białko odnosi się do polimeru, w którym większość lub wszystkie monomery są aminokwasami i są połączone ze sobą poprzez wiązania peptydowe. Gdy aminokwasy są α-aminokwasami, można zastosować L-izomer optyczny lub D-izomer optyczny.

Dodatkowo uwzględnione są także aminokwasy nie występujące w naturze np. β-alanina, fenyloglicyna i homoarginina. Aminokwasy stosowane w niniejszym wynalazku mogą być izomerami D lub L lub ich mieszaninami.

Termin „rekombinowany polipeptyd” odnosi się do białka chimerycznego zawierającego (i) domenę katalityczną LytM, obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą co najmniej 80% identyczności z nią, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii. Rekombinowane polipeptydy według niniejszego wynalazku wykazują aktywność bakteriolityczną przeciwko bakteriom z rodzaju Staphylococcus, w tym S. aureus.

Domena katalityczna LytM odnosi się do regionu enzymu, który oddziałuje z jego substratem, powodując reakcję enzymatyczną. LytM to hydrolaza peptydoglikanu (autolizyna) z aktywnością endopeptydazy glicylo-glicynowej. Działa specyficznie na poliglicynowe mostki sieciujące peptydoglikanów ściany komórkowej gronkowców.

Typowo, domena katalityczna LytM jest zdefiniowana przez sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji.

Korzystnie domena katalityczna pochodzi z enzymu LytM z S. aureus.

W ujawnionych rekombinowanych polipeptydach, domena katalityczna LytM jest połączona z domeną lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, opcjonalnie poprzez łącznik peptydowy, jak ujaw niono w niniejszym dokumencie. W ten sposób domena katalityczna jest zdolna do cięcia ściany komórkowej z pomocą domeny wiążącej ścianę komórkową, która kieruje enzym chimeryczny do ściany komórkowej bakterii, korzystnie Staphylococcus, jeszcze korzystniej Staphylococcus aureus. W szczególnie korzystnym wykonaniu pentaglicynowe mostki peptydoglikanu Staphylococcus aureus są cięte przez enzym chimeryczny zawierający domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii.

Domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową odnosi się do motywu, który rozpoznaje i wiąże się z powierzchnią bakterii. Lizostafina (EC 3.4.24.75; endopeptydaza glicylo-glicynowa) jest metaloendopeptydazą z S. simulans.

W bakteriach Gram-dodatnich zewnętrzną powierzchnią bakterii jest zazwyczaj warstwa mureiny. Zatem korzystnym elementem wiążącym będą elementy występujące na powierzchni komórki, czy to białkowe, lipidowe, sacharydowe, czy ich kombinacja. Korzystnie przecinane są ściany komórkowe Staphylococcus, szczególnie korzystnie przecinane są ściany komórkowe Staphylococcus aureus. Zazwyczaj domena lizostafiny wiążąca ściany komórkowe bakterii jest określona przez sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności.

Domena wiążąca ścianę komórkową jest połączona z domeną katalityczną LytM, opcjonalnie poprzez łącznik peptydowy, jak ujawniono w opisie wynalazku. Zatem domena wiążąca ścianę komórkową służy do kierowania domeny katalitycznej do ściany komórkowej bakterii, która ma zostać wyeliminowana, korzystnie jest to ściana komórkowa bakterii Staphylococcus, szczególnie korzystnie Staphylococcus aureus.

Opcjonalnie łącznik peptydowy łączy domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii. Opcjonalnie oznacza, że niniejszy wynalazek działa również pod nieobecność łącznika peptydowego, na przykład, przez połączenie bezpośrednio domeny katalitycznej i domeny wiążącej ścianę komórkową. Zazwyczaj łącznik peptydowy zawiera od 5 do 35 aminokwasów, korzystnie od 10 do 30 aminokwasów, jeszcze korzystniej od 15 do 25 aminokwasów. W korzystnym przykładzie wykonania łącznik zawiera około 17 aminokwasów.

Łącznik peptydowy stosowany w chimerycznym polipeptydzie według wynalazku może mieć dowolną sekwencję aminokwasową, ponieważ nie jest zaangażowany ani w funkcję kierowania do ściany komórkowej domeny wiążącej, ani w funkcję enzymatyczną domeny katalitycznej chimeryczn ego polipeptydu, ale służy jako łącznik, który zapewnia elastyczność steryczną dwóch domen w polipeptydzie.

Korzystnie łącznik obejmuje sekwencję aminokwasową AGYGKAASTVTPTPNTG (SEQ ID NO: 3) lub sekwencję mającą co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z nim.

Jako łącznik może być użyty również łącznik typu dzikiego z lizostafiny (UniProt P10547) zawierający sekwencję aminokwasową AGYGKAGGTVTPTPNTG (SEQ ID NO: 4).

Termin „odczynnik diagnostyczny” odnosi się do odczynnika diagnostycznego wykrywającego obecność lub nieobecność gronkowca w próbce, przy czym wiązanie ujawnionego rekombinowanego polipeptydu z bakteriami z rodzaju Staphylococcus wykrywa się poprzez grupę generującą sygnał przyłączoną do rekombinowanego polipeptydu. Sygnał może również wynikać z lizy komórek gronkowcowych przez rekombinowany polipeptyd. Może to być wykryte przez zmiany gęstości optycznej kultur bakteryjnych, uwalnianie kwasów nukleinowych wykrywanych przez markery kolorymetryczne lub fluorymetryczne, zmiany przewodności, uwalnianie poszczególnych substancji, które można wykryć w określonych testach lub dowolną inną metodą biochemiczną, biofizyczną lub optyczną.

Odczynnik diagnostyczny może być częścią zestawu diagnostycznego.

Próbką może być krew, ślina, mocz, woda, żywność (mleko, produkty mleczne, mięso, ryby, owoce morza itp.), wymazy pobrane z różnych części ciała ludzkiego lub zwierzęcego, a także wszelkie powierzchnie, które mogą być skażone/skolonizowane przez bakterie z rodzaju Staphylococcus.

Termin „środek dezynfekujący” odnosi się do kompozycji, która niszczy formy wegetatywne mikroorganizmów, takich jak bakterie, zwłaszcza na powierzchniach obiektów nieożywionych. Ujawniony środek dezynfekujący według niniejszego ujawnienia zawiera rekombinowane polipeptydy zdefiniowane powyżej. Zatem taki środek dezynfekujący według niniejszego ujawnienia działa poprzez wiązanie się z zewnętrzną powierzchnią bakterii z rodzaju Staphylococcus, ostatecznie lizując, a zatem eliminując je. Korzystnie bakteriami jest Staphylococcus aureus. Zazwyczaj środki dezynfekujące są stosowane na obiektach nieożywionych, takich jak urządzenia i sprzęty, wszelkiego rodzaju powierzchnie, np. mebli, podłóg. Są one powszechnie stosowane w szpitalach, pokojach przyjęć i gabinetach dentystycznych, a także w kuchniach i łazienkach.

Termin „środek antyseptyczny” odnosi się do kompozycji, która zapobiega lub zatrzymuje wzrost mikroorganizmów, takich jak bakterie. Antyseptyk według niniejszego ujawnienia zawiera rekombinowane polipeptydy, jak zdefiniowano powyżej. Zatem taki środek antyseptyczny działa przez wiązanie się z zewnętrzną powierzchnią bakterii rodzaju Staphylococcus, ostatecznie lizując, a zatem eliminując bakterie. Korzystnie bakteriami jest Staphylococcus aureus. Zazwyczaj środki antyseptyczne są stosowane na żywej tkance lub skórze w celu zmniejszenia możliwości zakażenia lub posocznicy.

Termin „środek przeciwbakteryjny” odnosi się do środka, który jest skierowany przeciwko zewnętrznej powierzchni bakterii, a zatem lizuje i skutecznie zabija bakterie. Środek przeciwbakteryjny obejmuje kompozycje farmaceutyczne lub weterynaryjne. Środek przeciwbakteryjny według niniejszego ujawnienia zawiera rekombinowane polipeptydy, jak zdefiniowano powyżej. Środek przeciwbakteryjny może jednocześnie działać jako środek przeciwzapalny.

Termin „środek przeciwzapalny” odnosi się do środka przeciwdziałającego zapaleniu. Środek przeciwzapalny według niniejszego ujawnienia przeciwdziała zapaleniu poprzez wiązanie ściany komórkowej bakterii i zabijanie bakterii przez co nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej, a przez to stanu zapalnego. Środek przeciwzapalny według niniejszego ujawnienia zawiera rekombinowany polipeptyd, jak zdefiniowano powyżej. Środek przeciwzapalny może działać jednocześnie jako środek przeciwbakteryjny.

Zwykle ujawniony rekombinowany polipeptyd stosuje się do zapobiegania i/lub leczenia choroby wywołanej przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, szczególnie choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego.

Określenie „zapobieganie” odnosi się do zmniejszenia ryzyka nabycia lub rozwoju choroby wywołanej przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, szczególnie choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego, tj. powodowania, aby co najmniej jeden z objawów klinicznych nie wystąpił u człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek, które może być narażone na zakażenie bakteriami z rodzaju Staphylococcus. Zapobieganie dotyczy również zmniejszenia ryzyka nabycia lub rozwoju choroby wywołanej przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, szczególnie choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego, tj. powodowania niewystąpienia żadnego objawu klinicznego u człowieka lub zwierzęcia nie będącego człowiekiem, które przenosi bakterie z rodzaju Staphylococcus. Dlatego zapobieganie odnosi się również do eliminacji bakterii z rodzaju Staphylococcus u ludzi lub zwierząt, którzy nie doświadczają żadnych objawów klinicznych. Innymi słowy, ograniczenie lub uniemożliwianie przekazywania bakterii z rodzaju Staphylococcus z jednego nosiciela na drugi jest również objęte terminem „zapobieganie”.

Termin „leczenie” odnosi się do leczenia choroby wywołanej lub w której biorą udział bakterie z rodzaju Staphylococcus, szczególnie choroby dermatologicznej i/lub stanu zapalnego, w szczególności leczenie dotyczy, w jednym przykładzie wykonania, łagodzenia choroby i/lub stanu (tj. zatrzymania rozwoju choroby lub zmniejszenie zasięgu lub nasilenia co najmniej jednego z jego objawów klinicznych). Leczenie może również odnosić się do polepszania co najmniej jednego parametru fizycznego, który może nie być dostrzegalny dla człowieka lub zwierzęcia. Leczenie może również odnosić się do zmian w objawach choroby: fizycznych (np. stabilizacja odczuwalnych objawów), fizjologic znych (np. stabilizacja parametru fizjologicznego), albo obu. Alternatywnie, „leczenie” może również odnosić się do spowolnienia postępu choroby.

Choroby dermatologiczne to choroby, które dotyczą skóry składającej się z warstw tkanki ektodermalnej. Skóra kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym i chroni leżące poniżej struktury (np. mięśnie, kości, więzadła i narządy wewnętrzne) przed kontaktem ze środowiskiem zewnętrznym lub urazami, w tym przed patogenami, takimi jak bakterie. Skóra może być dotknięta chorobami, które są zróżnicowane pod względem przyczyn, objawów i/lub leczenia. W przykładach zastosowania korzystnie, chorobami dermatologicznymi są trądzik, pryszcze, zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry, infekcje i/lub urazy błony śluzowej lub skóry, rany, stopa cukrzycowa, wrzody, oparzenia, zapalenie gruczołu mlekowego, wymienia, oczu, uszu, gardła, zatok lub genitaliów. Jako błona śluzowa rozumiana jest cienka warstwa skóry, która wytwarza śluz i pokrywa wewnętrzną powierzchnię części ciała. Błona śluzowa zawiera jedną lub więcej warstw nabłonkowych, takich jak w strzyku/sutku, przewodach mlecznym, zatoce mlecznej, oku, uchu, kanale nosowym lub drogach oddechowych i narządach płciowych. Stopa cukrzycowa jest chorobą związaną z cukrzycą typu II i wiąże się z wysokim ryzykiem zmian skórnych i ran na skórze stóp, które często przekształcają się w rany przewlekłe. Wrzody są nieciągłością skóry lub przerwaniem skóry lub błon śluzowych. Wrzody obejmują owrzodzenia stopy cukrzycowej, powikłanie stopy cukrzycowej, odleżyny, owrzodzenia narządów płciowych, wrzodziejące zapalenie skóry i odbytu. Zapalenie jest czynnikiem wywołującym owrzodzenie. Choroba dermatologiczna może występować w izolacji lub w połączeniu ze stanem zapalnym, jak opisano poniżej. Stąd też choroba dermatologiczna może być powiązana ze stanem zapalnym.

Stany zapalne są zaburzeniami, które wpływają na narządy przez zapalenie, tj. miejscową odpowiedź na uszkodzenie komórek, które objawia się przez wystąpienie pojedynczych lub połączenie następujących objawów: rozszerzenie naczyń włosowatych, naciek leukocytowy, zaczerwienienie, ciepło i ból. Zapalenie jest mechanizmem inicjującym eliminację szkodliwych czynników i uszkodzonej tkanki. Zatem na narządy mogą wpływać stany zapalne, które są zróżnicowane pod względem przyczyn, objawów i/lub leczenia. Stany zapalne mogą występować oddzielnie lub w połączeniu z chorobą dermatologiczną, jak opisano powyżej. Stąd też stany zapalne mogą również zawierać składnik dermatologiczny.

W niektórych przykładach problemy dermatologiczne i/lub stany zapalne obejmują obecność bakterii Gram-dodatnich, szczególnie bakterii z rodzaju Staphylococcus, zwłaszcza Staphylococcus aureus. Bakterie Gram-dodatnie, zwłaszcza bakterie z rodzaju Staphylococcus, szczególnie z gatunku Staphylococcus aureus mogą przyczyniać się do rozwoju lub postępu chorób dermatologicznych. Bakterie Gram-dodatnie, zwłaszcza bakterie z rodzaju Staphylococcus lub szczególnie z gatunku Staphylococcus aureus mogą przyczyniać się do powstania lub rozwoju stanu zapalnego. Określenie bakterie Gramdodatnie odnosi się do bakterii, których zewnętrzna powierzchnia jest zazwyczaj warstwą mureiny. Staphylococcus jest rodzajem bakterii Gram-dodatnich i może powodować wiele różnych chorób u ludzi i zwierząt poprzez wytwarzanie toksyn lub penetrację. Infekcja związana z gronkowcem może wahać się od łagodnej i nie wymagającej leczenia do ciężkiej i potencjalnie śmiertelnej. Ponad 30 różnych gatunków Staphylococcus może zainfekować ludzi i zwierzęta. Objawy zakażeń gronkowcowych zwykle zależą od rodzaju zakażenia oraz organizmu, który je powoduje. Powszechne typy zakażeń obejmują: zakażenia skóry (np. zapalenie mieszków włosowych, czyraki, liszajec, zakażenia ran, zespół oparzeniowy skóry), zakażenia tkanek miękkich (np. zapalenie mięśni, zapalenie septyczne, septyczne zapalenie stawów), zapalenie gruczołu mlekowego, zespół wstrząsu toksycznego, plamica piorunująca, zapalenie wsierdzia, zapalenie szpiku, zapalenie płuc, zakażenia związane z urządzeniami protetycznymi (np. stawami protetycznymi i zastawkami serca, przetoki naczyniowe, przeszczepy, cewniki) i zakażenie dróg moczowych. Osoby z osłabionym układem odpornościowym (przyjmujące leki immunosupresyjne lub z niedoborami odporności) są narażone na większe ryzyko rozwoju poważniejszych zakażeń. Bakterie Staphylococcus według niniejszego wynalazku obejmują: Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus NCTC 8325-4, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus carprae, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus dysgalactiae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warnerii, Staphylococcus xylosus. Korzystnie jeśli gatunkiem Staphylococcus jest Staphylococcus aureus.

W niektórych przedstawionych przykładach wykonania rekombinowany polipeptyd wykazuje aktywność bakteriolityczną w surowym mleku i/lub surowicy. Termin „bakteriolityczny” jest zazwyczaj stosowany do oznaczania „degradacji ściany komórkowej bakterii”, tj. degradowania zewnętrznej powierzchni bakterii. Działanie bakteriolityczne prowadzi do degradacji, rozkładu, rozpadu ściany komórkowej lub zmniejszenia jej integralności. Aktywność bakteriolityczna może być skrajną formą aktywności degradującej ścianę komórkową lub wynikiem takiej aktywności.

Korzystnie surowym mlekiem jest surowe mleko krowie, a surowicą korzystnie jest surowica bydlęca lub ludzka. Surowe mleko krowie jest nieprzetworzone i nierozcieńczone i zawiera obok wody, tłuszczu, laktozy, różnych białek mleka także bakterie z rodzaju Lactococci, Lactobacilli i Leuconostoc. Jeśli krowa jest nosicielem bakterii z rodzaju Staphylococcus lub cierpi na jakąkolwiek formę zapalenia gruczołu mlekowego, mleko zawiera bakterie z rodzaju Staphylococcus (gronkowca). pH mleka krowiego zależy od różnych czynników, m.in. od czasu przechowywania i obecności bakterii, w tym bakterii z rodzaju Staphylococcus. Normalne mleko krowie ma pH od około 6,0 do 7,0, mleko krowie, które zawiera Staphylococcus, ma podwyższone wartości pH w porównaniu do zwykłego mleka krowiego. W takim przypadku wartości pH mogą wahać się od 7,0 do 8,5. Zatem surowe mleko krowie jest emulsją o wysoce specyficznym środowisku, kształtowanym przez różne czynniki, w tym obecność bakterii. Dlatego enzymy wykazujące aktywność w surowym mleku krowim muszą być specjalnie ukierunkowan e na te specyficzne wymagania. Podobnie płodowa surowica bydlęca pochodzi z krwi płodu bydlęcego i dlatego zawiera złożoną gamę składników białkowych, w szczególności czynników wzrostu, hormonów i aminokwasów. Zawiera także węglowodany i lipidy. Albumina surowicy bydlęcej jest głównym składnikiem płodowej surowicy bydlęcej. Dlatego enzymy, które wykazują aktywność w surowym mleku krowim, muszą być specjalnie przystosowane do tych specyficznych wymagań. Ludzka surowica odpowiada osoczu krwi bez żadnych czynników krzepnięcia. Obejmuje on złożoną gamę składników białkowych, w szczególności czynników wzrostu, hormonów i aminokwasów. Zawiera także węglowodany i lipidy.

Rekombinowany polipeptyd według niniejszego wynalazku można formułować do podawania miejscowego. Miejscowe odnosi się do sposobu podawania, oznacza, że materiał jest podawany przez nanoszenie na skórę lub błonę śluzową, która zawiera jedną lub więcej warstw nabłonkowych, takich jak w sutku, kanale mlecznym, zatoce mlecznej, oku, uchu, nosie lub drogach oddechowych i genitaliach. Rekombinowany polipeptyd do podawania miejscowego może być stosowany miejscowo przez smarowanie skóry cienką warstwą w celu zapobiegania i/lub leczenia stanów zapalnych gruczołu mlekowego i/lub tkanki wymienia (w tym strzyku/sutka, kanału mlecznego, przewodów mlecznych, brodawek sutkowych), w szczególności do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu gruczołu mlekowego. Rekombinowany polipeptyd stosowany do podawania miejscowego można podawać przez płukanie lub zanurzanie dotkniętego chorobowo obszaru. Alternatywnie, postać do podawania miejscowego może być stosowana przez nakraplanie na lub do miejsca dotkniętego chorobą. Korzystnie preparat ma postać kremu, roztworu, maści, żelu, pianki, plastra przezskórnego, proszku, pasty, taśmy, podkładki, gazika, opatrunku na rany lub kompresu.

W niektórych przykładach wykonania rekombinowany polipeptyd jest formułowany do dostarczania dosutkowego/dostrzykowego. Dostarczanie dosutkowe odnosi się do postaci dostarczania, w której rekombinowany polipeptyd jest dostarczany przez przewody mleczne do wymienia/piersi poprzez wstrzyknięcie, infuzję lub płukanie.

W niektórych przykładach wykonanie odnosi się do rekombinowanego polipeptydu, który jest dostarczany do strzyku lub sutka korzystnie przez infuzję, płukanie lub zanurzanie. Strzyk obejmuje sutek/strzyk, przewody mleczne oraz zatokę mleczną. Infuzja odnosi się do dostarczania kompozycji zawierającej rekombinowany polipeptyd bezpośrednio do części ciała, gdzie wymagana jest kompozycja zawierająca rekombinowany polipeptyd. Płukanie odnosi się do oczyszczania przez przepłukanie kompozycją zawierającą rekombinowany polipeptyd, usuwając w ten sposób ewentualne bakterie i jednocześnie, specyficznie niszcząc ewentualne pozostałości bakterii.

Korzystne przykłady wykonania dotyczą dostarczania rekombinowanego polipeptydu do samicy człowieka lub zwierzęcia nie będącego człowiekiem cierpiącej na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonej rozwojem zapalenia gruczołu mlekowego, korzystnie przeżuwacza, korzystniej krowy mlecznej. Samica według niniejszego wynalazku jest osobnikiem posiadającym gruczoły mleczne, a zatem może wydzielać mleko. Zwierzęciem innym niż człowiek według niniejszego wynalazku jest ssak. Przeżuwacze obejmują bydło, udomowione i dzikie bydło, kozy, owce, żyrafy, jelenie, gazele i antylopy. Krowy mleczne obejmują samice krów, które mają zdolność do produkowania mleka. Ryzyko rozwoju zapalenia gruczołu mlekowego odnosi się do ryzyka nabycia lub rozwinięcia zapalenia gruczołu mlekowego, tj. spowodowania wystąpienia co najmniej jednego z klinicznych objawów u narażonego na zakażenie pacjenta, tj. zapalenia kanałów/przewodów mlekowych i/lub strzyku/sutka, w szczególności zapalenia gruczołu mlekowego lub predyspozycji do zapalenia kanałów/przewodów mlekowych i/lub strzyku/sutka, w szczególności zapalenia gruczołu mlekowego przed pełnym rozwojem objawów choroby. Alternatywnie, ryzyko rozwoju zapalenia gruczołu mlekowego może również odnosić się do ryzyka nabycia lub rozwinięcia zapalenia gruczołu mlekowego, tj. spowodowania, że żaden z objawów klinicznych nie wystąpi u osobnika, który może być narażony, jeśli osobnik jest nosicielem bakterii z rodzaju Staphylococcus. Zapalenie gruczołu mlekowego odnosi się do uporczywej reakcji zapalnej gruczołu mlekowego i tkanki wymienia i jest główną endemiczną chorobą bydła mlecznego. Zwykle występuje ono, gdy leukocyty są uwalniane do gruczołu mlekowego, jako odpowiedź immunologiczna na inwazję bakteryjną kanału mlekowego przez różne bakterie i inne mikroorganizmy. Zapalenie gruczołu mlekowego, w szczególności zapalenie gruczołu mlekowego u krów mlecznych, może być spowodowane przez wiele różnych gatunków bakterii, z których najczęstszym jest gronkowiec. Tkanka wydzielająca mleko i przewody w gruczołach mlecznych są uszkadzane przez toksyny uwalniane przez bakterie.

Inny aspekt ujawnienia dotyczy podawania kompozycji weterynaryjnej zawierającej rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM, obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą co najmniej 80% identyczności z nią, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii i co najmniej jedną dopuszczoną do stosowania w produktach farmaceutycznych substancję pomocniczą. Kompozycja weterynaryjna zawierająca rekombinowany polipeptyd według wynalazku może również zawierać co najmniej jedną substancję pomocniczą dopuszczoną do stosowania w produktach farmaceutycznych, która modyfikuje uwalnianie rekombinowanego polipeptydu i/lub modyfikuje biodegradację rekombinowanego polipeptydu i/lub stabilizuje co najmniej jeden rekombinowany polipeptyd podczas jego wytwarzania, przechowywania i uwalniania. Ponadto, substancja pomocnicza może modyfikować rozpuszczalność rekombinowanego polipeptydu. Substancja pomocnicza może np. być polimerem hydrofitowym, cukrem, poliolem, środkiem powierzchniowo czynnym, przeciwutleniaczem i/lub solą rozpuszczalną w wodzie lub jakąkolwiek inną substancją pomocniczą stosowaną do osiągnięcia wyżej wymienionych celów.

Ponadto, do kompozycji weterynaryjnej zawierającej polipeptyd można dodawać dalsze substancje pomocnicze w celu zoptymalizowania jej właściwości chemicznych, fizycznych i mechanicznych w celu dostosowania jej do zamierzonego zastosowania. Dodatki te obejmują między innymi benzoesan sodu, estry lub sole kwasów tłuszczowych, fosforan trisodowy, ciekłą parafinę, tlenek cynku, stearynian wapnia, stearynian cynku. Rekombinowany polipeptyd formułowany do podawania miejscowego może również zawierać inne substancje pomocnicze, np. w celu polepszenia właściwości technicznych kompozycji weterynaryjnej zawierającej rekombinowany polipeptyd, tak aby był łatwiejszy do wytworzenia lub w celu poprawy stabilności. Odpowiednią, dopuszczoną do użytku farmaceutycznego substancję pomocniczą do stosowania w kompozycji weterynaryjnej według wynalazku można wybrać z grupy obejmującej nośniki, wypełniacze, rozcieńczalniki, środki rozsadzające, środki poślizgowe, emulgatory, środki regulujące pH, środki regulujące lepkość, środki zwiększające lub zmniejszające rozpuszczalność, środki osmotycznie czynne i rozpuszczalniki.

Kompozycja weterynaryjna może ponadto zawierać dopuszczone do użytku farmaceutycznego substancje pomocnicze w celu zwiększenia stabilności chemicznej. Kor zystnymi substancjami pomocniczymi są np. środki chelatujące, takie jak EDTA, disodowa EDTA, desferoksamina, kwas liponowy, glutation lub przeciwutleniacze, takie jak palmitynian kwasu askorbinowego, alfa-tokoferol, ubikwinol, β-karoten, retinol i hydrofitowe i/lub lipofilowe przeciwutleniacze.

Konkretne przykłady wykonania dotyczą wykorzystania kompozycji weterynaryjnej do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób dermatologicznych i/lub stanów zapalnych. Choroby dermatologiczne to choroby, które wpływają na skórę zbudowaną z warstw tkanki ektodermalnej. Skóra chroni leżące poniżej struktury (np. mięśnie, kości, więzadła i narządy wewnętrzne) przed kontaktem ze środowiskiem zewnętrznym i urazami, w tym przed patogenami, takimi jak bakterie. Skóra może być dotknięta chorobami, które są zróżnicowane pod względem przyczyny, objawów i/lub leczenia. Choroba dermatologiczna może również być związana ze stanem zapalnym. Stany zapalne są stanami, które wpływają na różne narządy poprzez zapalenie tj. miejscową odpowiedź na uszkodzenie komórek, objawiającą się przez dowolne połączenie następujących symptomów: rozszerzenie naczyń włosowatych, naciek leukocytowy, zaczerwienienie, zaognienie i ból. Stan zapalny jest mechanizmem inicjującym eliminację szkodliwych czynników z uszkodzonej tkanki. Zatem na narządy mogą wpływać zaburzenia, które są zróżnicowane pod względem przyczyny, objawów i/lub leczenia. Stany zapalne mogą występować same lub w połączeniu z zaburzeniem dermatologicznym, jak opisano powyżej. Stąd też stany zapalne mogą również obejmować zmiany dermatologiczne.

Korzystne wykonania dotyczą kompozycji weterynaryjnej, dla której choroba dermatologiczna i/lub stan zapalny są wybrane z grupy obejmującej zapalenie skóry, urazy i/lub infekcje błony śluzowej lub skóry, rany, wrzody i zapalenie wymienia, oka, ucha, gardła, zatoki lub narządów płciowych. Błona śluzowa według tego wynalazku jest cienką błoną, która wytwarza śluz i pokrywa wewnętrzną powierzchnię części ciała. Błona śluzowa składa się z jednej lub więcej warstw nabłonkowych, takich jak w sutku, kanale mlekowym, zatoce mlekowej, oku, uchu, kanale nosowym lub drogach oddechowych i narządach płciowych. Wrzody są nieciągłością skóry lub przerwaniem skóry lub błon śluzowych. Wrzody obejmują odleżyny, owrzodzenia narządów płciowych, wrzodziejące zapalenie skóry i odbytu. Zapalenie jest czynnikiem wywołującym wrzody.

W niektórych przykładach wykonania kompozycja weterynaryjna zawierająca rekombinowany polipeptyd jest formułowana do podawania dosutkowego. Podawanie dosutkowe dotyczy postaci dostarczania, w której rekombinowany polipeptyd jest dostarczany do sutka lub strzyku, przykładowo przez infuzję, płukanie lub zanurzanie. Strzyk obejmuje strzyk/sutek, kanał mlekowy oraz zatokę mlekową. Infuzja odnosi się do dostarczania kompozycji zawierającej rekombinowany polipeptyd bezpośrednio do miejsca ciała, gdzie wymagana jest kompozycja zawierająca rekombinowany polipeptyd. Płukanie odnosi się do oczyszczania przez przepłukanie kompozycją zawierającą rekombinowany polipeptyd, usuwając w ten sposób bakterie a jednocześnie także pozostałości bakterii.

W jeszcze innym przykładzie wykonania kompozycja weterynaryjna jest przeznaczona do stosowania w leczeniu zapalenia gruczołu mlekowego u przeżuwaczy. Przeżuwacze obejmują bydło, udomowione i dzikie, kozy, owce, żyrafy, jelenie, gazele i antylopy. Krowy mleczne obejmują samice krów, które mają zdolność wytwarzania mleka. Zachorowanie na zapalenie gruczołu mlekowego odnosi się do przewlekłego stanu zapalnego gruczołu sutkowego i tkanki wymienia i jest główną endemiczną chorobą bydła mlecznego. Zwykle występuje ono, gdy leukocyty są uwalniane do gruczołu mlekowego jako odpowiedź immunologiczna na infekcję bakteryjną kanału mlekowego przez różne bakterie. Zapalenie gruczołu mlekowego, w szczególności zapalenie gruczołu mlekowego u krów mlecznych, może być spowodowane przez wiele różnych gatunków bakterii, z których najczęstszym jest Staphylococcus. Tkanka wydzielająca mleko oraz przewody w gruczołach mlekowych są uszkadzane przez toksyny uwalniane przez bakterie.

Stężenie rekombinowanego polipeptydu według wynalazku, gdy jest stosowany jako środek dezynfekujący, będzie zazwyczaj wynosić co najmniej 10 nM, korzystnie co najmniej 20 nM, korzystniej co najmniej 50 mM, a najkorzystniej co najmniej 100 nM. Zazwyczaj stężenie będzie w zakresie od 10 nM do 1000 nM, korzystnie w zakresie od 20 nM do 500 nM, korzystniej w zakresie od 20 nM do 200 nM. Jednak skuteczne stężenie będzie zależeć od preparatu, zastosowanych warunków, środ owiska itp. i może być nawet wyższe niż 1 mM.

Stężenie rekombinowanego polipeptydu przy zastosowaniu jako środek przeciwbakteryjny w kompozycji farmaceutycznej lub weterynaryjnej, będzie zazwyczaj wynosić co najmniej 10 nM, korzystnie co najmniej 50 nM, a bardziej korzystnie co najmniej 100 mM. Zazwyczaj stężenie będzie w zakresie od 10 nM do 1000 nM, korzystnie w zakresie od 50 nM do 1000 nM, korzystniej w zakresie od 100 nM do 1000 nM. Jednak skuteczne stężenie będzie zależeć od preparatu i zastosowanych warunków i może być nawet wyższe niż 1 mM. Dotyczy to również stosowania w podawaniu dowymieniowym w zapaleniu gruczołów mlecznych.

Rekombinowany polipeptyd według wynalazku można stosować w połączeniu z innym środkiem aktywnym, takim jak środek antybiotykowy lub antyseptyczny. Przykładami antybiotyków, które można stosować w terapii skojarzonej z polipeptydem według wynalazku, są wankomycyna, erytromycyna, daptomycyna i cyprofloksacyna. Przykładami środków antyseptycznych, które można stosować w połączeniu z rekombinowanym polipeptydem według wynalazku, są chlorheksydyna, jod, nanocząstki srebra i nadtlenek wodoru (do 0,03%).

Rekombinowany polipeptyd według wynalazku można również korzystnie stosować w połączeniu z detergentami, takimi jak SDS (korzystnie do 0,01%), polisorbat 20 (Tween 20; korzystnie do 0,01%), polisorbat 80 (Tween 80; korzystnie do 0,1%), oktoksynol-9 (Triton X-100; korzystnie do 0,1%), monooleinian sorbitanu (Span 80; korzystnie do 0,1%) i typowe detergenty, takie jak płyny do zmywania i zmiękczające.

Wynalazek dotyczy również kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej do zewnętrznego stosowania a przez to poprawy stanu i wyglądu skóry, szczególnie w przypadku skóry zakażonej gronkowcem jak i skóry trądzikowej poprzez ograniczenia ilości bakterii gronkowca na skórze lub eliminacje ich występowania. Skóra jest poddawana różnego rodzaju procesom niszczenia przez dermatologiczne choroby i niepożądane stany kosmetyczne, szczególnie trudne do wyleczenia są infekcje gronkowcowe jak i trądzikowe, które często są współzakażone lub wtórnie zakażone gronkowcem. Nieoczekiwanie znaleźliśmy dalsze nieujawnione zastosowanie nowego rekombinowanego polipeptydu według wynalazku w postaci kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi i zwierząt do stosowania na skórę, dla dostarczania wcześniej nieujawnionych korzyści leczniczych, zapobiegawczych i pielęgnacyjnych. Stwierdziliśmy, że możliwe jest skuteczne traktowanie i zapobieganie stanom dermatologicznym i niepożądanym stanom kosmetycznym wywołanym przez gronkowce, szczególnie przy trądziku współzakażonym gronkowcem.

Kompozycja zgodnie z wynalazkiem zawiera także dermatologicznie/kosmetycznie dopuszczalny nośnik, który działa jako rozcieńczalnik, środek dyspergujący lub nośnik dla składników aktywnych. Nośnik może obejmować materiały powszechnie stosowane w produktach przeznaczonych do pielęgnacji skóry, jak woda, ciekłe lub stałe substancje zmiękczające skórę, oleje silikonowe, emulgatory, rozpuszczalniki, środki utrzymujące wilgoć, środki zagęszczające, proszki, propelenty i podobne. Poza substancją aktywną jakim jest rekombinowany peptyd według wynalazku do kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej także mogą być wprowadzane inne specyficzne, korzystne dla skóry substancje aktywne, jak środki zapobiegające szkodliwemu wpływowi światła słonecznego, środki o właściwościach pielęgnacyjnych i antybakteryjnych, np. wyciągi z roślin, jony cynku, srebra, miedzi. Nośnik może także zawierać środki pomocnicze, jak środki zapachowe, zmętniające, konserwanty, barwniki i bufory. Dla wytworzenia kompozycji do zewnętrznego stosowania według wynalazku można zastosować typowe sposoby wytwarzania produktów przeznaczonych do pielęgnacji skóry. Korzystnymi kompozycjami są emulsje olej w wodzie, lub woda w oleju. Kompozycje mogą być w postaci konwencjonalnych produktów przeznaczonych do pielęgnacji, jak krem, żel lub lotion, maść, płyn, proszek lub podobnych. Wykazano, że te substancje czynne, nośniki i dodatki stosowane w opisanych kompozycjach są obojętne dla aktywności enzymatycznej rekombinowanego peptydu według wynalazku i mogą być korzystnie stosowane do podtrzymywania i/lub wzmacniania aktywności enzymatycznej rekombinowanego peptydu według wynalazku w różnych wymienionych tu zastosowaniach.

PRZYKŁADY

W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody stosowane w dziedzinie lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.

Przyk ład 1: Klonowanie i ekspresja enzymów chimerycznych

Przykład obejmuje przygotowanie i dostarczenie dwóch chimerycznych enzymów A i B, które zawierają katalityczną domenę LytM, domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii i łącznik peptydowy.

Klonowanie

Domena katalityczna (LytMCD, reszty 185-316), łącznik peptydowy (Lss_linker) i domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii (LssCWT) zostały zligowane przy użyciu techniki “overlap extension” PCR w dwóch różnych układach (Fig. 1). Starter jest skonstruowany tak, że ma końcówkę 5', która jest komplementarna do końca innej cząsteczki DNA. Po przyłączeniu i wydłużeniu DNA, otrzymane fragmenty DNA są namnażane przez PCR przy użyciu innej pary starterów, które są komplementarne do docelowych końców DNA. Otrzymane produkty PCR oczyszczono i strawiono enzymami Ncol i XhoI i zligowano z podobnie strawionym wektorem ekspresyjnym pET15b. Transformowano szczep E. coli TOP10 i po weryfikacji sekwencji plazmidy transformowano do szczepu E. coli BL21 (DE3). Nadekspresję białek indukowano przez 1 mM IPTG i prowadzono przez około 4 godziny w 25°C. Mutageneza

Podwójne mutanty łącznika w Chimerze A i Chimerze B wytworzono przez ukierunkowaną mutagenezę opartą na PCR za pomocą wysokiej jakości polimerazy DNA Phusion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) i przy użyciu plazmidów pET15b-Chimera A/B/ jako matrycy do PCR. Obecność wprowadzonych mutacji potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA.

Dołączenie sekwencji sygnalnych/kierujących

Wytworzono konstrukty, w których dołączono na C końcu Chimery A oraz N końcu Chimery B sekwencje, które były sekwencjami sygnalnymi / kierującymi do wnętrza komórki eukoriotycznej. Sekwencje sygnalne kierujące białko do wnętrza komórki eukariotycznej (ang. Cell-Penetrating Peptides, CPPs) wklonowane na C-końcu Chimery A w miejsce restrykcyjne XhoI lub na N-końcu Chimery B w miejsce restrykcyjne Ncol. Podłączenie sekwencji CCP umożliwia łatwe przejście przez błonę komórkową i transport do wnętrza komórki np. do cytoplazmy lub organelli komórkowych. Sekwencje DNA CPPs w formie jednoniciowych oligonukleotydów, zaprojektowanych tak, by końce były rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, zostały zhybrydyzowane, a następnie zligowane ze zlinearyzowanymi wektorami zwierającymi sekwencje Chimery A lub B. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki kompetentne E. coli TOP10, następnie pozytywne klony sekwencjonowano i wektorami z potwierdzoną s ekwencją transformowano komórki kompetentne E. coli BL21(DE3). Nadprodukcję białka prowadzono

PL 243303 BI w pożywce autoindukcyjnej przez noc w 25°C. Poziom ekspresji weryfikowano na żelu poliakrylamidowym.

Sekwencje dołączonych sekwencji sygnalnych CPP, dla których wytworzono konstrukty z Chimerą A i B podano poniżej w Tabeli 1. Należy zauważyć, że znane są inne CPP, które można również podłączyć do rekombinowanego peptydu, w celu jego skierowania go do wnętrza komórki.

Tabela 1

SEQ ID No	Sekwencja aminokwasowa	Nazwa CPP
9	RQIKIWFQNRRMKWKK	Penatrin
10	WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA	CPP 2
11	M VT YLFRRLRIRR AS GPPRVRV	CPP 3
12	KLALKLALKALKAALKLA	CPP 4
13	RRQRRTSKLMKR	CPP 5
14	LLIILRRRIRKQAHAHSK	CPP 6
15	RRRRRRRR	poly-arginine
16	GRKKRRQRRRPPQ	HIY-TAT
17	GWTLNSAGYLLGK1NLKALAALAKKIL	CPP 9
18	AGYLLGKINLKALAALAKKIL	CPP 10
19	RKKRRQRRR	CPP 11

Schemat budowy Chimery A z dołączonym CPP i sekwencje wytworzonych rekombinowanych peptydów z dołączonymi na C-końcu zaznaczonymi sekwencjami CPP przedstawiono na Fig. 1D. Schemat budowy Chimery B z dołączonym na N końcu CPP przedstawiono na Fig. 1E. Sekwencje wytworzonych rekombinowanych peptydów z dołączonymi zaznaczonymi sekwencjami CPP na N końcu Chimery B miały sekwencje CPP przedstawione w Tabeli 1.

Oczyszczanie białka

Osad z hodowli E. coli zawierający nadeksprymowane białka zawieszono w 20 mM Tris-HCI pH 7,0, 1 M NaCI, 10% glicerolu i sonikowano. Lizat komórkowy dializowano wobec 20 mM Tris-HCI, pH 7,0, 50 mM NaCI i oczyszczano przez chromatografię jonowymienną na gradiencie NaCI (kolumna SP Sepharose, GE Healthcare). Dalsze oczyszczanie przeprowadzono przez filtrację żelową na kolumnie Superdex 75 (GE Healthcare, Uppsala, Szwecja) w buforze: 20 mM Tris-HCI pH 7,0, 200 mM NaCI, 10% glicerol.

Aktywność antygronkowcową oczyszczonych enzymów chimerycznych monitorowano za pomocą testów redukcji zmętnienia zawiesin bakteryjnych. Szczepy referencyjne S. aureus (NCTC 8325-4) hodowano w pożywce Tryptic Soy Broth (TSB) w 37°C. Testy redukcji zmętnienia przeprowadzono w płytkach 96-dołkowych. Komórki bakteryjne stosowane we wszystkich doświadczeniach zbierano w fazie wzrostu wykładniczego, zawieszono w TSB, przemywano i ponownie zawieszono w odpowiednim buforze do OD595 równego 1,0 (co odpowiada 10⁸ CFU/ml). Lizę komórek monitorowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odczyty wykonywano co 10 minut po 5 sekundowych wytrząsaniach próbki. Testy przeprowadzono w 50 mM buforze glicynowym, pH 8,0, 100 mM NaCI. Aktywność lityczna obydwu Chimer (A i B) była prawie identyczna (Fig. 2). Dlatego dalej opisano szczegółowo jedynie eksperymenty przeprowadzone przy użyciu Chimery A.

Podobną aktywnością charakteryzowały się również wytworzone Chimery A i B z dołączonymi sekwencjami sygnalnymi CPP.

Przykład 2: Chimera A jest aktywna przeciwko bakteriom Staphylococcus powodującym zapalenie gruczołu mlekowego

Celem tego przykładu jest izolacja szczepów bakteryjnych z mleka krów mlecznych cierpiących na zapalenie gruczołu mlekowego i badanie ich podatności na enzym - tu Chimerę A. Próbki mleka

PL 243303 Β1 pobierano od krów, w mleku których liczba komórek somatycznych (SSC) była podwyższona. Podwyższony SCC wskazuje na zapalenie gruczołu mlekowego. Próbki mleka pobierano oddzielnie z każdej ćwiartki wymienia i wysiewano na CHROMagar Mastitis (GrasoBiotech, Owidz, Polska). Po 18 godzinach inkubacji w 37°C pojedyncze kolonie o różnych morfologiach wysiano na świeżą pożywkę i hodowano przez kolejne 18 godzin w 37°C. Izolowane kolonie zidentyfikowano za pomocą systemu VITEK (bioMerieux).

Tabela 2. Aktywność Chimery A na izolatach powodujących zapalenie gruczołu mlekowego u bydła. Aktywność enzymu mierzono jako zmniejszenie zmętnienia zawiesiny komórek bakteryjnych.

Szczep Aktywność Chimery A

Staphylococcus aureus NCTC 8325-4+++ ^Staphylococcus aureus j +++|

Staphylococcus equorum .++

Staphylococus sciuri j +++j

Staphylococcus simulans+++

Staphylococcus warnerii j +++j

Staphylococcus xylosus -.Walili®

Bacillus polymyxa j -j

Corynebacterium spp.

Gardnerella vaginalis j -J

Kocuria kristinae ’+++ oznacza redukcję OD595 o 75 - 100%, ++ oznacza redukcję OD595 o 50 - 75%, a + oznacza redukcję OD595 o 25 - 50%, podczas gdy - oznacza redukcję OD595 o 0 - 25%. Wszystkie izolaty gronkowcowe były podatne na traktowanie Chimerą A, podczas gdy gatunki nie będące gronkowcami nie były wrażliwe na traktowanie Chimerą A.

Przykład 3: Chimera A jest aktywna w mleku UHT

Celem tego przykładu jest wykazanie aktywności Chimery A w mleku UHT. Aktywność Chimery A w mleku UHT oszacowano na podstawie redukcji liczby kolonii Staphylococcus aureus (CFU) w 1 ml po inkubacji w mleku w obecności badanych enzymów. Szczep Staphylococcus aureus NCTC 8325-4 hodowano do OD595 0,6 w TSB w 37°C przy łagodnym mieszaniu. Aktywność Chimery A w 37°C określono dla początkowej liczby komórek w stężeniu 10³ CFU/ml i dla różnych stężeń enzymów (36 - 4000 nM). S. aureus był całkowicie wyeliminowany z mleka do niewykrywalnego poziomu w ciągu 1 godziny inkubacji nawet przy stężeniach Chimery A tak niskich jak 36 nM (Fig. 3 i Fig. 4).

Mleko UHT zaszczepiono S. aureus w ilości 10⁶ CFU/ml i inkubowano w 4°C lub temperaturze pokojowej w obecności 100 nM enzymu. Próbki pobierano po 2 i 24 godzinach inkubacji i liczbę bakterii określano przez seryjne rozcieńczanie i wysiewanie na płytkach agarowych z TSB. Płytki inkubowano w 37°C przez 18 godzin. Mleko inkubowane bez enzymów było kontrolą negatywną. Eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach.

Chimera A wyeliminowała S. aureus z mleka UHT, zarówno w 4°C, jak i 22°C (Fig. 5) i była znacznie bardziej skuteczna w temperaturze pokojowej (redukcja liczby kolonii CFU/ml o 8 rzędów wielkości). Początkowa liczba komórek gronkowcowych (1 milion/ml) została zmniejszona o co najmniej 99,9% już w ciągu 2 godzin traktowania enzymem.

Przykład 4: Chimera A jest aktywna w surowym mleku krowim

Celem tego przykładu jest wykazanie aktywności enzymu chimerycznego w surowym mleku krowim. W celu określenia wpływu surowego mleka na aktywność enzymu chimerycznego, surowe krowie mleko z dodatkiem S. aureus inkubowano w obecności 36 i 100 nM Chimery A przez 3 godziny. Aktywność Chimery A w surowym krowim mleku określono jako spadek rzędu liczby komórek w 1 ml w czasie. Surowe mleko zaszczepiono szczepem NCTC 8325-4 S. aureus, hodowanym do OD595 0,6 w TSB w 37°C przy łagodnym mieszaniu, w stężeniu 10³ komórek/ml. Zaszczepione mleko inkubowano w obecności różnych stężeń Chimery A w 37°C. Próbki pobierano po 0, 1,2 i 3 godzinach, wysiewano na płytki z agarem TSB, które inkubowano w 37°C przez 18 godzin. Zliczano komórki, które przeżyły i szacowano spadek rzędu liczby komórek w 1 ml (CFU/ml log). Próbka inkubowana bez enzymu służyła jako kontrola negatywna. Eksperymenty powtórzono trzy razy. Chimera A wyeliminowała ponad 99% komórek w ciągu 1 godziny (Fig. 6A i Fig. 7). W kolejnych testach sprawdzono zdolności Chimer do eliminowania większej liczby bakterii. 106 CFU/ml komórek S. aureus (szczep NCTC 8325-4) obecnych w mleku było traktowane 100 nM Chimerą A w 22°C przez 24 godziny. Już po dwóch godzinach liczba komórek bakteryjnych spadła do 103 CFU/ml a po 24 godzinach 100% komórek bakteryjnych zostało wyeliminowanych (Fig. 6B).

Przykład 5: Chimera A powoduje spadek liczby komórek somatycznych w mleku uzyskanym od krów dotkniętych zapaleniem gruczołu mlekowego

Celem tego przykładu jest wykazanie, że liczba komórek somatycznych zmniejszyła się w próbkach mleka krów ze stwierdzonym zapaleniem gruczołu mlekowego po potraktowaniu ich Chimerą A. Do eksperymentu wybrano cztery krowy należące do eksperymentalnego stada bydła mlecznego z gospodarstwa doświadczalnego. Wybór krów opierał się na analizie liczby komórek somatycznych z ostatnich 8 miesięcy; wybrane krowy miały zwiększoną liczbę komórek somatycznych w co najmniej jednej ćwiartce wymiona, co wskazywało na różne stadia zaawansowania zapalenia gruczołu mlekowego. Bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu określono liczbę komórek somatycznych w mleku pobranym z każdej ćwiartki, a uzyskana próbka mleka została poddana analizie mikrobiologicznej. Bakterie hodowano i gatunki zidentyfikowano jak opisano w Przykładzie 1. Taką samą analizę przeprowadzono dla mleka zebranego pod koniec doświadczenia.

Użyty roztwór enzymu zawierał 20 mM Tris-HCl w pH 7,4, 100 mM NaCl, 10% glicerolu i 100 nM Chimery A. Każdą ćwiartkę wymienia przemywano roztworem enzymu dwa razy dziennie zaraz po udoju przez siedem dni.

W przypadku krowy 1 początkowa liczba komórek somatycznych wynosiła prawie 3,5 miliona w mleku uzyskanym z ćwiartki B, co świadczyło o ostrym stanie zapalnym gruczołu mlekowego. W pozostałych ćwiartkach (A, C, D) liczba komórek somatycznych nie przekraczała 20 000, co wskazywało na brak stanu zapalnego (Fig. 8). Testy mikrobiologiczne próbek mleka wykazały, że liczba komórek somatycznych, a tym samym stan zapalny ćwiartki B był spowodowany przez Staphylococcus. Po siedmiu dniach traktowania wymion roztworem Chimera A liczba komórek somatycznych w mleku uzyskanym z ćwiartki B została znacznie zmniejszona i wynosiła nieco powyżej 500 000. Liczba komórek somatycznych w pozostałych ćwiartkach (A, C, D) zmieniła się nieznacznie i nie przekroczyła 100 000, co jest standardowym poziomem dla zdrowych zwierząt i wskazuje na brak zakażenia. Gatunki gronkowców wyizolowane z zakażonej ćwiartki zidentyfikowano jako S. xylosus. W testach in vitro wrażliwości na Chimerę A, ten szczep gronkowca okazał się wrażliwy na zastosowany enzym chimeryczny (Tabela 2).

Podobny efekt zaobserwowano u krowy 4, u której liczba komórek somatycznych wskazywała na ostre zapalenie dwóch strzyków (ćwiartek wymion): A i B (liczba komórek somatycznych odpowie dnio powyżej 4,5 miliona i 2,6 miliona) oraz nieco mniej ostre zapalenie gruczołu mlekowego w strzyku C - ponad 600 000. Czwarta ćwiartka (D) nie wykazywała żadnych oznak zapalenia (liczba komórek somatycznych 54 000). Analiza mikrobiologiczna próbek mleka wykazała obecność gronkowca tylko w strzyku C. Jedynie w mleku z ćwiartki C uzyskano znaczące zmniejszenie liczby komórek somatycznych z ponad 623 000 do 150 000 po potraktowaniu roztworem enzymu chimerycznego przez jeden tydzień. We wszystkich pozostałych ćwiartkach nie zaobserwowano istotnych zmian w liczbie komórek somatycznych, nie wykryto również patogennych gatunków gronkowców w próbkach mleka pobranych z tych ćwiartek.

Przykład 6: Chimera A jest aktywna w surowicy

Celem tego przykładu jest wykazanie aktywności chimerycznego enzymu w surowicy. Aktywność lityczną 100 nM roztworu enzymu Chimera A badano w testach redukcji zmętnienia w obecności płodowej surowicy bydlęcej. Test przeprowadzono na 96-dołkowych płytkach.

Szczep referencyjny Staphylococcus aureus NCTC 8325-4 hodowano do fazy logarytmicznego wzrostu, przemywano i zawieszano w 50 mM glicynie, pH 8,0, i 100 mM NaCl do OD595 równego 1,0. Testy przeprowadzono w 50 mM buforze glicynowym, pH 8,0, 100 mM NaCl z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) o końcowym stężeniu od 0 do 100%. Spadek OD595 monitorowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, z odczytami co 10 minut po 5 sekundach wytrząsania. Kontrola

PL 243303 BI pozytywna nie zawierała FBS. Aktywność enzymu chimerycznego nie zmieniła się w obecności FBS, nawet przy 100% stężeniu (Fig. 9).

W celu potwierdzenia, że enzym chimeryczny jest tak samo aktywny w 100% surowicy, jak w warunkach optymalnych, określono liczbę żywych komórek i wykazano, że enzym wyeliminował ponad 99,99% (zmniejszenie o 5 rzędów liczby komórek gronkowcowych w ciągu 2 godzin (Tabela 3). Ten sam wynik otrzymano dla aktywności enzymu chimerycznego w buforze glicynowym.

Tabela 3. Aktywność enzymu chimerycznego A w obecności 100% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).

Aktywność 100 nM enzymu oszacowano jako zmniejszenie rzędu wielkości liczby komórek bakteryjnych w 1 ml w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej (spadek logio CFU/ml).

	Stężenie bakterii {CFU/ml) średnia±SD	CFU/ml log10 spadek po2godz.
Oh	2h
Bufor (kontrola)	2.71 ± 0.45 χ 108	2.25 ± 0.43 x 108	0
Bufor + Chimera A	2.71 ± 0.45 x 108	2.40 ± 1.41 x 103	5
FBS (kontrola)	2.65 ±0.43 χ 108	5.05 ± 0.28 x 108	0
FBS + Chimera A	2.65 ±0.43 x 108	5.40 ± 0.28 X 103	-

Przykład 7. Przykłady porównawcze

A. Porównanie aktywności chimer

Verbree i in. opublikowali wyniki analiz około 170 różnych lizyn pochodzenia fagowego i różnych zmodyfikowanych chimer badanych pod kątem aktywności w mleku (Verbree, Datwyler i in. 2018). Tylko 8 ze 170 testowanych enzymów wykazało ograniczoną aktywność w mleku pasteryzowanym, ale żaden z nich nie był skuteczny w usuwaniu komórek gronkowca z surowego mleka. Nieznaczne zmniejszenie liczby komórek gronkowca w surowym mleku zaobserwowano tylko w przypadku mieszanin różnych enzymów bakteriolitycznych podanych jednocześnie i w bardzo wysokim stężeniu. Żaden z testowanych enzymów nie był skuteczny w eliminowaniu dużej liczby komórek bakteryjnych przy niskich stężeniach enzymów.

Porównaliśmy aktywności chimer - Chimery A - przeprowadzając z nimi doświadczenia w warunkach i stężeniach identycznych w jakich testowane były chimery opisane w publikacji Verbree, Datwyler i in. 2018. W Tabeli 4 przedstawione są otrzymane wyniki porównawcze przedstawione jako rzędy wielkości liczby komórek, oraz rzędy spadku liczby komórek (Δ) po potraktowaniu odpowiednimi enzymami.

Tabela 4. Porównanie efektów działania badanych enzymów z wynikami testów innych chimer przedstawionymi w publikacji Verbree, Datwyler i in. 2018.

Warunki testu	Liczba komórek po trzech godzinach traktowania enzymem logio
Mleko	Stężenie enzymu	Kontrolna liczba komórek logio	Wyniki Yerbree at al	Wyniki Chi mera A
To	T3c	T3E	A	T3E	A
UHT	36 nM	3	5	4-5	0-1	0	5
UHT	360 nM	3	5	0-4	1-5	0	5
UHT	4000 nM	3	5	3-0	2-5	0	5
RAW 100%	36nM	3	4	-	-	0	4
RAW 100%	320nM	3	4	4-1	1-3	-

Liczba bakterii w rzędach wielkości. To - początkowa; Tac - po 3 godzinach bez enzymu, T₃e - po 3 godzinach z enzymem, A - spadek liczby bakterii po 3 godzinach traktowania enzymem wyrażony w rzędach wielkości. RAW- mleko surowe.

Wykazano, że takie Chimery wykazują się wielokrotnie wyższą aktywnością, również gdy są stosowane w bardzo niskich stężeniach. Wysoka aktywność Chimer obserwowana była nie tylko w mleku

UHT ale również okazało się, że są bardzo skuteczne w usuwaniu komórek gronkowca z surowego mleka, których to właściwości nie posiadały żadne znane ze stanu techniki chimery.

B. Brak aktywności chimery znanej ze stanu techniki

W zgłoszeniu patentowym WO2007/130655 firmy Ganagagen opisano chimeryczne enzymy złożone z domeny aktywnej LytMcD i domeny wiążącej ścianę komórkową lizostafiny. Przyrównanie sekwencji aminokwasowej Chimery A do chimery przedstawionej w Seq Id No 9 publikacji WO2007/130655 przedstawiono na Fig. 10.

Jak widać z przedstawionego przyrównania sekwencja chimery Seq ID No 9 znanej ze stanu techniki obejmuje tylko część peptydu budującego domenę katalityczną, brakuje w niej 34 aminokwasów na N-końcu, w tym dwóch koordynujących reszty cynku H210 i D214, które jak wykazano eksperymentalnie, są niezbędne do działania domeny katalitycznej LytM (Odintsov, Sabala i in. 2004) i innych członków tej rodziny, takich jak Ale-1 (Fujiwara, Aoki i in. 2005) i lizostafina (Bardelang, Vankemmelbeke i in. 2009). Brak każdej z tych reszt oddzielnie, tym bardziej obu jednocześnie, blokuje aktywność katalityczną enzymu, warunkującą jego właściwości antybakteryjne. Konstrukt z niepełnym centrum aktywnym nie może przeprowadzić reakcji rozszczepiania wiązań peptydowych prowadzących do dezintegracji ścian, a przez to lizy komórek bakteryjnych. Wykazano, że chimery znane ze stanu techniki są nieaktywne katalitycznie.

LITERATURA

Bardelang, P., M. Vankemmelbeke, Y. Zhang, H. Jarvis, E. Antoniadou, S. Rochette, N. R. Thomas, N. Penfold and R. James (2009). Design of a polypeptide FRET substrate that facilitates study of the antimicrobial protease lysostaphin. Biochem J 418(3): 615-624.

Bowler et al. (2001). Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev 14(2): 244-269.

Brusselaers et al. (2010). Severe burn injury in Europe: a systematic review of the incidence, etiology, morbidity, and mortality. Crit Care 14(5): R188.

Fujiwara, T., S. Aoki, H. Komatsuzawa, T. Nishida, M. Ohara, H. Suginaka and M. Sugai (2005). Mutation analysis of the histidine residues in the glycylglycine endopeptidase ALE-1. J Bacteriol 187(2): 480-487.

Hicks et al. (2014). Trends and determinants of costs associated with the inpatient care of diabetic foot ulcers. J Vase Surg 60(5): 1247-1254, 1254.e1241-1242.

Hop et al. (2014). Costs of burn care: a systematic review. Wound Repair Regen 22(4): 436-450.

Jagielska, E., O. Chojnacka and I. Sabala (2016). LytM fusion with SH3b-like domain restore its activity in physiological conditions.

Karthikesalingam et al. (2010). A systematic review of scoring systems for diabetic foot ulcers. Diabetic Medicine 27(5): 544-549.

Kruse and Edelman (2006). Evaluation and Treatment of Diabetic Foot Ulcers. Clinical Diabetes 24(2): 91-93.

Malinowski and Smulski (2007). „Prevalence and prophylaxis of intramammary infections and mastitis in pregnant heifers.“ Życie Weterynaryjne 82(6): 476-482.

Odintsov, S. G., I. Sabala, M. Marcyjaniak and M. Bochtler (2004). Latent LytM at 1.3A resolution. J Mol Biol 335(3): 775-785.

Osipovitch, D. C. and K. E. Griswold (2015). Fusion with a cell wall binding domain renders autolysin LytM a potent anti-Staphylococcus aureus agent. FEMS Microbiol Lett 362(2): 1-7.

Rodriguez-Rubio, L., B. Martinez, D. M. Donovan, P. Garcia and A. Rodriguez (2013). Potential of the virion-associated peptidoglycan hydrolase HydH5 and its derivative fusion proteins in milk biopreservation. PLoS One 8(1): e54828.

Verbree, C. T., S. M. Datwyler, S. Meile, F. Eichenseher, D. M. Donovan, M. J. Loessner and M. Schmelcher (2018). Corrected and Republished from: Identification of Peptidoglycan Hydrolase Constructs with Synergistic Staphylolytic Activity in Cow's Milk. Appl Environ Microbiol 84(1).

PL 243303 BI

WYKAZ SEKWENCJI

SEQ ID NO: 1 - sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej CD z LytM (LytMCD) z Staphylococcus aureus.

SEQ ID NO: 2 - sekwencja aminokwasowa domeny CWT z lizostafiny Lss wiążacej/rozpoznąjącej ścianę komórkową (LssCWT) z Staphylococcus simulans

SEQ ID NO: 3 - sekwencja aminokwasowa zmutowanego łącznika Lss_linkcr (Lss_linker^M)

SEQ ID NO: 4 - sekwencja aminokwasowa dzikiej wersji łącznika Lssjinker (Lss_linkcr^w)

SEQ ID NO: 5 - sekwencja aminokwasowa Chimery A

SEQ ID NO: 6 - sekwencja nukleotydową Chimery A

SEQ ID NO: 7 - sekwencja aminokwasowa Chimery B

SEQ ID NO: 8 - sekwencja nukleotydową Chimery B

SEQ ID NO: 9-19 - sekwencje sygnalnych CPP przyłączonych do Chimery A i B przedstawione są w Tabeli 1, odpowiednio.

LISTA SEKWENCJISekwencje SEQ ID NO: 6, 8, 9-19 przedstawione w wersji elektronicznej (oraz na Fig. 1 i w Tabeli 1) <110> MIBMIK <120> Chimery LytM i lizostafiny <130> G/728/AGR <160>19 <170> Patentln version 3.5 <210>1 <211>132 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1

His

Ala

Lys

Asp

Ala

Ser

Trp

Leu

Thr

Ser

Arg

Lys

Gin

Leu

Gin

Pro

1 Tyr

Gly

Gin

Tyr

5 His

Gly

Gly

Gly

Ala

10 His

Tyr

Gly

Val

Asp

15 Tyr

Ala

Met

Pro

Glu

20 Asn

Ser

Pro

Val

Tyr

25 Ser

Leu

Thr

Asp

Gly

30 Thr

Val

Val

Gin

Ala

35 Gly

Trp

Ser

Asn

Tyr

40 Gly

Gly

Gly

Asn

Gin

45 Val

Thr

Ile

Lys

Glu

50 Ala

Asn

Ser

Asn

Asn

55 Tyr

Gin

Trp

Tyr

Met

60 His

Asn

Asn

Arg

Leu

65 Thr

Val

Ser

Ala

Gly

70 Asp

Lys

Val

Lys

Ala

75 Gly

Asp

Gin

Ile

Ala

80 Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

85 Gly

Asn

Ser

Thr

Ala

90 Pro

His

Val

His

Phe

95 Gin

Arg

Met

Ser

Gly

100 Gly

Ile

Gly

Asn

Gin

105 Tyr

Ala

Val

Asp

Pro

110 Thr

Ser

Tyr

Leu

Gin 130

115 Ser

Arg

120

125

PL 243303 BI <210> 2 <211> 92 <212> PRT

<213>	Staphylococcus simulans
<400> Trp Lys	2 Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser
1 Phe Thr	5 10 15 Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg
Ser Met	20 25 30 Pro Gin Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gin Thr Ile His Tyr
Asp Glu	35 40 45 Val Met Lys Gin Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly
50 Asn Ser	55 60 Gly Gin Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser
65 Thr Asn <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Ala Gly	70 75 80 Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly Thr Ile Lys 85 90 3 17 PRT artificial LSS- mutated linker 3 Tyr Gly Lys Ala Ala Ser Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr
1 Gly	5 10 15

<210>	4
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Staphylococcus simulans
<400>	4
Ala Glj	r Tyr Gly Lys Ala Gly Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr
1	5 10 15
Gly

<210> 5 <211> 243 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> Chimeric AA seguence of Chimera A <400> 5

Met

Gly His

Ala

Lys

Asp

Ala

Ser

Trp

Leu

Thr

Ser

Arg

Lys

Gin

Leu

1

5

10

15

Gin

Pro Tyr

Gly 20

Gin

Tyr

His

Gly

Gly 25

Gly

Ala

His

Tyr

Gly 30

Val

Asp

Tyr

Ala Met 35

Pro

Glu

Asn

Ser

Pro 40

Val

Tyr

Ser

Leu

Thr 45

Asp

Gly

Thr

Val

Val Gin 50

Ala

Gly

Trp

Ser 55

Asn

Tyr

Gly

Gly

Gly 60

Asn

Gin

Val

Thr

Ile 65

Lys Glu

Ala

Asn

Ser 70

Asn

Asn

Tyr

Gin

Trp 75

Tyr

Met

His

Asn

Asn 80

Arg

Leu Thr

Val

Ser 85

Ala

Gly

Asp

Lys

Val 90

Lys

Ala

Gly

Asp

Gin 95

Ile

PL 243303 BI

Ala Tyr Ser

Gin Arg Met 115

Ser Tyr Leu 130

Thr Pro Thr 145

Tyr Lys Ser

Arg Thr Thr

Ala Gly Gin 195

Val Trp Val 210

Val Arg Thr 225

Thr Ile Lys

Gly Ser Thr Gly Asn 100

Ser Gly Gly Ile Gly

120

Gin Ser Arg Ala Gly 135

Pro Asn Thr Gly Trp 150

Glu Ser Ala Ser Phe 165

Gly Pro Phe Arg Ser 180

Thr Ile His Tyr Asp

200

Gly Tyr Thr Gly Asn 215

Trp Asn Lys Ser Thr 230

Ser Thr Ala Pro His Val His Phe 105 110

Asn Gin Tyr Ala Val Asp Pro Thr 125

Tyr Gly Lys Ala Ala Ser Thr Val 140

Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu 155160

Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr 170175

Met Pro Gin Ser Gly Val Leu Lys 185190

Glu Val Met Lys Gin Asp Gly His 205

Ser Gly Gin Arg Ile Tyr Leu Pro 220

Asn Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly

235 240 <210> 7 <211> 243 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> AA seguence of Chimera B <400> 7

Met

Gly

Trp

Lys

Thr

Asn

Lys

Tyr

Gly

Thr

Leu

Tyr

Lys

Ser

Glu

Ser

1 Ala

Ser

Phe

Thr

5 Pro

Asn

Thr

Asp

Tle

10 Ile

Thr

Arg

Thr

Thr

15 Gly

Pro

Phe

Arg

Ser

20 Met

Pro

Gin

Ser

Gly

25 Val

Leu

Lys

Ala

Gly

30 Gin

Thr

Ile

His

Tyr

35 Asp

Glu

Val

Met

Lys

40 Gin

Asp

Gly

His

Val

45 Trp

Val

Gly

Tyr

Thr

50 Gly

Asn

Ser

Gly

Gin

55 Arg

Ile

Tyr

Leu

Pro

60 Val

Arg

Thr

Trp

Asn

65 Lys

Ser

Thr

Asn

Thr

70 Leu

Gly

Val

Leu

Trp

75 Gly

Thr

Ile

Lys

Ala

80 Gly

Tyr

Gly

Lys

Ala

85 Ala

Ser

Thr

Val

Thr

90 Pro

Thr

Pro

Asn

Thr

95 Gly

His

Ala

Lys

Asp

100 Ala

Ser

Trp

Leu

Thr

105 Ser

Arg

Lys

Gin

Leu

110 Gin

Pro

Tyr

Gly

Gin

115 Tyr

His

Gly

Gly

Gly

120 Ala

His

Tyr

Gly

Val

125 Asp

Tyr

Ala

Met

Pro

130 Glu

Asn

Ser

Pro

Val

135 Tyr

Ser

Leu

Thr

Asp

140 Gly

Thr

Val

Val

Gin

145 Ala

Gly

Trp

Ser

Asn

150 Tyr

Gly

Gly

Gly

Asn

155 Gin

Val

Thr

Ile

Lys

160 Glu

Ala

Asn

Ser

Asn

165 Asn

Tyr

Gin

Trp

Tyr

170 Met

His

Asn

Asn

Arg

175 Leu

Thr

Val

Ser

Ala

180 Gly

Asp

Lys

Val

Lys

185 Ala

Gly

Asp

Gin

Ile

190 Ala

Tyr

Ser

Gly

Ser

195 Thr

Gly

Asn

Ser

Thr

200 Ala

Pro

His

Val

His

205 Phe

Gin

Arg

Met

Ser

210 Gly

Gly

Ile

Gly

Asn

215 Gin

Tyr

Ala

Val

Asp

220 Pro

Thr

Ser

Tyr

Leu

225 Gin

Ser

Arg

230

235

240

Claims (34)

1. Rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w którym aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1;

(ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności; i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii;

(iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu wybraną z SEQ ID NO: 9-19; do zastosowania do leczenia choroby i/lub stanu wywołanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przez Staphylococcus aureus.

2. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

3. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-2, znamienny tym, że domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

4. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-3, znamienny tym, że łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

5. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-4, znamienny tym, że zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

6. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-4, znamienny tym, że zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

7. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-6, znamienny tym, że choroba i/lub stan jest wybrany z grupy obejmującej trądzik, pryszcze, zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry, infekcje i/lub uszkodzenia błony śluzowej lub skóry, rany, stopę cukrzycową, wrzody, oparzenia, zapalenia gruczołu mlekowego, zapalenie wymienia, zapalenia oka, zapalenia ucha, zapalenia gardła, zapalenia zatok, zapalenia genitaliów.

8. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-7, znamienny tym, że rekombinowany polipeptyd jest formułowany do podawania miejscowego, korzystnie w postaci kremu, lotionu, roztworu, maści, żelu, pianki, plastra przezskórnego, proszku, pasty, zawiesiny, taśmy, podkładki, wacika, opatrunku na rany lub kompresu.

9. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 1-8, znamienny tym, że rekombinowany polipeptyd jest formułowany do dostarczania dosutkowego/dostrzykowego.

10. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrz. 9, znamienny tym, że rekombinowany polipeptyd jest dostarczany do sutka lub strzyku, korzystnie przez infuzję, płukanie lub zanurzanie.

11. Rekombinowany polipeptyd do zastosowania według zastrzeżenia 9-10, znamienny tym, że rekombinowany polipeptyd jest dostarczany samicy człowieka lub zwierzęcia innego niż człowiek cierpiącego na zapalenie gruczołu mlekowego lub zagrożonego rozwojem zapalenia gruczołu mlekowego, korzystnie przeżuwacza, korzystniej krowy mlecznej.

12. Kompozycja weterynaryjna zawierająca rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w której aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący katalityczną domenę LytM i domenę lizostafiny wiążącą ściany bakterii, (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19; oraz (v) farmaceutycznie lub weterynaryjnie dopuszczalną substancję pomocniczą;

do zastosowania w leczeniu choroby i/lub stanu spowodowanego przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przeciwko Staphylococcus aureus.

13. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12, znamienna tym, że w rekombinowanym peptydzie domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

14. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12-13, znamienna tym, że w rekombinowanym peptydzie domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

15. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12-14, znamienna tym, że w rekombinowanym peptydzie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

16. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12-15, znamienna tym, że rekombinowany peptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

17. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12-16, znamienna tym, że rekombinowany peptyd, zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

18. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrz. 12-17, znamienna tym, że jest do leczenia choroby i/lub stanu wybranego z grupy obejmującej zapalenie skóry, urazy i/lub infekcje błony śluzowej lub skóry, rany, wrzody, zapalenie gruczołu mlekowego, zapalenie oka, zapalenie ucha, zapalenie gardła, zapalenie zatok, zapalenie narządów płciowych.

19. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według z zastrzeżeń 12-18, znamienna tym, że kompozycja weterynaryjna jest formułowana do podawania dosutkowego.

20. Kompozycja weterynaryjna do zastosowania według zastrzeżeń 12 do 19, znamienna tym, że jest do zastosowania w leczeniu zapalenia gruczołu mlekowego u przeżuwaczy.

21. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu zawierającego (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w którym aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1, (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii, (iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19;

jako środek dezynfekujący, in-vitro czynnik przeciwbakteryjny, in-vitro środek aktywny w kompozycji kosmetycznej, pielęgnacyjnej lub higienicznej dla ludzi lub zwierząt przeciw bakteriom z rodzaju Staphylococcus, korzystnie przeciwko Staphylococcus aureus.

22. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 21, znamienne tym, że domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

23. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 21-22, znamienne tym, że domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

24. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 22-23, znamienne tym, że łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

25. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 22-24, znamienne tym, że polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

26. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 22-25, znamienne tym, że polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.

27. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 22-26, znamienne tym, że gdy polipeptyd jest stosowany jako środek dezynfekujący stosowany jest do dezynfekcji powierzchni, urządzeń, sprzętów, mebli, podłóg, szczególnie w szpitalach, gabinetach lekarskich i dentystycznych, kuchniach i łazienkach.

28. Zastosowanie rekombinowanego polipeptydu według zastrz. 22-26, znamienne tym, że gdy polipeptyd jest stosowany jako in-vitro czynnik przeciwbakteryjny stosowany jest jako in-vitro czynnik przeciwbakteryjny w mleku, surowicy, korzystnie w mleku pełnym.

29. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna do zastosowań kosmetycznych, pielęgnacyjnych i higienicznych u ludzi lub zwierząt, znamienna tym, że zawiera rekombinowany polipeptyd zawierający (i) domenę katalityczną LytM (LytMCD) zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 1 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, przy czym zachowuje aktywność bakteriolityczną wobec Staphylococcus aureus i w której aminokwasy koordynujące cynk w centrum aktywnym nie są zmienione i są His w pozycji 26, Asp w pozycji 30, His w pozycji 109 SEQ ID NO: 1; ‘ (ii) domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii (LssCWT), zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 2 lub mającą z nią co najmniej 80% identyczności, i (iii) opcjonalnie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny wiążącą ścianę komórkową bakterii;

(iv) sekwencję sygnalną CCP kierującą do wnętrza komórki eukariotycznej dołączoną od strony domeny LssCWT na N lub C końcu polipeptydu, korzystnie wybraną z SEQ ID NO: 9-19;

(v) co najmniej jeden nośnik dopuszczony w zastosowaniach kosmetycznych, pielęgnacyjnych, higienicznych u ludzi lub zwierząt;

przy czym kompozycja jest przeznaczona do zewnętrznego stosowania, i przy czym rekombinowany polipeptyd jest stosowany w kompozycji kosmetycznej lub pielęgnacyjnej dla ograniczenia występowania lub usunięcia bakterii z rodzaju Staphylococcus, korzystniej Staphylococcus aureus.

30. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna według zastrz. 29, znamienna tym, że w rekombinowanym polipeptydzie domena katalityczna LytM składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 1.

31. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna według zastrz. 29-30, znamienna tym, że w rekombinowanym polipeptydzie domena lizostafiny wiążąca ścianę komórkową bakterii składa się z sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO: 2.

32. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna według zastrz. 29-31, znamienna tym, że w rekombinowanym polipeptydzie łącznik peptydowy łączący domenę katalityczną LytM i domenę lizostafiny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 4, korzystnie składa się z sekwencji SEQ ID NO: 3.

PL 243303 BI

33. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna według zastrz. 29-32, znamienna tym, że rekombinowany polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 5 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierająca SEQ ID NO: 6, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 5.

34. Kompozycja kosmetyczna lub pielęgnacyjna według zastrz. 29-33, znamienna tym, że rekombinowany polipeptyd zawiera sekwencję SEQ ID NO: 7 lub kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zawierającą SEQ ID NO: 8, korzystnie składa się z SEQ ID NO: 7.